Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых простагландин-Н-синтазой

Цаплина, Людмила Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых простагландин-Н-синтазой
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых простагландин-Н-синтазой"

На правах рукописи

Цаллина Людмила Александровна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЦИКЛООКСИГЕНАЗНОЙ И ПЕРОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИЙ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ ПРОСТАГЛАНДИН-Н-СИНТАЗОЙ

Специальность 03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2007

003066962

Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета и факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Вржещ Петр Владимирович

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Алесенко Алиса Владимировна

доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович

Ведущая организация

Институт биохимии имени А H Баха РАН

Защита состоится

часов на

заседании Диссертационного совета Д 501 001 96 при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992, г Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория "Новая"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Т Е Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Фермент простагландин-Н-синтаза (РОШ, К Ф 1 14 99 1) катализирует ключевую реакцию каскада арахидоновой кислоты - превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2, исходное соединение в биосинтезе всех простагландинов, тромбоксана и простациклина в организме большинства млекопитающих, в том числе человека РОТК имеет два активных центра, на которых протекает циклооксигеназная (окисление арахидоновой кислоты до простагландина С2) и пероксидазная (восстановление перекисной группы простагландина до спиртовой с образованием простагландина Н2) реакции

Фермент РОНЗ - димер, состоящий из одинаковых субъединиц с молекулярным весом 72 кДа Для проявления обеих активностей ферменту необходим гемин в качестве простетической группы Существует две изоформы РвШ. конституционная (РОИКМ) и индуцибельная (РОШ-2) В настоящей работе исследовались свойства РОШ-1 из везикулярных желез (семенных пузырьков) барана

Между двумя активностями РвШ существуют довольно сложные взаимоотношения циклооксигеназная реакция не протекает в отсутствие перекисей, пероксидазная реакция идет как в присутствии, так и в отсутствие арахидоновой кислоты, а также в присутствии ингибиторов циклооксигеназы Обе реакции РвИВ сопровождаются быстрой и необратимой инактивацией фермента в процессе реакции До настоящего времени не существовало адекватной модели, описывающей кинетику РбДО Бифункциональный характер РвШ является причиной того, что все предложенные механизмы принципиально не подходят для описания работы этого фермента, так как предполагают использование уравнения материального баланса по сумме промежуточных форм фермента, участвующих в циклооксигеназной и пероксидазной реакциях Такие механизмы характеризуются конкуренцией между реакциями, что противоречит экспериментальным данным Адекватных моделей, описывающих инактивацию фермента, тоже нет Систематически инактивация двух активностей РОШ не исследовалась, поэтому остается непонятной взаимосвязь инавсгивационных процессов в ходе обеих реакций Этот круг вопросов и предстояло исследовать в данной диссертационной работе

Цель исследования. Разработать методологические подходы для экспериментального исследования кинетических закономерностей катализа и

инактивации фермента РвШ Разработать кинетическую модель действия фермента РОШ, учитывающую его бифункциональный характер, предполагающую независимое, но взаимовлияющее протекание реакций на одной молекуле фермента Разработать кинетические модели инактивации фермента РвШ

Задачи исследования

1) Разработать экспериментальные подходы для исследования взаимовлияния реакций РОШ, инактивации в процессе реакции и инактивации при прединкубации с перекисями циклооксигеназной и пероксидазной активностей РОКВ, а также получить очищенные препараты фермента

2) Исследовать кинетические закономерности взаимодействия и взаимовлияния пероксидазной и циклооксигеназной реакций РвШ

3) Исследовать кинетику инактивации циклооксигеназной активности в ходе протекания циклооксигеназной и пероксидазной реакций, и кинетику инактивации пероксидазной активности в ходе протекания циклооксигеназной и пероксидазной реакций

4) Исследовать кинетику инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвШ при прединкубации с перекисными субстратами пероксидазной реакции

5) Разработать кинетические модели катализа и инактивации бифункционального фермента РвШ, учитывающие все особенности его действия и состояние его двух активных центров, основываясь на моделях многосубстратной ферментативной реакции, ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивации и двумерной модели бифункционального фермента

Научная новизна. На основе обобщенной двумерной модели действия бифункционального фермента, а также модели многосубстратной ферментативной реакции предложена кинетическая схема действия бифункционального фермента РвШ, которая, в отличие от представленных в литературе схем, предусматривает независимое протекание двух ферментативных реакций на одной молекуле фермента и взаимное влияние этих реакций

Предложен подход, заключающийся в исследовании кинетики инактивации обеих активностей PGHS в ходе протекания как циклооксигеназной, так и пероксидазной реакций

Показано, что при прединкубации фермента с перекисью водорода инактивация каждой активности протекает как минимум в две стадии. При прединкубации PGHS с исследуемыми перекисями концентрация последних в широком диапазоне не влияет на константу скорости инактивации пероксидазной активности Для циклооксигеназной активности наблюдается зависимость константы скорости инактивации от концентрации перекиси, с которой проводили прединкубацию Исследование инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей PGHS в различных условиях свидетельствует о том, что инактивация этих активностей имеет разные химические механизмы

На основе обобщенной модели ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивацией, предложены модели, которые с помощью минимального количества параметров описывают наши и известные из литературы данные по инактивации PGHS

Практическая значимость. Проведенные исследования позволили подробнее изучить свойства PGHS и расширить наши представления о механизме функционирования этого фермента

Представленные в работе обобщенные кинетические модели (двумерная модель действия бифункционального фермента, кинетическая модель инактивации в ходе реакции) могут быть использованы для анализа механизма действия и других бифункциональных ферментов

Знание механизмов протекания реакций PGHS, важного фармакологического объекта, даст возможность скорректировать разработку новых лекарственных препаратов и способов контроля каскада арахидоновой кислоты m vivo

Полученные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы для подготовки по специализациям биофизика, катализ, биохимия и биотехнология

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международной

конференции "Ломоносов-2004" (Москва, 2004 г), Международной молодежной

конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2005 г),

Международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая

физика» (Москва, 2006 г ), Международной конференции «Математическая биология и биоинформатика» (Пущино, 2006 г) Работа также докладывалась на семинарах кафедр биофизики, биоинженерии и биохимии биологического факультета МГУ

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 в научных российских журналах (по списку ВАК), 5 в тезисах конференций

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы Количество страниц -_, ссылок -_, рисунков -_, таблиц -_

Сокращения. РвШ - простагландин-Н-синтаза, Туг* - тирозин-радикал, РОС2 -простагландин 02, Р6Н2 - простагландин Н2, АА - арахидоновая кислота, Б - донор электронов, РР1Х — протопорфирин IX

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В обзоре говорится о биологической роли и месте РвШ в

цепи синтеза простагландинов. Подробно

рассмотрена доменная структура РОШ,

структура пероксидазного и

циьслооксигеназного активных центров

Также подробно описаны каталитические

свойства РОШ циклооксигеназная и

пероксидазная реакции, химические

превращения, происходящие в ходе этих

реакций Описаны кинетические

особенности действия РОНЭ, дан

критический анализ схем, предложенных

для описания этих особенностей другими

„ , „ . авторами Рассмотрено влияние различных

Схема 1 Схема реакции, осуществляемых г х- г-

ферментом простаглавдин-н-сяшазой ингибиторов на циклооксигеназную актив-

ность фермента Рассмотрены имеющиеся в литературе сведения по инактивации РОНв в процессе катализируемых им реакций и проанализированы кинетические схемы, предложенные другими авторами Рассмотрены кинетические особенности

РвШ

Арахидоновая кислота

_ I циклооксигеназная

■¿"2 I реакция

Простагландин

| лероксадазная реакция

Простагландин Н2

бифункциональных ферментов, представлен критический анализ предложенных механизмов для описания бифункциональных ферментов, многосубстратных реакций и инактивации ферментов

Методы исследования. 1) Солюбилизированный препарат PGHS выделяли из везикулярных желез барана по методу [Van der Ouderaa et al, 1977] с небольшими изменениями

2) Очистку солюбилизированного препарата PGHS проводили методом колоночной хроматографии на носителе DEAE Sepharose Электрофоретическая чистота полученного препарата PGHS более 95%

3) Концентрацию белка в препаратах фермента определяли с помощью колориметрических методов [Lowiy et al, 1951, Bradford, 1976]

4) Электрофорез в полиакриаламидном геле проводили в денатурирующих условиях с добавлением додецилсульфата натрия по методу Лэмли [Laemmh, 1970]

5) Измерение концентрации кислорода для слежения за ходом циклооксигеназной реакции PGHS осуществляли амперометрически с использованием полярографа «АКПМ-02-05» (ООО «Фирма «Альфа БАССЕНС», Россия), снабженным газодиффузионным платино-серебряным электродом Кларка

6) Измерение концентрации окисленной формы донора электронов для слежения за пероксидазной реакцией PGHS осуществляли с помощью спектрофотометра «Сагу 100» («Varían Inc», США)

7) Методика обработки экспериментальных данных Для подтверждения моделей и получения значений констант экспериментальные данные аппроксимировали согласно полученным формулам методом нелинейной регрессии с использованием программы Origin б 0 фирмы Microcal

Результаты и обсуждение.

Анализ обобщенных схем. Фермент PGHS катализирует две многосубстратные реакции, каждая из которых протекает на своем активном центре (схема 1, рис 1) Обе активности подвергаются необратимой инактивации, причем в процессе циклооксигеназной реакции может инактивироваться как циклооксигеназная, так и пероксидазная активности, а в процессе пероксидазной реакции может инактивироваться как пероксидазная, так и циклооксигеназная активности Поэтому кинетическую схему действия PGHS целесообразно

разрабатывать В общем виде, так как комбинаторный перебор рсех возможных вариантов дает большое количество схем. Эта работа проведена с использованием разработанных ранее подходов [Вржещ. 1996]. Для создания кинетических моделей катализа и инактивации бифункционального фермента PGHS необходимо проанализировать модели многосубстратной ферментативной реакции, бифункционального фермента, и ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивации.

Рис-I. Лет очная диаграмма мономера PGHS-J с арахндоновой кислотой (АА), связанной ь цнклооксженазном активном ucirrpe ГШ ((РР1Х) Fe) - активный центр □сроке идазной реакции. Также на рисунке показан тирозин jK5. Кристаллическая структура взята us PDB банка, Ш ■ IU67 [Нагтаал et. а1„7ДСМ]. Диаграмма выполнена с помощью программы VMD (Visual Molecular Di nam i cs), Beck тал Institute for Advanced Science and Technology.

на схеме ¿ представлен механизм многосубстратной неразветвленной ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивацией:

—РГ^ —ргЕ> ПЗГ..... : ШГ..... "-1 "

1л, i л, V л, 1л ^

Е' Е' Е' Е- Е' É

Схема 2. Обобщенная модель неразветвленнои ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактинациен ферме1гга н процессе реакции.

(1 < / < п) - каталитически активные промежуточные формы фермента (интермеднаты), а, и Д (1 < i < п) - конеганты скорости реакций первого (псевдопервого) порядка для реакций взаимопревращения интермедиатов.

Взаимодействие субстрата с промежуточной формой фермента Б, выражается в том, что константа скорости а, является константой скорости псевдопервого порядка и равна константе скорости второго порядка прямой реакции, умноженной на концентрацию этого субстрата. Взаимодействие продукта с промежуточной формой фермента Ем и отщепление продукта егг промежуточной формы фермента Ег выражается в том, что константа скорости Д является константой псевдопсрвого

i r^ivi

порядка и равна константе скорости второго порядка обратной реакции, умноженной на концентрацию этого продукта

Предусмотрено, что каждая промежуточная форма фермента может подвергаться необратимой инактивации (£' - инакгивированные формы фермента) Процессы необратимой инактивации интермедиатов характеризуются константами скороеги первого (псевдопервого) порядка Я, >0 (1<1<п) В данной работе проанализированы уравнения, описывающие подобные схемы (схема 2) и определены качественные критерии кинетического поведения таких схем, необходимых для построения кинетической схемы РвШ

Бифункциональный фермент катализирует протекание двух реакций (А и В) Кинетику этих реакций опишем в рамках механизма упорядоченной (неразветвленной) многосубстратной ферментативной реакции ((1) и (2)) Реакция А

°ТМ1 > г _■■ р _с- _аю -. р _.<р ч О)

Реакция В

Е < «Й ^ «Й ч р < ч * ой „„ V (2)

~!~Щ>--- 4 /¡д--4 - •■ Оя -

Наличие у фермента двух активных центров приводит к необходимости в кинетических схемах одновременно учитывать состояние первого и второго активного центра, интермедиаты в кинетических схемах должны характеризоваться двумя индексами Учет независимого изменения величин двух индексов превращает кинетические схемы в «двумерные»

При одновременном присутствии компонентов (субстратов и продуктов) реакций А и В и независимом одновременном протекании реакций А и В суммарный механизм процесса будет иметь двумерный характер и может быть представлен в виде матрицы, фрагмент которой (на примере промежуточной формы Еи) показан на схеме 3

„в

■ Р

ЯГ

Схема 3 Фрагмент обобщенной двумерной модели действия бифункционального фермента

Предусматривается, что в результате завершения цикла в вертикальном направлении (схема 3) происходит один оборот реакции А, в результате завершения цикла в горизонтальном направлении - один оборот реакции В Зависимости стационарных скоростей vA и ve от концентраций субстратов SA и S" имеют вид дробно-рациональных функций (3), (4)

d0+dlisA]+d7[sAf+ +dMl[sArl VA hb+hl[sB]+h2[sBf+ +hmti[sBr'

Аналогичным образом выглядят уравнения для vB

Только в том случае, если протекание одной реакции не меняет величину кинетических констант другой реакции, и наоборот, реакции А и В протекают строго независимо и могут быть описаны отдельно как две независимые ферментативные реакции (1) и (2)

Бифункциональный характер фермента проявляется в отклонении от гиперболичности скорости одной ферментативной реакции в случае присутствия в реакционной среде компонентов другой реакции, а также к появлению зависимости скорости одной ферментативной реакции от концентрации субстрата другой реакции Необходимо также рассмотреть инактивацию бифункционального фермента Каждый промежуточный шггермедиат (схема 3) может обладать или двумя различными активностями, или одной, или не обладать активностью В общем виде рассматривать инактивацию не представляется возможным ввиду сложности процесса Элементы общей схемы инактивации для частного случая рассмотрены при обсуждении конкретных экспериментов (схема 7)

Исследование взаимовлияния реакций. Исследовали влияние субстратов циклооксигеназной реакции PGHS и обратимого ингибитора циклооксигеназы напроксена на начальную скорость пероксидазной реакции, а также субстратов пероксидазной реакции на начальную скорость циклооксигеназной реакции

Влияние доноров электронов, субстратов пероксидазной реакции, на циклооксигеназную реакцию PGHS. Получены зависимости скорости циклооксигеназной реакции от концентрации доноров электронов TMPD, ABTS, L-адренапина, ферроцианвда калия (рис 2, 3)

1,2-

>Ъ 0,4-

t '

...Л

Gr-

/2 3

500 1000 1500

[ D], mkM

0,8-

0,6-

5 0,4-f 2

> 0,2-1 0,0

"л-—.

