Электрокаталитическое окисление этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда

Инджгия, Екатерина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрокаталитическое окисление этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Электрокаталитическое окисление этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда"

На правах рукописи

щи^1-"- ■ -

ИНДЖГИЯ ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА

ЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЭТАНОЛА ФЕРМЕНТНЫМИ СИСТЕМАМИ БАКТЕРИЙ СИ]СОЫОВАСТЕ11 ОХУИЛт В ПРИСУТСТВИИ МЕДИАТОРОВ ФЕРРОЦЕНОВОГО РЯДА

03.01.06 - биотехнология (в том числе биоианотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 6 ДЕК 2010

МОСКВА-2010

004617653

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Алферов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Кизим Николай Федорович

доктор технических наук, профессор Ашихмина Тамара Яковлевна

Ведущая организация:

Белгородский государственный университет

Защита диссертации состоится «27» декабря 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.ВЛомоносова по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться па сайте www.mitht.ru

Автореферат разослан < > ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических паук, старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Перспективным направлением биотехнологии является разработка электрохимических биосенсоров и экологически чистых источников электроэнергии (биотопливных элементов). При разработке таких систем широко используется способность некоторых соединений с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами (медиаторов электронного транспорта) к быстрому переносу на электрод электронов, генерируемых ферментами или ферментными системами целых клеток микроорганизмов в процессе окисления субстратов.

Использование целых клеток микроорганизмов в качестве биокатализаторов по сравнению с ферментами имеет ряд преимуществ: микроорганизмы дешевле очищенных ферментов, что позволяет создавать недорогие приборы для экологического контроля и мониторинга биотехнологических процессов; микроорганизмы обладают каталитической активностью по отношению ко многим субстратам, что является преимуществом при экспресс-определении степени загрязнения водных объектов органическими соединениями (индекса биохимического потребления кислорода (БПК)); биосенсоры на основе целых клеток во многих случаях характеризуются повышенным сроком эксплуатации.

Способность микроорганизмов взаимодействовать с медиаторами электронного транспорта определяется доступностью ферментных систем для этих соединений. Известно, что уксуснокислые бактерии Gluconobacter имеют мембранную локализацию основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов -PQQ-зависимых альдоз - и алкогольдегидрогепаз, что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Кроме того, различные штаммы бактерий Gluconobacter oxydans широко используются в качестве биокатализаторов во многих биотехнологичсских процессах получения пищевых и биологически активных соединений. Биохимической особенностью штамма Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 является эффективное окисление этилового спирта, что можно использовать при разработке биосеисоров для экспресс-определения содержания этанола в биотехнологических средах.

Наиболее перспективными медиаторами при разработке биосенсоров являются соединения ферроценового ряда. Пара ферроцен - катион ферроцения представляет собой высоко обратимую окислительно-восстановительную систему. Ферроцены в сочетании с биокатализаторами на основе ферментов широко используют при разработке электрохимических биосенсоров, в то же время взаимодействие ферроценов с биокатализаторами на основе бактерий мало изучено. Представляется актуальным исследование закономерностей элсктрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 в сравнении с выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.

является лауреатом стипендии Президента РФ на 2009/2010учебный год, а также победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2009 г. (г. Казань), госконтракт № 7282 р/10122.

Цель работы:

Выявление закономерностей электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacler oxydans subsp. industrius BKM В-1280 и выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• Охарактеризовать биокаталитические свойства бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 и ферментных фракций спектрофотометрическим методом.

• Провести анализ кинетических параметров электрокаталитического окисления этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 в присутствии медиаторов ферроценового ряда в рамках модели двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг».

• Определить эффективность медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в реакциях электрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 и выявить влияние заместителей ферроцена на медиаторные свойства соединений.

• Разработать макет медиаторного биосенсора. Определить рабочие параметры функционирования (pH, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса биокатализатора на электроде) биосенсоров на основе медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда.

• Выявить спектр окисляемых субстратов мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 в присутствии медиаторов ферроценового ряда. Апробировать разработанный макет биосенсорного анализатора.

Научная новизна

Впервые проведен сравнительный анализ процессов электрокаталитического окисления этанола целыми клетками Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280 и выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда.

Установлено, что окисление в биоэлектрокаталитических системах «этанол -мембранная фракция или целые клетки бактерий Gluconobacter oxydans - медиаторы ферроценового ряда - электрод» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг», что обусловлено функционированием мембранлокализованных ферментов. Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосенсорах. Установлено, что мембранная фракция бактерий является более эффективным

катализатором в системах окисления этанола в присутствии медиаторов ферроценого ряда.

Впервые определены индексы эффективности медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в электрокаталитических системах окисления этанола на основе целых клеток уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydons subsp. industrius BKM В-1280 и мембранной фракции этих бактерий, которые увеличиваются в ряду: 1,1 '-ферроцендикарбоиовая кислота<этилферроцен<1,1 '-диметилферроцен<ферроцен<1,1 '-ферроцендиметанол<ферроценмонокарбоновая кислота. Показано, что эффективность медиаторов - производных ферроцена, зависит от электронных эффектов заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электропоакцепторные заместители увеличивают индекс эффективности медиатора, а электронодонорные - уменьшают.

Впервые показана возможность применения медиаторного биосенсора на основе биокатализатора - мембранной фракции бактерий для определения индекса БПК в отходах бродильных производств.

Практическая значимость работы

Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydons и мембранной фракции бактерий могут быть использованы в качестве научной основы при разработке электрохимических биосенсоров для экологического контроля и мониторинга биотехнологических процессов.

Разработан макет биосенсорного анализатора на основе мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydons subsp. industrius BKM B-1280 и медиатора ферроцена для экспресс-определения индекса БПК отходов бродильных производств. Полученные результаты показывают возможность применения действующего макета биоеснсорного анализатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: поставлены две новые лабораторные работы «Определение рабочих параметров функционирования микробного медиаторного биосеисора» и «Определение индекса БПК отходов спиртового производства с помощью биосенсора на основе ферроцена и мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydons» по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. и 2010 г. (диплом, медаль конкурса)', Российской школе-конференции молодых ученых «Экогоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», (Пущино) в 2006 г. (диплом лауреата конкурса) и 2009 г.; Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино), 2008 г. (диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008 г.» (Москва), 2008 г. (диплом, медаль выставки); Международной конференции «Molecular and nanoscale systems for energy conversion (MEC-2007)» (Москва), 2007 г.; Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006» (Москва), 2006 г.; IV Международной научной конференции

«Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск), 2006 г.

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 10 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 131 странице, содержит 51 рисунок и 11 таблиц. Список литературы включает 146 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе дается анализ научно-технической литературы, посвященной медиаторному биоэлектрокатализу, применению бактерий Gluconobacter oxydons и выделенных из них ферментов в биосенсорах, а также изложены особенности строения и метаболизма бактерий Gluconobacter oxydons. Глава 2. Во второй главе дано описание материалов и методов исследования. Объектом исследования являлись уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydons sbsp. industrius BKM В-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина). Периодическое культивирование бактерий проводили аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объёмом 500 мл при температуре 28°С в среде следующего состава: сорбит - 200 г/дм3, дрожжевой экстракт - 20 г/дм3, дистиллированная вода - 100 см3. Контроль чистоты культуры осуществляли методом высева бактерий на агаризованную среду.

Ферментные препараты из бактерий Gluconobacter oxydons sbsp. industrius BKM B-1280 (далее G. oxydans) получали путем разрушения биомассы бактерий на ультразвуковом диспергаторе УЗД11-0,1/22 и последовательным центрифугированием.

Спектрофотометрические измерения удельной активности и кинетических параметров биокатализаторов при окислении глюкозы и этанола проводили с использованием спектрофотометра СФ103 в кинетическом режиме при длине волны 600 им. В качестве редокс-красителей использовали 2,6-дихлорфенолиндофенол совместно с феназинметасульфатом, концентрации которых в измерительной кювете составляли 0,15 мМ и 0,75 мМ соответственно.

В работе применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала с помощью медиаторных биосенсоров. Медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод, а рабочим электродом - графитово-пастовый электрод (площадь поверхности 7,1 мм2). Суспензию биоматериала наносили на поверхность рабочего электрода и фиксировали диализной мембраной (Sigma, предел пропускания 14 кДа). Используемые в работе медиаторы ферроценового ряда входили в состав графитовой пасты, из которой формировали рабочий электрод. Электрохимические измерения проводили с помощью гальванопотенциостата

IPC2000 («Кронас», Москва), интегрированного с компьютером. Диапазон регистрируемых токов 1 нА - 10 мА. Компьютерная программа регистрации данных IPC2000 разработана для операционной системы Windows-XP. Амперометрические измерения проводили в цитратно-фосфатном буферном растворе при непрерывном перемешивании при помощи магнитной мешалки (300 об/мин). Обработку данных проводили с помощью программ «Microsoft Excel» и «SigmaPlot 9.0».

Определение индекса БПК5 стандартным методом разбавления проводили согласно действующим в РФ нормативным документам (ПНД Ф 14. 1:2:3:4.1 23-97), согласно которым содержание растворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определяется иодометрическим методом Винклера. Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение. Характеристика биокаталитических свойств бактерий С. oxydans и ферментных фракций

Известно, что уксуснокислые бактерии содержат преимущественно мембранлокализоваиные PQQ-глюкоздегидрогеназу (КФ 1.1.5.2) и

алкогольдегидрогеназу (КФ 1.1.5.5). Свойства ферментных препаратов, как потенциальных биокатализаторов в распознающих элементах электрохимических биосенсоров, можно охарактеризовать с помощью кинетических параметров окисления субстратов. Удельную активность и кинетические параметры биокатализаторов при окислении глюкозы и этанола определяли спектрофотометрическим методом с использованием стандартной системы редокс-красителей (таблица 1).

Таблица 1.

Кинетические параметры окисления этанола и глюкозы целыми клетками бактерий

G. oxydans и выделенными ферментными фракциями

Nv Субстрат Биокатализатор \ Этанол Глюкоза

Константа Михаэлиса Км, ммоль/дм3 Удельная активность х 104, мкмоль/ (мин-мг) Константа Михаэлиса Км, ммоль/дм3 Удельная активность х104, мкмоль/ (мин-мг)

Клетки бактерий 0,75±0,05 1,68±0,08 0,51 ±0,04 1,33 ±0,07

Цитоплазматическая фракция 0,255±0,009 6,0±0,5 0,80±0,07 28 ±2

Мембранная фракция 0,17±0,02 23 ±2 0,84±0,06 4,0 ±0,5

Удельная активность ферментов цитоплазматической фракции по отношению к глюкозе в 4,6 раза выше, чем по отношению к этанолу. Удельная активность ферментов мембранной фракции по отношению к этанолу в 5,8 раз выше, чем по отношению к глюкозе. Таким образом, мембранная фракция более эффективно окисляет этанол, а цитоплазматическая глюкозу. Сравнение значений констант Михаэлиса биокатализаторов на основе ферментных фракций позволяет заключить, что при одинаковой концентрации субстратов скорость окисления этанола

мембранной фракцией выше, чем скорость окисления глюкозы, а скорость окисления глюкозы ферментами цитоплазматической фракции выше, чем скорость окисления этанола.

Таким образом, перспективным биокатализатором окисления этанола является мембранная фракция бактерий G. oxydans.

Анализ кинетических параметров электрокаталитического окисления этанола ферментными системами бактерий G. oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда

Для изучения биоэлекгрокаталитического окисления этанола в присутствии медиаторов электронного транспорта использовали лабораторную модель медиаторного биосенсора кюветного типа (рис. 1).

Рис. /. Внешний вид лабораторной модели медиаторного биосенсора кюветного типа

Рис. 2. Схематическая модель процесса окисления субстрата ферментами бактериальных клеток в присутствии медиаторов электротюго транспорта

субстрат

Мок ^субстрат

IO.

фермоиты

Принцип функционирования медиаторного биосецсора заключается в том, что в процессе окисления субстратов ферментными системами бактерий распознающего элемента увеличивается концентрация восстановленной формы медиатора, которая в дальнейшем окисляется на электроде при наложении соответствующего потенциала, что вызывает прохождение тока через внешнюю нагрузку (рис. 2).

В качестве медиаторов электронного транспорта при электрокаталитическом окислении этанола бактериями & охус1ап$ и выделенной из них мембранной фракцией использовали соединения ферроценового ряда (таблица 2). Используемые соединения содержат различные заместители в циклопентадиенильных кольцах ферроцена как электроноакцепторпые (карбоксильная, гидроксиметильная группы), так и электроиодонорные (метальная, этильная группы). Электронные эффекты заместителей определяют рабочие потенциалы редокс-соединений и могут оказывать влияние на медиаторные свойства соединений.

Таблица 2.

Применяемые в исследовании медиаторы электронного транспорта __ферроценового ряда__

Fe Заместители Название соединения Рабочий потенциал (относительно х.с.э), мВ

R, r2

-с2н5 -н этилферроцен 220

-СН3 -СНз 1,1'-диметилферроцен 220

-Н -н ферроцен 250

-СН2ОН -СН2ОН 1 ,Г-ферроцепдиметанол 350

-соон -н ферроценмонокарбоновая кислота 350

-соон -соон 1,1'-ферроцендикарбоновая кислота 350

Рабочий потенциал медиаторов подбирали экспериментально путем снятия зависимости величины ответа сенсора от налагаемого на систему потенциала. За рабочий принимали потенциал, при котором ответ биосеисора был максимальным.

Отклики медиаторных биосенсоров получали в виде зависимости силы тока от времени при соответствующем рабочем потенциале для каждого медиатора. Протекающий в системе ток пропорционален скорости ферментативной реакции: 1=п-р-у, где п - количество электронов, Р - число Фарадея, V — скорость реакции. За ответ сенсора принимали амплитуду силы тока Д1 - разность между базовой и стационарной величинами тока (в дальнейшем рассмотрении Д1 тождественно 1).

Время, с

— бпосенсор на основе бактерии СЫатпЬаскг охухШь ......бпосенсор на основе мембранной фракции ферментов

Рис. 3. Типичный вид откликов биосенсоров на основе бактерий б. охус1ат и выделенной из них мембранной фракции на этанол в присутствии ферроцена

На рисуике 3 показаны отклики биосенсоров на основе бактерий & охус1ат и выделенной из них мембранной фракции на этанол в присутствии ферроцена. Через некоторое время после добавления этанола ток достигал стационарного значения. Похожие ответы наблюдали для биосенсоров на основе электродов, модифицированных 1,1'-диметилферроценом, этилферроценом, 1,1'-ферроцендиметанолом, ферроценмонокарбоновой и 1,1'-ферроцендикарбоновой кислотами. Следует отметить, что отклик биосенсора на основе мембранной фракции развивается быстрее (в течение 20 секунд), чем у биосенсора на основе целых клеток бактерий (в течение 120 секунд). Кроме того, ответы сенсора на основе мембранной фракции бактерий по абсолютной величине больше, чем микробного сенсора.

Для сравнительной оценки эффективности биоэлектрокаталитического окисления этанола в присутствии соединений ферроценового ряда использовали ранее предложенную модель, где окисление глюкозы суспензированными и иммобилизованными целыми клетками бактерий в присутствии медиаторов переноса электронов рассматривается как двухсубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Предположили, что окисление этанола при использовании в качестве биокатализатора целых бактерий и мембранной фракции будет протекать по аналогичной схеме: к., к2

8+Е°кпггЕ8—^Р+Ев (,)

кл к4

Мок + Ев — ЕМ -М„ + Е0К (2)

где Б и Р - субстрат и продукт; М01( иМ,- окисленная и восстановленная форма медиатора внутри бактериальной клетки соответственно; Еок и Ев - фермент, локализованный в мембране бактериальной клетки в окисленной и восстановленной форме, соответственно; к,, к_ь к2, к3, к_3 и - константы скоростей соответствующих стадий реакции.

При использовании амперометрического метода для регистрации процессов окисления в схему реакции к уравнениям (1) и (2) добавляется еще одна стадия -регенерация медиатора на электроде:

Мв - пе" Мок (3)

Константы скорости электрохимической регенерации медиатора в большинстве случаев велики по сравнению с константами скорости ферментативной реакции, поэтому стадия окисления восстановленной формы медиатора на электроде не лимитирует скорость процесса биоэлектрокаталитического окисления субстратов.

Таким образом, общее уравнение для тока электрокаталитического окисления этанола ферментными системами бактерий, основанное на механизме «пинг-понг», запишется в виде:

/ =--Ь*--—, (4)

где и Км - эффективные константы Михаэлиса для этанола и медиатора соответственно, учитывающие распределение субстрата и медиатора между внутренней средой клетки и раствором.

Исходя из предложенной модели, процесс электрокаталического окисления субстрата ферментными системами бактерий можно охарактеризовать тремя параметрами: максимальной силой тока 1тах, эффективными константами Михаэлиса для этанола и медиатора и Км:

(5)

где концентрация ферментов электрода.

к.

т vivo на единицу площади поверхности

к 2'к 4 к2+к4

(6)

АГс=-

к ,+к,

(7)

к-у+к. к,К,.

(8)

где Кх.р и Км,Р - константы распределения субстрата и медиатора соответственно между внутренней средой клетки и внешним раствором.

Параметры электрокаталитического окисления этанола в присутствии медиаторов электронного транспорта можно рассчитать, используя уравнения типа Михаэлиса-Ментеп (9) - (10), полученные из уравнения (4) при условии избытка медиатора или этанола в системе:

I ( К А (9)

—- при —- (( 1 - избыток субстрата

,/[Щ Г и )

к» ... ^ , ^ (10)

/ = -

при

(( I - избыток медиатора

[М] )

1 + #ГаД5]

Для биосенсоров на основе мембранной фракции и целых клеток бактерий С. охус1ап$ в присутствии медиаторов ферроценового ряда получены зависимости ответов от содержания медиатора в графитовой пасте рабочего электрода (в условиях избытка этанола) и от концентрации этанола (в условиях избытка медиатора) (рис. 4-5). Зависимости генерируемого в биосенсорной системе тока окисления этанола мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта аналогичны зависимостям, полученным при использовании в качестве биокатализаторов целых клеток бактерий.

1,1 '-ферроцеидимегамол ферроценмлнокарбонппвя кмелотя (.Г-фсррткпдикар^ипва« кислот»

этнлфорроцен

1,Г-диммнлферр«негг

ферропеп

и ТУ ¿4 М) «О Э1

Концентрация этанола в кювете, ммоль/длг

Концентрация этанола в кювете, ммоль/дм

Рис. 4. Зависимость ответов медиаторных биосеисоров на основе мембранной фракции бактерий О. оху<1ат от концентрации этанола в условиях избытка медиатора (а - 1,1 -ферроцендиметанола, ферроценмонокарбоновой

кислоты, 1,1 '-ферроцендикарбоновой кислоты; б - этилферроцеиа, 1,1 -диметилферроцена, ферроцена)

Рис. 5. Зависимость ответов медиаторных биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий С. охус/апх от концентрации медиатора (а -этилферроцеиа, 1,1 '-диметилферроцена; б-ферроцена, ¡.¡'-ферроцеидиметанола, ферроценмонокарбоновой и 1,1 '-ферроцендикарбоновой кислот) в условиях избытка этанола (50 мМ)

Из полученных зависимостей по уравнениям (9), (10) рассчитали параметры биоэлектрокаталитического окисления этанола: максимальную силу тока 1та„ эффективные константы Михаэлиса для этанола К8 и для медиатора Км (таблицы 3,

4).

Таблица 3.

Параметры электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий

& охус/апяъ присутствии медиаторов переноса электронов

Медиатор Условия 1таХ5 мкА К8, мМ Км, ммоль/г ^ПИХ/КБ, мкА-дм3/ ммоль 1та>Жм, мкАт/ммоль

этилферро-цеп Этанол 50 мМ 4,0±0,6 0,30+0,05 13,3+0,7

Медиатор 2,3 ммоль/г 4,2+0,7 3,2+0,6 1,3+0,2

1,1'- диметил-ферроцен Этанол 50 мМ 1,4+0,3 0,05+0,01 28,0+0,4

Медиатор 1,4 ммоль/г 1,9±0,4 1,8+0,3 1,1±0,1

ферроцен Этанол 50 мМ 2,1+0,3 0,06+0,01 35+1

Медиатор 1,6 ммоль/г 2,3+0,2 2,1+0,4 1,1+0,1

ферроцел-монокарбо-повая кислота Этанол 50 мМ 2,3+0,1 0,020±0,005 120+30

Медиатор 1,3 ммоль/г 2,5+0,2 1,9+0,1 1,3+0,1

Продолжение таблицы 3.

Медиатор Условия мкА к5, мМ Км, ммоль/г 'пих/Кв, мкА-дм3/ ммоль 1тах/Км, мкА-г/ммоль

1,1'- ферроцен-дикарбоно-вая кислота Этанол 50 мМ 1,5±0,2 0,18+0,02 8+1

Медиатор 1,1 ммоль/г 1,7+0,1 1,1+0,2 1,5+0,3

1,Г-ферроцем-диметанол Этанол 50 мМ 5,0+0,4 0,05+0,01 100+10

Медиатор 1,2 ммоль/г 4,7±0,5 3,7+0,4 1,3+0,1

Таблица '■ Параметры электрокаталитического окисления этанола мембранной фракцией бактерий С. охус/апя в присутствии медиаторов переноса электронов

Медиатор Условия 1тах> мкА к8, мМ Км> ммоль/г ^шах^Кз, мкА-дм3/ ммоль 'тах/Км, мкА-г/ммоль

этилферро-цеп Этанол 50 мМ 3,8±0,4 - 0,03±0,01 - 130±30

Медиатор 1,4 ммоль/г 4,2±0,2 1,2±0,3 - 3,5±0,4 -

1,1'- диметилфе рроцен Этанол, 50 мМ 4,3±0,2 - 0,018±0,003 - 240±30

Медиатор 1,4 ммоль/г 4,4±0,2 1,3±0,2 - 3,4±0,3 -

ферроцен Этанол 50 мМ 4,1 ±0,2 - 0,008±0,002 - 510±80

Медиатор 1,6 ммоль/г 4,5+0,1 1,2±0,1 - 3,7±0,2 -

1,1'-ферроцен-диметанол Этанол 50 мМ 7,0±0,5 - 0,009±0,004 - 800±100

Медиатор 1,2 ммоль/г 8,0±0,5 2,4±0,5 - 3,3±0,5 -

ферроцен-монокарбо-новая кислота Этанол 50 мМ 4,5±0,3 - 0,0014+0,0003 - 3200±500

Медиатор, 1,3 ммоль/г 4,7±0,2 1,3±0,2 - 3,7±0,4 -

1,1'-ферроцен-дикарбоно-вая кислота Этанол, 50 мМ 4,5±0,6 - 0,15±0,07 - 30±8

Медиатор, 1,1 ммоль/г 4,6±0,1 1,3±0,2 - 3,5±0,5 -

Значения максимальной силы тока 1тах для биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий больше значений 1та1С для биосенсоров на основе целых клеток. Возможно, это связано с тем, что при использовании мембранной фракции бактерий количество доступных для субстрата и медиатора активных центров ферментов на

единицу поверхности электрода значительно увеличивается по сравнению с использованием целых клеток.

Из уравнений (5-8) следует, что отношение Imax/Ks характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с этанолом и не зависит от используемого медиатора (11), а отношение Imax/KM - характеризует взаимодействие медиатора с ферментом и дает индекс эффективности медиатора электронного транспорта (12).

Ks {к^кг) Ku (k^+kj

Величины Imax^Ks Для медиаторов ферроценового ряда совпадают в пределах погрешности (таблицы 3, 4), что подтверждает принятую модель. Однако, при использовании в качестве биокатализатора мембранной фракции

значения в

3-4 раза выше, чем при использовании целых клеток бактерий. Это свидетельствует о том, что применение в качестве биокатализатора мембранной фракции дегидрогеназ по сравнению с целыми клетками бактерий позволяет более эффективно проводить биоэлектрокаталитический процесс окисления этанола.

Сравнивая индексы эффективности Imax/KM> можно заключить, что эффективность медиаторов при окислении этанола как для биосенсоров на основе мембранной фракции, так и на основе целых клеток бактерий G. oxydans увеличивается в ряду: 1,Г-ферроцендикарбоновая кислота<этилферроцен<1,Г-диметилферроцен<ферроцеп<1,Г-ферроце11диметаиол<ферроценмонокарбоновая кислота. Таким образом, наиболее эффективным медиатором является ферроценмонокарбоновая кислота. Однако, в случае ферментов в составе мембранной фракции их взаимодействие с медиаторами на поверхности электрода намного эффективнее, чем в случае использования ферментов в составе целых клеток, о чем свидетельствует увеличение индекса эффективности в несколько раз.

Стоит отметить, что полученные индексы эффективности для медиаторов независимо от используемого биокатализатора связаны с электронными эффектами заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электроиоакцепторные заместители (карбоксильная, гидроксиметильная группы) увеличивают индекс эффективности, а электронодонорные (метильная, этильная группы) заместители, напротив, уменьшают эффективность. Однако 1,Г-ферроцендикарбоновая кислота не подчиняется этому правилу, что может быть связано с гидрофилыюстыо этого соединения и затруднением диффузии медиатора через гидрофобные мембраны биоматериала к активным центрам ферментов.

Таким образом, показано, что взаимодействие в системе «бактериальные клетки G. oxydans / выделенная мембранная фракция - этанол - медиатор -электрод» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Процесс биоэлектрокаталитического окисления этанола более эффективно протекает при использовании в качестве медиатора ферроценмонокарбоновой кислоты. В качестве биокатализатора предпочтительно использование мембранной фракции бактерий. Дальнейшие исследования проводили с использованием медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий.

Выбор рабочих параметров функционирования медиаторного биосенсора

Для разработки макета медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий б. оху(1ат необходимо подобрать условия, при которых генерируемый сенсором ток будет максимальным. Выявлены зависимости ответов медиаторных биосенсоров от рН среды, массы биоматериала на электроде, концентрации солей буферного раствора, а также определена долговременная и операционная стабильность медиаторных биосенсоров. На основе полученных зависимостей определены рабочие параметры медиаторных биосенсоров, представленные в таблице 5.

Таблица 5.

Рабочие параметры и стабильность медиаторных биосенсоров на основе

мембранной фракции бактерий & охуйат

Медиатор рН среды Содержание медиатора, ммоль/г Концентрация солей буферного раствора, моль/дм3 Масса мембранной фракции на электроде, мкг Операционная стабильность , % Долговременная стабильность , сутки

ферроцен 1,6 4 29

этилферро-цен 1,4 2 12

и- диметил-ферроцен 1,4 2 15

1,1'-ферроцен-диметанол 6,5 1,4 0,18 180 2 4

ферроцен-монокарбо-новая кислота 1,3 2 4

1,1- ферроцен-дикарбоно-вая кислота 1,1 19 2

* операционную стабильность характеризовали относительным стандартным отклонением для 15 измерений, %

** За время стабильной работы биосенсора принимали время, в течение которого величина сигнала составляла не менее 70% от начальной.

Наибольшее время стабильной работы получено для биосенсора на основе ферроцена. В то время как биосенсор на основе ферроценмонокарбоновой кислоты (самого эффективного медиатора) был нестабилен. Это связано со значительным снижением концентрации медиатора электронного транспорта за счет высокой растворимости ферроценмонокарбоновой кислоты.

Субстратная специфичность мембранной фракции бактерий G. oxydons в присутствии медиаторов электронного транспорта

Важной характеристикой любого анализа является его селективность. В случае биосенсорного анализа селективность определяется преимущественно субстратной специфичностью биоматсриала, используемого для формирования рецепторного элемента сенсора. При биоэлектрокаталитическом окислении субстратов селективность сенсора может также зависеть от используемого медиатора.

Субстратная специфичность мембранной фракции бактерий G. oxydons определена в присутствии медиаторов ферроценового ряда при биоэлектрокаталитическом окислении субстратов (рис. 6). Наибольшие токи медиаторный биосенсор генерировал при окислении глюкозы ферментами мембранной фракции бактерий. Высокие ответы биосенсора наблюдали при биоэлектрокаталитическом окислении одноатомных спиртов нормального строения: 1-пропапола, 1-бутанола, этанола (за исключением метанола). При окислении ферментами мембранной фракции спиртов разветвленного строения ответы биосснсора были значительно ниже. Важно отмстить, что при использовании медиаторов ферроценового ряда с различными заместителями профиль субстратной специфичности мембранной фракции меняется незначительно.

Рис. 6. Профиль субстратной специфичности мембранной фракции бактерий & oxydans в присутствии медиаторов электронного транспорта (за 100% приняли ответ биосеисора на глюкозу)

Полученная в работе субстратная специфичность биокатализатора на основе мембранной фракции бактерий хорошо согласуется с субстратной специфичностью целых клеток & oxydans в присутствии медиатора ферроцена (рис. 7). Это позволяет предположить, что в биосенсорах на основе целых клеток бактерий с медиатором

электронного транспорта взаимодействуют преимущественно

мембранлокализованные ферменты.

При использовании мембранной фракции ответы биосенсора на спирты становятся соизмеримыми с ответами на глюкозу, в отличие от клеток, при использовании которых ответ на глюкозу и другие углеводы выше ответов на спирты (рис. 7). Возможно, это связано с тем, что активные центры алкогольдегидрогеназ становятся более доступными для медиатора после их выделения в виде мембранной фракции.

120

100

Я мембранная фракция

бактерий □ целые клетки бактерий

^ ^ ^

^ ^ * * / / / / / / / /./ ^-V/:////////////

^ ч~ N V > >'

V -V

Рис. 7. Профиль субстратной специфичности бактерий О. охус/ап.ч и выделенной из них мембранной фракции в присутствии ферроцена как медиатора электронного транспорта (за 100% приняли ответ биосенсора на глюкозу)

Медиаторные биосенсоры па основе мембранной фракции бактерий & охус1ап5 благодаря своей биохимической активности по отношению к целому ряду углеводов и спиртов могут быть использованы для определения содержания легкоокисляемых соединений в водных объектах, например, индекса БПК. Экспресс-определснис индекса БПК медиаторным биосенсором на основе мембранной фракции бактерий С. охуйшк

Индекс БПК является важной характеристикой степени загрязненности воды легкоокисляемыми органическими веществами. Одной из важных задач в экологии является контроль БПК сточных вод бродильных производств, в том числе спиртовых производств. Сточные воды спиртовых заводов характеризуются высоким содержанием органических соединений, выброс которых приводит к эутрофикации водоемов и дальнейшей гибели естественных экосистем. Традиционная методика определения БПК является продолжительной процедурой (от 5 до 20 суток) со сложной пробоподготовкой. Альтернативой являются экспрессные методы определения БПК с использованием биосенсорных анализаторов, например: клеточных биосенсоров на основе кислородного электрода

Кларка, принцип функционирования которых основан на измерении скорости дыхания микроорганизмов вблизи поверхности преобразователя. Для того, чтобы на значение БПК, определяемого с помощью микробного дыхания, не влияло количество растворенного кислорода в образце, предложено использовать медиаторные БПК-биосенсоры. Следует отметить, что в медиаторных микробных сенсорах генерируются токи в 100 - 1000 раз большие, чем при использовании кислородного электрода, что обеспечивает возможность дальнейшей миниатюризации биосенсоров (создания микросснсоров).

При разработке макета БПК-биосенсора на основе мембранной фракции бактерий в качестве медиатора электронного транспорта выбрали ферроцен, так как это соединение позволяет разрабатывать воспроизводимый и чувствительный биосенсор для определения БПК сточных вод бродильных производств. Важно, что для регистрации токов биоэлектрокаталитического окисления использован гальванопотенциостат серии IPC, который зарегистрирован в Государственном реестре средств измерений и допущен к применению в Российской Федерации. Это обеспечивает возможность продвижения разработанного биосенсора на Российский рынок БПК-анализаторов.

Для построения градуировочной зависимости ответа биосенсора от концентрации определяемого соединения использовалась смесь глюкозы и глутаминовой кислоты - стандарта для определения индекса БПК (рис. 8). Линейный диапазон градуировочной зависимости ответов сенсора от концентрации глюкозо-глутаматной смеси составил 0,05-0,65 г/дм3, что соответствует значениям БПК5 34 - 440 мг/дм3.

БПКр мг/дм

Рис. 8. Зависимость ответов биосеисора от значений индекса БПК5 (медиатор - ферроцен, биокатализатор - мембранная фракция бактерий)

В качестве образцов для определения индекса БПК5 с помощью медиаторного биосенсора использовали отходы спиртового производства (ржаную барду), а также полупродукты брожения пшеничной и ржаной муки, имитирующие состав сточных вод бродильных производств (таблица 6).

Таблица 6.

Значения индексов БПК5 образцов, полученные с помощью медиаторного _^_биосенсора и стандартным методом разбавления_

№ образца Значение БПК5, Значение БПК5,

Название образца определенное с помощью биосенсора, г/дм3 определенное стандартным методом, г/дм3

1 Бродильная смесь на основе

пшеничнои муки после добавления 1-го фермента сн- 3,1 ±0,2 2,9±0,2

ам и лазы

2 Бродильная смесь на основе

пшеничнои муки после 33±3 35±2

добавления 2-го фермента

глюкоамилазы

3 Бродильная смесь на основе

пшеничной муки после 48±5 49±5

процесса брожения

4 Бродильная смесь на основе

ржаной муки после добавления глюкоамилазы и 29±4 26±3

а-амилазы

5 Бродильная смесь на основе ржаной муки после процесса брожения 45±5 47±5

6 Барда ржаная 3,0±0,6 2,8±0,6

Полученные результаты определения индекса БПК5 с помощью биосенсора согласуются с данными, полученными стандартным методом разбавления.

Таким образом, разработанный макет медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans и медиатора ферроцена можно использовать для определения индекса БПК стоков бродильных производств.

Выводы

На основе анализа кинетических параметров (удельной активности, констант Михаэлиса) биокатализаторов - бактерий G. oxydans и выделенных из них ферментных фракций, выявили, что перспективным биокатализатором окисления этанола является мембранная фракция бактерий G. oxydans. Впервые показано, что взаимодействие в системе «бактериальные клетки G. oxydans / выделенная мембранная фракция - этанол - медиаторы ферроценового ряда» можно рассматривать как двухсубстратнуго ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосенсорах.

Установлено, что эффективность медиаторов независимо от используемого биокатализатора связана с электронными эффектами заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электроноакцепторные заместители увеличивают индекс эффективности, а электронодонорные заместители уменьшают.

Показано, что применение в качестве биокатализатора мембранной фракции дегидрогеназ по сравнению с целыми клетками бактерий позволяет более эффективно проводить биоэлектрокаталитические процессы. Определены рабочие параметры функционирования биосепсоров на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans (рН 6,5; концентрация солей буферного раствора - 0,18 моль/ дм3; масса биокатализатора на электроде - 180 мкг; содержание медиатора- 1,1-1,6 ммоль/г), которые следует использовать при создании опытных образцов приборов для серийного освоения и применения. Разработанный макет медиаторного биосснсора на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans применили для оценки индекса БПК5 отходов спиртового производства, имитирующих состав сточных вод. Разработанный макет биосенсора позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1) Понаморева О.Н., Ииджгия Е.Ю., Алферов В.А., Решетнлов А.Н. Эффективность биоэлектрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда // Электрохимия. 2010. Т. 46. № 12. С. 1503-1508.

2) Чигрииова (Ииджгия) Е.Ю., Иськив Е.Н., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Влияние электронных заместителей в молекулах ферроценов на их медиаторные свойства в биосенсорных системах на основе бактерий Gluconobacter oxydans // Известия Тульского государственного университета Сер. Химия. Тула. 2008. Вып. 2 . С. 238-245.

3) Чигрииова (Ииджгия) ЕЛО., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры па основе производных ферроцена и бензохинона, применяемых в качестве медиаторов // Сенсорные системы. 2007. Т. 21. № 3. С. 262-268.

4) Babkina Е., Chigrinova (Indzhgiya) Е., Ponamoreva О., Alferov V., Reshetilov A. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter oxydans. Evaluation of water-insoluble mediator efficiency // Electroanalysis. 2006. Vol. 18. № 19-20. P. 2023-2029.

5) Чигрииова (Ииджгия) Е.Ю., Бабкина E.E., Алферов В.А. Безреагентный медиаторный биосенсор на основе бактерий Gluconobacter oxydans для определения БПК сточных вод // Известия Тульского государственного университета. Сер. Химия. Тула. 2006. Вып. 6. С. 153-161.

6) Arlyapov V.A., Chigrinova (Indzhgiya) Е. Yu., Ponamoreva O.N., Reshetilov A. N. Express detection of BOD in wastewaters of starch-processing industry // Starch science and technology. Editor: G.E. Zaikov. Nova Science Publishers. 2008. P. 43 - 50.

7) Понаморева O.H., Бабкина E.E., Чигрииова (Ииджгия) ЕЛО., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные медиаторные биосенсоры. //Сборник трудов Международной научной конференции «Фундаментальные основы инженерных наук». 2006. Т. 2. С. 96-102.

8) Chigrinova (Indzhgiya) E.Yu., Babkina E.E., Ponamoreva O.N., Alferov V.A., Reshetilov A.N. Parameters of microbial sensor with ferrocenes and quinines as mediators // Book of Abstracts. International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006. Moscow. 2006. V. 1. P. 292.

9) Чигрииова (Ииджгия) Е.Ю., Бабкина E.E., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность функционирования медиаторов электронного транспорта в биосенсорах на основе Gluconobacter oxydans // Материалы IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». 2006. Томск. Том 2. С. 443-444.

10) Чигрииова (Ииджгия) ЕЛО. Система «бактериальные клетки-медиаторы электронного транспорта-графитовый электрод» как основа безреагентных микробных биосенсоров // Сборник статей Российской школы-конферепци молодых ученых «Экотоксикология: современные

биоаналитические системы, методы и технологии». Пущино. 2006. С. 62-64.

11) Чигрииова (Инджгия) Е.Ю., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н. Биоэлектрокаталитическое окисление субстратов бактериями Gluconobacter oxydans II Материалы четвертого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2007. Т. 2. С. 269.

12) Sergey V. Alferov, Ekatcrina U. Chigrinova (Indzhgiya), Liudmila G. Tomashevskaia, Elena E. Babkina, Olga N. Ponamoreva, Anatoly N. Reshetilov. Biosensor Approach to assessment of efficiency of mediators for their application in microbial biofuel cells // the International Conference «Molecular and nanoscale systems for energy conversion (MEC-2007)». Moscow. 2007. P. 37-43.

13) Чигринова (Инджгия) E.IO. Эффективность медиаторов электронного транспорта биоэлектрокаталического окисления этанола бактериями Gluconobacter oxydans в биосенсорах и биотопливных элементах // Сборник трудов Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино. 2008. С. 183-184.

14) Чигринова (Инджгия) Е.Ю. Действующий образец биосенсорного анализатора БПК // Сборник тезисов докладов X Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». Казань. 2009. С. 260-262.

15) Панченко Е.А., Чигринова (Инджгия) ЕЛО., Понаморева О.Н. Биосепсор на основе мембранной фракции ферментов бактерий Gluconobacter oxydans и медиаторов ферроценового ряда // Сборник статей Российской школы-конференци молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». Пущино-Тула. 2009. С.66-67.

16) Инджгия ЕЛО., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н. Медиаторный биосепсор на основе мембранной фракции ферментов бактерий Gluconobacter oxydans для экспресс-определения БПК сточных вод // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». Москва. 2010. С. 437-438.

Подписано в печать 22.11.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Инджгия, Екатерина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Медиаторные биосенсоры.

1.2. Бактерии С1исопоЬас1ег охуйат и их применение в биосенсорных технологиях.

1.2.1. Особенности метаболизма бактерий рода СЫсопоЬаМег.

1.2.1.1. Особенности дегидрогепаз бактерий аисопоЬаМег.

1.2.1.2. Окисление глюкозы бактериями СЫсопоЬасЬег.

1.2.1.3. Окисление спиртов бактериями СЫсопоЬаМег.

1.2.2. Применение С1исопоЬаМег охуйат и выделенных из них ферментов в биосенсорных технологиях.

1.2.2.1. Электрохимические биосенсоры на основе целых клеток аисопоЬасЬег.

1.2.2.2. Электрохимические биосенсоры на основе выделенных ферментов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электрокаталитическое окисление этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда"

Способность микроорганизмов взаимодействовать с медиаторами электронного транспорта определяется доступностью ферментных систем для этих соединений. Известно, что уксуснокислые бактерии СШсопоЬаМег имеют мембранную локализацию основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов - РС^-зависимых альдоз - и алкогольдегидрогеназ, что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Кроме того, различные штаммы бактерий СЫсопоЪасЬег охусЯат широко используются в качестве биокатализаторов во многих биотехнологических процессах получения пищевых и биологически активных соединений. Биохимической особенностью штамма аисопоЪаМег охус1ат БиЬзр. industrius BKM В-1280 является эффективное окисление этилового спирта, что можно использовать при разработке биосенсоров для экспресс-определения содержания этанола в биотехнологических средах.

Наиболее перспективными медиаторами при разработке биосенсоров являются соединения ферроценового ряда. Пара ферроцен - катион ферроцения представляет собой высоко обратимую окислительно-восстановительную систему. Ферроцены в сочетании с биокатализаторами на основе ферментов широко используют при разработке электрохимических биосенсоров, в то же время взаимодействие ферроценов с биокатализаторами на основе бактерий мало изучено. Представляется актуальным исследование закономерностей электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM В-1280 в сравнении с выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.

Работа выполнялась в рамках проектов РНП.2.1.1.7789 (2006-2008 г.; ВП «Развитие научного потенциала высшей школы»), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2013г.), госконтракт № 02.740.J 1.0296, госконтракт № П 551, РФФИ 09-03-97528 (2009 г.). Автор работы является лауреатом стипендии Президента РФ на 2009/2010 учебный год, а также победителем конкурса Программы «Участник молодеэ/сного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2009 г. (г. Казань), госконтракт № 7282 р/10122.

Цель работы:

Выявление закономерностей электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM В-1280 и выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• Охарактеризовать биокаталитические свойства бактерии Gluconobacter oxydans subsp. indus trius BKM B-1280 и ферментных фракций спектрофотометрическим методом.

• Разработать макет медиаторного биосенсора. Определить рабочие параметры функционирования (рН, концентрация солей, концентрация медиатора, масса биокатализатора на электроде) биосенсоров на основе медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда.

Научная новизна

Установлено, что окисление в биоэлектрокаталитических системах «этанол - мембранная фракция или целые клетки бактерий аисопоЬаМег охусЯат - медиаторы ферроценового ряда - электрод» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг», что обусловлено функционированием мембранлокализованных ферментов. Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосенсорах. Установлено, что мембранная фракция бактерий является более эффективным катализатором в системах окисления этанола в присутствии медиаторов ферроценого ряда.

Впервые определены индексы эффективности медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в электрокаталитических системах окисления этанола на основе целых клеток уксуснокислых бактерий 01исопоЬас1ег охус1ат БиЬБр. тсклзМт ВКМ В-1280 и мембранной фракции этих бактерий, которые увеличиваются в ряду: 1,1'-ферроцендикарбоновая кислота<этилферроцен<1,1 '-диметилферроцен<ферроцен<1,1'-ферроцендиметанол <ферроценмонокарбоновая кислота. Показано, что эффективность медиаторов - производных ферроцена, зависит от электронных эффектов заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена, электроноакцепторные заместители увеличивают индекс эффективности медиатора, а электронодонорные - уменьшают.

Практическая значимость работы

Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий ОЫсопоЬаМег охус1апз и мембранной фракции бактерий могут быть использованы в качестве научной основы, при разработке электрохимических биосенсоров для экологического контроля? и мониторинга биотехнологических процессов.

Разработан макет биосенсорного анализатора на основе мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM В-1280 и медиатора ферроцена для экспресс-определения индекса БПК в отходах бродильных производств. Полученные результаты показывают возможность применения действующего макета биосенсорного анализатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: поставлены две новые лабораторные работы «Определение рабочих параметров функционирования микробного медиаторного биосенсора» и «Определение индекса БПК отходов спиртового производства с помощью биосенсора на основе ферроцена и мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans» по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. и. 2010 г. {диплом, медаль конкурса)', Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», (Пущино) в 2006 г. {диплом лауреата конкурса) и 2009 г.; Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино), 2008 г. {диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008 г.» (Москва), 2008 г. {диплом, медаль выставки); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва), 2007 г.; Международной конференции «Molecular and nanoscale systems for energy conversion (MEC-2007)» (Москва),

2007 г.; Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006» i

Москва), 2006 г.; IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск), 2006 г.

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 10 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Инджгия, Екатерина Юрьевна

выводы

На основе анализа кинетических параметров (удельной активности, констант Михаэлиса) биокатализаторов - бактерий С. охуЛапя и выделенных из них ферментных фракций, выявили, что перспективным биокатализатором окисления этанола является мембранная фракция бактерий С. охус1апя.

Впервые показано, что взаимодействие в системе «бактериальные клетки С. охус1ап$ / выделенная мембранная фракция - этанол - медиаторы ферроценового ряда» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосенсорах.

• Определены рабочие параметры функционирования биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans (рН 6,5; концентрация солей буферного раствора - 0,18 моль/ дм ; масса биокатализаторал на электроде - 180 мкг; содержание медиатора - 1,1-1,6 ммоль/г), которые следует использовать при создании опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

• Разработанный макет медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans применили для оценки индекса БПК5 отходов спиртового производства, имитирующих состав сточных вод. Разработанный макет биосенсора позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признательность д.х.н., зав. лабораторией биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина УРАН Решетилову Анатолию Николаевичу и коллективу кафедры химии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и интерпретации результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Инджгия, Екатерина Юрьевна, Москва

1. Биосенсоры: основы и приложения: Пер. с англ./ Под. ред. Э. Тернера, И. Карубе, Дж. Уилсона. - М:. Мир, 1992. - 616 с.

2. Gorton L. Selective detection in flow analysis based on the combination of immobilized enzymes and chemically modified electrodes // Analytica Chimica Acta. 1991. Vol. 250. P. 203-210

3. Kalcher K., Kayffmann J., Wang J., Svancara I., Yang Z. Sensors based on carbon paste in electrochemical analysis: a review with particular emphasis on the period 1990-1993 //Electroanalysis. 1995. Vol. 7. № 1. P. 5-22

4. Tkac J., Vostiar I., Gorton L., Gemeiner P., Sturdik E. Improved selectivity of microbial biosensor using membrane coating. Application to the analysis of ethanol during fermentation // Biosensors and bioelectronics. 2003. № 18. P.1125-1134

5. Ikeda Т., Matsuyama K., Kobayashi D., Matsushita F. Whole-cell enzyme electrodes based on mediated bioelectrocatalysis // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1992. Vol. 56. № 8. P. 1359-1360

6. Wang S., Lu L., Yang M., Lei Y., Shen G. and Yu R. A novel cobalt hexacyanoferrate nanocomposite on CNT scaffold by seed medium and application for biosensor // Analytica Chimica Acta. 2009. Vol. 651. № 2. P. 220-226

7. Sheng Q., Shen Y., Zhang H. and Zheng J. Neodymium (III) hexacyanoferrate (II) nanoparticles induced by enzymatic reaction and their use in biosensing of glucose // Electrochimica Acta. 2008. Vol. 53. № 14. P. 4687-4692

8. Skladal P., Morozova N., Reshetilov A. Amperometric biosensors for detection of phenol using chemically modified electrodes contaning immibilizid bacteria // Biosensors and Bioelectronics. 2002. № 17. P. 867873

9. Takayama K. Biocatalyst electrode modified with whole-cells of P. denitrificans for the determination of nitrate // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1998. № 45. P. 67-72

10. Zou C., Fu Y., Xie Q., Yao S. High-performance glucose amperometric biosensor based on magnetic polymeric bionanocomposites // Biosensors and Bioelectronics. 2010. Vol. 25. № 6. P. 1277-1282

11. Che X., Yuan R., Chai Y., Li J., Song Z. and Li W. Amperometric glucose biosensor based on Prussian blue-multiwall carbon nanotubes composite and hollow PtCo nanochains // Electrochimica Acta. 2010. Vol. 55. № 19. P. 5420-5427

12. Lenarczuk T., Wencel D., and Koncki R. Prussian blue-based optical glucose biosensor in flow-injection analysis // Analytica Chimica Acta. 2001. Vol. 447. № 1-2. P. 23-32

13. Li T., Yao Z. and Ding L. Development of an amperometric biosensor based on glucose oxidase immobilized through silica sol-gel film onto Prussian Blue modified electrode // Sensors and Actuators B: Chemical. 2004. Vol. 101. № 1-2. P. 155-160

14. Li L., Sheng Q., Zheng J. and Zhang H. Facile and controllable preparation of glucose biosensor based on Prussian blue nanoparticles hybrid composites //Bioelectrochemistry. 2008. Vol. 74. № 1. P. 170-175

15. Largueze J-B., Kirat K. and Morandat S. Preparation of an electrochemical biosensor based on lipid membranes in nanoporous alumina // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2010. Vol. 79. № 1. P. 33-40

16. Kawakami M., Tanaka K., Uriuda N. and Gondo S. Effects of nonionic surfactants on electrochemical behavior of ubiquinone and menaquinone incorporated in a carbon paste electrode // Bioelectrochemistry. 2000. Vol. 52. № 1. P. 51-56

17. Enzyme electrodes (Marco Cardosi, University of Paisley) (сайт) URL: http://www-biol.paisley .ac.uk/marco/EnzymeElectrode/Chapterl/Start.htm (дата обращения: 21.08.2007)

18. Перевалова Э.Г., Решетова М.Д., Гранберг К.И. Методы элементоорганической химии. Ферроцен. М.: Наука, 1983. - 557 с.

19. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера, 2005.- 336 с.

20. Katz Е., Shipway A.N., Willner I. Медиаторы электронного переноса (сайт). URL: http://chem.kcn.ru/science/Katzl/Content.htm (дата обращения: 01.11.2009)

21. Allen P.M., Hill Н.А.О., Watron N.J. Surfase modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytocrome c. // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1984. Vol. 178. P. 69-86

22. Smolander M. Electrochemical aldose detection with PQQ-dependent aldose dehydrogenase: Dissertation for the degree of doctor of technology. Espoo. 1995. 55 pages.

23. Chen M., Diao G. Electrochemical study of mono-6-thio-P-cyclodextrin/ferrocene capped on gold nanoparticles: Characterization andapplication to the design of glucose amperometric biosensor // Talanta. 2009.Vol. 80. № 2. P. 815-820

24. Qiu J.-D., Deng M.-Q., Liang R.-P. and Xiong M. Ferrocene-modified multiwalled carbon nanotubes as building block for construction of reagentless enzyme-based'biosensors // Sensors and Actuators B: Chemical. 2008. Vol. 135. № 1. P. 181-187

25. Tkac J., Vostiar I., Sturdik E., Gemeiner P., Mastihuba V. and Annus J. Fructose biosensor based on D-fructose dehydrogenase immobilised on a ferrocene-embedded cellulose acetate membrane // Analytica Chimica Acta. 2001.VoL 439. № l.P. 39-46

26. Bean L.S., Heng L.Y., Yamin B.M. and Ahmad M. Photocurable ferrocene-containing poly(2-hydroxyl ethyl methacrylate) films for mediated amperometric glucose biosensor // Thin Solid Films. 2005. Vol. 477. № 1-2. P. 104-110

27. Deppenmeier U., Hoffmeister M., Prust C. Biochemistry and biotechnological application of Gluconobacter strains // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. № 60. P. 233 242

28. Giridhar R., Srivastava A.K. Model based constant feed fedbatch 1-sorbose production process for improvement in 1-sorbose productivity // Chemical and Biochemical Engineering Quarterly. 2000. № 14. P. 133-140

29. Boudrant J. Microbial processes for ascorbic acid biosynthesis: a review. Enzyme and Microbial Technology. 1990. № 12. P. 322-329

30. Schedel M. Regioselective oxidation of aminosorbitol with Gluconobacter oxydans, a key reaction in the industrial synthesis of 1-deoxynojirimycin // Biotechnology. 2000. Biotransformations. Kelly, D.R., Ed. Wiley-VCH, Weinheim. P. 296-311

31. Claret C., Bories A., Soucaille P. Glycerol inhibition of growth and dihydroxyacetone production by Gluconobacter oxydans II Current Microbiology. 1992. № 25. P. 149-155

32. Weenk G., Olijve W., Harder W. Ketogluconate formation by Gluconobacter species // Applied Microbiology and Biotechnology. 1984. № 20. P. 400-405

33. De Ley, Gillis M., Swings J. The genus Gluconobacter II In: Krieg N.R., Holf J.G. (eds) Bergey's manual of systematic bacteriology. 1984. Vol. 1. P. 267-278

34. Matsushita K., Toyama H., Adashi O. Respiratory chains and bioenergetics of acetic acid bacteria // Advances in Microbial Physiology. 1994. № 36. P. 247-301

35. Klasen R., Bringer-Meyer S., Sahm H. Biochemical characterization and sequence analysis of the gluconate: NADP 5-oxidoreductase gene from Gluconobacter oxydans II The Journal of Bacteriology. 1995. № 177. P. 2637-2643

36. Choi E.S., Lee E.H., Rhee S.K. Purification of membrane-bound sorbitol dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans II Microbiology Letters. 1995. № 125. P. 45-50

37. Adachi O., Toyama H., Matsushita K. Crystallne NADPH-dependent D-mannitol dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans II Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 1999. № 63. P. 402-407

38. Hoshito T., Sugisawa T., Fujiwara A. Isolation and characterization of NAD(P)-dependent L-sorbosone dehydrogenase from Gluconobacter melanogenus UV10 // Agricultural and Biological Chemistry. 1991. № 55. P. 665-670

39. Sugisawa T., Ojima S., Matzinger P.K., Hoshitino T. Isolation and characterization of a new vitamin C producing enzyme (L-gulonolactone dehydrogenase) of bacterial origin // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 1995. № 59. P. 190-196

40. Shinagawa E., Matsushita K., Adachi O., Ameyama M. Selective production of 5-keto-B-gluconate by Gluconobacter oxydans II Journal Perm. Technology. 1983. № 61. P. 359-363

41. Pronk J.T., Levering P.R., Olijve W., Van Dijken J.P. Role of NADP-dependent and quinoprotein glucose dehydrogenases in gluconic acid production by Gluconobacter oxydans II Enzyme and Microbial Technology. 1989. № 11. P. 160-164

42. Ameyama M., Shinagawa E., Matsushita K., Adachi O. B-glucose dehydrogenase of Gluconobacter suboxydans Solubilization, purification and characterization // Agricultural and Biological Chemistry. 1981. № 45. P.851-861

43. Hommel R., Ahnert P. Gluconobacter. In: Encyclopedia of Food Microbiology. Robinson R., Batt C., Patel P. Eds., Academic Press, London. 2000. P. 955-961

44. Velizarov S., Beschkov V. Biotransformation of glucose to free gluconic acid by Gluconobacter oxydans-. substrate and product inhibition situations // Process Biochemistry. 1998. № 33. P. 527-534

45. Velizarov S., Beschkov V., Georgieva T. Inhibitory effects of gluconic acid on glucose oxidation by Gluconobacter II Comptes Rendus de I'Academie Bulgare des Sciences. 1997. № 50. P. 63-66

46. Gupta A., Singh V. K., Qazi G.N., Kumar A. Gluconobacter oxydans: Its biotechnological applicacations // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2001. № 3. P. 445-456

47. Sonoyama T., Tani H., Matsuda K., Kageyama B., Tanimoto M., Kobayashi K., Yagi S., Kyotani H., Mitsushima K. Production of 2-keto-L-gulonic acid from B-glucose by 2-stage fermentation // Applied and Environmental Microbiology. 1982. № 43. P. 1064-1069

48. Grindley J.F., Payton M. A., Vandepol H., Hardy K. G. Conversion of glucose to 2-keto-L-gulonate, an intermediate in L-ascorbate synthesis, by a recombinant strain of Erwinia citreus // Applied and Environmental Microbiology. 1988. № 54. P. 1770-1775 '

49. Reshetilov A.N., Donova M.V., Dovbnya D.B., Boronin A.M., Lethers T.D., Greene R.V. FET-microbial sensor for xylose detection based on Gluconobacter oxydans cells // Biosensors and Bioelectronics. 1996. № 11. P. 401-408

50. Reshetilov A.N., Iliasov P.V., Donova M.V., Dovbnya D.B., Boronin A.M., Lethers T.D., Greene R.V. Evaluation of a Gluconobacter oxydans whole cell biosensor for amperometric detection of xylose // Biosensors and Bioelectronics. 1997. № 12. P. 241-247

51. Tkac J., Gemeiner P., Svitel J., Benikovsky T., Sturdik E., Vala V., Petrus L., Hrabarova E. Determination of total sugars in lignocellulose hydrolysate by a mediated Gluconobacter oxydans biosensor // Analítica Chimica Acta. 2000. № 420. P. 1-7

52. Toyama H., Mathews F.S., Adachi O., Matsushita K. Quinohemoprotein alcohol dehydrogenases: structure, function, and physiology // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2004. № 428. P. 10-21

53. McNeil B., Harvey L. Energy well spent on prokaryotic genome // Nature Biotechnology. 2005. № 23. P. 186-187

54. Prust C., Hoffmeister M., Liesegang H., Wiezer A., Fricke W., Ehrenheich A., Gottschalk G., Deppenmeier U. Complete genome sequence of acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans II Nature Biotechnol. 2005. № 23. P. 195-200

55. Tkac J., Navratil M., Sturdik E., Gemeiner P. Monitoring of dihydroxyacetone production during oxidation of glycerol by immobilized Gluconobacter oxydans cells with an enzyme biosensor // Enzyme and Microbial Technology. 2001. № 28. P. 383-388

56. Valach M., Katrlik J., Sturdik E., Gemeiner P. Ethanol Gluconobacter biosensor designed for flow injection analysis. Application in ethanolfermentation off-line monitoring // Sensors and Actuators B. 2009. 138. P. 581-586

57. Lee S.A., Choi Y., Jung S.H., Kim S. Effect of initial carbon sources on the electrochemical detection of glucose by Gluconobacter oxydans II Bioelectrochemistry. 2002. № 57. P. 173-178

58. Lusta K.A., Reshetilov A.N. Physiological and biochemical features of Gluconobacter oxydans and prospect of their use in biotechnology and biosensor system (review) // Applied Biochemistry and Microbiology. 1998. № 34. P. 307-320

59. Vostiar I., Ferapontova E.E., Gorton L. Electrical «wiring» of viable Gluconobacter oxydans cells with a flexible osmium redo polyelectrolyte // Electrochemistry Communications. 2004. № 6. P. 621-626

60. Tkac J., Svitel J., Novak R., Sturdik E. Triglyceride assay by amperometric microbial biosensor: Sample hydrolysis and kinetic approach // Analytical Letters. 2000. № 33. P. 2441-2452

61. Tuncagil S., Odaci D., Varis S., Timur S. and Toppare L. Electrochemical polymerization of l-(4-nitrophenyl)-2,5-di(2-thienyl)-l H-pyrrole as a novel immobilization platform for microbial sensing // Bioelectrochemistry. 2009. Vol. 76. № 1-2. P. 169-174

62. Tkac J., Vostiar I., Gemeiner P., Sturdik E. Monitoring of ethanol during fermentation using a microbial biosensor with enhanced selectivity // Bioelectrochemistry. 2002. № 56. P. 127-129

63. Арляпов B.A., Понаморева O.H., Алферов B.A., Рогова Т.В., Блохин И.В., Чепкова И.Ф., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры для экспресс-определения БПК сточных вод предприятий пищевой промышленности. Вода: Химия и Экология. 2008. №3. С. 20-22

64. Takayama K. Mediated electrocatalysis at a biocatalyst electrode based on a bacterium Gluconobacter industrius II Journal of Electroanalytical Chemistry. 1993. №356. P. 295-301

65. Adachi O., Tayama K., Shinagawa E., Matsushita K., Ameyama M. Purification and characterization of particulate alcohol dehydrogenase from Gluconobacter oxydans II Agricultural and Biological Chemistry. 1978. №. 42. P. 2045-2056

66. Adachi O., Tayama K., Shinagawa E., Matsushita K., Ameyama M. Purification and characterization of membrane-bound aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter oxydans II Agricultural and Biological Chemistry. 1980. №. 44. P. 503-515

67. Ameyama M., Shinagawa E., Matsushita K., Adachi O. D-fructose dehydrogenase of Gluconobacter industrius: purification, characterization, and application to enzymatic microdetenination of D-fructose // Journal of Bacteriogy. 1981. № 5. P. 814- 823

68. Shinagawa E., Matsushita K., Adachi O., Ameyama M. D-gluconate dehydrogenase, 2-keto-D-gluconate yielding, from Gluconobacter -dioxyacetonicus -purification and characterization // Agricultural and Biological Chemistry. 1984. № 48. P. 1517-1522

69. Gluconobacter suboxydans var a II Agricultural and Biological Chemistry. 1982. №46. P. 135-141

70. Hoshino T., Sugisawa-T., Masako S., Tomiyama N., Miyazaki T. Membrane-bound D-sorbitol dehydrogenase of Gluconobacter suboxydans IFO 3255 enzymatic and genetic characterization // Biochimica et Biophysica Acta. 2003. № 1647. P. 278-288

71. Ameyama M., Shinagawa E., Matsushita K., Adachi O. Solubilization, purification and properties of membrane bound glycerol dehydrogenase from Gluconobacter industries II Agricultural and Biological Chemistry. 1985. №. 49. P. 1001-1010

72. Lapenaite I., Kurtinaitiene B., Marcinkeviciene L., Bachmatova I., Laurinavicius V., Ramanavicius A. An enzymatic sensor for the analysis of glycerol in beverages //Chemical Papers. 2001. № 55. P. 345-349

73. Razumiene J., Niculescu M., Ramanavicius A., Laurinavicius V., Csoregi E. Direct bioelectrocatalysis at carbon electrodes modified with quinohemoprotein alcohol dehydrogenase from Gluconobacter sp. 33 // Electroanalysis. 2002. № 14. P. 43-49

74. Laurinavicius V., Razumiene J., Ramanavicius A., Ryabov A.D. Wiring of PQQ-dehydrogenases // Biosensors and Bioelectronics. 2004. № 20. P. 1217-1222

75. Malinauskas A., Kuzmarskyte J., Meskys R., Ramanavicius A. Bioelectrochemical sensor based on PQQ-dependent glucose dehydrogenase // Sensors and Actuators B: Chemical. 2004. № 100. P. 387-394

76. Tkac J., Vostiar I., Gemeiner P., Sturdik E. Stabilization of ferrocene leakage by physical retention in a cellulose acetate membrane. Fructose biosensor//Bioelectrochemistry. 2002. № 55. P. 149-151

77. Aizawa M., Yabuki S., Shinohara* H., Ikariyama Y. Electrically regulated biocatalytic processes of redox enzymes embedded in conducting polymer membrane // Annals of the New York Academy of Sciences. 1990. №. 613. P. 827-83

78. Begum A., Kobatake E., Suzawa T., Ikariyama Y., Aizawa M. New electroanalytical interface for fabricating a fructose dehydrogenase-based sensing system // Analytica Chimica Acta. 1993. №. 280. P. 31-36

79. Treu B.L., Minteer S.D. Isolation and purification of PQQ-dependent lactate dehydrogenase from Gluconobacter and use for direct electron transfer at carbon and gold electrodes // Bioelectrochemistry. 2008. № 74. P. 73-77

80. Справочник химика. Под ред. Б.П.Никольского. Том III. JL: Химия. 1965. с. 169-171

81. Пустовалова JI.M.' Практикум по биохимии. Ростов-на-Дону: Феникс, , 1999. - 544 с.

82. Smolander M., Buchert J., Viikari L. Large-scale applicable purification and characterization of a membrane bound PQQ-dependent dehydrogenase // Biotechnology. 1993. № 29. P. 287-297

83. Tkac J., Svitel J., Vostiar I., Navratil M., Gemeiner P. Membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter sp.: Interfacial electrochemistry and direct bioelectrocatalysis // Bioelectrochemistry. 2009. № 76. P. 53-62

84. Луста K.A., Решетилов A.H. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 4. С. 339-353

85. Laurinavieius V., Razumiene J., Kurtinaitiene В., Gureviene V., Marcinkeviciene L., Bachmatova I. Comprative characterization of soluble and membrane-bound PQQ-glucose dehydrogenases // Biologija. 2003. №2. P. 31-34

86. Okochi M., Matsunaga T. Electrochemical sterilization of bacteria using graphite electrode modified with adsorbed ferrocene // Electrochimica Acta. 1997. V. 42. № 20-22. P. 3247-3250

87. Ikeda Т., Kurosaki Т., Takayama К., Капо K. Measurements of oxidoreductase-like activity of intact bacterial cells by an amperometric method using a membrane-coated electrode // Analytical Chemistry. 1996. V. 68. P. 192-198

88. Бабкина E.E. Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans: Дисс. канд. хим. наук. Тула. 2006. 129 с.

89. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: Фаир-Пресс, 1999. 720 с.

90. Islami М., Shabani A., Saifi-Abolhassan М., Sepehr S., Soudi M.R., Mossavi-Nejad S.Z. Purification and characterization of alcoholdehydrogenase from Gluconobacter suboxydans II Pakistan Journal of Biological Sciences. 2008. № 11. P. 208-213

91. Арляпов B.A., Асулян Л.Д., Власова Ю.А., Ануфриев М.А., Блохин И.В., Карташова Т.Д. Иммобилизация клеток Gluconobacter oxydans для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров // Известия ТулГУ. Серия Химия. 2006. Вып. 6. С. 137 -144

92. Чигринова Е.Ю., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры на основе производных ферроцена и бензохиноиа, применяемых в качестве медиаторов // Сенсорные системы. 2007. Т. 21. № 3. С. 262-268

93. Ввозная H. Ф. Химия воды и микробиология. М.: Высш. школа, 1979.-361 с.

94. Hikuma М., Suzuki Н., Yasuda Т., Karube I., Suzuki S. Amperometric estimation of BOD by using living immobilized yeasts // European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 1979. № 8. P. 289-297

95. Nomura Y., Chee G. J., Karube I. Biosensor technology for determination of BOD // Field Analytical Chemistry and Technology. 1998. № 2. P. 333-340

96. Riedel K., Kunze G., Konig A. Microbial sensors on a respiratory basis for wastewater monitoring // Advances in biochemical engineering/biotechnology. 2002. 75. P. 81-118

97. Yoshida N., Yano K., Morita Т., McNiven S. J., Nakamura H. and Karube I. A mediator-type biosensor as a new approach to biochemical oxygen demand estimation // The Analyst. 2000. 125. P. 2280-2284

98. Yoshida N., Hoashi J., Morita Т., McNiven S. J., Nakamura H., and Karube I. Improvement of a mediator-type biochemical oxygen demand sensor for onsite measurement // Journal of Biotechnology. 2001. №. 88. P. 269-275

99. Richardson N., Gardner S., Rawson D. A chemically mediated amperometric biosensor for monitoring eubacterial respiration // Journal of Applied Bacteriology. 1991. № 70. P. 422-426

100. Pasco N., Baronian K., Jeffries C., Hay J. Biochemical mediator demand a novel rapid alternative for measuring biochemical oxygen demand // Applied Microbiology and Biotechnology. 2000. 53. P. 613-618

101. Pasco N., Baronian K., Jeffries C., Webber J., Hay J. MICREDOX -development of a ferricyanide-mediated rapid biochemical oxygen demand method using an immobilized Proteus vulgaris biocomponent // Biosensors and Bioelectronics. 2004. № 20. P.524-532

102. Morris K., Zhao H., and John R. Ferricyanide-mediated microbial reactions for environmental, monitoring // Australian Journal of Chemistry. 2005. № 58. P. 237-245

103. Гармаш А.В., Сорокина Н.М. Метрологические основы аналитической химии (электронная версия). URL: http://lib.ololo.cc/b.usr/A.V.GarmashMetrologicheskieosnovyianalitic heskoyhimii.pdf

Информация о работе

Инджгия, Екатерина Юрьевна
кандидата химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Электрокаталитическое окисление этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы