Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетические аспекты переноса электронов в системе "субстрат - биокатализатор - медиатор - электрод" в биотопливном элементе на основе Gluconobacter oxydans

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Кинетические аспекты переноса электронов в системе "субстрат - биокатализатор - медиатор - электрод" в биотопливном элементе на основе Gluconobacter oxydans"

На правах рукописи

НГУЕН ВИНЬ ТИЕН

КИНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В СИСТЕМЕ «СУБСТРАТ - БИОКАТАЛИЗАТОР - МЕДИАТОР -ЭЛЕКТРОД» В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ НА ОСНОВЕ и СОN03А СТЕК ОХУОАЖ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

3 ОКТ 2013

Москва-2013

005533848

Работа выполнена кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент,

декан естественно-научного факультета Тульского государственного университета, заведующий кафедрой химии Алферов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

декан факультета химико-

фармацевтических технологий и биомедицинских препаратов Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева, профессор кафедры химии и технологий биомедицинских препаратов Офицеров Евгений Николаевич

кандидат химических наук, старший преподаватель кафедры биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного

университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова. Еремин Сергей Владимирович

Ведущая организация: Мордовский государственный университет

им. Н.П. Огарева

Защита состоится «21» октября 2013 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (МИТХТ им М.В. Ломоносова) по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

Автореферат разослан сентября 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

А.И.Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

В последнее время темп использования ископаемых топлив, особенно нефти и газа, ускоряется, что влечет за собой угрозу энергетического кризиса и глобального загрязнения окружающей среды. Возобновляемые формы энергии являются одним из путей решения этих проблем, значительные усилия направляются на исследование альтернативных источников электроэнергии. В последние годы интенсивно исследуются биотехнологические аспекты генерирования энергии, в том числе технологии биотопливных элементов (БТЭ) как способ генерации электричества или водорода из возобновляемых источников без эмиссии углекислого газа в экосистему. БТЭ также могут быть использованы для очистки сточных вод за счет способности применяемых биокатализаторов окислять широкий спектр органических веществ. В качестве биокатализаторов для окисления субстратов могут выступать ферменты или микроорганизмы. Использование последних более предпочтительно, т.к. не требуются сложные и дорогостоящие процессы выделения, очистки и хранения ферментов. Одними из перспективных микроорганизмов, на основе которых возможно создание БТЭ, являются уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans. Эти микроорганизмы обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся мембранной локализацией основных ферментов - дегидрогеназ, что делает возможным перенос электронов из активных центров фермента на внешнее пространство. В связи с этим мембранная фракция, относительно просто выделенная из бактериальных клеток, также может явиться перспективным биокатализатором в БТЭ. Для облегчения процесса передачи электронов от мсмбранно-локализованных ферментов бактерий на анод БТЭ применяются медиаторы электронного транспорта — низкомолекулярные соединения, которые могут проникать через внешнюю мембрану бактерий, получать электроны у мембранно-локализованных ферментов и окисляться на аноде. В качестве медиаторов электронного транспорта для Gluconobacter oxydans в БТЭ использовались различные органические и неорганические соединения, среди них 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) оказался наиболее подходящим. При разработке проточных систем БТЭ важной проблемой является потеря биокатализатора, одним из возможных решений является применение иммобилизованных микроорганизмов. Сополимер поливинилового спирта (ПВС) и N-винилпирролидона представляется перспективной матрицей для иммобилизации бактериальных клеток за счет способности удерживать клетки, нетоксичности для них, механической и химической устойчивости. Анализ литературы показывает, что большинство исследований по БТЭ до сих пор посвящено в основном прикладным аспектам технологии, т.е. подбору оптимальных условий и разработке конструкций для достижения максимальных энергетических характеристик БТЭ. При этом фундаментальные вопросы по механизмам работы БТЭ, в том числе кинетические аспекты процессов переноса зарядов в системе «субстрат - биокатализатор - медиатор - электрод» не были систематически исследованы. Понимание таких механизмов позволит создавать эффективные БТЭ с высокими электрическими характеристиками. Таким образом, исследо-

вание кинетических аспектов передачи электронов в анодном отделении БТЭ на основе Gluconobacter oxydans представляется актуальной задачей в области биотехнологии альтернативных источников энергии.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - выявление закономерностей и определение кинетических параметров процессов передачи электронов в системе «субстрат - биокатализатор — медиатор 2,6-дихлорфенолиндофенол - графитовый электрод» в БТЭ на основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans и выделенной из них мембранной фракции в суспензионном и иммобилизованном состояниях.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Определить кинетические параметры взаимодействия медиатора с биокатализаторами в суспензионном состоянии в присутствии субстрата.

2. Выявить влияние операционных условий (природа и концентрация субстрата, содержание биокатализатора, рН, ионная сила раствора, присутствие растворенного кислорода) на скорость восстановления медиатора при использовании биокатализатора в суспензионном состоянии.

3. Выявить лимитирующую стадию и определить кинетические параметры взаимодействия медиатора с иммобилизованным биокатализатором.

4. Определить кинетические характеристики процесса разряда медиатора на графитовом электроде.

5. Сравнить энергетические характеристики БТЭ на основе бактерий Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции, применяемых в виде суспензии и в иммобилизованном состоянии.

Научная новизна

Впервые определены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ уксуснокислыми бактериями Gluconobacter oxydans и выделенной из них мембранной фракцией при различных условиях работы БТЭ (окислительная и инертная атмосфера, разомкнутая цепь и короткое замыкание, суспензионный и иммобилизованный биокатализатор), что позволяет оценить влияние этих условий на кинетику процесса восстановления ДХФИФ биокатализаторами.

Показано, что в условиях функционирования разработанного макета БТЭ растворенный кислород в анодном отделении не конкурирует с медиатором в процессе получения электронов от ферментных систем бактерий.

На основе модели ферментного электрода впервые выявлены области концентраций субстрата, при которых лимитирующей стадией является диффузия субстрата к частицам биокатализатора или ферментативная реакция окисления субстрата иммобилизованными в химически модифицированный поливиниловый спирт бактериями Gluconobacter oxydans на электроде.

Установлено, что процесс переноса электронов с восстановленной формы ДХФИФ на графитовый электрод протекает в смешанном режиме, т.е. конкурирующими являются стадии диффузии медиатора к электроду, адсорбции его на поверхности и перенос заряда на электрод, при этом окисление медиатора является реакцией первого порядка.

Практическая значимость

Выявленное влияние рабочих условий БТЭ на скорость восстановления ДХФИФ может служить ориентиром при подборе оптимальных условий для работы БТЭ на основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans и медиатора ДХФИФ.

Установлено, что при избытке бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в качестве биокатализатора БТЭ может работать в аэробных условиях. При этом процесс передачи электронов от бактерий на молекулы медиатора не подвергается конкуренции со стороны растворенного кислорода, что позволяет конструировать более простые БТЭ без изолирования их анодного отделения от воздуха.

Впервые показана возможность использования поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, для иммобилизации бактериальных клеток Gluconobacter oxydans на аноде БТЭ. Такая композиция анода повышает долговременную стабильность БТЭ, улучшает его энергетические характеристики и позволяет применять биокатализатор в проточных системах.

Результаты работы внедрены в учебный процесс - поставлена новая лабораторная работа по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы и публикации

Результаты работы представлены во всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология», (г. Тула, 2010, 2011, 2012 гг.), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (2011г. г. Москва, диплом и медаль конкурса), Всероссийской школе-конференции "Химия биологически активных веществ" с международным участием "ХимБиоАктив-2012" (г. Саратов 2012г.), Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее», (2012г.), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (г. Саранск, 2012г).

По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК и 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, получен патент на полезную модель (2012г.).

Место проведения работы

Экспериментальная часть работы выполнялась на кафедре Химии ЕНФ Тульского государственного университета, в рамках проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», Соглашение № 14.В37.21.0561 и Государственного задания Минобрнауки 4412 ГЗ.

Благодарности. Автор благодарен коллективам кафедры химии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и обсуждении результатов. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям - к.х.н., проф. Алферову В.А., к.х.н., доц. Пона-моревой О.Н.

Структура и объем работы.

Работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 12 таблиц. Список литературы включает 97 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе дан анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям в области технологии БТЭ. Приведено описание физиолого-биохимических особенностей уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans, а также кинетического аспекта процессов передачи электронов в анодном отделении БТЭ.

Глава 2. Во второй главе дано описание материалов и методов исследования.

В работе использован бактериальный штамм: Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKMB-1280). (Всероссийская коллекция микроорганизмов, УРАН ИБФМ им. Г.К. Скрябина). Мембранную фракцию из бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius BKMB-1280 (далее G. oxydans) получали путем разрушения биомассы бактерий на ультразвуковом диспергаторе УЗД11-0,1/22 и последующим центрифугированием на центрифугаторе Centrifuge 5417R (Eppendorf).

Электрохимические измерения проводили с помощью гальванопотенцио-статов IPC2000 и IPC Micro («Кронас», Москва) с программным управлением. Измерения концентрации глюкозы и этанола в анодном отделении БТЭ проводили при помощи биосенсора на основе кислородного электрода и ферментов глюкозооксидазы и алкогольоксидазы соответственно.

Определение концентрации кислорода в растворе проводили на анализаторе жидкости «ЭКСПЕРТ-001» с программным управлением.

Определение скорости восстановления медиатора ДХФИФ проводили с использованием спектрофотометра СФ-103 при длине волны 600 нм. Обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ «Microsoft Excel» и «Sigma Plot 11.0»

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

1. Кинетические аспекты взаимодействия медиатора с биокатализатором в суспензионном виде

Кинетические характеристики взаимодействия ДХФИФ с суспеизией клеток G. oxydans

Для выявления кинетических закономерностей взаимодействия медиатора с биокатализатором на первом этапе работы спектрофотометрическим мето-

дом были определены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления медиатора в присутствии избытка клеток G.oxydans и субстрата (этанола и глюкозы).

Для этого измеряли в кинетическом режиме оптическую плотность раствора, содержащего ДХФИФ, суспензию бактерий G.oxydans и избыток субстрата, при разомкнутой цепи и коротком замыкании БТЭ, в присутствии и в отсутствие кислорода.

Известно, что в большинстве случаев кинетика восстановления медиатора бактериальными клетками соответствует реакции первого порядка по медиатору, т.е. С = С0 е~к' (где С„ и С - начальная и текущая концентрации медиатора в измерительной кювете соответственно, к - константа скорости реакции) (Sibel D. Roller et al., 1984). С другой стороны оптическая плотность раствора ДХФИФ прямо пропорциональна его концентрации, поэтому D = Da-e~b(где D0 и D - начальная и текущая оптические плотности раствора при длине волны бООнм).

Данные по оптической плотности были обработаны в виде зависимости 1п(-^)от времени, где D0 и D —начальная и текущая оптические плотности реакционной смеси (Рис.1 и 2).

е

д

10 12 14 16 18 20 время, млн.

_ А,

Рис.1. Зависимость In —от вре-

D

Рис.2. Зависимость In—от

D

мени в присутствии кислорода. времени в бескислородной среде.

Тангенс угла наклона линейной зависимости является эффективной константой скорости реакции. Полученная константа скорости является эффективной, поскольку включает в себя концентрации биокатализатора и субстрата, константу адсорбционного равновесия и константу скорости переноса электрона на электрод в режиме короткого замыкания.

Кинетика восстановления медиатора биокатализаторами в присутствии этанола как в режиме разомкнутой цепи, так и в режиме короткого замыкания соответствует реакциям первого порядка (табл.1).

Таблица 1. Эффективные константы скорости (к) и начальные скорости (у) реакции восстановления ДХФИФ бактериями С.оху(1ап8 при различных условиях.

Субстрат Атмосфера 02 Атмосфера N2

Разомкнутая цепь Короткое замыкание Разомкнутая цепь Короткое замыкание

Этанол к,с-' г'1 16±1 6,7±0,4 18±1 7,3±0,3

v, мкмоль с'1 г'1 1,0±0,1 0,40±0,02 1,1±0,1 0,44±0,02

Глюкоза к,с'1 г'1 1,<Ж),1 0,40±0,02 1Д±0,1 0,44±0,02

v,мкмоль-с'1 г'' 0,062±0,002 0,029±0,002 0,12±0,01 0,028±0,002

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы. При использовании этанола в качестве субстрата эффективные константы скорости реакции восстановления ДХФИФ клетками G. oxydans на порядок большие, чем при использовании глюкозы.

В режиме короткого замыкания из-за реакции окисления восстановленной формы медиатора на аноде скорость исчезновения окисленной формы ДХФИФ в 2-3 раза меньше, чем в режиме разомкнутой цепи. Присутствие кислорода практически не влияет на скорость восстановления ДХФИФ. Это можно объяснять либо более высокой скоростью взаимодействия бактериальных клеток с медиатором, чем с кислородом, либо присутствием избытка субстрата и биокатализатора, что обеспечивает одновременно восстановление и кислорода, и медиатора.

Оценка конкуренции между медиатором и растворенным кислородом.

Для аэробных бактерий, таких как G. oxydans, кислород является естественным конечным акцептором электронов и может конкурировать с медиатором при получении электронов с дыхательной цепи бактерий.

Для определения скорости восстановления кислорода бактериями G. oxydans измерили концентрацию кислорода в системе, содержащей этанол, суспензию бактерий G. oxydans в отсутствие и в присутствии ДХФИФ (рис.3).

Результаты обработки экспериментальных данных показывают, что присутствие кислорода не влияет на скорость восстановления медиатора (табл.1) и присутствие медиатора не влияет на скорость восстановления кислорода. При одинаковых экспериментальных условиях скорости восстановления кислорода и ДХФИФ составляют 130±20 (мкмоль электронов)л"1т"1с'1 и 150±30 (мкмоль электронов)'л~1'г"1'с"1 соответственно, т.е. одинаковы. В литературе описаны подобные случаи для других видов бактерий и медиаторов (Escherichia coli и тио-нин, Bacillus subtilis и метиленовый синий, Proteus vulgaris и метиленовый синий) где скорости восстановления медиатора и кислорода бактериями близки (Sibel D. Roller, 1984).

Время, мин

Рис.3. Кинетика расходования кислорода в случаях присутствия и отсутствия медиатора при разомкнутой цени.

Ранее было установлено, что гомогенизат G. oxydans, полученный после ультразвуковой обработки бактериальных клеток, обладает удельной активностью по этанолу 2,78 Е/мг, что соответствует скорости восстановления этанола 46,3 мкмоль ■ г~' ■с(Islami M., 2008). Даже если предположить, что целые клетки обладают удельной активностью в 10 раз меньшей, чем гомогенизат клеток, т.е. 4,6 мкмоль ■ г'' -с'\ то такое значение все равно значительно выше, чем суммарная скорость восстановления ДХФИФ и кислорода. Таким образом, отсутствие конкуренции между медиатором и кислородом можно объяснить присутствием избытка биокатализатора в условиях эксперимента и тем фактом, что весь присутствующий в системе кислород полностью расходуется за 10 минут, что видно на рисунке 3.

Кинетические характеристики взаимодействия ДХФИФ с суспензией мембранной фракции, выделенной из G. oxydans

Известно, что способность G. oxydans быстро окислять спирты и моносахариды обусловлена в основном мембранно-локализованными дегидрогеназа-ми. Эти ферменты в свободном состоянии могут непосредственно взаимодействовать с ДХФИФ. Ферменты в мембранной фракции, выделенной из бактериальных клеток, становятся более доступными субстратам и медиатору, что делает ее перспективным биокатализатором в БТЭ.

Эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ в присутствии мембранной фракции в качестве биокатализатора и эта-

нола в качестве субстрата были определены спектрофотометрическим методом (табл.2).

Таблица 2. Эффективные константы скорости (к) и начальные скорости (у) реакции восстановления ДХФИФ мембранной фракцией в при-

сутствии этанола при различных условиях.

Кинетические характеристики Атмосфера 02 Атмосфера N2

Разомкнутая цепь Короткое замыкание Разомкнутая цепь Короткое замыкание

к,с-' ■ г 100±5 35±2 110±10 38±2

6,3±0,3 2,2±0,1 6,9±0,6 2,4±0,1

Результаты обработки экспериментальных данных показывают, что кинетика восстановления медиатора мембранной фракцией в присутствии этанола в режимах разомкнутой цепи и короткого замыкания соответствует реакциям первого порядка. Присутствие кислорода в реакционной среде, как в случае с суспензией клеток, практически не влияет на скорость восстановления медиатора.

Можно видеть, что при использовании мембранной фракции в качестве биокатализатора скорости восстановления медиатора примерно в 6-7 раз выше, чем при использовании целых клеток G.oxydans (табл.1 и табл.2).

2. Влияние операционных условий БТЭ на скорость восстановления медиатора

Влияние природы субстрата. Известно, что бактерии G.oxydans обладают широким спектром окисляемых субстратов, для выявления влияния природы субстрата на скорость восстановления медиатора были определены скорости взаимодействия бактерий G.oxydans с ДХФИФ при использовании различных спиртов и моносахаридов.

Рис 4. Субстратная специфичность микроорганизмов G.oxydans. А-спирты, Б - моносахариды (на вертикальной оси дано соотношение констант скоростей, полученных спектрофотометрически, для кислородного электрода - соотношение ответов сенсора).

Полученный портрет субстратной специфичности в основном согласуется с результатами, полученными с помощью биосенсора на основе кислородного электрода (рис.4).

Бактериальные клетки обладают самыми высокими скоростями взаимодействия с ДХФИФ при использовании этанола, н-пропанола и глюкозы в качестве субстратов окисления. Для линейных одноатомных спиртов при увеличении числа атомов углерода от 2 до 4 скорость восстановления медиатора и скорость потребления кислорода уменьшается. Для первичных спиртов скорости восстановления медиатора и кислорода выше, чем для вторичных.

Влияние концентрации субстрата. График зависимости начальной скорости восстановления ДХФИФ от концентрации субстрата имеет типичный для ферментативных реакций вид (рис. 5), поэтому экспериментальные данные аппроксимировали по уравнению Михаэлиса-Ментен, константа Михаэлиса для ферментных систем окисления этанола бактериями С.оху<Ьт составила 0,045мМ.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Сэтатл, мМ

Рнс.5. Зависимость скорости восстановления ДХФИФ от концентрации этанола.

Такой результат имеет одинаковый порядок по сравнению с константами Михаэлиса для алкогольдегидрогеназы, выделенной из G.oxydans [www.brenda-enzymes.info].

Таблица 3. Константа Мцхаэлиса алкогольдегидрогеназы, выделен-

Км, мМ Примечание

0,035 присутствие N-dodecyl-beta-D-maltoside

0,045 присутствие N-dodecyl-beta-D-maltoside

0,011 присутствие Triton Х-100

Влияние содержания бактериальных клеток Количество биокатализатора - бактериальных клеток, влияет на скорости окисления этанола и восстановления ДХФИФ. При увеличении содержания бактериальных клеток в сус-

11

пензии возрастает скорость восстановления ДХФИФ, причем при содержании клеток выше 5мг/мл наблюдает эффект насыщения (Рис. 6).

2,5

О 2 4 6 8 10 12 14 16 Склетки, мг/мл

Рис.6. Зависимость скорости восстановления ДХФИФ от содержания бактериальных клеток в растворе.

Влияние рН среды. рН среды оказывает существенное влияние на активность ферментов, функционирование целых клеток бактерий и окислительно-восстановительные свойства ДХФИФ. Влияние рН фосфатного буферного раствора на скорость восстановления ДХФИФ исследовали методом спектрофото-метрии в диапазоне рН от 5 до 8. Максимальная скорость восстановления ДХФИФ наблюдается в области рН 6 (рис.7), что соответствует данным по каталитической активности G. oxydans в условиях естественного окисления этанола, полученным с помощью кислородного электрода (рис.8).

РН7

Рис.7. Зависимость эффективной Рис.8. Зависимость ответа константы скорости восстановле- биосенсора на основе кислород-ния ДХФИФ от рН среды._ного электрода от рН среды.

Таким образом, значение рН среды в первую очередь влияет на активность бактерий, в то время как изменение окислительно-восстановительных свойств ДХФИФ не является решающим фактором.

Влияние ионной силы раствора

Одним из факторов, которые могут влиять на активность бактериальных клеток является ионная сила раствора. Было определено влияние ионной силы фосфатного буферного раствора (рН=6) на скорость восстановления ДХФИФ клетками О. оху^апв в диапазоне ионной силы от 10"4М до 0,1М.

181

Рис.9. Зависимость эффективной константы скорости восстановления ДХФИФ от логарифма ионной силы среды.

Как можно видеть, в относительно широком диапазоне ионной силы раствора эффективная константа скорости восстановления ДХФИФ практически не меняется, что свидетельствует об устойчивости уксуснокислых бактерий к изменению ионной силы раствора.

З.Кпнетика взаимодействия иммобилизованных клеток аисопоЬас(ег охус1ат с медиатором.

Определение лимитирующей стадии при взаимодействии субстрата с иммобилизованными бактериальными клетками аисопоЪасЯет охус1ат

Для разработки БТЭ, работающего в проточных системах, важной задачей является иммобилизация биокатализатора на электроде. В качестве матрицы для иммобилизации бактериальных клеток О.охусЬзт в работе использован сополимер поливинилового спирта (ПВС) и № винилпирролидона. Данный сополимер отличается механической и химической устойчивостью, нетоксичностью для бактерий и способностью удерживать их в долгое время.

При использовании сополимера ПВС и И- винилпирролидона для иммобилизации бактерий на аноде диффузия субстрата к бактериям через слой матрицы затрудняется и в результате ограничивает общий процесс переноса электронов. Поэтому важно подобрать условия, в которых диффузия не является лимитирующим фактором.

Чтобы описать кинетические закономерности процесса переноса электронов в БТЭ на основе иммобилизованного биокатализатора анод с иммобилизованными бактериями С. охус1ат представили в виде модели, учитывающей

различные стадии: перенос субстрата и медиатора через слой полимера, их взаимодействие с ферментными системами бактериальных клеток, регенерацию фермента и медиатора (рис. 10). В стационарном состоянии системы имеется равенство потоков электронов и вещества на всех стадиях процесса биоэлек-трокаталитического окисления субстрата.

i S-

бактернальная клетка

Рис. 10. Схематическое изображение анода БТЭ с иммобилизованными бактериями.

Такая модель микробного электрода БТЭ аналогична модели ферментного электрода, поэтому для анализа процессов, протекающих на биоаноде с иммобилизованными бактериальными клетками, применили подход, который был использован для определения лимитирующей стадии процессов, протекающих на ферментном электроде.

Для определения лимитирующей стадии при взаимодействии субстрата с иммобилизованными бактериальными клетками G. oxydans была использована математическая модель ферментного электрода, приводящая в конечном итоге к выражению (Albery W.J., Bartlett P.N.,1985):

S j

1

k'

XI

1+-

K,

1-

J

k'.S

(1)

где ] — поток электронов, протекающий через электрод; Б - концентрация субстрата в растворе; к' - эффективная константа скорости электрохимиче-

МЕ

ской реакции на микробном электроде; К^. - константа, эквивалентная константе Михаэлиса для микробного электрода; к'3 — константа скорости массо-переноса субстрата.

Первый этап анализа для нахождения лимитирующей стадии процессов, протекающих на микробном электроде, заключается в регистрации зависимости силы стационарного тока (I), проходящего через микробный электрод, от концентрации этанола (Б) при постоянном потенциала электрода и в присутствии медиатора.

Далее определили к'мЕ по графику зависимости Б/] от Б. к'ми представляет собой обратную величину свободного члена уравнения линейной зависимости Э^у от 8 (рис.10), полученное значение константы дано в таблице 5.

4 6

в, мМ

Рис. 11. Графическое определение эффективной константы к'МЕ-

Затем были найдены параметры р и у, которые не имеют конкретного физического смысла, но позволяют представить экспериментальные данные в удобном для анализа виде.

Р = Ш = (2)

У =

0/8), к7

8 к' Рк'мв

(3),

После нескольких математических преобразований уравнение (1) можно привести к виду:

. Р"'-1

У = -

(4)

Для определения лимитирующей стадии процесса строили график зависимости у от р.

Рис.12. Зависимость у от р для анода с иммобилизованными клетками С.охуйаю.

Согласно применяемой модели, если скорость процесса лимитируется ферментативной реакцией, зависимость у от р должна иметь вид горизонтальной линии, если же прямая зависимости у от р отсекает на оси абсцисс отрезок, равный единице, то процесс лимитируется диффузией субстрата к частицам биокатализатора.

Было установлено, что в диапазоне концентраций этанола 0,25 - 8,0 мМ зависимость у от р носит характер прямой, практически параллельной оси абсцисс, следовательно, скорость процессов, протекающих в системе, лимитируют ферментативная реакция.

В диапазоне концентраций этанола 0,012 - 0,12 мМ скорость процессов, протекающих в системе, лимитирует диффузия субстрата через полимерную матрицу к бактериальным клеткам, так как отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс равен значению близкому к единице.

Таблица 5. Интервалы концентраций этанола и кинетические константы скорости лимитирующей стадии на аноде с иммобилизованными _ бактериями С.оху(1ап$_

Лимитирующая стадия Интервал концентраций Кинетические константы

Ферментативная реакция 0,25 - 8,0 £'лж = 3,5±0,6

Диффузия 0,012-0,12 к, = 0,47±0,4

Таким образом, в области низких концентраций (от 0,012 до 0,12 мМ) лимитирующей стадией в анодном отделении БТЭ на основе иммобилизованных клеток О. охуёапх является диффузия субстрата к частицам биокатализатора. В области более высоких концентраций (от 0,25 до 8,0 мМ) лимитирующей стадией процесса является ферментативная реакция.

Дальнейшие исследования кинетических закономерностей функционирования БТЭ на основе иммобилизованных биокатализаторов проводили в условиях, когда лимитирующей стадией процесса является ферментативная реакция.

Кинетические характеристики взаимодействия медиатора с иммобилизованными бактериями

Для выявления кинетических закономерностей взаимодействия медиатора с иммобилизованными бактериями при использовании этанола в качестве субстрата в БТЭ использовали метод спектрофотометрии.

Результаты обработки экспериментальных данных показывают, что реакция восстановления ДХФИФ в режимах разомкнутой цепи и короткого замыкания БТЭ имеет первый порядок по медиатору. В таблице 6 представлены полученные эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ иммобилизованными клетками С. оху<1ат.

Таблица 6. Эффективные коистаиты скорости (к) и начальные скорости (V) восстановления ДХФИФ иммобилизованными бактериями

Кинетические характеристики Разомкнутая цепь Короткое замыкание

/с, с"' - г'1 1,4±0,3 2,0±0,4

у,мкмоль-с~1г~' 0,09±0,02 0,12±0,02

После иммобилизации бактериальных клеток в модифицированный ПВС константа скорости их взаимодействия с медиатором падает почти на 2 порядка (табл.2 и табл.6). Это можно объяснить уменьшением количества «активных центров» биокатализатора в результате взаимодействия его поверхности с иммобилизующей полимерной матрицей.

Влияние поверхностной плотности биокатализатора. Для того, чтобы процессы окисления субстрата и восстановления медиатора протекали с высокой скоростью, количество биокатализатора на поверхности анода должно быть достаточно большим.

С ростом поверхностной плотности бактериальных клеток до величины 4мг/см2 эффективная константа скорости реакции повышается, что свидетельствует об увеличении количества эффективных клеток - биокатализаторов. При более высоких плотностях биокатализатора эффективная константа скорости реакции почти не изменяется, что свидетельствует о присутствии «недействующего» количества биокатализатора (рис. 13).

Таким образом, для эффективной работы иммобилизованного биокатализатора бактериальные клетки С. охуЛат целесообразно иммобилизовать в пределах плотности 2-4 мг/см2.

0,12

0,10 —?

гн 0,08

'и V

0,06 Г

/

- 0,04 1

0,02 0,00 1

О 2 4 6 8 10 12 Склеток, мг/см^

Рис.13. Зависимость эффективных констант скорости от содержания иммобилизованных бактерий С.охуйапь

3. Кинетика разрядки медиатора ДХФИФ на электроде

Важной стадией в процессе переноса электронов в БТЭ является разрядка восстановленного медиатора на аноде. Для получения кинетических характеристик этого процесса получили и обработали вольтамперные кривые разрядки ДХФИФ на графитом электроде.

Выявление конкурирующих стадий. Для оценки числа электронов, участвующих в процессе электронного транспорта молекулами ДХФИФ вольтамперные зависимости были обработаны в координатах ^¡={Щ) для разных скоростей развёртки, где 1 - плотность силы тока.

Полученные результаты представлены на рисунке 14 .

ш 20 мВ/с

• 15 мВ/с

♦ 10 мВ/с

А 5 иВ/с

О 0.02 0,04 0,06

Е, В

Рис.14. Зависимость плотности тока от потенциала в системе ДХФИФ/буфер.

На основании уравнения Тафеля

Е = а +

где Е - перенапряжение;

а, Ь - эмпирические коэффициенты,

по тангенсу угла наклона полученных прямых был определен коэффициент Ь. Для системы ДХФИФ/буфер его среднее значение составило 0,26±0,02, а при аналогичной обработке серии опытов с ис пользованием суспензии клеток и медиатора - 0,28±0,03.

Таблица 7. Значения коэффициента Ь уравнения Тафеля при разных скоростях развертки потепциала электрода.

Скорость развертки, мВ/с 5 10 15 20

Ь 0,21±0,02 0,31±0,04 0,27±0,02 0,26±0,02

Если учесть, что поляризационные кривые получены в условиях, близких к равновесным, то рассчитанные значения коэффициента Ь указывают на участие в электрохимическом процессе окисления молекул ДХФИФ 0,5 электрона. Если данный процесс лимитируется стадией переноса заряда, число электронов должно быть 1 или 2 (значение коэффициента Ь при этом близко к 0,118 или 0,059).

Подобные зависимости были получены для графитовых электродов разного диаметра (4 мм, 3,7 мм, 3,5 мм, 3,2 мм). Установлено что, определяемый коэффициент Ь изменяется в зависимости от диаметра рабочего электрода. Полученный график представлен на рисунке 15.

3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 <1, ММ

Рис.15. Зависимость коэффициента Ь уравнения Тафеля от диаметра

электрода.

Для электрохимических процессов, лимитируемых переносом заряда, коэффициент Ь уравнения Тафеля не зависит от площади поверхности электрода. Поэтому и число электронов 0,5, и факт зависимости коэффициента Ь от площади электрода свидетельствует о том, что процесс окисления ДХФИФ на графитовом электроде протекает в смешанном режиме, т.е. конкурирующими являются стадии диффузии, адсорбции частиц восстановленной формы ДХФИФ и переноса электронов от медиатора на электрод.

Скорость передачи электронов на электрод - скорость окисления медиатора на графитовом электроде должна быть пропорциональна степени заполнения поверхности электрода молекулами восстановленного медиатора:

где г - скорость окисления восстановленного медиатора на электроде, к- константа скорости передачи электрона от адсобироваиного восстановленного медиатора к электроду

9КЫ - степень заполнения поверхности графитового электрода частицами восстановленного медиатора

Степень заполнения определяется уравнением Лэнгмюра:

а ___^-мгесрмт! _

1 + КМге<1СМге11 + ^Мох^Мох

где Сит1, КМт1, СМах,КМю- концентрации и константы адсорбционного равновесия восстановленной и окисленной форм медиатора соответственно.

Т.к. адсорбционная способность восстановленного и окисленного медиатора мала КкыС1Ш<< 1, КМтСМт«1, то степень заполнения пропорциональна концентрации восстановленной формы медиатора и реакция должна иметь первый порядок по медиатору:

г — кК.МгЫСМгЫ

Для экспериментального определения порядка реакции при применении суспензии бактериальных клеток в качестве биокатализатора использовалась зависимость ^¡=а+п^С для различных значений потенциала, где тангенс угла наклона полученных прямых указывает на порядок реакции по ДХФИФ в исследуемом процессе.

Результаты данной серии опытов с использованием суспензии клеток в присутствии этанола представлены на рисунке 16.

Рис.16. Зависимость логарифма плотности тока от логарифма концентраций ДХФИФ системе ДХФИФ/буфер/клетки/этанол.

Полученные значения порядка реакции приведены в таблице 7.

Таблица 7. Порядок реакции окисления ДХФИФ на графитовом электроде при разных значениях потенциала электрода._

Е, мВ 30 40 50 60

Порядок реакции 0,94±0,09 0,86±0,12 0,99±0,09 1,1±0,1

Таким образом, реакция окисления ДХФИФ на графитовом электроде действительно имеет первый порядок. Ранее для метиленового синего первый порядок реакции окисления медиатора на аноде был установлен методом вращающего дискового электрода (Кузьмичева Е.В., 2009).

3.4. Энергетические характеристики БТЭ на основе вШсопоЬасЛег охуйапз

Мощность биотопливного элемента — важнейшая характеристика, позволяющая судить о возможности применения биотопливных элементов в качестве источников электропитания. Для достижения максимальных значений мощности в макете биотопливного элемента требуется учесть ряд факторов: кинетику передачи заряда, внутреннее сопротивление, эффективность медиатора элек-

тронного транспорта, рабочую поверхность анода и др.

Оценку внутреннего сопротивления БТЭ проводили методом пика мощности, для чего исследовали зависимость мощности БТЭ от приложенного внешнего сопротивления в интервале от 1 до 510 кОм. При достижении максимального значения мощности внешнее сопротивление равно внутреннему.

Удельную мощность, нормированную к единице рабочей поверхности

и ■

электрода, определяли по формуле Р = —,

где и- рабочее напряжение БТЭ (В), Я — внешнее сопротивление между анодом и катодом БТЭ (Ом), Э - площадь части поверхности анода, погруженной в раствор (м2).

В таблице 9 представлены мощностные характеристики макетов БТЭ с использованием суспензии бактерий О.охуйапъ, выделенной из них мембранной фракции и иммобилизованных клеток в качестве биокатализатора.

Таблица 9. Мощностные характеристики макетов БТЭ на основе суспензий бактерий С.охуйат и выделенной из них мембранной фракции.

Биокатализатор Внутреннее сопротивление, кОм ЭДС, мВ Максимальная мощность, мкВт/м2

Суспензия бактерий G.oxydans 240 100 7

Суспензия мембранной фракции из клеток G.oxydans 100 217 500

Иммобилизованные клетки G.oxydans 150 160 200

При использовании иммобилизованных бактерий по сравнению с суспензией клеток внутреннее сопротивление элемента снижается в 1,6 раз, а максимальная мощность биотопливного элемента возрастает в 30 раз.

Величина генерируемого потенциала при использовании суспензии мембранной фракции по сравнению суспензией клеток возрастает в 2 раза, внутреннее сопротивление элемента снижается в 2,4 раза, а максимальная удельная мощность биотопливного элемента возрастает в 70 раз.

Таким образом, иммобилизация биокатализатора на аноде не только позволяет применять БТЭ в проточных системах, но и значительно улучшает его энергетические характеристики. Ключевой проблемой остается иммобилизация медиатора на электроде, при этом способность медиатора переносить электроны должна быть сохранена.

выводы

1. Проведено изучение взаимодействия в системе субстрат - бактериальные клетки G.oxydans - медиатор электронного транспорта - графитовый электрод. Установлено, что реакция восстановления медиатора ДХФИФ в присутствии суспензии бактерий G.oxydans и субстрата в анодном отделении биотопливного элемента имеет первый порядок по медиатору.

2. Определены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ при различных условиях работы БТЭ (разомкнутая цепь и короткое замыкание, присутствие и отсутствие кислорода в системе, этанол и глюкоза в качестве субстратов биоокисления). Выявлено, что при использовании этанола в качестве субстрата скорость восстановления медиатора клетками G.oxydans на порядок выше, чем при использовании глюкозы, применение в качестве биокатализатора мембранной фракции увеличивает скорость восстановления медиатора в 6-7 раз.

3. Экспериментально установлено, что скорости восстановления кислорода и медиатора клетками G.oxydans в присутствии субстрата одинаковы. В условиях эксперимента растворенный кислород в процессе работы биотопливного элемента не конкурирует с медиатором в получении электронов от биокатализатора, что связано с присутствием избытка последнего и субстрата в растворе, в результате чего концентрация кислорода в анодном пространстве падает до нуля.

4. Выявлено влияние операционных условий на скорость восстановления медиатора. Влияние природы субстрата в целом совпадает с субстратной специфичностью G.oxydans, полученной с помощью биосенсора на основе кислородного электрода. Зависимость начальной скорости восстановления ДХФИФ от концентрации субстрата этанола имеет типичный вид для ферментативных реакций. Максимальные значения скорости восстановления медиатора наблюдаются при рН раствора 6, что соответствует оптимальному значению рН для алкогольдегидрогеназы G.oxydans. В диапазоне ионной силы от 0,0001 до 0,1 M скорость восстановления медиатора практически не меняется.

5. Показано; что в области низких концентраций этанола (до 0,12 мМ) лимитирующей стадией процессов для биоанода на основе иммобилизованных клеток G.oxydans является диффузия субстрата к биокатализатору, при более высоких (выше 0,25 мМ) - ферментативная реакция. В кинетической области определены константы скорости и начальные скорости восстановления медиатора иммобилизованным биокатализатором в режимах разомкнутой цепи и короткого замыкания БТЭ.

6. Установлено, что процесс окисления ДХФИФ на графитовом электроде протекает в смешанном режиме, т.е. конкурирующими являются стадии диффузии, адсорбции медиатора и перенос заряда на электрод, при этом реакция разрядки медиатора на электроде имеет первый порядок. (

7. Проведена оценка мощностных характеристик макета БТЭ, установлено, что при использовании иммобилизованных бактерий по сравнению с суспензией клеток максимальная удельная мощность элемента возрастает в 30 раз, при использовании мембранной фракции в 70 раз.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

Статьи п реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Нгуен В. Т., Алферов В. А., Алферов С. В., Матвейко Н.П. Кинетические аспекты процесса передачи электронов в системе «окисляемый субстрат -бактериальные клетки - медиатор - электрод» в биотопливном элементе// Бут-леровские сообщения, 2011, Т.24, №4, с. 60-65.

2. Нгуен В.Т., Алферов В.А., Алферов C.B., Скорынина A.B., Кинетика восстановления 2,6- дихлорфенолиндофенола в присутствии этанола в биотопливном элементе на основе клеток Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции. // Известия ТулГУ. Естественные науки. Тула: Изд-во ТулГУ, 2012, Вып.1, с. 254-264.

3. С. В. Алферов, О. А. Воеводская, В.Т.Нгуен. Уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans как биокатализаторы в медиаторном биотопливном элементе/// Сенсорные системы. -М.:Наука, 2011. т. 25,№4.-с.346-351.

Патент:

1. Алферов C.B., Минайчева П.Р., Нгуен В.Т., Арляпов В.А., Алферов В.А. , Патент на полезную модель № 122381. Устройство для генерации электричества. Приоритет полезной модели 5 июня 2012 г., зарегистрировано в Государственном реестре полезных моделей РФ 27 ноября 2012 г, бюл. №33, срок действия патента 5 июня 2022 г.

Тезисы докладов:

1. Нгуен В.Т., Алферов В.А., Носова Н.М. Кинетические аспекты процесса передачи электронов в системе «окисляемый субстрат - бактериальные клетки - медиатор - электрод» на примере системы « глюкоза - Gluconobacter oxydans - 2,6- дихлорфенолиндофенол» в биотопливном элементе. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» -Тула, 2010 - с.15 .

2. Нгуен В.Т., Алферов В.А., Влияние различных факторов на скорость восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии суспензии Gluconobacter oxydans и этанола. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» -Тула, 2011 -с.40.

3. Нгуен В.Т., Дыронкова В.В., Алферов В.А., Кинетика восстановления медиатора в биотопливном элементе на основе Gluconobacter oxydans и выделенной из них мембранной фракции Материалы Всероссийской конференции

с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2012» -Тула, 2012-С.42.

4. Нгуен В.Т., Дыронкова В.В., Алферов В.А. Кинетика восстановления медиатора в биотопливном элементе на основе иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции, Сборник трудов Всероссийской школе-конференции "Химия биологически активных веществ" с международным участием "ХимБиоАктив-2012" - Саратов, 2012, с. 143.

5. Нгуен В.Т., Алферов В.А., Кинетика передачи заряда в системе «этанол - биокатализатор — 2,6- дихлорфенолиндофенол - графитовый электрод» в биотопливном элементе. Сборник трудов международной Интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее»,- Казан: Изд-во «Казанский университет», 2012. С. 163-165.

6. Нгуен В.Т., Алферов В.А. Кинетические аспекты процесса передачи электронов в системе « глюкоза -Gluconobacter oxydans - 2,6- дихлорфенолиндофенол - графитовый электрод» в биотопливном элементе. // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития».2011. Материалы конгресса, часть 2,С. 280-281.

7. Нгуен В.Т., Алферов C.B., Алферов В.А., Кинетика взаимодействия медиатора электронного транспорта с бактериальными клетками, иммобилизованными на поверхности электрода//Материалы международной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» - Саранск: Типография ООО «Мордовия - Экспо», 2012. с. 144.

Подписано в печать:

17.09.2013

Заказ № 8755 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Нгуен Винь Тиен, Москва

Тульский і осударсі венный университет

На правах рукописи

04201362565

Нгуен Винь Тисн

КИНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В СИСТЕМЕ «СУБСТРАТ - БИОКАТАЛИЗАТОР - МЕДИАТОР -ЭЛЕКТРОД» В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ НА ОСНОВЕ С Ь и СОМОВА СТЕЯ ОХУОЛКХ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионаноI ехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Н а у ч 11 ы й ру ко водител ь кандидат химических наук, донент Алферов В.А.

МОСКВА-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

Глава 1. Литературный обзор............................................................................... 10

ЕМикробные биотопливные элементы............................................................... 10

1.2. Компоненты микробного биотопливного элемента................................ 10

ЕЗ. Г Двухкамерные М'ГЭ................................................................................. 1 1

Е3.2. Однокамерные МТЭ.................................................................................13

1.3.3.Системы М'ГЭ с восходящим потоком................................................... 15

1.3.4. Сложенные М'ГЭ...................................................................................... 16

2. Микроорганизмы, использованные в М'ГЭ..................................................... 17

3. Уксуснокислые бактерии С/исопоЬасГег охус1апх...........................................20

4.Медиа горы .электронного транспорта..............................................................23

5. Характеристики МТЭ........................................................................................26

6. Влияние операционных условий на характеристики М'ГЭ...........................30

7. Кинетика процессов переноса электронов в анодном отделении М'ГЭ.......37

8. Иммобилизация биоматериала в БТЭ..............................................................44

9.Возможные направления применения М'ГЭ....................................................47

10.Заключение........................................................................................................49

Елава 2. Экспериментальная часть......................................................................5 1

2.1. Реакт ивы..........................................................................................................51

2.2. Культивирование бактериальных клеток СЛисопоЬасЧег о.хус1ап.\..............51

2.3.Получение мембранной фракции бактерий С1ысопоЬас1ег о.хуЛапь'...........51

2.4. Подготовка ячейки биотопливного элемента............................................52

2.5. Спектрофотометрическое определение скорости воссгановления медиатора при различных условиях....................................................................53

2.6. Изучение концентрации кислорода в анолите БТЭ...................................53

2.7. Изучение вольтамперных характеристик медиатора..................................54

2.8. Иммобилизация бактерий в модифицированный 11ВС на графитовом элек гродс.................................................................................................................54

2.9. Определение стадии, лимитирующей переноса электронов на электрод с

иммобилизованными бактериями........................................................................55

Глава 3. Обсуждение результатов.......................................................................5 1

3.1 .Кинетические аспекты взаимодействия медиатора с биокатализатором в суспензионном виде...............................................................................................56

3.1.1 .Кинетические характеристики взаимодействия ДХФИФ с суспензией

клеток G¡uconobacter.oxydons...........................................................................57

3.1.2.Оценка конкуренции между медиатором и растворенным кислородом.

..............................................................................................................................62

3.1.3.Кинетические характеристики взаимодействия ДХФИФ с суспензией мембранной фракции, выделенной из Gluconohocter.oxydons ......................65

3.2 Влияние операционных условиях МТЭ на скорость восстановления медиатора................................................................................................................68

3.3. Кинетика взаимодействия иммобилизованных клеток Gluconohocter oxvdans.....................................................................................................................77

3.3.1 .Определение лимитирующей стадии при взаимодействии субстрата с иммобилизованными бактериальными клетками Gluconohocter oxydons.... 78

3.3.2.Кинетические характерист ики взаимодействия медиатора с иммобилизованными биокатализаторами.......................................................85

3.3.3.Влияние поверхностной плотности биокатализатора...........................88

3.4. Кинетика разрядки медиатора на электроде................................................89

3.4.1 .Выявление конкурирующих стадий........................................................89

3.4.2.Определение порядка реакции.................................................................91

3.5. Энергетические характеристики БТЭ на основе бактерий Gluconohocter oxvdans.....................................................................................................................92

Выводы...................................................................................................................95

Благодарное'] и........................................................................................................97

Список литературы...............................................................................................98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВПК - биоло! ическое потребление кислорода Б I Э - биотопливный элемент БХ - 1,4-бенюхинон

П 1,Ф - [ексанианоферраг (Ш) калия Кф1 e(CN)6|

ДББХ - 2,5-дибром-1,4-бен юхинон

ДГ ~ легидрог енача

ДМФЦ -1,1 '-димет ил ферроцен

ДХФИФ - 2,6-ли\лорфснолиндофенол

МБХ - 2-viei ил-1,4-бензохинон

МЛ Э - микробный биотопливный элемент

M1")IIII - микробный биотопливный элемент плоской плаепшы НАД - никот инамидадсниндинуклсот ид

НАДН - восс iановленная форма никотинамидадсниндинуклеотида

ПВС - поливиниловый спирт

ПОМ - проюшю-обменная мембрана

ФАД - флавинадениндинуклсот ид

ФАДНт- восстановленная форма флавинадениндинуклсот ида Ф1 \ - ферроцен

XIIK - химическое погребленис кислорода ЭДГА - Э1илендиаминтетраацстат

С owclans - G envelans subsp mchtsívivs (BKM В -1 280) PQQ - 11 nppoj i \ и и ол и н х и 11 о н

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время темп использования ископаемых гоплив, особенно нефги и газа. ускоряется, что влечет за собой угрозу энер[ ет ического кризиса и глобального загрязнения окружающей среды. Возобновляемые формы энергии являются одним из пут ей решения этих проблем. Значительные усилия ученых направляются на исследование альтернативных источников электроэнергии. В последние годы интенсивно исследуются биотехнологическис аспекты генерирования энергии, в том числе технологии биотопливных элементов (БТЭ) как способ генерации электричества или водорода из возобновляемых источников без эмиссии углекислого газа в экосистему. БТЭ также могут быть использованы для очистки сточных вод за счет способности применяемых биокатализаторов окислять широкий спектр органических веществ. В качестве биокагализаторов для окисления субстратов могут выступать ферменты или микроорганизмы. Использование последних более предпочтительно, т.к. не требуются сложные и дорогостоящие процессы выделения, очистки и хранения ферментов. Одними из перспективных микроорганизмов, па основе которых возможно создание БТЭ, являются уксуснокислые бактерии С.oxydons Эти микроорганизмы обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся мембранной локализацией основных ферментов -дегидрогеначто делаег возможным перенос электронов in активных центров фермента на внешнее пространство. В свя^и с этим мембранная фракция, относительно просто выделенная из бактериальных клеток С.oxydons, также может явиться перспективным биокатализатором в БТЭ.

Для облегчения процесса передачи электронов i-и мембранно-локализованных ферментов уксуснокислых бактерий С oxydons на анод БТЭ применяю 1ся медиаторы электронного транспорта - низкомолекулярные соединения, которые могут проникать через внешнюю мембрану бактерий, получать электроны у мембранно-локализованных ферментов и окисляться на аноде. ГЗ качестве медиатора электронного транспорта для G oxydons в БГЭ испытывали различные органические и неорганические соединения. Среди них

водорастворимый 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) - искусственный акцептор электронов, часто используемый в экспериментах для обнаружения цепей электронного транспорта в фотосинтеза. Он эффективно взаимодействует с бактериальными клетками и генерирует относительно высокое значение потенциала анода при применении 15 БТЭ [1, 2].

При разработке проточных систем БТЭ важной проблемой является потеря биокатализатора. Одним из возможных решений этой проблемы является применение иммобилизованных микроорганизмов. Сополимер поливинилового спирта (ПВС) и М-винилпирролидона представляется перспективной матрицей для иммобилизации бактериальных клеток за счет способности удерживать клетки, нетоксичности для них, механической и химической устойчивости.

Анализ литературы показывает, что большинство исследований по БТЭ до сих пор посвящено в основном прикладным аспектам технологии, т.е. подбору оптимальных условий и разработке конструкций для достижения максимальных энергетических характеристик Б'ГЭ. При этом фундаментальные вопросы по особенностям механизмов работы БТЭ, в том числе кинетические аспекты процессов переноса зарядов I? системе «субстрат - биокатализатор -медиатор - электрод» не были систематически исследованы. Понимание таких механизмов позволит целенаправленно создавать эффективные БТЭ с высокими электрическими характеристиками. Таким образом, исследование кинетических аспектов передачи электронов в анодном отделении БТЭ представляется актуальной задачей в области биотехнолен ии альтернативных источников энергии.

Цель работы: Выявление закономерностей и определение кинетических параметров процессов передачи электронов в системе «субстрат -биокатализатор - медиатор 2,6-дихлорфенолиндофенол - графитовый электрод» в БТЭ на основе уксуснокислых бактерий С1исопоЬасГе1• охус1стя и выделенной из них мембранной фракции в суспензионном и и м м о б и л и з о в а н н о м с о с то я н и я х.

/Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

• Определи i ь кинешчсскис параметры взаимодеис i вия медиатора с биокаiали ?аiорами в суспензионном состоянии в нрисугсгвии субстрата

• Выяви ib влияние операционных условий (природа и концентрация cy6crpaia, содержание биока тали за i opa, pH, ионная сила раствора, ирису le i вис рас i BopcHiioi о кислорода) на скорое ib восстановления медиаюра при испоньзовании биокатализаюра в суспензионном сост оянии

• Выявить л ими тирующую стадию и определить кинетические параметры взаимодействия медиаюра с иммобилизованным биока i ал та юром

• Определи ib кинегическис харакюрисгики процесса разряда медиаюра на г рафи i овом эле к гродс

® Сравнить эпср[ е i ичсские харакюриешки HIна основе бамерий Glutonobattci owc/ans и и\ мембранной фракции, применяемых в виде суспензии и в иммобилизованном состоянии

Научная новиша работы

Впервые определены оффекшвные константы скорости и начальные скорое in восыановлсния ДХФИФ уксуснокислыми бактериями G/uconobactei owclcms и выдепенной из них мембранной фракцией при разпичных условиях рабо!ы Ь 1 О (окисни тельная и иисршая а1мосфера. разомкнутая цепь и короткое замыкание, суспензионный и иммоби чизованный биока1ачизагор), что по зво ияс i оцени1ь вмиянис них усновий на кине i и к) процесса восстаиовпенпя ДХФИФ биокагализаюрами

Показано, то в условиях функционирования разработannoi о макета ЬТЭ растворенный кислород в анодном оитспении не конкурирус! с медиатором в процессе получения электронов oí ферментных систем бактерии

На основе модспи ферменшот элем рода впервые выявлены области копнешранпй субстрат, при которых лимитирующеи С1адией является диффузия c\6cipara к час[ицам биока тали ^а юра и пи фермент a i ивная реакция

окисления субстрата иммобилизованными в химически модифицированный поливиниловый спирт бактериями С/исопоЬасгег охунЗапь на электроде.

Установлено, что процесс переноса электронов с восстановленной формы ДХФИФ на графитовый электрод протекает в смешанном режиме, т.е. конкурирующими являются стадии диффузии медиатора к электроду, адсорбции его на поверхности и перенос заряда на электрод, при этом окисление медиатора является реакцией первого порядка.

Практическая значимость работы

Выявленное влияние рабочих условий БТЭ на скорость восстановления ДХФИФ может служить ориентиром при подборе оптимальных условий для работы БТЭ на основе уксуснокислых бактерий С/ысопоЬас!ег охусЗапя и медиатора ДХФИФ.

Установлено, что при избытке бактериальных клеток С/исопоЬас1ег охус/ап.\ 13 качестве биокатализатора БТЭ может работать в аэробных условиях. При этом процесс передачи электронов от бактерий на молекулы медиатора не подвергается конкуренции со стороны растворенного кислорода, что позволяет конструировать более простые БТЭ без изолирования их анодного отделения от воздуха.

Впервые показана возможность использования поливинилового спирта, м од и ф и ц и ро ва н н о го N - в и н и л п и рро л и д о и о м, дл я иммобилизации

бактериальных клеток С/исопоЬасГег охус1ат на аноде БТЭ. Такая композиция анода повышает долговременную стабильность БТЭ, улучшает его энергетические характеристики и позволяет применять биокатализатор в проточных системах.

Результаты работы внедрены в учебный процесс — поставлена новая лабораторная работа по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы и публикации

Результаты работы представлены во всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология», (г. Тула) 2010, 2011, 2012 гг., Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2011г. (г. Москва, диплом и медаль конкурса). Всероссийской школе-конференции "Химия биологически активных веществ" с международным участием "ХимБиоАкпив-2012" (I-. Саратов) 2012г., Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее», 2012г.. Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (г. Саранск), 20121'.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, зарегистрирован патент на полезную модель (27 ноября 201 2г).

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.Микробные биотпливные 'элементы

1.1.Общие сведении о биотонливнмх элементах

Биотопливные элементы (БТЭ) — это устройства, в которых осуществляется превращение химической энергии различных веществ (углеводов, спиртов) в электричество в процессе биологической трансформации. Интерес к разработке альтернативных источников энергии (к которым относятся БТЭ) связан с грядущим глобальным истощением на Земле источников полезных ископаемых, используемых для нужд энергетики. Особая привлекательность БТЭ обусловлена возможностью использования в них в качестве топлива веществ, являющихся отходами. Это обстоятельство связано с тем. что микроорганизмы или их ферменты способны к деструкции достаточно широкого спектра низко- и высокомолекулярных соединений. Таким образом, помимо энергетической, БТЭ способны решать и экологические проблемы утилизации отходов. Биологические топливные элементы можно разделить на 2 класса по типу используемых биоокатализаторов: ферментные и микробные.

Принцип работы БТЭ схож с таковым у химических топливных элементов (ХТЭ). Помимо различия в природе катализатора следует отметить, что в БТЭ условия протекания реакций существенно более мягкие (близкие к нейтральным значения рН растворов, комнатная температура). Количество электричества, вырабатываемое с помощью БТЭ, как правило, сравнимо с ХТЭ

I 1

| э |.

1.2. Компоненты микробного биотопливного элемента

Типичный МТЭ состоит' из анодной и катодной камер, которые разделяются протонно-обменной мембраной (ПОМ). Однокамерный МТЭ не нуждается в катодной камере, т.к. катод выставлен непосредственно на воздухе. Таблица 1 показывает сводку компонентов МТЭ и материалов, использованных для их создания [4].

Таблица 1: Компоненты БТЭ и материалы для их создания

Компонент Материалы

Анод Графит, графитовый фетр, углеродная бумага, углеродная ткань, Рі. Рі черновая, сетчатый стекловидный углерод

Катод Графит, графитовый фетр, углеродная бумага, углеродная ткань, Рі, Рі черновая, сетчатый стекловидный углерод

Анодная камера Стекло, поликарбонат, оргстекло

Катодная камера Стекло, поликарбонат, оргстекло

Протопно-обменная система Протонно-обменные мембраны: ЫаПоп. икгех, солевой мостик, фарфоровая перегородка, или только электролит

Электродный катализатор Рї, Рі черновая, Мп02 , Ре1 , полианилин, иммобилизованный на аноде медиатор электронного транспорта [5]

1.3.Конструкция МТЭ

1.3.1. Двухкамерные МТЭ

Двухкамерные МТЭ, как правило, работают в периодическом режиме с растворами с известным химическим составом. Они в настоящее время используются только в лабораториях. В типичном двухкамерном МТЭ есть анодная и катодная камеры, связанные ПОМ, или иногда солевым мостиком, чтобы позволить протонам проходить на катод и препятствовать диффузии кислорода в анодную камеру. Камеры могут иметь различные формы.

Схематические диаграммы пяти двухкамерных МТЭ показаны в рис. 1.1. Мини-МТЭ. показанный в рис. 1С, имеет диаметр приблизительно 2 см, но генерирует высокую удельную плотность энергии на единицу объема. Они могут быть полезными в питании автономных датчиков для долгосрочных р