¿fitrti-Jij, ~~ fe° B -

"о--—.

°\Г

Э 50 100 150 200 250

концентрация TMPD, мкМ

Рис 2 Зависимость начальной скорости циклооксигеназной реакции от концентрации донора электронов Концентрация

арахидоновой кислоты — 100 мкМ, гемина — 2 мкМ Кривые построены при аппроксимации экспериментальных данных согласно уравнению (6) 1 - ABTS, Vi = 1,13, V2 = 0,41, К,/К2 = 14, К3 = 0, 2 - L-адреналин, V, = 0,92, V2 = 0,41, К,/К2 = 14, К3 = 0, 3 - ферроцианвд калия, V, = 0,83, V2 = 0,41, КУК2 = 14, Кз = 0

Рис 3 Зависимость начальной скорости циклооксигеназной реакции от концентрации TMPD при концентрациях арахидоновой кислоты 40, 75, 100, 180 мкМ (1 - 4 соответственно) Кривые построены при аппрокетмадии экспериментальных данных согласно уравнению (6) Vi = 1,9, V2 = 0,41, Ki = 2,4, К2 = 0,04, К3 = 20, К4 = 0,06

В отсутствие донора электронов циклооксигеназная реакция протекает, однако, в присутствии донора электронов скорость циклооксигеназной реакции увеличивается. Для доноров электронов ABTS, L-адреналина и ферроцианида калия наблюдается зависимость «с насыщением» без инпибирования (Рис 2)

^ 10

сГ 8

1 6

х о о

0,00

0,05

0,10

Рис 4 Зависимость начальной скорости циклооксигеназной реакции при фиксированных концентрациях ТМРР 20, 90, 135 мкМ (1-3 соответственно) от концентрации арахидоновой кислоты в двойных обратных координатах. Сплошные линии построены при аппроксимации экспериментальных данных согласно уравнению (6) V, = 0,62, \7 = 0,4, К,/К2 = 15,3, К3 = 12,6 , К, = 0,03

(концентрация АА)"1, (мкМ)"1

Увеличение концентрации донора электронов ТМИ5 до определенного значения повышает скорость циклооксигеназной реакции, а при дальнейшем увеличении концентрации ТМРБ - понижает (Рис 3). Характер рисунков 3 и 4 говорит о конкурентных отношениях донора электронов ТМРБ и арахидоновой кислоты за центр связывания субстрата циклооксигеназной реакции, по крайней мере,

неконкурентные отношения в чистом виде отсутствуют (рис 4) Так как зависимость (рис 4) является линейной в двойных обратных координатах, механизм взаимодействия фермента с арахидоновой кислотой в первом приближении можно описать в рамках модели Михаэлиса-Ментен

Влияние перекиси водорода, субстрата пероксидазной реакции, на циклооксигеназную реакцию РОН8.

В отдельных экспериментах было показано, что добавление перекиси водорода к смеси для проведения циклооксигеназной реакции РвШ (как в отсутствие, так и в присутствии донора электронов) уменьшает начальную скорость циклооксигеназной реакции на 15-20%, и увеличивает константу скорости инактивации циклооксигеназной активности на 20-25%

Влияние напроксена, ингибитора циклооксигеназной реакции РвНБ, на циклооксигеназную и пероксидазную реакции. Напроксен относится к нестероидным противовоспалительным препаратам и является хорошо известным быстрым обратимым конкурентным ингибитором циклооксигеназной реакции РОНБ Добавление напроксена вызывает быстрое и практически полное подавление циклооксигеназной активности РвШ (рис 5)

Присутствие напроксена во время протекания пероксидазной реакции (рис 6) практически не влияет на начальную скорость, а лишь незначительно уменьшает константу скорости инактивации РвШ в ходе пероксидазной реакции при добавлении напроксена до начала пероксидазной реакции по сравнению с контролем Влияние арахидоновой кислоты, субстрата циклооксигеназной реакции на пероксидазную реакцию. В присутствии арахидоновой кислоты, добавленной до начала пероксидазной реакции, одновременно протекают пероксидазная и циклооксигеназная реакции (рис 7) Начальная скорость пероксидазной реакции практически не меняется Добавление напроксена в эту систему также не отражается на начальной скорости пероксидазной реакции

Таким образом, можно сделать вывод о том, что активный центр пероксидазной реакции практически не чувствителен к состоянию активного центра циклооксигеназной реакции Реализуется случай, когда протекание одной реакции не влияет на протекание другой.

время, с

Рис 5 Влияние напроксена на кинетику циклооксигеназной реакции 1 — контроль (ABTS — 750 мкМ, АА - 150 мкМ, гемин - 2 мкМ, PGHS -15 мкг/мл), 2 - контроль + напроксен (1 мМ, добавлен до внесения фермента), 3 - контроль + напроксен (1 мМ, добавлен на пятой секунде реакции), 4 - контроль + напроксен (1 мМ, добавлен на десятой секунде реакции)

1 5

5? 2-] н ш < 1-1

0-1

2,3

.Jo I 4 о • А ° . •

. 5 •

-4

-1

время, с

Рис 6 Влияние напроксена на кинетику пероксидазной реакции 1 — контроль (ABTS -750 мкМ, Н202 - 1,5 мМ, PGHS - 5,4 мкг/мл), 2 - контроль + напроксен (1 мМ, добавлен до внесения фермента), 3 - контроль + напроксен (1 мМ, добавлен на 5 секунде реакции), 3 -контроль + напроксен (1 мМ, добавлен на 10 секунде реакции)

Рис 7 Влияние арахидоновой кислоты и напроксена на протекание пероксвдазной реакции 1 - контроль (ABTS - 750 мкМ, Н202 -1,5 мМ, PGHS - 5,4 мкг/мл), 2 - контроль + арахидоновая кислота (150 мкМ, добавлена до внесения фермента), 3 - контроль + арахидоновая кислота (150 мкМ) и напроксен (1 мМ), добавлены до внесения фермента, 4 -контроль + напроксен (1 мМ, добавлен до внесения фермента)

Кинетическая модель действия РСНЗ.

Требования к кинетической модели действия РСН5. Протекание пероксидазной реакции РвНБ не зависит от протекания циклооксигеназной реакции Напротив, из литературы известно, что для протекания циклооксигеназной реакции необходимы следовые количества перекиси [Нет1ег & а1, 1978] (в отсутствие перекисей наблюдается лаг-период) В этом случае протекает пероксидазная реакция и происходит образование тирозил-радикала, играющего роль исходного окислителя в свободнорадикальном механизме циклооксигеназной реакции (схема 4) Скорость циклооксигеназной

„ж

реакции увеличивается в присутствии донора

электронов, субстрата

пероксидазной реакции Донор электронов ТМРВ конкурирует с субстратом циклооксигеназы за центр связывания Циклооксигеназная и

пероксидазная реакции идут одновременно, и нет явных Схема 4 Этапы превращения арахвдоновой кислоты в РОС2 признаков конкурентных

jer

>60»!

во время протекания циклооксигеназной реакции [Kulmacz et

взаимоотношении между ними

а!, 2003]

Предполагаемая схема действия РвНБ. На основании теоретических разработок обобщенной двумерной модели действия бифункционального фермента (схема 3) нами предложена кинетическая схема действия РйШ, предусматривающая независимое протекание двух ферментативных реакций на одной молекуле фермента, допускающая взаимовлияние этих реакций (схема 5)

1 г t

■ [ (PPIX) Fe"' ] [ (PPIX) Fe"']

Туг* Тут AA*

41 aa .-jl

[ (PPIX) Feiv О ] -г"» [ (PPIX) Fe™ О ] Туг* Туг AA*

t j

[ (PPIX) Fe ]

TyrAAOA*

202 e —"j | PGGj

[ (PPIX) Fe'vO ] -X TyrAAOA*

AA e—| 20, в—I } PGG,

[ (PPIX)* Fe™ О ] [ (PPIX)* Fe" О ] [ (PPIX)* Fe1" О ]

Туг* Tyr AA* TyrAAO/),*

ROH

ROH,

ROOH-—

ROH ч—A

ROOH• ROOH-

Схема 5 Схема действия PGHS

Образование тирозил-радикала не показано, так как этот процесс происходит относительно быстро (спустя 1-2 секунды после начала реакции) [Marshall et al, 1987], а мы рассматриваем работу фермента в стационарном приближении и

характерные времена составляют десятки секунд Правомерность такого

рассмотрения подтверждается отсутствием лаг-периода на кинетических кривых в наших экспериментах

Завершение цикла в вертикальном направлении (схема 5) соответствует одному акту катализа пероксидазной реакции, завершение цикла в горизонтальном направлении - одному акту катализа циклооксигеназной реакции Принципиальное отличие этой схемы от всех предлагавшихся ранее состоит в том, что материальный баланс ведется отдельно по всем возможным промежуточным состояниям фермента, и реакции могут протекать по разным маршрутам

Для схемы 5 зависимость начальной скорости циклооксигеназной реакции от концентрации донора электронов в стационарном режиме выражается следующим образом

..сох _ е„ + е, [Р] + е2 [Р]2 + е3 [Р]3 + е< [Р]4 + е5 [Р]5 + е6 [Р]6

(1,+а,[Р]+а2[р]2+<13[Р]3+а„[Р]4+а5[Р]5+суп]6' ^

где [Р] - концентрация донора электронов, константы е, и й, выражаются через

константы скоростей элементарных стадий и концентрации других участников

реакции, причем, е, *0 (0<1<6), <1г*0 (0</<6) В уравнении (5) присутствует

шестая степень, за счет того, что донор электронов дважды принимает участие в

механизме реакции Так как протекание пероксидазной реакции не зависит от

циклооксигеназной, все кинетические константы у реакций, протекающих в

вертикальном направлении на схеме 5, соответственно равны друг другу

Такая зависимость, при определенных соотношениях между константами е, и с!,

описывает стимулирование циклооксигеназной реакции с увеличением концентрации

донора электронов Уравнением (5) можно описать не только увеличение скорости

циклооксигеназной реакции при малых концентрациях донора электронов, но и

уменьшение при больших Однако способность ингибировать циклооксигеназную

реакцию зависит от природы донора электронов и не присуща всем донорам, поэтому

это явление необходимо описать отдельно

Для описания иншбирования циклооксигеназной реакции донором электронов

ТМРО проведено экспериментально обоснованное упрощение схемы 5 и предложена

схема 6 На схеме 6 Е - молекула фермента с тирозил-радикалом, О - донор

электронов ТМИ), который может конкурентно взаимодействовать с центром

связывания арахидоновой кислоты

Экспериментально показано, что скорость циклооксигеназной реакции увеличивается при добавлении донора электронов (рис 2, 3) При этом увеличивается доля восстановленной формы (РР1Х) Бе (пероксидазный активный центр) (схема 5, верхняя строка), следовательно, восстановленные формы фермента более каталитически активны по отношению к циклооксигеназной реакции Принимая во внимание состояние пероксидазного активного центра, можно выделить V] и У2 -

^ максимальные стационарные скорости

РСНЗг — я Е < ■ —— Б Е циклооксигеназной реакции,

катализируемой ферментом РОЖ с восстановленным и окисленным пероксидазным активным центром Е АА соответственно

Схема 6 Схема циклооксигеназной реакции С учетом сказанного выше получим

для схемы 6 следующую зависимость наблюдаемой стационарной скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты и ТМИЭ

[АА]

усох _К,У2 + К2У1[Р]

(6)

К.+ВД] [АА]+К3(1+К,[Щ)' где Кь К2, К3, К4 - функции констант скоростей реакций

Схема 5 и уравнение (6) описывают полученные нами экспериментальные данные (рис 2, 3, 4) Согласно уравнению (6) зависимость начальной скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты линейна в двойных обратных координатах, что согласуется с экспериментальными данными (рис 4)

Инактивация циклооксигеназной и пероксидазной активностей РОНБ в процессе катализа. Для исследования механизмов инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РОНЭ нами был разработан методологический подход, позволяющий сравнивать скорость инактивации циклооксигеназной активности РвШ, обусловленной протеканием самой циклооксигеназной реакции (т е инактивации в процессе реакции), со скоростью инактивации пероксидазной активности РвИв, обусловленной протеканием циклооксигеназной реакции И наоборот сравнивать скорость инактивации пероксидазной активности РвШ, обусловленной протеканием самой пероксидазной реакции (те инактивации в

процессе реакции) со скоростью инактивации циклооксигеназной активности РвШ, обусловленной протеканием пероксидазной реакции

Влияние времени инкубации фермента Р01$ в условиях протекания циклооксигеназной реакции на пероксидазную и циклооксигеназную активности. Фермент инкубировали в присутствии субстратов циклоохсигеназной реакции (арахидоновая кислота, растворенный кислород) в стандартном буферном растворе

ВРЕМЯ ПРОТЕКАНИЯ * ЦИКЛООКСИГЕНАЗНОЙ РЕАКЦИИ

ю1

ОМ

-10

100 200 время, с

300

Рис 8 Кинетика изменения концентрации кислорода (кривая 1) и концентрации донора электронов (на примере TMPD) (кривая 2) в процессе инкубации PGHS с субстратами пероксидазной и циклооксигеназной реакций 1 - Детекция концентрации кислорода, АА - 150 мкМ, PGHS - 75 мкг/мл, 2 - детекция концентрации окисленной формы TMPD, АА - 150 мкМ, PGHS - 18 мкг/мл, перекись водорода - 1,5 мМ, TMPD -60 мкМ Стрелками указаны моменты добавления реагентов

После заданного времени протекания циклооксигеназной реакции с целью определения пероксидазной активности РОНБ в ту же реакционную смесь одновременно добавляли перекись водорода и донор электронов За происходящими процессами следили с помощью полярографической и спектрофотометрической методик Полярографически наблюдали изменение концентрации кислорода (рис 8, кривая 1), которое после добавления РвН8 соответствует циклооксигеназной реакции Спектрофотомегрически следили за накоплением окисленной формы донора электронов (рис 8, кривая 2) Как видно из рисунка 8, после добавления донора электронов и перекиси водорода наблюдается изменение концентрации окисленной формы донора электронов вследствие пероксидазной реакции Определяли начальную скорость пероксидазной реакции, а в качестве количественной характеристики пероксидазной активности использовали относительную активность (рис 9а, квадраты, кружки) Относительная циклооксигеназная активность представлена как функция времени протекания циклооксигеназной реакции (рис 9а, треугольники, ромбы)

Полученные экспериментальные зависимости описывали с помощью эмпирического уравнения (7), по которому осуществляли предварительную оценку констант скорости инактивации (А) (аппроксимации не показаны)

К = + (7)

Величина Л пероксидазной активности (рис. 9а) составляет 5 мин"1, Л текущей скорости циклооксигеназной активности 4,5-5,5 мин"1 (рис 9а) Аппроксимация экспериментальных данных по эмпирическому уравнению (7) дает возможность сравнивать скорости представленных процессов друг с другом и делать предположения о кинетических механизмах В отдельных экспериментах было показано (например, рис 9а, треугольники, ромбы), что значения Л не зависят от концентрации РвНБ На рисунках 9а, 96 и 10 представлены аппроксимации по уравнениям (9), (10) Эти уравнения получены в результате рассмотрения схемы 7 и описаны далее

л 1.0 6

1 0,8 X

S 0,6-^

I 0,4 1

g 0,2 о

Б 0,0-

время

0 20 40 60 80 100 120 протекания циклооксигеназной реакции, с

¡5 1,0-§

а 0,8-

I 0,6- к ©V

1 3 0,4- 1 \ 1 ■

§ ®

£ 0,2- ф

8 1 0,0- ь / <ъ

0 500 1000 1500 2000 время протекания циклооксигеназной реакции, с

Рис 9а Зависимость относительной пероксидазной активности {Ва„„) (квадраты, кружки) и относительной циклооксигеназной активности (А„„„) (треугольники, ромбы) PGHS от времени протекания циклооксигеназной реакции Квадраты -PGHS - 18 мкг/мл, АА (здесь и далее 150 мкМ), 02, перекись водорода (здесь и далее 1,5 мМ), TMPD (60 мкМ), кружки - PGHS - 9 мкг/мл, АА, 02, перекись водорода, ABTS (750 мкМ), треугольники - PGHS 45 мкг/мл, АА, 02, ромбы - PGHS (75 мкг/мл), АА, 02 Сплошные линии построены при аппроксимации экспериментальных данных (квадраты, кружки) согласно уравнению (9), пунктирные (треугольники, ромбы) — согласно уравнению (10)

Инкубация PGHS с арахидоновой кислотой (рис 9а), проводилась в отсутствие донора электронов На рис 96 показана инактивация обеих активностей в ходе циклооксигеназной реакции в присутствии донора электронов Значение А пероксидазной реакции PGHS, полученное по уравнению (7) равно 0,2 мин"1, а Л циклооксигеназной реакции - 2,9 мин"1 (рис. 96)

Рис 96 Зависимость относительной пероксидазной активности (й„„) (1) и относительной циклооксигеназной

активности {Aomi) (2) PGHS от времени протекания циклооксигеназной реакции в присутствии донора электронов ABTS 1 -PGHS - 9 мкг/мл, АА (150 мкМ), 02, ABTS (750 мкМ), перекись водорода (1,5 мМ), 2 -PGHS - 15 мкг/мл, АА (150 мкМ), ABTS (750 мкМ), 02 Сплошная линия построена при аппроксимации экспериментальных данных согласно уравнению (9), пунктирная -согласно уравнению (10)

Добавление донора электронов во время протекания циклооксигеназной реакции

(рис 96) приводит к уменьшению величины Л пероксидазной и циклооксигеназной

активностей PGHS, причем донор электронов предохраняет пероксидазную

активность от инактивации в существенно большей степени, чем циклооксигеназную

При полной инактивации циклооксигеназной активности сохраняется 70%

пероксидазной активности (рис 96) Можно сделать вывод о том, что инактивация

пероксидазной и циклооксигеназной активностей в условиях протекания

циклооксигеназной реакции идет по различным механизмам

Влияние времени инкубации фермента PGHS в условиях протекания

пероксидазной реакции на циклооксигеназную и пероксидазную активности.

Фермент инкубировали в присутствии субстратов пероксидазной реакции (перекись

водорода, донор электронов) После заданного времени протекания пероксидазной

реакции (время варьировали) с целью определения циклооксигеназной активности в

ту же реакционную смесь добавляли арахидоновую кислоту За происходящими

процессами следили с помощью спектрофотометрической и полярографической

методик Спекгрофотометрически наблюдали изменение концентрации окисленной

формы донора электронов, которое после добавления PGHS соответствует

пероксидазной реакции Полярографически наблюдали изменение концентрации

кислорода и определяли начальную скорость циклооксигеназной реакции На рис 10

представлена относительная циклооксигеназная активность, а также относительная

пероксидазная активность как функция времени протекания пероксидазной реакции

Рис 10 Зависимость относительной

циклооксигеназной активности (Вотн) очищенного (1, 2) и относительной пероксидазной активности (Аотн) солюбилизированного препарата PGHS (3, 4) от времени протекания пероксидазной реакции 1 - PGHS (5 мкг/мл), гемин (2 мкМ), ферроцианид калия (1,5 мМ), перекись водорода (здесь и далее 1,5 мМ), АА (150 мкМ), 2 - PGHS (5,3 мкг/мл), гемин (2 мкМ), TMPD (60 мкМ), перекись водорода, АА (150 мкМ), 3 - PGHS (216 мкг/мл), ферроцианид калия (1,5 мМ), перекись водорода, 4 - PGHS (18

-I-.---.---.-1-■-1 мкг/мл), TMPD (60 мкМ), перекись водорода

0 50 100 150 200 Сплошные линии построены при аппроксимации время протекания пероксидазной реакции, с экспериментальных данных согласно уравнению

(9), пунктирные — согласно уравнению (10)

Получены значения Л для двух доноров электронов При использовании в качестве донора электронов TMPD величина Л циклоокигеназной активности PGHS,

л 1,05

I 0,8

I 0,6

I 0,4

I 0.2-j

1 0,0-

полученная по уравнению (7), равна 1,1-1,4 мин'1, а А пероксидазной активности -3-3,9 мин"1 Для донора электронов ферроцианида калия величина А циклоокигеназной реакции РвШ, полученная по уравнению (7), равна 0,5-1 мин"1, а А пероксидазной реакции - 2-2,7 мин"1 (рис 10)

Инактивация циклооксигеназной активности в процессе протекания пероксидазной реакции идет медленнее, чем инактивация пероксидазной, причем при использовании ферроцианида калия значения А обеих активностей меньше, чем при использовании ТМРБ При полной инактивации пероксидазы сохраняется 30-40% циклооксигеной активности (рис 10) Можно сделать вывод о том, что инактивация пероксидазной и циклооксигеназной активностей в условиях протекания пероксидазной реакции идет по различным механизмам

Для проведения данного (рис 10) и ряда других экспериментов (рис 11) использовали очищенный препарат РвШ Свойства солюбилизированного и очищенного препарата одинаковы, за исключением наличия у солюбилизированного препарата каталазной активности, препятствующей измерению циклооксигеназной активности РОШ в присутствии перекиси водорода

Кинетическая модель инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РОНЗ в процессе протекания катализируемых им реакций. Так как в свободном состоянии РОИ® не подвергается инактивации, и процессы инактивации происходят во время протекания реакций, следовательно, они идут через промежуточные соединения - интермедиаты Как показывают рисунки 9а, 96 и 10, ход изменения относительных циклооксигеназной и пероксидазной активностей в ряде случаев существенно различается Следовательно, потеря циклооксигеназной и пероксидазной активностей - различные процессы

Если предположить, что в первом приближении процессы инактивации в ходе одной и той же инкубации протекают через одни и те же интермедиаты, то схема 2 трансформируется в схему 7 С помощью схемы 7 можно описать процессы потери пероксидазной и циклооксигеназной активностей в процессе протекания как циклооксигеназной, так и пероксидазной реакции Рассмотрим случай потери обеих активностей в процессе протекания циклооксигеназной реакции Циклооксигеназную активность обозначим как А, пероксидазную - как В

На схеме 7 изображен цикл, в котором

•о

схематически показано качественное

^ состояние свободной формы фермента и

других интермеди атов Интерм едиаты

Х0 X, обладают обеими

активностями (А и В) Цикл

(Х0 X, Х0) соответствует одному

Схема 7 Кинетическая модель инактивации каталитическому циклу реакции циклоохсигеназной и пероксидазной активностей

РОЖ в ходе реакции Предполагается, что инактивация фер-

мента происходит через интермедиат X, путем превращения его в каталитически неактивные интермедиаты Циклооксигеназная активность (А) фермента инактивируется путем превращения X, в X' с константой скорости Л, Инактивация пероксидазной активности (В) осуществляется путем превращения интермедиата Х1 с константой скорости -I,, с образованием интермедиата У, Потерявший пероксидазную активность интермедиат Г, сохраняет циклооксигеназную активность, то есть способность осуществлять цикл (К0 У, У0) Интермедиат У, теряет циклооксигеназную активность в результате превращения в лишенную обеих активностей промежуточную форму фермента X" с константой скорости А, Форма фермента х" обладает пероксидазной активностью (В) и теряет ее в результате превращения в X" с константой скорости А, Полагаем, что для интермедиатов X, и X' пероксидазная активность одинакова

Предполагаем, что все интермедиаты X и все интермедиаты У находятся в стационарном состоянии и в первом приближении обладают одинаковыми каталитическими свойствами (конставггы скоростей реакции для интермедиатов X равны соответствующим константам скорости реакции для интермедиатов К) Тогда соотношения [х,ух и [У, у У для подвергающихся инактивации интермедиатов равны друг другу и определяются концентрациями субстратов.

х У

В качестве количественных характеристик активностей удобно использовать относительные активности (4,™) и (АмЛ то есть экспериментально наблюдаемые величины, нормированные на их значения в нулевой момент времени Решив систему

дифференциальных уравнений, соответствующих схеме 7, можно выразить Ашя и В„ш следующим образом-

л ^ c-"(Wlt ] _Cg")

й , ОЛ; -Л .^г(Л^Л)' (9)

Так как потеря ферментативной активности в процессе катализа одноименной с этой активностью реакции - это одноэкспонентный процесс (см рис 9а, 96, 10, а также [Smith, Lands, 1972]), предполагаем, что X, = Л4 Это оправдано, так как А, и Д, описывают потерю циклооксигеназной активности формами фермента X, И Yt, обладающими одинаковыми каталитическими свойствами Тогда

(Ю)

Эти формулы получены в общем виде В уравнения (9), (10) входят всего три независимые константы, которые полностью описывают различные процессы (потеря активности в процессе протекания одноименной реакции и потеря активности в процессе протекания альтернативной реакции) Для оценки значений констант экспериментальные данные (рис 9а, 96, 10) аппроксимировали согласно этим формулам методом нелинейной регрессии Как видно из рисунков, экспериментальные данные хорошо описываются полученными уравнениями

Влияние времени прединкубации фермента PGHS с перекисью водорода и третбутилпероксидом на пероксидазную и циклооксигеназную активности. Инкубация PGHS с перекисью водорода приводит к прогрессивному уменьшению циклооксигеназной и пероксидазной активностей (концентрация перекиси водорода, используемая для проведения инкубации с ферментом и для осуществления пероксидазной реакции равна 1,5 мМ) (рис 11)

Циклооксигеназную активность детектировали как в отсутствие донора электронов (рис 11, квадраты), так и в присутствии донора электронов (рис 11, ромбы). Характер указанных зависимостей сходный

Оценка с помощью уравнения (7) значений А показывает, что константы скорости инактивации (А) циклооксигеназной активности при прединкубации с перекисью водорода (Л = 0,7-1,1 мин"1) меньше, чем пероксидазной (А = 4-6 мин"1)

На рисунке 11 представлены аппроксимации по уравнениям (11), (12) Эти уравнения получены в результате рассмотрения схемы 8 и описаны далее

g о

ш 0,8

■ 0,6

л 0,4

I °'2 | 0,0

Рис 11 Зависимость относительной

циклооксигеназной активности очищенного (1, 2) и относительной пероксидазной активности солюбилизированного препаратов PGHS (3, 4) (Сотн ) от времени прединкубации с перекисью водорода 1 - PGHS (6,7 мкг/мл), гемин (2 мкМ), перекись водорода (1,5 мМ), АА (150 мкМ), 2 -PGHS (4,7 мкг/мл), гемин (2 мкМ), перекись водорода (1,5 мМ), АА (150 мкМ) и ферроцианида калия (1 мМ), 3 - PGHS (9 мкг/мл), перекись водорода (1,5 мМ), TMPD (60 мкМ), 4 - PGHS (9 мкг/мл), перекись водорода (0,15 мМ), детекцию „ ' ' ' ' ' ' ' ' „ ' ' „J. ' пероксидазной активности осуществляли после 0 20 40 60 80 100 120 2

добавления в реакционную смесь перекиси

время прединкубации, с водорода (1,35 мМ) и TMPD (60 мкМ) Сплошные

линии построены при аппроксимации экспериментальных данных согласно уравнению (12), пунктирные - согласно уравнению (11)

Нами были проведены эксперименты по влиянию времени прединкубации PGHS с третбутилпероксидом В первом приближении третбутилпероксид инактивирует обе активности PGHS так же, как и перекись водорода.

Основываясь на результатах, представленных на рисунке 11, можно сделать вывод, что инактивация пероксидазной и циклооксигеназной активностей при прединкубации с перекисями идет по различным механизмам

Кинетическая модель инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей PGHS при прединкубации с перекисью водорода. При описании зависимости по влиянию перекиси водорода на циклооксигеназную активность (рис 11, квадраты, ромбы) с использованием уравнения (7) наблюдаются систематические отклонения (рис 12а) Кинетика изменения циклооксигеназной активности PGHS при прединкубации с перекисью водорода (рис 11) представляет собой характерную кривую с лаг-периодом, которую невозможно описать одной экспонентой Это свидетельствует о том, что механизм потери циклооксигеназной активности содержит, по меньшей мере, две последовательные стадии, последняя из которых приводит к инактивации Кинетика изменения пероксидазной активности PGHS при прединкубации с перекисью водорода в тех же условиях имеет двухфазный характер и представляет собой быструю (« 10 сек) потерю ~ 50% пероксидазной активности, вслед за которой можно наблюдать процесс медленной потери оставшейся пероксидазной активности PGHS (рис 11)

< 00 —,, у--- , ,

200 Рис 12 Разница между экспериментальными значениями относительной скорости

цикяооксигеназной реакции, полученной при прединкубации PGHS с перекисью водорода и теоретическими значениями, полученными в

0 0. t i | _ * • результате аппроксимации (Л) а - аппроксимация

~т щ 100 200 по уравнению (7), 6 — аппроксимация по

уравнению (11)

время прединкубации, с

Приведенные выше закономерности хорошо описываются следующей простейшей схемой (схема 8)

a—^b—^c—^d

Схема 8 Кинетическая модель инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей PGHS при прединкубации с перекисью водорода.

На схеме 8 отражены превращения, которые происходят с молекулой белка, где а, Ь, с, d — интермедиаты PGHS, которые образуются в результате воздействия перекиси водорода а - исходная форма фермента Превращение а в b с константой скорости первого порядка к„ отражает быстрый («10 сек) процесс потери 50% пероксидазной активности, превращение Ь в с с константой скорости к, отражает более медленный процесс потери оставшейся пероксидазной активности Интермедиаты Ъ и с в схеме 8 обладают 100%-й циклооксигеназной активностью Превращение ende константой скорости к2 отражает процесс потери циклооксигеназной активности

В результате анализа схемы 8 для t > 10 сек были получены уравнения для относительной циклооксигеназной активности (С™ , уравнение (11)) и относительной пероксидазной активности (С™, уравнение (12)), описывающие инактивацию циклооксигеназной и пероксидазной активностей PGHS при прединкубации с перекисью водорода (рис 11)

rco _k1e~k*-к^ , .

С1 =0,5^' (12)

Отклонения для аппроксимации зависимости по влиянию перекиси водорода на циклооксигеназную активность (рис 11, квадраты, ромбы) по уравнению (11) случайно распределены вокруг нулевого среднего значения (рис 12 б) Схема 8 с использованием двух параметров (к, и к2) хорошо описывает процессы потери как циклооксигеназной, так и пероксидазной активностей PGHS при прединкубации с перекисью водорода

ВЫВОДЫ.

1 Показано, что активный центр пероксидазной реакции бифункционального фермента PGHS не чувствителен к состоянию активного центра циклооксигеназной реакции, так как кинетические характеристики пероксидазной реакции не зависят от наличия в реакционной смеси арахидоновой кислоты и ингибитора циклооксигеназной реакции

2 Разработан подход для изучения инактивации фермента, заключающийся в исследовании кинетики изменения обеих активностей PGHS в ходе протекания как циклооксигеназной, так и пероксидазной реакций, получены очищенные препараты фермента Показано, что после полной инактивации циклооксигеназной активности сохраняется пероксидазная активность, после полной инактивации пероксидазной активности - циклооксигеназная Проведенные исследования инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей PGHS в различных условиях показали, что химические механизмы инактивации этих активностей различны

3 Показано, что при прединкубации фермента с перекисью водорода инактивация каждой активности PGHS протекает как минимум в две стадии При прединкубации PGHS с исследуемыми перекисями показано, что концентрация последних в широком диапазоне не влияет на константу скорости инактивации пероксидазной активности Для циклооксигеназной активности наблюдается зависимость константы скорости инактивации от концентрации перекиси, с которой проводили прединкубацию фермента Изучение инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей PGHS при прединкубации с перекисями показало, что инактивация этих активностей имеет разные химические механизмы Экспериментальные данные описаны с помощью кинетической модели

4 На основе обобщенной двумерной модели действия бифункционального фермента разработана кинетическая схема действия PGHS, которая, в отличие от

предложенных в литературе схем, предусматривает учет материального баланса по всем возможным интермедиатам бифункционального фермента в ходе одновременного катализа двух реакций Схема предусматривает независимое протекание двух ферментативных реакций на одной молекуле фермента, учитывая их взаимное влияние, и описывает полученные в настоящей работе и известные из литературы экспериментальные факты

5 На основании проанализированных моделей (обобщенной двумерной модели действия бифункционального фермента, модели многосубсгратной ферментативной реакции и ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивацией) разработана кинетическая модель инактивации обеих активностей бифункционального фермента в процессе катализируемых им реакций, которая описывает экспериментальные данные и может быть использована для описания инактивации других бифункциональных ферментов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Паплина Л А. Каратассо Ю О , Филимонов И С , Вржещ П В , Кинетический механизм действия бифункционального фермента простагландин-Н-синтазы Влияние доноров электронов на цикпооксигеназную реакцию // Биохимия 2006 Т 71 № 11 С 1534-1543

2 Паплина Л А. Вржещ П В, Потеря циклооксигеназной и пероксидазной активностей простагландин-Н-синтазы в процессе катализа // Биохимия 2007 Т 72 №6 С.774-784

3 Вржещ П.В , Паплина Л А. Сахарова И С , Кинетические модели процессов изменения циклооксигеназной и пероксидазной активностей простагландин-Н-синтазы в процессе катализа//Биохимия 2007 Т 72 №8 С 10181026

4 Филимонов И С , Паплина Л А . Вржещ П В , Обобщенная модель бифункциональных ферментов с учетом иерархии быстрых и медленных каталитических циклов, молекулярный кислород в кинетическом механизме

простагландин-Н-синтазы II Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел биологический 2007 Т 112 Вып 1 Прил 1 С 155-184

5. Цаплина JIА, Каратассо Ю О, Филимонов И С,

Ферментативный синтез простагландинов Кинетический механизм действия фермента простагландин-Н-синтазы // Тезисы докладов 11-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", секция Биология М МГУ 2004 С 168

6 Каратассо Ю О, Филимонов И С, Цаплина Л А, Кинетическая модель бифункционального многосубстратного фермента в стационарном приближении // Тезисы докладов 11-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", секция Физика М МГУ 2004 С 105

7 Цаплина Л А. Рязанцева Б Н, Вржещ П В , Ферментативный синтез простагландинов Оценка каталазной активности фермента простагландин-Н-синтазы // Тезисы докладов V международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика 2005» 2005 С 44

8 Цаплина Л А. Вржещ П В Влияние гемина, сульфата аммония и додецилсульфата натрия на кинетику инактивации в процессе реакции фермента простагландин-Н-синтазы // Тезисы докладов VI международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика 2006» 2006 С 269

9 Цаплина Л А. Каратассо Ю О, Вржещ П В , Кинетическая модель ингибирования фермента простагландин-Н-синтазы тетраметил-п-фенилендиамином Инактивация фермента в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций // Тезисы докладов I международной конференции «Математическая биология и биоинформатика» М МАКС Пресс 2006 С 18

Издательство ЦПИ при механико-математическом факультете МГУ им М В Ломоносова

Подписано в печать /г. о 9, о? Формат 60x90 1/16 Уел печ л /, Ь Тираж Iо экз Заказ

Отпечатано с оригинал-макета на типографском оборудовании механико-математического факультета

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Цаплина, Людмила Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Место РвШ в цепи синтеза простагландинов.

2. Структура РвНБ.

2.1 Доменная структура РвШ.

2.2 Структура циклооксигеназного и пероксидазного активных центров.

3. Каталитические свойства РвШ: циклооксигеназная и пероксидазная реакции.

4. Механизм циклооксигеназной реакции РвШ.

4.1 Циклооксигеназная реакция.

4.2 Роль торозил-радикала в осущесвлении циклооксигеназной реакции РвШ.

4.3 Связывание арахидоновой кислоты в циклооксигеназном активном центре.

4.4 Молекулярный кислород как субстрат циклооксигеназной реакции.

5. Механизм пероксидазной реакции РвНБ.

6. Кинетические особенности действия РвШ и схемы, предложенные для описания этих особенностей.

7. Влияние различных ингибиторов на циклооксигеназную активность фермента РвНБ.

7.1 Селективные ингибиторы по отношению к изоформам РвШ.

7.2 Механизмы действия ингибиторов РвШ.

7.3 Структурные различия циклооксигеназного активного центра РвНБ-! и 2, влияющие на механизмы их ингибирования.

7.4 Создание новых специфичных ингибиторов РОШ-2 путем биохимических преобразований КБАГОб.

7.5 Недостатки использования специфичных ингибиторов РОН8-2.

Сердечно-сосудистые заболевания.

8. Инактивация РвШ.

8.1 Инактивация РвШ в процессе реакции.

8.2 Кинетические механизмы, предлагаемые для описания инактивации РвШ.

9. Бифункциональные ферменты.

10. Многосубстратные ферментативные реакции.

11. Инактивация ферментативных реакций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1 Получение РвШ.

2.2 Очистка РвШ.

2.3 Определение белка.

2.4 Электрофорез в полиакриаламидном геле.

2.5 Определение активностей РвШ.

2.5.1 Определение циклооксигеназной активности.

2.5.2 Определение пероксидазной активности.

2.5.3 Определение суммарной активности РвШ.

2.5.4 Определение каталазной активности.

2.5.5 Определение циклооксигеназной активности РвШ при различных значениях рН.

2.5.6 Ингибирование циклооксигеназной активности напроксеном.

2.5.7 Обработка кинетических кривых.

2.6 Определение активностей РвШ в ходе протекания альтернативной реакции.

2.6.1 Циклооксигеназная активность фермента РОНБ, инкубированного в условиях протекания пероксидазной реакции.

2.6.2 Пероксидазная активность фермента РвНБ, инкубированного в условиях протекания циклооксигеназной реакции.

2.7 Определение активностей РОШ при прединкубации фермента с перекисью водорода.

2.7.1 Определение циклооксигеназной активности.

2.7.2 Определение пероксидазной активности.

2.8 Обработка экспериментальных данных по инактивации РвШ.

2.9 Определение циклооксигеназной активности РОНБ в присутствии экзогенно добавленных гемина, сульфата аммония и додецилсульфата натрия.

2.10 Квантово-химические расчеты.

3. Приготовление растворов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Теоретическое исследование кинетических закономерностей ферментативных реакций.

1. Разработка теоретических моделей.

1.1 Обобщенная модель неразветвленной ферментативной реакции, сопровождающейся инактивацией фермента в процессе реакции.

I.2. Кинетические закономерности взаимного влияния двух реакций, катализируемых бифункциональным ферментом.

II. Экспериментальное исследование кинетических закономерностей фермента РвШ.

2. Очистка РвНБ методом колоночной хроматографии.

3. Исследование взаимного влияния циклооксигеназной и пероксидазной реакций фермента РвШ.

3.1 Влияние доноров электронов, субстратов пероксидазной реакции, на циклооксигеназную реакцию РОНБ.

3.2 Влияние перекиси водорода, субстрата пероксидазной реакции, на циклооксигеназную реакцию РОНБ.

3.3 Влияние напроксена, ингибитора циклооксигеназной реакции РвШ, на циклооксигеназную и пероксидазную реакции.

3.4 Влияние арахидоновой кислоты, субстрата циклооксигеназной реакции РОНБ, на пероксидазную реакцию.

3.5 Влияние напроксена, ингибитора циклооксигеназной реакции РвШ, на суммарную реакцию.

4. Кинетическая модель действия РОНБ.

4.1 Требования к кинетической модели действия РвШ.

4.2 Предполагаемая схема действия РвНБ.

4.3 Вывод уравнения зависимости начальной скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты и донора электронов ТМРО.

4.4 Обсуждение результатов исследования взаимовлияния реакций РОШ.

5. Инактивация циклооксигеназной и пероксидазной реакций РвШ в процессе катализа.

5.1 Влияние времени инкубации фермента РОНБ в условиях протекания циклооксигеназной реакции в отсутствие донора электронов на пероксидазную и циклооксигеназную активности.

5.2 Влияние времени инкубации фермента РвШ в условиях протекания циклооксигеназной реакции в присутствии донора электронов на пероксидазную и циклооксигеназную активности.

5.3 Влияние времени инкубации фермента РвШ в условиях протекания пероксидазной реакции на циклооксигеназную и пероксидазную активности.

6. Кинетическая модель инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвНБ в процессе протекания катализируемых им реакций.

7. Прединкубация с перекисями.

7.1 Влияние времени прединкубации фермента РвШ с перекисью водорода и третбутилпероксида на пероксидазную и циклооксигеназную активности.

7.2 Влияние прединкубации фермента РвШ с различными концентрациями перекиси водорода на пероксидазную активность.

7.3 Влияние прединкубации фермента РвНБ с различными концентрациями перекиси водорода на циклооксигеназную активность.

7.4 Влияние прединкубации фермента РвШ с различными концентрациями третбутилпероксида на пероксидазную активность.

7.5 Влияние прединкубации фермента РвНБ с различными концентрациями третбутилпероксида на циклооксигеназную активность.

8. Кинетическая модель инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвШ при прединкубации с перекисью водорода.

9. Обсуждение результатов исследования инактивации РвШ. Возможные молекулярные механизмы инактивации.

9.1 Обсуждение результатов исследования инактивации РвНБ.

9.2 Возможный молекулярный механизм (химизм) инактивации циклооксигеназной реакции.

9.3 Возможный молекулярный механизм (химизм) инактивации пероксидазной реакции.

10. Зависимость кинетических характеристик циклооксигеназной активности РвШ от значения рН.

11. Влияние гемина, сульфата аммония и додецилсульфата натрия на кинетику инактивации фермента РвШ в процессе циклооксигеназной реакции.

11.1 Влияние гемина на кинетику инактивации фермента РСНБ в процессе циклооксигеназной реакции.

11.2 Влияние сульфата аммония на кинетику инактивации фермента РСНБ в процессе циклооксигеназной реакции.

11.3 Влияние додецилсульфата натрия на кинетику инактивации фермента РйШ в процессе циклооксигеназной реакции.

12. Квантово-химический расчет геометрии арахидоновой кислоты и простагландинов йг и Н2.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых простагландин-Н-синтазой"

Фермент простагландин-Н-синтаза (РОНБ, простагландин - эндопероксид синтаза, циклооксигеназа К.Ф.1.14.99.1) - катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2, который является исходным соединением в биосинтезе всех простагландинов, тромбоксана и простациклина в организме большинства млекопитающих, в том числе человека [1]. РвН8 имеет два активных центра, на которых протекает циклооксигеназная (окисление арахидоновой кислоты до простагландина вг [2]) и пероксидазная (восстановление перекисной группы простагландина до спиртовой [3]) реакции. В результате двух реакций образуется простагландин Н2 [4]), который далее под действием специфических ферментов - конвертаз, может превращаться в другие физиологически активные соединения, такие как простагландины Е2, 02, ¥2а, тромбоксан А2, простациклин [1,5-7]. Простагландины являются внутриклеточными сильнодействующими регуляторами, участвующими в формировании клеточного ответа на самые различные внешние воздействия, включая гормональные, механические, действие лекарственных препаратов и др. [8].

Открыт [9-11] и описан субъединичный состав фермента [12], расшифрован аминокислотный состав [13] и пространственная структура белковой молекулы [14], найдено большое число ингибиторов циклооксигеназной реакции РвН8 [7,15,16].

Фермент РвШ в растворе присутствует в виде димера, состоящего из двух одинаковых субъединиц с молекулярным весом 72 кДа [12]. Каждая субъединица РвНБ связывает молекулу гемина в качестве простетической группы и осуществляет циклооксигеназный и пероксидазный катализ в комплексе с ним [11,17]. Кинетические [18] и кристаллографические [14] исследования показали, что циклооксигеназный и пероксидазный активные центры в субъединице РвНБ пространственно разнесены и расположены по обе стороны от плоскости гемовой группы. У млекопитающих простагландин-Н-синтаза постоянно присутствует в клетках, обеспечивая их нормальное функционирование [19], эта изоформа получила название РОН8-1. Другая изоформа (РОН8-2) нарабатывается в ответ на определенные стимулы, такие как цитокины или факторы роста [20]. В настоящей работе исследовались свойства РОШ-1 из везикулярных желез (семенных пузырьков) барана.

Несмотря на то, что фермент РвНБ на протяжении многих лет является объектом интенсивного изучения, многие вопросы остаются не выясненными.

Между двумя активностями РвН8 существуют довольно сложные взаимоотношения: циклооксигеназная реакция не протекает в отсутствие перекисей, т.к. во время пероксидазной реакции происходит образование радикала тирозина 385, необходимого для осуществления циклооксигеназной реакции, пероксидазная реакция идет как в присутствии, так и в отсутствие арахидоновой кислоты, а также в присутствии ингибиторов циклооксигеназы. Обе реакции РвН8 сопровождаются быстрой и необратимой инактивацией фермента в процессе реакции [3].

До настоящего времени не существовало адекватной модели, описывающей кинетику РвШ. Бифункциональный характер РвН8 является причиной того, что все предложенные механизмы принципиально не подходят для описания работы этого фермента, так как предполагают использование уравнения материального баланса по сумме промежуточных форм фермента, участвующих в циклооксигеназной и пероксидазной реакциях. Такие механизмы характеризуются конкуренцией между реакциями, что противоречит экспериментальным данным. Адекватных моделей, описывающих инактивацию фермента, тоже нет. Систематически инактивация двух активностей РвШ не исследовалась, поэтому остается непонятной взаимосвязь инактивационных процессов в ходе обеих реакций. Этот круг вопросов и предстояло исследовать в данной диссертационной работе.

Цель исследования. Разработать методологические подходы для экспериментального исследования кинетических закономерностей катализа и инактивации фермента РвНБ. Разработать кинетическую модель действия фермента РОНБ, учитывающую его бифункциональный характер, предполагающую независимое, но взаимовлияющее протекание реакций на одной молекуле фермента. Разработать кинетические модели инактивации фермента РОНБ.

Задачи исследования:

1) Разработать экспериментальные подходы для исследования взаимовлияния реакций РвНБ, инактивации в процессе реакции и инактивации при прединкубации с перекисями циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвШ, а также получить очищенные препараты фермента.

2) Исследовать кинетические закономерности взаимодействия и взаимовлияния пероксидазной и циклооксигеназной реакций РОНБ.

4) Исследовать кинетику инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвНБ при прединкубации с перекисными субстратами пероксидазной реакции.

5) Разработать кинетические модели катализа и инактивации бифункционального фермента РвНБ, учитывающие все особенности его действия и состояние его двух активных центров, основываясь на моделях многосубстратной ферментативной реакции, ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивации и двумерной модели бифункционального фермента.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Место PGHS в цепи синтеза простагландинов.

Фермент PGHS является составной частью полиферментной системы, осуществляющей в организмах высших животных синтез простагландинов и родственных им соединений [1,5,6].

Первое упоминание о простагландинах появилось в 30-е годы 20 века, когда одновременно несколькими учеными был открыт этот новый тип биологических регуляторов [21-23]. Работы по изучению простагландинов значительно ускорились после выделения, очистки и установления структуры природных простагландинов [24] и открытия ферментативной системы, осуществляющей их синтез in vivo [25,26]. В 70-е годы стало очевидным, что PGHS играет ключевую роль в превращении арахидоновой кислоты в простагландин Н2, который является исходным соединением в биосинтезе всех простагландинов, тромбоксана и простациклина в организме млекопитающих. Установлено, что мишенью аспирина, в то время уже широко используемого, является фермент PGHS [7]. За открытие механизма действия аспирина в 1982 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине. С тех пор интерес к изучению простагландинов лишь усилился. Это связано с исключительно важной ролью, которую играют простагландины и родственные им соединения тромбоксаны и простациклины в развитии воспалительных процессов, повышения температуры, аллергических реакций [27,28], иммунного ответа [8,29-31], в свертывании крови [32,33], показано их участие в возниновении раковых опухолей [34,35] и болезни Альцгеймера [36]. Кроме того, они служат медиаторами боли [37,38], поэтому регуляция их синтеза - актуальная на сегодня задача медицины.

Простагландины и родственные им соединения тромбоксаны -представляют собой продукты окисления полиненасыщенных жирных кислот. Наиболее распространённой кислотой способной вступать в реакцию биосинтеза простагландинов, является цис-5,8,11,14-эйкозатетраеновая (арахидоновая, 20:4) кислота [39] (схема 1).

В зависимости от субстрата конечные продукты биосинтеза простагландинов и тромбоксанов обозначаются цифровыми индексами, которые соответствуют числу двойных связей в молекуле продукта. Соединения, образующиеся в результате ферментативного превращения арахидоновой кислоты, отмечаются индексом 2 (например РОЕ2, Р002) в отличие от производных цис-8,11,14-эйкозатриеновой (20:3) (индекс 1) и цис-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновой (20:5) (индекс 3) кислот. Буквенные обозначения (Н, Е, Б) соответствуют характеру заместителей в молекуле продуктов, который определяется специфичностью производящих их ферментативных систем [40]. РОШ может преобразовывать 20:3, 20:4, 20:5 в соответствующие простагландины с разной степенью эффективности (20:4>20:3»20:5) [41].

Схема биоспецифического окисления жирных кислот полиферментативной системой синтеза простагландинов на примере арахидоновой кислоты показана на схеме 1 [40]. Эта схема отражает тот факт, что синтез конечных продуктов окисления жирных кислот протекает в три этапа:

1) освобождение из фосфолипидов мембран под действием фермента фосфолипазы А2 субстрата (арахидоновой кислоты) [39];

2) синтез универсального предшественника простагландинов и тромбоксанов - простагландина Н2, протекающий под действием РвШ [39,40];

3) превращение РОН2 в конечные продукты, катализируемое органоспецифическими ферментами РОН-конвертазами [40].

Далее простагландин Н2 под действием специфических конвертаз может превращаться в физиологически активные соединения, такие как простагландины Е2, ¥2, тромбоксан А2, простациклин.

Таким образом, РвШ является центральным звеном цепи синтеза внутриклеточных регуляторов - простагландинов, обеспечивающим все последующие стадии универсальным «строительным материалом» -простагландином Н2

Фосфолипиды

Схема 1. Схема биоспецифического синтеза простагландинов и тромбоксанов.

2. Структура РСНБ.

Ферментативные системы, конвертирующие жирные кислоты в прстагландины, содержатся во всех обследованных органах и тканях [42], за исключением лейкоцитов [43]. Наиболее изученными представителями РОН-синтаз являются ферменты, выделенные из везикулярных желёз барана [9] и быка [44], так как эти источники наиболее богаты РвНБ, причём основные свойства этого фермента из желёз барана и быка одинаковы [9,19].

РвНБ - мембранно-связанный гликопротеин, активные центры которого находятся на поверхности эндоплазматической сети, граничащей с цитоплазмой. В раствор этот фермент переходит в присутствии неионного детергента (наиболее часто применяют твин-20) [9,11,17,44]. В 0,1% растворе твина-20 фермент связан с детергентом в соотношении 1:0,69 по массе [9].

Данные гель-хроматографии [9,11] и электрофореза в полиакриламидном геле [9-11] дают основания считать, что фермент РвШ в растворе присутствует в виде димера, состоящего из двух одинаковых субъединиц с молекулярным весом 72 кДа [12]. На основании изучения спектров абсорбции гемовой группы РвНБ было установлено, что каждая субъединица апофермента РвНБ связывает одну молекулу гемина [17] и осуществляет циклооксигеназный и пероксидазный катализ в комплексе с ним [11,17]. Связывание гемина строго необходимо для проявления каталитических активностей фермента [9,11,17,44] и, по-видимому, существенно изменяет конформацию белка, так как неустойчивый к обработке трипсином апофермент полностью сохраняется в присутствии гемина в концентрации, достаточной для образования холофермента [45]. Равновесная константа связывания РвНБ с гемином по данным работы [46] равна 0,6*108 М"1.

Кинетические [18] и кристаллографические [14] исследования показали, что циклооксигеназный и пероксидазный активные центры в субъединице РвНБ пространственно разнесены и расположены по обе стороны от плоскости гемовой группы [14]. У млекопитающих простагландин-Н-синтаза постоянно присутствует в клетках, обеспечивая их нормальное функционирование [19], эта изоформа получила название РОН8-1. Другая изоформа (РОН8-2) нарабатывается в ответ на определенные стимулы, такие как цитокины или факторы роста [20]. В настоящей работе исследовались свойства РОН8-1 из везикулярных желез (семенных пузырьков) барана.

Изоэлектрическая точка РОШ из везикулярных желез барана согласно данным изоэлектроэлектрического фокусирования равна 7.0±0,2 [9].

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Цаплина, Людмила Александровна

выводы.

1. Показано, что активный центр пероксидазной реакции бифункционального фермента РвШ не чувствителен к состоянию активного центра циклооксигеназной реакции, так как кинетические характеристики пероксидазной реакции не зависят от наличия в реакционной смеси арахидоновой кислоты и ингибитора циклооксигеназной реакции.

2. Разработан подход для изучения инактивации фермента, заключающийся в исследовании кинетики изменения обеих активностей РОШ в ходе протекания как циклооксигеназной, так и пероксидазной реакций; получены очищенные препараты фермента. Показано, что после полной инактивации циклооксигеназной активности сохраняется пероксидазная активность, после полной инактивации пероксидазной активности - циклооксигеназная. Проведенные исследования инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвШ в различных условиях показали, что химические механизмы инактивации этих активностей различны.

3. Показано, что при прединкубации фермента с перекисью водорода инактивация каждой активности РОШ протекает как минимум в две стадии. При прединкубации РОШ с исследуемыми перекисями показано, что концентрация последних в широком диапазоне не влияет на константу скорости инактивации пероксидазной активности. Для циклооксигеназной активности наблюдается зависимость константы скорости инактивации от концентрации перекиси, с которой проводили прединкубацию фермента. Изучение инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РОШ при прединкубации с перекисями показало, что инактивация этих активностей имеет разные химические механизмы. Экспериментальные данные описаны с помощью кинетической модели.

4. На основе обобщенной двумерной модели действия бифункционального фермента разработана кинетическая схема действия РвШ, которая, в отличие от предложенных в литературе схем, предусматривает учет материального баланса по всем возможным интермедиатам бифункционального фермента в ходе одновременного катализа двух реакций. Схема предусматривает независимое протекание двух ферментативных реакций на одной молекуле фермента, учитывая их взаимное влияние, и описывает полученные в настоящей работе и известные из литературы экспериментальные факты.

5. На основании проанализированных моделей (обобщенной двумерной модели действия бифункционального фермента, модели многосубстратной ферментативной реакции и ферментативной реакции, сопровождающейся необратимой инактивацией) разработана кинетическая модель инактивации обеих активностей бифункционального фермента в процессе катализируемых им реакций, которая описывает экспериментальные данные и может быть использована для описания инактивации других бифункциональных ферментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе с кинетической точки зрения изучено взаимовлияние реакций бифункционального фермента РвН8. Показано, что пероксидазная реакция протекает независимо от циклооксигеназной, так как кинетические характеристики пероксидазной реакции не зависят от наличия в реакционной смеси арахидоновой кислоты и ингибитора циклооксигеназной реакции. В отличие от пероксидазной реакции, протекание циклооксигеназной реакции нуждается в протекании пероксидазной, ее скорость зависит от того, в каком состоянии находится активный центр пероксидазной реакции. Восстановленные формы фермента наиболее каталитически активны по отношению к циклооксигеназной реакции. Предложена модель, по которой описаны все экспериментальные данные. Модель предполагает независимое протекание двух ферментативных реакций на одной молекуле фермента и учитывает их взаимное влияние, т.е. описывает зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты (субстрата циклооксигеназной реакции) и от донора электронов (субстрата пероксидазной реакции).

Найдены кинетические закономерности инактивации обеих активностей РОНБ. Проведенные исследования инактивации циклооксигеназной и пероксидазной активностей РвШ в различных условиях показали, что химические механизмы инактивации этих активностей различны. Для исследования инактивации использовали различные инактивирующие агенты. Предложены модели, описывающие полученные экспериментальные зависимости. Предложены возможные молекулярные механизмы, которые могут лежать в основе процессов инактивации.

В ходе работы обнаружено, что экзогенно добавленный гемин может как инактивировать, так и стабилизировать молекулу фермента в зависимости от используемой концентрации последнего. Это явление пока не нашло объяснения.

Полученные результаты говорят о целесообразности исследования химических изменений, происходящих с молекулой фермента в процессе реакций (в том числе феномена инактивации) с помощью методов масс-спектрометрии и молекулярной динамики.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Цаплина, Людмила Александровна, Москва

1. Samuelsson В., Goldyne М., Granstrom Е., Hamberg М., Hammarstrom S., Malmsten С. Prostaglandins and thromboxanes // Annu. Rev. Biochem. 1978. V. 47. P. 997-1029.

2. Hamberg M., Svensson J., Wakabayashi Т., Samuelsson B. Isolation and structure of two prostaglandin endoperoxides that cause platelet aggregation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1974. V. 71 (2). P. 345-349.

3. Hamberg M., Samuelsson B. Detection and isolation of an endoperoxide intermediate in prostaglandin biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1973. V. 70 (3). P. 899-903.

4. Helliwell R.J.A., Adams L.F., Mitchell M.D. Prostaglandin synthases: recent developments and a novel hypothesis // Prost. Leukot. and Essential Fatty Acids. 2004. V. 70 (2). P. 101-113.

5. Watanabe K., Yoshida R., Shimizu Т., Hayaishi O. Enzymatic formation of prostaglandin F2 alpha from prostaglandin H2 and D2. Purification and properties of prostaglandin F synthetase from bovine lung // J. Biol. Chem. 1985. V. 260(11). P. 7035-7041.

6. Vane J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs//Nature. 1971. V. 231. P. 232-235.

7. Hammarstrom S. Biosynthesis and biological actions of prostaglandins and thromboxanes //Arch Biochem Biophys. 1982. V. 214 (2). P. 431-445.

8. Van der Ouderaa F.J., Buytenhek M., Nugteren D.H., Van Dorp D.A. Purification and characterisation of prostaglandin endoperoxide synthetase from sheep vesicular glands // Biochim Biophys Acta. 1977. V. 487 (2). P. 315-331.

9. Roth G.J., Siok C.J., Ozols J. Structural characteristics of prostaglandin synthetase from sheep vesicular gland I I J Biol Chem. 1980. V. 255 (4). P. 1301-1304.

10. Van der Ouderaa F.J., Buytenhek M., Slikkerveer F.J., van Dorp D.A. On the haemoprotein character of prostaglandin endoperoxide synthetase // Biochim Biophys Acta. 1979. V. 572(1). P. 29-42.

11. Smith, W.L., Garavito, R.M., DeWitt, D.L. Prostaglandin endoperoxide H synthases (cyclooxygenases)-l and -2 // 1996. J. Biol. Chem. V. 271 (52). P. 33157-33160.

12. Yokoyama, C., Takai, T., Tanabe, T. Primary structure of sheep prostaglandin endoperoxide synthase deduced from cDNA sequence // FEBS Lett. 1988. V. 231 (2). P. 347-351.

13. H.Picot D., Loll P.J., Garavito R.M. The X-ray crystal structure of the membrane protein prostaglandin H2 synthase-1 // Nature. 1994. V. 367. P. 243-249.

14. Roth G.J., Machuga E.T., Strittmatter P. The heme-binding properties of prostaglandin synthetase from sheep vesicular gland // J. Biol. Chem. 1981. V. 256 (19). P.10018-10022.

15. Marshall P.J., Kulmacz R.J. Prostaglandin H synthase: distinct binding sites for cyclooxygenase and peroxidase substrates // Arch. Biochem. Biophys. 1988. V. 266. P. 162-170.

16. Yokoyama C., Tanabe T. Cloning of human gene encoding prostaglandin endoperoxide synthase and primary structure of the enzyme // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 165. P. 888-894.

17. Jones D.A., Carlton D.P., Mclntyre T.M., Zimmerman G.A., Prescott S.M. Molecular cloning of human prostaglandin endoperoxide synthase type II and demonstration of expression in response to cytokines // J. Biol. Chem. 1993. V. 268(12). P. 9049-9054.

18. Goldblatt M.W. A depressor substance in seminal fluid // J. Soc. Chem. Ind. 1933. V. 52. P. 1056-1057.

19. Von Euler U.S. On the specific vaso-dilating and plain muscle stimulating substances from accessory genital glands in man and certain animals (prostaglandin and vesiglandin) // J. Physiol. 1936. V. 88. P. 213-234.

20. Feigen L.P., Hyman A.L. Vascular influences of prostaglandins: introduction // Fed. Proc. 1981. V. 40 (7). P. 1985-1986.

21. Bergstrom S., Sjovall J. The isolation of prostaglandin E from sheep prostate glands//Acta. Chem. Scand. 1960. V. 14. P. 1693-1700.

22. Bergstrom S., Danielsson H., Samuelsson B. The enzymatic formation of prostaglandin E2 from arachidonic acid // Biochim. Biophys. Acta. 1964. V. 90(1). P. 207-210.

23. Van Dorp D.A., Beerthuis R.K., Nugteren D.H., Vonkeman H. The Biosynthesis of prostaglandins // Biochim. Biophys. Acta. 1964. 90 (1). P. 204-207.

24. Zhang Y., Shaffer A., Portanova J., Seibert K., Isakson P.C. Inhibition of cyclooxygenase-2 rapidly reverses inflammatory hyperalgesia and prostaglandin E2 production // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. V. 283 (3). P. 1069-1075.

25. Kuehl F.A.Jr., Humes J.L., Egan R.W., Ham E.A., Beveridge G.C., Van Arman C.G. Role of prostaglandin endoperoxide PGG2 in inflammatory processes //Nature. 1977. V. 265. P. 170-173.

26. Vane J.R. Prostaglandins as mediators of inflammation // Adv. Prostaglandin and Thromboxane Res. 1976. V. 2. P. 791-801.

27. Kuehl F.A.Jr., Egan R.W. Prostaglandins, arachidonic acid, and inflammation // Science. 1980. V. 210 (4473). P. 978-984.

28. Patrono C. Aspirin as an antiplatelet drug // N. Engl. J. Med. 1994. V. 330 (18). P. 1287-1294.

29. Watanabe K., Yoshida R., Shimizu T., Hayaishi O. Biosynthesis of prostaglandin F2 alpha from prostaglandins H2 and D2 by an apparently homogeneous enzyme // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 1985.V. 15. P. 151-153.

30. Wlodawer P., Hammarstrom S. Some properties of prostacyclin synthase from pig aorta // FEBS Lett. 1979. V. 97 (1). P. 32-36.

31. Ullrich V., Haurand M. Thromboxane synthase as a cytochrome P450 enzyme // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 1983. V. 11. P. 105-110.

32. Christ-Hazelhof E., Nugteren D.H. Purification and characterisation of prostaglandin endoperoxide D-isomerase, a cytoplasmic, glutathione-requiring enzyme //Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 572 (1). P. 43-51.

33. Bergstrom S., Danielsson H., Samuelsson B. The enzymic formation of prostaglandin E2 from arachidonic acid. Prostaglandins and related factors 32 // Biochim. Biophys. Acta. 1964. V. 90. P. 207-210.

34. Kuehl F.A.Jr., Egan R.W., Prostaglandins, arachidonic acid, and inflammation // Science. 1980. V. 210 (4473). P. 978-984.

35. Feigen L.P., Hyman A.L., Vascular influences of prostaglandins: introduction // Fed. Proc. 1981. V. 40 (7). P. 1985-1986.

36. Xie W.L., Chipman J.G., Robertson D.L., Erikson R.L., Simmons D.L. Expression of a mitogen-responsive gene encoding prostaglandin synthase is regulated by mRNA splicing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88 (7). P. 2692-2696.

37. Tomura T., Ogata H. Distribution of prostaglandins in the animal kingdom // Biochem. Biophys. Acta. 1976. V. 431 (2). P. 127-131.

38. Borgeat P., Samuelsson B. Arachidonic acid metabolism in polymorphonuclear leucocytes: unstable intermediates in formation of dihydroxy acids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73 (7). P. 32133217.

39. Miyamoto T., Ogino N., Yamamoto S., Hayaishi O. Purification of prostaglandin endoperoxide synthetase from bovine vesicular gland microsomes // J. Biol. Chem. 1976. V. 251 (9). P. 2629-2636.

40. Kulmacz R.J., Lands W.E. Protection of prostaglandin H synthase from trypsin upon binding of heme // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 104 (2). P. 758-764.

41. Veno R., Shimizu T., Kondo K., Hayaishi O. Activation mechanism of prostaglandin endoperoxide synthetase by hemoproteins // J. Biol. Chem. 1982. 257 (10). P. 5584-5588.

42. Fu J.Y., Masferrer J.L., Seibert K., Raz A., Needleman P. The induction and suppression of prostaglandin H2 synthase (cyclooxygenase) in human monocytes // J. Biol. Chem. 1990. V. 265 (28). P. 16737-16740.

43. Smith W.L., DeWitt D.L., Garavito R.M. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 145182.

44. Luong C., Miller A., Barnett J., Chow J., Ramesha C., Browner M.F. Flexibility of the NSAID binding site in the structure of human cyclooxygenase-2 //Nat. Struct. Biol. 1996. V. 3. P. 9277-9233.

45. Kulmacz R.J., Lands W.E. Protection of prostaglandin H synthase from trypsin upon binding of heme // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 104. P. 758-764.

46. Kulmacz R.J. Concerted loss of cyclooxygenase and peroxidase activities from prostaglandin H synthase upon proteolytic attack // Prostaglandins. 1989. V.38.P. 277-288.

47. Raz A., Needleman P. Differential modification of cyclo-oxygenase and peroxidase activities of prostaglandin endoperoxidase synthase by proteolytic digestion and hydroperoxides // Biochem. J. 1990. V. 269. P. 603-607.

48. Guo Q., Chang S., Diekman L., Xiao G., Kulmacz R.J. Comparison of prostaglandin H synthase isoform structures using limited proteolytic digestion // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 344. P. 150-158.

49. Guo Q., Kulmacz R.J. Distinct influences of carboxyl terminal segment structure on function in the two isoforms of prostaglandin H synthase // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 384. P. 269-279.

50. Kulmacz R.J., van der Donk W.A., Tsai A.L. Comparison of the properties of prostaglandin H synthase-1 and -2 // Prog. Lipid. Res. 2003.V. 42 (5). 377-404.

51. Toh H. Prostaglandin endoperoxide synthase contains an EGF-like domain // FEBS Lett. 1989. V. 258. P. 317-319.

52. Smith T., Leipprandt J., DeWitt D. Purification and characterization of the human recombinant histidine-tagged prostaglandin endoperoxide H synthases-1 and -2 // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 375. P. 195-200.

53. Shaftel S.S., Olschowka J.A., Hurley S.D., Moore A.H., O'Banion M.K. COX-3: a splice variant of cyclooxygenase-1 in mouse neural tissue and cells // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 2003 V. 119. P. 213-215.

54. Malkowski M.G., Ginell S.L., Smith W.L., Garavito R.M. The productive conformation of arachidonic acid bound to prostaglandin synthase // Science. 2000. V. 289 (5486). P. 1933-1937.

55. Struijk C.B., Beerthuis R.K., Van Dorp D.A. Specificity in the enzymayic conversion of polyunsaturated fatty acids into prostaglandins. Nobel

56. Symposium 2 // Prostaglandins. Stokholm. Almqwist & Wiksell. 1967. P. 51-56.

57. Van Dorp D.A. Recent development in the biosynthesis and analyses of prostaglandins//Ann.N.Y. Acad. Sci. 1971. V. 180 (1). P. 181-195.

58. Samuelsson B. On the incorporationn of oxygen in the conversion of 8,11,14-eicosatrienoic acid to prostaglandin Ei // J. Amer. Chem. Soc. 1965. V. 87(13). P. 3011-3013.

59. Nugteren D.H., van Dorp D.A. The participation of molecular oxygen in the biosynthesis of prostaglandins // Biochim. Biophys. Acta. 1965. V. 98 (3). P. 654-656.

60. Hemler M.E., Crawford C.G., Lands W.E. Lipoxygenation activity of purified prostaglandin-forming cyclooxygenase // Biochemistry. 1978. V. 17 (9). P. 1772-1779.

61. Hemler M.E., Graff G., Lands W.E. Accelerative autoactivation of prostaglandin biosynthesis by PGG2 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. V. 85(4). P. 1325-1331.

62. Hemler M.E., Lands W.E. Evidence for a peroxide-initiated free radical mechanism of prostaglandin biosynthesis // J. Biol. Chem. 1980. V. 255 (13). P. 6253-6261.

63. Egan, R.W., Gale P.H., Baptista E.M., Kennicott K.L., VandenHeuvel W.J., Walker R.W., Fagerness P.E., Kuehl F.A.Jr. Oxidation reactions by prostaglandin cyclooxygenase-hydroperoxidase // J. Biol. Chem. 1981. V. 256 (14). P. 7352-7361.

64. Egan R.W., Gale P.H., Kuehl F.A. Jr. Reduction of hydroperoxides in the prostaglandin biosynthetic pathway by a microsomal peroxidase // J. Biol. Chem. 1979. V. 254 (9). P. 3295-3302.

65. Marnett L.J., Bienkowski M.J. Hydroperoxide-dependent oxygenation of trans-7,8-dihydroxy-7,8-dihydro benzoa.pyrene by ram seminal vesicle microsomes. Source of the oxygen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V. 96 (2). P. 639-647.

66. Marnett L.J., Bienkowski M.J., Pagels W.R. Oxygen 18 investigation of the prostaglandin synthetase-dependent co-oxidation of diphenylisobenzofuran //J. Biol. Chem. 1979. V. 254 (12). P. 5077-5082.

67. Marshall P.J., Kulmacz R.J., Lands W.E. Constraints on prostaglandin biosynthesis in tissues // J. Biol. Chem. 1987. V. 262 (8). P. 3510-3517.

68. Samuelsson B. Biosynthesis of prostaglandins // Fed. Proc. 1972. V. 31 (5). 1442-1450.

69. Hamberg M., Samuelsson B. On the mechanism of the biosynthesis of prostaglandins E-l and F-l-alpha // J. Biol. Chem. 1967. V. 242 (22). P. 5336-5343.

70. Marnett L.J. Cyclooxygenase mechanisms // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000 V. 4. P. 545-552.

71. Mason R.P., Kalyanaraman B., Tainer B.E., Eling T.E. A carbon-centered free radical intermediate in the prostaglandin synthetase oxidation of arachidonic acid. Spin trapping and oxygen uptake studies // J. Biol. Chem. 1980. V. 255 (11). P. 5019-5022.

72. Hamberg M., Samuelsson B. Oxygenation of unsaturated fatty acids by the vesicular gland of sheep // J Biol Chem. 1967. V. 242 (22). P. 5344-5354.

73. Egan R.W., Paxton J., Kuehl F.A.Jr. Mechanism for irreversible self-deactivation of prostaglandin synthetase // J. Biol. Chem. 1976. V. 251 (23). P. 7329-7335.

74. Kalyanaraman B., Mason R.P., Tainer B., Eling T.E. The free radical formed during the hydroperoxide-mediated deactivation of ram seminal vesicles is hemoprotein-derived //J. Biol. Chem. 1982. V. 257 (9). P. 4764-4768.

75. Karthein R., Dietz R., Nastainczyk W., Ruf H.H. Higher oxidation states of prostaglandin H synthase. EPR study of a transient tyrosyl radical in the enzyme during the peroxidase reaction // Eur. J. Biochem. 1988. V. 171 (12). P. 313-320.

76. Shimokawa T., Kulmacz R.J., DeWitt D.L., Smith W.L. Tyrosine 385 of prostaglandin endoperoxide synthase is required for cyclooxygenase catalysis // J. Biol. Chem. 1990. V. 265 (33). P. 20073-20076.

77. Tsai A.L., Hsi L.C., Kulmacz R.J., Palmer G., Smith W.L. Characterization of the tyrosyl radicals in ovine prostaglandin H synthase-1 by isotope replacement and site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1994. V. 269 (7). P. 5085-5091.

78. Smith W. L., Eling T.E., Kulmacz R.J., Marnett L.J., Tsai A. Tyrosyl radicals and their role in hydroperoxide-dependent activation and inactivation of prostaglandin endoperoxide synthase // Biochemistry. 1992. V.31(l). P. 3-7.

79. Malkowski M.G., Theisen M.J., Scharmen A., Garavito R.M. The formation of stable fatty acid substrate complexes in prostaglandin H(2) synthase-1 // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 380 (1). P. 39-45.

80. Lands W.E.M., Sauter J., Stone G.W. Oxygen requirement for prostaglandin biosynthesis // Biochem. Prostaglandins and Medicine. 1978. V. 1 (2). P. 117-120.

81. Juranek I., Suzuki H., Yamamoto S. Affinities of various mammalian arachidonate lipoxygenases and cyclooxygenases for molecular oxygen as substrate // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1436 (3). P. 509-518.

82. Longu S., Medda R., Padiglia A., Pedersen J.Z., Floris G. The reaction mechanism of plant peroxidases // Ital. J. Biochem. 2004. V. 53(1). P. 41-45.

83. Hsuanyu Y., Dunford H.B. Prostaglandin H synthase kinetics. The effect of substituted phenols on cyclooxygenase activity and the substituent effect on phenolic peroxidatic activity // J. Biol. Chem. 1992. V. 267 (25). P. 1764917657.

84. Bakovic M, Dunford H.B. Reactions of prostaglandin endoperoxide synthase and its compound I with hydroperoxides // J. Biol. Chem. 1996. V. 271 (4). P. 2048-2056.

85. Koshkin V., Dunford B.H. Coupling of the peroxidase and cyclooxygenase reactions of prostaglandin H synthase // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1430 (2). P. 341-348.

86. Egan R.W., Gale P.H., Beveridge G.C., Marnett L.J., Kuehl F.A.Jr. Direct and indirect involvement of radical scavengers during prostaglandin biosynthesis // Adv. Prostaglandin Thromboxane Res. 1980. V. 6. P. 153155.

87. Robak J., Wieckowski A., Gryglewski R. The effect of 4-acetamidophenol on prostaglandin synthetase activity in bovine and ram seminal vesicle microsomes // Biochem. Pharmacol. 1978. V. 27. P. 393396.

88. Wei С., Kulmacz R.J., Tsai A.L. Comparison of branched-chain and tightly coupled reaction mechanisms for prostaglandin H synthase // Biochemistry. 1995. V. 34 (26). P. 8499-8512.

89. Tien J.H., Hazelton W.D., Sparks R., Ulrich C.M. A Michaelis-Menten-style model for the autocatalytic enzyme prostaglandin H synthase // Bull. Math. Biol. 2005. V. 67 (4). P. 683-700.

90. Hazelton W.D., Tien J.H., Donato V.W., Sparks R., Ulrich C.M. Prostaglandin H synthases: members of a class of quasi-linear threshold switches // Biochem. Pharmacol. 2004. V. 68 (3). P. 423-432.

91. McCarthy D. Nonsteroidal anti-inflammatory drug-related gastrointestinal toxicity: definitions and epidemiology // Am. J. Med. 1998. V. 105(5A). P.3S-9S.

92. Laine L. Nonsteroidal anti-inflammatory drug gastropathy // Gastrointest Endosc. Clin. N. Am. 1996. V. 6 (3). P. 489-504.

93. Mitchell J.A., Akarasereenont P., Thiemermann C., Flower R.J., Vane J.R. Selectivity of nonsteroidal antiinflammatory drugs as inhibitors of constitutive and inducible cyclooxygenase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90 (24). P. 11693-11697.

94. Варфоломеев С.Д. Простагландины новый тип биологических регуляторов // Соросовский образовательный журнал. 1996. Т. 1. С. 4047.

95. Humes J.L., Winter C.A., Sadowski S.J., Kuehl. F.A. Jr. Multiple sites on prostaglandin cyclooxygenase are determinants in the action of nonsteroidal antiinflammatory agents // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78 (4). P. 2053-2056.

96. Appleton R.A., Brown K. Conformational requirements at the prostaglandin cyclooxygenase receptor site: a template for designing nonsteroidal anti-inflammatory drugs // Prostaglandins. 1979. V. 18 (1). P. 2934.

97. Guo Q., Wang L.H., Ruan K.H., Kulmacz R.J. Role of Val509 in time-dependent inhibition of human prostaglandin H synthase-2 cyclooxygenase activity by isoform-selective agents // J. Biol. Chem. 1996. V. 271 (32). P. 19134-19139.

98. Marnett L.J., Rowlinson S.W., Goodwin D.C., Kalgutkar A.S., Lanzo C.A. Arachidonic acid oxygenation by COX-1 and COX-2. Mechanisms of catalysis and inhibition//J. Biol. Chem. 1999. V. 274 (33). P. 22903-22906.

99. Roth G.J., Stanford N., Majerus P.W. Acetylation of prostaglandin synthase by aspirin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72 (8). P. 30733076.

100. Kalgutkar A.S., Crews B.C., Rowlinson S.W., Garner C., Seibert K., Marnett L.J. Aspirin-like molecules that covalently inactivate cyclooxygenase-2 // Science. 1998. V. 280 (5367). P. 1268-1270.

101. Kalgutkar A.S., Kozak K.R., Crews B.C., Hochgesang G.P.Jr., Marnett L.J. Covalent modification of cyclooxygenase-2 (COX-2) by 2-acetoxyphenyl alkyl sulfides, a new class of selective COX-2 inactivators // J. Med. Chem. 1998. V. 41 (24). P. 4800-4818.

102. Bayly C.I., Black W.C., Leger S., Ouimet N., Ouellet M., Percival M.D. Structure-based design of COX-2 selectivity into flurbiprofen // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V. 9 (3). P. 307-312.

103. Psaty B.M., Furberg C.D. COX-2 inhibitors-lessons in drug safety // N. Engl. J. Med. 2005. V. 352 (11). P. 1133-1135.

104. Nussmeier N.A., Whelton A.A., Brown M.T., Langford R.M., Hoeft A., Parlow J.L., Boyce S.W., Verburg K.M. Complications of the COX-2 inhibitors parecoxib and valdecoxib after cardiac surgery // N. Engl. J. Med. 2005. V. 352 (11). P. 1081-1091.

105. Becker R.C. COX-2 inhibitors // Tex. Heart. Inst. J. 2005. V. 32 (3). P. 380-383.

106. Smith W.L., Lands W.E.M. Oxygenation of polyunsaturated fatty acids during prostaglandin biosynthesis by sheep vesicular gland // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 3276-3285.

107. Smith F.L., Carpenter M.P. Studies of the mechanism of inactivation of prostaglandin endoperoxide synthetase // Fed. Proceedings. 1982. V. 41 (4). P. 1443-1450.

108. Kulmacz R.J., Pendleton R.B., Lands W.E.M. Interaction between peroxidase and cyclooxygenase activities in prostaglandin-endoperoxide synthase. Interpretation of reaction kinetics // J. Biol. Chem. 1994. V. 269 (8). P. 5527-5536.

109. Kulmacz R.J. Prostaglandin H synthase and hydroperoxides: peroxidase reaction and inactivation kinetics // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 249 (2). P. 273-285.

110. Song I., Ball T.M., Smith W.L. Different suicide inactivation processes for the peroxidase and cyclooxygenase activities of prostaglandin endoperoxide H synthase-1 // Biochem. Biophys. Res. Communs. 2001. V. 289 (4). P. 869-875.

111. Wu G., Wei C., Kulmacz R.J., Osawa Y., Tsai A.L. A mechanistic study of self-inactivation of the peroxidase activity in prostaglandin H synthase-1 //J. Biol. Chem. 1999. V. 274 (14). P. 9231-9237.

112. Tsai A.L., Palmer G., Kulmacz R.J. Prostaglandin H synthase. Kinetics of tyrosyl radical formation and of cyclooxygenase catalysis // J. Biol. Chem. 1992. V. 267 (25). P. 17753-17759.

113. Lu G., Tsai A.L., Van Wart H.E., Kulmacz R.J. Comparison of the peroxidase reaction kinetics of prostaglandin H synthase-1 and -2 // 1999. J. Biol. Chem. V. 274 (23). P. 16162-16167.

114. Bambai B., Rogge C.E., Stec B., Kulmacz RJ. Role of Asn-382 and Thr-383 in activation and inactivation of human prostaglandin H synthase cyclooxygenase catalysis // J. Biol. Chem. 2004. V. 279 (6). P. 4084-4092.

115. Wu G., Kulmacz R.J., Tsai A.L. Cyclooxygenase inactivation kinetics during reaction of prostaglandin H synthase-1 with peroxide // Biochemistry. 2003. V. 42 (46). P. 13772-13777.

116. Yourno J., Kohno T., Roth J.R. Enzyme evolution: generation of a Afunctional enzyme by fusion of adjacent genes // Nature. 1970. V. 228 (5274). P. 820-824.

117. Smith S. The animal fatty acid synthase: one gene, one polypeptide, seven enzymes // FASEB J. 1994. V. 8 (15). P. 1248-1259.

118. Liang P.H., Anderson K.S. Substrate channeling and domain-domain interactions in bifunctional thymidylate synthase-dihydrofolate reductase // Biochemistry. 1998. V. 37 (35). P. 12195-12205.

119. Huang X., Holden H.M., Raushel F.M. Channeling of substrates and intermediates in enzyme-catalyzed reactions // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 149-180.

120. Meek T.D., Garvey E.P., Santi D.V. Purification and characterization of the bifunctional thymidylate synthetase-dihydrofolate reductase from methotrexate-resistant Leishmania tropica // Biochemistry. 1985. V. 24 (3). P. 678-686.

121. Miles E.W., Rhee S., Davies D.R. The molecular basis of substrate channeling//J. Biol. Chem. 1999. V. 274 (18). P. 12193-12196.

122. Trujillo M., Donald R. G.K., Roos D.S., Greene P.J., Santi D.V. Heterologous expression and characterization of the bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase enzyme of Toxoplasma gondii //Biochemistry. 1996. V. 35 (20). P. 6366-6374.

123. Schneider T.R., Gerhardt E, Lee M, Liang P.H., Anderson K.S., Schlichting I. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase // Biochemistry. 1998. V. 37 (16). P. 5394-5406.

124. Leys D., Basran J., Scrutton N.S. Channelling and formation of'active' formaldehyde in dimethylglycine oxidase // EMBO J. 2003. V. 22 (16). P. 4038-4048.

125. Miles B.W., Banzon J.A., Raushel F.M. Regulatory control of the amidotransferase domain of carbamoyl phosphate synthetase // Biochemistry. 1998. V. 37 (47). P. 16773-16779.

126. Eling T.E., Glasgow W.C., Curtis J.F., Hubbard W.C., Handler J.A. Studies on the reduction of endogenously generated prostaglandin G2 by prostaglandin H synthase // J. Biol. Chem. 1991. V. 266 (19). P. 1234812355.

127. Easterby J.S. A generalized theory of the transition time for sequential enzyme reactions//Biochem. J. 1981. V. 199 (1). P. 155-161.

128. Easterby J.S. The kinetics of consecutive enzyme reactions. The design of coupled assays and the temporal response of pathways // Biochem. J. 1984. V. 219(3). P. 843-847.

129. Liang P.H., Anderson K.S. Kinetic reaction scheme for the dihydrofolate reductase domain of the bifunctional thymidylate synthase-dihydrofolate reductase from Leishmania major // Biochemistry. 1998. V. 37 (35). P. 12206-12212.

130. Вржещ П.В. Кинетическая модель бифункционального многосубстратного фермента. Стационарное приближение // Биохимия. 1999. Т. 64 (4). С. 502-512.

131. Alberty R.A. The relationship between Michaelis constants, maximum velocities and the equilibrium constants for an enzyme-catalysed reaction // J. Amer. Chem. Soc. 1953. V. 75 (8). P. 1928-1932.

132. Theorell H., Chance B. Studies of liver alcohol dehydrogenase. II. The kinetics of the compound of horse liver alcohol dehydrogenase and reduced diphosphopyridine nucleotide // Acta. Chem. Scand. 1951. V. 5 (7-8). P. 1127-1144.

133. Dalziel K. Initial steady state velocities in the evaluation of the enzyme-coenzyme-substrate reaction mechanism // Acta. Chem. Scand. 1957. V. 11 (10). P. 1706-1723.

134. Cleland W.W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. I. Nomenclature and rate equations // Biochim. Biophys. Acta. 1963. V. 67. P. 104-137.

135. Cleland W.W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. II. Inhibition: nomenclature and theory // Biochim. Biophys. Acta. 1963. V. 67. P. 173-187.

136. King E.L., Altman C. A schematic method of deriving the rate laws for enzyme-catalyzed reactions//J. Phys. Chem. 1956. V. 60. P. 1375-1378.

137. Ferdinand W. The interpretation of non-hyperbolic rate curves for two-substrate enzymes. A possible mechanism for phosphofructokinase // Biochem. J. 1966. V. 98 (1). P. 278-283.

138. Sweeny J.R., Fisher J.R. An alternative to allosterism and cooperativity in the interpretation of enzyme kinetic data // Biochemistry. 1968. V. 7 (2). P. 561-565.

139. Monod J., Wyman J., Changeux J.-P. On the nature of allosteric transitions: a plausible model //J. Mol. Biol. 1965. V. 12. P. 88-118.

140. Koshland D.E.Jr., Nemethy G., Filmer D. Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits // Biochemistry. 1966. V. 5 (1). P. 365-385.

141. Peller L., Alberty R.A. Multiple intermediates in steady state enzyme kinetics. I. The mechanism involving a single substrate and product // J. Amer. Chem. Soc. 1959. V. 81. P. 5907-5914.

142. Volkenstein M.V., Goldstein B.N. A new method for solving the problems of the stationary kinetics of enzymological reactions // Biochim. Biophys. Acta. 1966. V. 115 (2). P. 471-477.

143. Volkenstein M.V., Goldstein B.N. Allosteric enzyme models and their analysis by the theory of graphs // Biochim. Biophys. Acta. 1966. V. 1152.. P. 478-485.

144. Cha S. A simple method for derivation of rate equations for enzyme-catalyzed reactions under the rapid equilibrium assumption or combined assumptions of equilibrium and steady state // J. Biol. Chem. 1968. V. 243 (4). P. 820-825.

145. Roy, A.B. Kinetic properties of arylsulphatase A~theoretical treatment // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 276 (2). P. 488-490.

146. Walsh C., Cromartie T., Marcotte P. Suicide substrates for flavoprotein enzymes // Method Enzymol. 1978. V. 53. P. 437-448.

147. Waley. S.G. Kinetics of suicide substrates // Biochem. J. 1980. V. 1853.. P. 771-773.

148. Tatsunami S., Yago N., Hosoe M. Kinetics of suicide substrates. Steady-state treatments and computer-aided exact solutions // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 662 (2). P. 226-235.

149. Duggleby R.G. Progress curves of reactions catalyzed by unstable enzymes. A theoretical approach//Theor. Biol. 1986. V. 123 (1). P. 67-80.

150. Garrido-del Solo C., Garcia-Canovas F., Havsteen B.N., Varon-Castellanos R. Kinetic analysis of a Michaelis-Menten mechanism in which the enzyme is unstable // Biochem. J. 1993. V. 294 (2). P. 459-464.

151. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193 (1). P. 265-272.

152. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

153. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227 (5259). P. 680-685.

154. Merril C.R. Gel-staining techniques // Meth Enzymol. 1990. V. 182. P. 477-488.

155. Reisner A.H., Nemes P., Bucholtz C. The use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1975. V. 64 (2). P. 509-516.

156. Франк Г.М., Кондрашова M.H., Мохова E.H., Ротенберг Ю.С. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом // Наука. Москва. 1973.

157. Kulmacz R.J., Ren Y., Tsai A.L., Palmer G. Prostaglandin H synthase: spectroscopic studies of the interaction with hydroperoxides and with indomethacin // Biochemistry. 1990. V. 29 (37). P. 8760-8771.

158. Кузнецова Ю.А., Ромах В.Б., Строкин М.Л., Мевх А.Т. Чувствительный метод определения активности простагландин-Н-синтазы // Вестн. моек, ун.-та. 1998. Т. 39 (5). С. 302-304.

159. Вржещ П.В. Интегральная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Критерии кинетического поведения и характеристические координаты для решения прямой и обратной задач // Биохимия. 1996. Т. 61. С. 2069-2083.

160. Falk J.E. (1964) in: Porphyrins and metalloporphyrins, Elsevier Amsterdam. N.Y.-L. V. 2. P. 181-241.

161. Kulmacz R.J. Prostaglandin G2 levels during reaction of prostaglandin H synthase with arachidonic acid // Prostaglandins. 1987. V. 34 (2). P. 225240.

162. Варфоломеев С.Д., Мевх А.Т. Простагландины молекулярные биорегуляторы. МГУ. Москва. 1985.

163. Roth G.J., Siok C.J. Acetylation of the NH2-terminal serine of prostaglandin synthetase by aspirin // J. Biol. Chem. 1978. V. 253 (11). P. 3782-3784.

164. Selinsky B.S., Gupta К., Sharkey С.Т., Loll P.J. Structural analysis of NSAID binding by prostaglandin H2 synthase: time-dependent and time-independent inhibitors elicit identical enzyme conformations // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 5172-5180.

165. Strout D.L., Scuseria G.E. A quantitative study of the scaling properties of the Hartree-Fock method // J. Chem. Phys. 1995. V. 102. P. 8448-8452.

166. McCammon J.A. Protein dynamics // Rep. Progr. Phys. 1984. V. 47. P. 1-46.

Информация о работе

Цаплина, Людмила Александровна
кандидата химических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых простагландин-Н-синтазой - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы