Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологический синтез бета-хлормолочной кислоты

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологический синтез бета-хлормолочной кислоты"

КАЗАНСКИЙ ОРЛЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ----------------------ИМЕНИ В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА------------

- На правах рукописи

Семина Исина Грнняльопня

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ХЛОРМОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

ОЗ. 00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1994

Работа выполнена в отделе биофизики Института биологии Казанского научного центра РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

М. И.Беляева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Р. П. Наумова кандидат технических наук, с.н.с. С. Г. Мухачев

Ведущая организация: Московская Государственная Академия химического машиностроения

Защита состоится "¿£."„^£.<¿1 1995 г. в // часов на заседании специализированного С вета К 053.29.19 в Казанском ордена Ленина к ордена Трудового Красного Знамени государственном университете им В.И.Ульянова-Ленина по адресу:420008, Казань, ул.Ленина,18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им.В. И. Ульянова -Ленина по адресу: 420008', Казань, ул.Ленина, 35.

Автореферат разослан " 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблем'- й последние годы наблюдается -повывенный "интерес химической промышленности к разработке микробиологических сии тезсв различных соединении, таг. как они выгодно отмнчытся cneim-'.ivif? кой направленностью своего действия; протекают при обычных температурах I! давлении; их осуществление не требует ни антикоррозионной апла -ратурц. h;i крупных энергетических затрат, Поэтому задачей совоеменной микробиологической наук;; является дальнейшее раоглу не и v:\";."\. ;>г-ксследовгний Зизиояогии и биохимии кикр „организмов г- л?язи с iiwijkc:'. и выявлением закономерностей синтеза новнх полезных для народного

: '.'.'Л rv МПЙМ .:.1ил»н™1Ы11 птолог,»«л

М ..............- ' Г------- - .......,, „_ , „.,,.,,,,•,-,

^ ■* . -- ------ . w >» UIWjHI '( Ч I -Т! '.'Г*" ™ ____________.

Хлормолочная кислота широко используется как полупродукт для получения пестицидов, негорючих материалов н ряда органических соединений, используемых в малой химии.

J) - хлормолочная кислота - неприродное соедоненне. В промышленности она получается химически., способом при окислении <1- хлоргидрина ( 3-хлор-1,2-пропандиола ) или эпйхлоргидрина (З-хлор-i.2-эпо; зипропа-на ) глицерина азотной кислотой. Существенные недостатки химического метола синтеза целевого продукта { низкая с. .c-.vn:sn>;c7i-, гуялГ'К»? токсичннх окислов азота, нестабильность скорости прот-зхагия ;;р;/ . особенно сильно проявляющиеся в уологпях расширен.-то крмк^олгк!. :: так:;:е ?зозрас7ак;«ая тенденция развит;:;; химической г;;':кьчл^н. .тл лекее-v.i к ноязлечте исследований, направлю-«5« на н'г«:илг!к* созг х.::-г7Г, -к-ологичеехи;-; способов получения fi- хлормодочнеа кислоты.

Инстсг&я работа выполнялась согласно .-iViHiiiP <• ин:«стл; -> П" г;:оизво;:ст;>\' м/нералпны; удобрении в ранка;-. когп;лоьечоЛ ;;,■■;.; 'Сез-тшие телеологии производства ¿¡реларата "7сл/и и ли-

лупродуктов".

Лнали.ч литер п'уры свидетельствует о ;п„ ;г:;;п л; чине ; елл'-е—ел.

C;iHT03y ^ -/лорпо^с^но:; ч;:л г.ц. ;.г.о :Лие-< -ел -у четами ( Kokai, 1934;Hasegav;a, Yu,.zo et al, 1986, а; б ) и ферментными препаратами ( Hlrsehbeln, Whitesldes, 1982; Urban et al,l983; Huiimel et al, 1985; Kates et al,1985; Wong et al,l935; Yamazaki, .4ueda, 1986 ).

Известные биологические способ1; подуч--т.'.л хлорполочн^й кислот;; имеет весы.:-, f значительные выход продукта и степень конверсии субстрата, кроме того они достаточно трудоемки и продзлгзггельпи. и с сблзи

с этим но имеют промышленного значения.

Отсутствие дат^х о влиянии предшественников целевого продукта, а также ряда физико-химических факторов на рост и окислительную способность его продуцентов обуславливает необходимость изучения особенное тей их физиологии и биохимии. Кроме того, эти исследования способствуют расширению представлений о путях метаболизма ксенобиотиков, к которым относятся JL- хлоргидрин и. эпихлоргидрин глицерина.

Таким образом, изучение процесса получения ß -хлормолочной кислоты с помощью микроорганизмов в равно.., мере важно как в теоретическим отношении, так и при решении практических задач.

Цель п задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась ь поиске наиболее активных продуцентов хлормолочной кислоты как из числ-. микроорганизмов синтезирующих этот продукт, так и среди неисследованных в этом отноиений микроорганизмов, способных осуществлять реакции неполного окисления спи тов, и изучение условий, обеспечисающих максимальное образование продукта при окислении ¿¿-хлоргидрина или эпихлор-гидрина глицерина.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Исследование образования .¿-хлормолочной кислоты представителями микроскопических грибов p.Geotrlchum и p.Saccharomyces, а такке бактериями. ■ принадлежащими к родам Gluconobacter. Aeetobacter. Pseudomonas, и отбор наиболее активных продуцентов.

2. Выявление условий, обеспечивающих оптимальный рост и высокую окисл,.гельную способность активного продуцента хлормолочной кислоты.

3. Изучение условий и биохимии процесса образования целевого продукта.

Научная новизна. Показана возможность синтеза хлормолочной кислоты п; 'Дставителями различных систематических групп микроорганизмов, ранее неисследованных с этой целью. Впервые установлено, что штамм уксуснокислых бактерий Acetobacter acetl ЛГ-15 способен к активному окислению «¿-хлоргидрыа глицерина до ^-хлормолочной кислоты. Хлоргидрин глицерина не является ростовым субстратом для этих микроорганизмов. более того, он оказывает ингибирущее действие на их рост и окислительную способность. В связи с этим рекомендовано процесс получения хлормолочной кислоты осуществлять в 2 стадии: выращивание культуры уксуснокислых С.лсгерий А. acetl ЛГ-15 с высокой окислительной активностью и осуществление синтеза целевого продукта при окислении хлор

- s -

гидрина глинерпиа полученной суспензиеГ клеток. ---------Ксследованч-зависиггостя'удельноЯ" сксроста'ростг;, рйхШ'ЯГ^.ПТ

и уровня окислительной cno< юности бактерий условиях гоздей':г-'и;- ••• UuuUhíx ¿изико-химичееких Факторов среды ( концентрации ростового суос-тртп, рН. наличия дополнительного органического субстрата, гш~нлст; бактериальной суспензии ).

"КНСЛОННС хг гидрияа глицерина суспбнэпоп Клс'.оХ '!•:•• í. i ЛГ-«/-;ijv "■■■■л^т yMif-/ийно лишь п условиях кочетлРолп.: ^ и ■ у - ■ тоього субстрата - этилового спирта. Количество образующейся в этом

СЛУЧае ХЛООМОЛОЧНПЙ КМГ.-ППТН пяпнг.ит к nunmm nL:<jn<inL. лч- лппфишпепшл

iluiiutn i LfaUHH n.ui: vue Ttisl 1 мк и 'Wlfïo пт vrnnnMÜ ппо пооппфд m. ij^rtr,

вания бактерия и "возраста" используемой культуры. Из/чекие процесса соскисления спиртов позволило предположить вероятный механизм вовлечения ксенобиотика ( х„^ргидрика глицерина ) в метаболизм уксуснокислых бактерий при участии неспецифичных алкоголь- и альдеглддегидрогелаз этих микроорганизмов.• Для уксуснокислых бактерий все перечисленные вопросы являются неизученными.

Практическая значимость. Выявлен новый аспект исгользовашш дея-Т"Л'ЛЮ~ТН УКСУСНОКИСЛЫХ бактерий ДЯЯ UWMsuru «йши;« Ji •г.чп.т,:

ни-готы Создана гэоретичесхал основа гетода пг-ун"Л'я /'. :»" " •••*• •• » ¡•.¡:оя)ТЫ, ^ к -о ч -з -ci : ; ; -1 я. p¡..r ащиьаниз культуры бактс-р.«: с ¡упеке;; :;* г.у. ;-.-Л:.но;"1 способность» и проведение окисления хлог'Гпдсхна i.■•;:: ...:. ..с /полоты суспензий клеток Acctobactc- acotí ЛГ-ió

Разработан регламент истода, обеспсчивгнхнй ч -

••■> продукта i 15 г/л ) и степень пнверсии субстрма '. oü.ь". ,. ¡.иго.-шо от г.'ччпт огп от известных оиолсл'.ческих чхх;- ; ' :. р-

молочной кислоты, разработанный нами способ г /учения кис,;-... //.„.ьн авторским свидетельством СССР !ю 1678836, 1991 г.

-•"оЗаптл pciyoin. Материал'! диоиуюн,:,' ,v. /v/.ti . " •.. расширенном задании отдела ипочпзпги ííiící;:;./: j ".ne.. .■;. . ■ .."-.. . -научного центра РАЙ ( 1994 ).

Основные положения диссертационной работы сообщены и обсуждены на итоговых научных конференциях Ют 1ШЦ РАН ( Казань, 19РП,1939. '990 ), га конференции молодых ученых КИБ КНЦ РАН "Кёхсшшы ре- -/.-лц-.-н уункцн-онирования биологических систем и методы их изучения" < Казань, 1533 ;. Всесоюзном координационном • совещании по ,пестицидам ( Черноголовка. 1988), Международном симпозиуме по биотехнол' -ни ( Иерзсбург. 1939). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и обърм диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа иллюстрирована 31 рисунком и 8 таблицами. Список литературы содержит 238 работ из них 155 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ^СЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы микроскопические грибы Geotrichum candldun ( шт. 30,1.10,11,15.37,40,56.81,91.107,120,122 ).полученные из коллекции культур института биохгогп им. А.Н.Баха РАН и ферментный препара: из пекарских дрожжей Sacchara;.yces cerevlslae, а также бактериальные культуры: Gluconobacter oxydms ( шт. 18,95 J.Pseudomonas fUmrescens 890, Pseudomonas a"reoi.ciens 2028. Pseudomonas aeruginosa 889, -Pseudomonas stutzeri 4136 ( из коллекции культур Санкт-Петербургского государственное университета ): Gluconobacter oxydans Д-20 ( ВНИИ пищевой биотехнологии, Москва ) и Acetobacter acetl ЛГ-15 ( Московская государственная академия химического машиностроения ).

G.candldum выращивали на синтетической среде с глюкозой { Ко-kal,1984 ). Культивирование G.oxldans Д-20 проводили на среде с глицерином ( 150 г/л ),кукурузным экстрактом ( 12.5 г/л ) и минеральными солями KHjPO^ ( 3 ;/л ). MgSOy( 0,25 г/л ). Бактерии рода Pseudomonas и штаммы G. oxydans 18 и 95 выращивали на среде А ( Павленко,1980 ). уксуснокислые бактерии A. acetl культизировали на синтетической среде с этанолом ( 1 г/л ). фосфатами (Шф^НРО^ ( 1 г/л ). КНгР0^( 1 г/л ) п сульфатом магния ( ,25-0.50 г/л ).

Выращивание грибных и бактериальных культур проводили в аэробных условиях при интенсивном перемешивании на качалках ( 200-220 об/мин ) при зо°с.

Определение способности штаммов G.candldum образовывать^-хлормо-леную кислоту изучали на среде; содержащей eC-монохлоргидрин или эпих-лоргидрин, с глюкозой или без нее.

Образование целевого продукта при они еле..ии хг ргидрина или эпих-лоргиг~ина глицерина бактериальными культурами проверяли на следующих средах: для псевдомонад использовалась среда Б ( Павленко.1980 ) с глицерином ил,1 без него; для G. oxydans шт. 18 и 95 - среда В ( Павленко. 1980 ) с глюкозой или сахарозой, сорбитом, глицерином или без них.

для G.oxydans Д-20 среда им?ла слздувгдай состав: глиаер;ш ; 1С-' г/л > или без не г«, кукурузкки экстракт ( 6,3 г/л ) u муо^ ( 5 г/л ): дуй, "'"асе'Л" ЛГ-" 1Г~!!споль:-иеалась "роГ;1Сва7Го"рёда~"с 'этаюлои 1йт~7»ез 4,s:v> или этил.-'1<г"п еч>ця си глицерином.

Удельную скорость роста, экономический и метаболический кпг4!>«чч-ентг ( по этанолу ) рассчитывали по формулам ( Перт. \<-'П'. > Сод' р:;;акн= с елка r клетках определяли по модифицированному методу Лоури ( горн-на,Яковлева IPS." ). "т^нол и ацетат определяли ити гэз^-чзш-лстг"^! уромз? "рай;;» i Hns^o. 19% ) ■ J)~ хлорнолочну» кислот1, «гаг-: як !•' »."и методом газо-шдкостнол'хроматографип на'хроматографе "Слгст-4". Олр?-

ЛР-ЛймИР КНР ппти ni'Ui'ior.TH па п» о п ~ — ~ —

/|ЙНнПИ МПППНКО ППМЫПН 1 On пи Г\ ЛЧ ТГо Г» А Г\г> 4ПП

r.iesh. Температуру термостата программировали от GO до 200° с со скоростью Ю°С/кин. Газ - носитель - гелий, расход 35 мл/мин. Детектор пламенно-ионизационный.

"Зичазкый" комплекс получали растиранием клето". дрожжей S.serevl-slae с окисью алюминия ( Герхардт. 1984 ).

Для получения экстрактов клетки бактерий ресуспензировали в На--фосфатном буфере (рН 7.0) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2? при частот кГц, затем центрифугировали 40 ><и;:ут при 12000 о&/м?!н. В опытах использовали сулер.чатантную Фракции.

Ллкогольдегидрогеназную активность уксуснокислых бактернп л.агеп /1Г-1Г> определяли по восстановлении HAD при спектрофосмстрип при ллинп волны ЗЮ им.

Результаты исследований обрабатывали пето нем вариацаошгой .:п»м. -тики ( Романенко и др..1987 ).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Сравнительное изучение способности микроорганизмом ¡1 дерч»н: ньк 'препаратов ч образован;:, ji - хлормэлочной шгелэти.

Хлоргидрин и эппхлоргидрин глицерина - непрмродные соединения. С.чи не являются ростовыми субстратам! ни для одного из исследуемых нами микроорганизмов, а именно ь-ти птаммов микрижиета Geotrlchum cancti-ciurc и 0 бактериальных штаммез, принадлежащим к родам Gluconobacler. Acetobacter. Pseodomonas.

Предварительный скрининг возможных проду;ентов ^-хлормолочней

- В -

кислоты выявил ряд культур, способных к окислению J. -хлоргидрина глицерина, единственного органического соединения в среде, до целевого продукта.

Процесс неростового окисления хлоргидрина глицерина до хлорнолоч ной кислоты наблюдался у бактериальных культур G.oxydans шт.18 ч S5; А. acetl ЛГ-15; ?. fluorescens 890; Р. aeruginosa tf&9; P.stuizerl ¿136 ( табл.: ).

Эгшдоргидрин но подвергался трансформации пол воздействием изучаемых микроорганизмов, вероятие, из-за наличия в молекуле трудио расцепляемого эпоксидного кольца.

способность микроорганизмов трансформировать субстраты, которые не могут использоваться ими в качзстзе единственного источника углерода и энергии, известка давно и широко используется. Сама возможность вовлечения неприродных соединений в метаболизм микроорганизмов основана преде всего на существовании ферментов, у которых отсутствует специфичность к субстрату или специфичность в отношении осуществляемой ими функции ( Наумова, 1985 ).

Проведанные исследования »¡оказали, что хлоргидрин глицерина не только не является субстратом роста, но и полностью подавляет его ь присутствии ростовых субстратов. Выросшие (48 часовые) культуры микроскопического гриба Geotrlchum candldum окисляют ксенобиотик до хлор-молочной кислоты ; табл.1 ). Полученные данные согласуются с результатами японских исследователей ( Kokal, 1S84; Hasegawa. 1986 ),отмечавших, что образование хлермолочной кислот« у грибов ( Geotrlciium loublerl и Trlcnosporon erlense ) не связано с ич. ростом и является дыхательным процессом.

Окисление хлорированного спирта до кислоты ( дегидрирование протекает при участии неспещфичных дегидрогенаь - ферментов, которые распространены среди указанных выше микроорганизмов ( Scheldon, 1934; Matos et al. 1985; Wong et al.i985 ).

С. едя изученных микромицетов наиболее эффективным с образовании хлормолочной кислоты является природной штамм G.candldum з-j ; табл. 1 ). Мутаатныа по целлюлазной активности штаммы G.candidum 0.10.11,15,37,5G,91,107,120,122 ) накапливают значительно меньшее количество целевого продукта. Как показали наши эксперименты,обра: ванне

елочной кислоты выросшими грибными культурам; в результат- неполного оки^лени** хлоргилрина глицерина протекает в присутствии iilou-точкогэ количества

06pa3OBaHKe Jl - xjicpmojiohhoU khcjiotn l^pMHrnn '.v. nwnapaTOK.

TaC^iiui 1

nwi:poopri.ui!2MaMi!

HiiKtwoppanH-wu

MaKOHVaJIbHOe KOJUi- BpeMH -iC3S- CI'sCW»«

HecTOO ofipaajtoaieB- hhs npouec- ko!!b?p-»»' cs khcjiotu. r/a ca, huc cy^crf»*»*. ?

T'liKpoi-nmeiH:

■"•>.<: u iotiur^ candid urn 3c

(.'eotricnum cancMrtum '. 1

HftA tr' ohnm /-> o. M i ^««•vi «A . rfl r-ttum rt o -»»^ 4 rt*y+ 4 *

'JtJ'Jtr Iciium Geotrichum Geotrlchum Geotrlchum Geotrichum Geotrlchum Geoirlchum Ceotrlchum ilfOU'! chun

oandldura canJldum candldum candldun candidum candldum candid^ 10? candldum 120 candidum 122

15 37 40 56 81 91

1, 1 <' » 0,30 «•

0,01 * 0,05 *

0,04 *

CJiew 0,04 «

0,03 * 0,03 *

120

120 120 12 J 120 120 120 120 ;_-o 12'/

'">. ' 'I! 1, 50

0.05 0,25

0,20

0,20

r

caKTeptn:

Giuconobacter oxydans 16 0.C3

Cluconobacter oxycins S5 0.43 Glueonooacu,r oxydans n-20

Awicbacter acotl /I,'-!5 0,07/ 3.00

Psoudoir.onas flaorescpp.s f-90 0,38

Pseudoraor.as aureofaclens 2028 cjiexu

Pseudomona? aeruginosa 86? 0,52

PoiMqcrnonao Ftuizerl 4136 0,15

24

24 24

n

1 .

iepweHTHUfl nponapar: "3HMa3Ha0" KOMimeKc ¡13

Eaccharomyces cerevlslae 1.80 0, 7

* - oepaaoBamre khc^oth b yc.aoBW>x kom^taunyvte.

ростового субстрата ( глюкозы ), что согласуется с данными Кокай,Хаси-гава ( Kokal.1984; Ha3Sgawa et al. 1986 а ). По мнению ряда авторов ( Ылегель, 1987; Давранов и др. 1990 ) высокие концентрации ростового субстрата являются одной из причин нарушения регуляции метаболизма грибов, приводящих к неполному окислению.

Известно, что стимуляция , биохимической деятельности микроорганизмов мокет быть достигнута путем кометаболизма ( соокисления ) при наличии в среде дополнительного субстрата, сопряженно используемого в качестве источника углерода и азста для роста или как энергетический материал ( Скрябин, Головлева,1972; Еербина, 1978, Kmet,1990 ).

С целью увеличения выхода хлормолочной кислоты были проведены эксперименте по окислению хлоргидрина глицерина бактериальными культурами в условиях коиотаболизма. Результаты исследований показали, что введение ростсвых субстратов в среду с хлоргидрииом не стимулировало продуцирование хлорлактата у большинства штаммов. Исключение составила акетогенная уксуснокислая бактерия A.aceti ЛГ-15. где в случае внесения этилового спирта ! 2% объема ) в среду с «¿-хлоргидрииом глицерина ( 22 веса ) концентрация кислоты через 24 часа достигала 3 г/л.

Учитывая наибольший выход целевого продукта, а также сравнительно непродолжительное время ведения процесса, культура уксуснокислых бактерий A.aceti ЛГ-15 била отмечена как более перспективный продуцент хлормолочной кислоты к отобрана для дальнейших исследований.

2. Подбор условий, обеспечивающих оптимальный реет и окислительную способность A.aceti ЛГ-15.

Сведения, касающиеся возможности получения хлормолочной кислоты при трансформации хлоргидрина глицерина уксуснокислыми бактериями и, в частности A.aceti ЛГ-15, в литературе отсутствуют. В настоящпй работе предпринята попытка изучения метода синтеза Ji -хлормо-очной кислоты из «С- хлоргидрина глицерина, культурой A.ace'l ЛГ-15, что потребовало ьсестиронее изучение физиологии этой бактерии при использовании столь необычного для неё субстрата ( хлоргидрина глицерина ).

Исследования, направленные на оптимизацию роста и окислительной активности, выявили зависимость названных параметров, от концентрации этилового спирта • классического субстрата для A.aceti. Проведенные

¡ами исследования показали, что этанол оказывает ингибирусщее действие ш развитие.культуры,- если присутствует в избытке ( рис.1 )-------------------

Максикалышй прирост биомассы ( 0,9 г/л ) наблюдается в присутствии 1,0-;; оСь..'№ спирта. Концентрации этилового спирта менее 0.5% н.-.-•¡••¿спечикают конструктивный обмен, наблюдается лимитирование роста па субстрату, а виз 1% термозит процесс размножения бактерий.

Оптимальными лля роста являются 0,5 - 1.0% концентрации субстрата Токсичное действие зтиловоп спирта на рост А.аееи Г.Г-\Г- гарчета „я но мер.; ;2з..лченля его содержания ц проявляв!ся а ;а!Ин;енни удеяшеп скорости роста бактерий, увеличении продолжительности лаг-фазн. воз-

ПО Г» та 13 им ипп ПС т»« »V ЯЧ1Л<Я /.. (Кляттяп I т яшгтлл л ттти • » .|лмллл ■» I «»>оЛ я ** \

Таблица 2

Физиологические показатели роста АсеЮЬассег асе с 1 ЛГ-15

на этаноле.

концентрация длительность время ге- удельная ско- экономичес-зтанола, лаг-фазы, нерации, рость роста, кий коэффи-

2 обьаиа «ее час час ~ ци^нт,г/г

0.25 5 7.5 0, ОЭ 0,25

0,5 4.9 5.8 0,;.? 0, Г0

1.0 4.7 7,2 0..10 0,12

1.5 5,3 8,9 Г/. 08 0,07

2,0 7,5 12.6 О.Се '\Оо

Яровенко с соавторами ( 1986 ) такие отмечали ингионрующее рост действ»0 пуЛлтрат? при непрерывном культивировании .». г гркеут^тгни

объема и. большего количества этанола. Варфоломеег и чдогснкП ' 1 Эч-С считают. что для спиртов феномен субстратного ингибирования при высоких их концентрациях является характерным.

Повышение содержания этилового спирта в ростовой сроде приводит к росту окислительной активности А. асе». Метаболический коэффициент по скнелению этанола возрастает в з, 5 раза при увеличении концентрации субстрата от 0,25 до 2% объема ( рис.2 ). что иллюстрирует "разобщенность" конструктивного и энергетического пропс-сов яри росте * ас-': ЛГ-15 на среде с различным содержанием этанола.

- лг -

"1о 20 30 40 50 время,час

0,5 1,0 1,5 2,0 этанол, % объема

Рис.3 Рост уксуснокислых бактерий Асеюьааег асе и ЛГ-15 на средах с этанолом.

Рис. 2 Влияние содержания гтанола в среде на рост н; и окислительную активность ( о) Асе!;о-

1. 0.25% этанола 4. 1.5% этанола Ьас1ег асеи ЛГ-15.

2. 0,5% этанола 5. 2,05 этанола

3. 1.0% этанола

Является ли токси.чноз действие высоких концентраций этанола на рост уксуснокислых бзктерий результатом его непосредственного влияния или оОразувщейся при окислении спирта уксусной кислоты ( рис.3 ) остается неясным.

Уксуснокислые бактерии рода АсеЮЬа^ег способны к окислению уксусной кислоты и используют её в своём конструктивном обмене ( Лой-цянская. 1966; Готтшалк,19С2 ).. Результаты наших исследований показали, что потребление уксусной кислоты растущей культурой А.асеИ в условиях, когда весь этанол у»е израсходован, объясняется затратами ее на биосинтез ( рис.3 }.

При культивировании А. асеИ ЛГ-15 на смешанном субстрате ( 0.5% этанола и 1% ацетата ) увеличивается количество образующейся биомассы до 1,2 г/л ( рис.4 ). Однако, в этих условиях культура развивается медленнее 0,07 час"), рост её наступает после более длительной задержки (■ 7 часов ) в сравнении с аналогичными параметрами при росте на моносубстрате ( 0,5% этанола ). Кроме того, уксусная кислота отрицательно влияет на окислительную активность бактерий, что выражается в

3,0

2,8 2,6

20 30 40

Рис.3 Динамика роста '1)

потребления субстрат ' и содержания уксусной кислсти (3) при росто

« л » « Г г' •

на среде с ^тамолсч

время, час

снижении скорости окисления этилового спирта в даг-фазе клетками А.асеИ ЛГ-15 в присутствии уксусной кислоты в 1.5 раза ( рис.5 ).

3,2 3,0 ^2,в

4 2,6

и

4 2,4

л

и 2,2

л

о 2,и

о

1,а

13

о о 05 2 О

О

и

У

К

10

50

20 30 40

вреня, час

!-ис 4 Рост АосЮЬаиег асеЧ ЛГ-15 на мсносуСстрате - этаноле (1) и ъ присутствии уксусной кислоты (2).

6 12 18 24

время, час Рис.5 Скорость окисления этанолч АсеюЬасСег асег.1 ЛГ-15 ири иоае на моносубстраге : о ) и в пгис/г ствии уксусной кислоты ' » ■ Полученные нами данные подтверждаются наблюдениями ряда автзров. гмечавшими токсичтее действие уксусной кислота для роста микр^срг^-

низмов ( Zlnes, Rogers, 1970; 1971; Abbot. 1973; Смирнова. Октябрьский. 1935 ) и. в частности, уксуснокислых метилотрофов Acetofcac-ter me thy11cum ( Андрианова. Давидова, 1988;193Э ).

Результаты исследований по влиянию внешних Факторов на рост и окислительную способность уксуснокислых бактерий были учтены при наращивании активной биомассы клеток A.acetl ЛГ-15 для прицесса окисления хлоргидрпна глицерина до fe- хлормолочной кислоты.

Учитывая тот факт, что этиловый спирт в концентрации выше \% объема. а также хлоргидрин глицерин - более 0,1% ингибируют рост уксуснокислой бактерии, а эффективное окисление ксенобиотика до целевого продукта наблюдается линь в присутствии высоких концентраций этилового спирта, осуществление процесса получения хлормолочной кислоты необходимо проводить в две стадии: . выращивание культуры бактерий с высокой окислительной способностью и проведение окисления хлоргидрпна глицерина до кислоты суспензией клеток A.acetl ЛГ-15.

3. Окисление хлоргидрпна глицерина до ^-хлормолочной кислоты суспензией клеток уксуснокислой бактерии A.acetl ЛГ-15.

Как было показано выше, эффективное образование хлормолочной кислоты при окислении хлоргидрпна глицерина протекает в присутствии этанола. В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на изучение процесса кометабслизыа хлоргидрпна глицерина и этанола. Результаты экпериментов показали, что клеточная суспензия A.acetl ЛГ-15 осуществляет одновременное окисление хлорированного и этилового спиртов, то есть имеет место процесс соокисления -один из вариантов кометаболнзма.

Активность соокисления хлоргидрина глицерина определяется соотношением концентраций спиртов ( рис.6 ).

С повышением уровня ростового субстрата увеличивается количество соокисленного хлоргидрина; если этанол значительно преобладает в реакционной среде, содержание окисленного хлорглицерина ( образовавшейся хлормолочной кислоты ) снижается ( рис.6 ).

Максимальное количество'-целевого продукта образуется при соокис-лении 1,211 М и 0.181 М этанола и хлоргидрина,- соответственно.

Как правило субстратами соокисления являются вещества, структурно подобные ростовому субстрату ( Налашенко, 1987 ). Предполагается, что в этом случае реакции соокисления и окисления -катализируются одной и той же ферментной системой,- то есть механизм соокисления и окисления

од1;.; и тот же < Van еук. Bartels. 1968; Perry. 1979; Соколов и др.. 1984; Малашенко и др.,1987; Gibson. 1990 ^___________—- —

Прннимгя_во_внимание структурную аналогию хлоргидрнна глицерина и ■ этанолаГТ также уникальные способности уксуснокислых бактерий к окисление первичных спиртов, осукествляеиояу неспецифичными к субстрату алкоголь- и а.пьдегиддегидрогеназами. меню предположить, что за окисление хлоргидрина до хлормолочной кислоты ответстненпы названные вии;-:-Ферменты.

Значительней интерес представляет вог.рос с роли этилового спирта з э?ом про*.-се. очевидно, что реакции окисления этипполГ; ;; ^„««и«. Банного спиртов сопряжены. Та«»«» ы<гшот ~c-,„lou»""^izr. „„ трепне

!!нтес!.1Рп,,от:- и'-™'":;;;.^ углерода { Скрябин. Головле-

г*., ¡¿in- '"ir.-w.!, 11 lams. 1 ">?.; Малашенко, 1987 ¡.Поскольку, оба процесса катализируются, по-видимому, алкоголь- и альдегиддегидрогеназз-ми, то для окисления обоих субстратов необходима затрата одного и того ~:е окислителя ( NAD ). Восстановленный в ходе р.-акции пиридиннуклеотид отдает протоны Н*в дыхательную цепь,что приводит к генерировании энергии ( образованию АТФ ) и освобождению NAD. _,озможно, далеко не каялм"

10

г.<

й

ю

I

0,5 1,0 1,5 2,0

атанол, М рН=4,5

хлоргидрин глицерина-0,18Ш, Д=0.2

0,25 0,50 0,75 1,00

§ин глицерина, М , 174М,Д=0.2, рНИ,5

хлоргид! этанол ;

Рис.6 Образование хлормолочной кис- Рис.7 Скорость окисления этанол^

лоты суспензией клеток Асе1оЬас1ег суспензиями клеток Асе^Ьа^ег

асеч ЛГ-15 при различных соотно- асеИ ЛГ-15 при различных сооть -

шениях хлоргндрина глицерина и эта- шениях спиртов, нола в реакционной среде.

образующийся тройной комплекс ( фермент-кофермент-субстрат ( >:... ргид рин глицерина )) диссоциирует с образованием продукта и освобождение NADH, что приводит в конечном с1'" те к "потерям" NAD. Лишь эффективно окисление этанола, ведущее к образованию JiADfi и окисление последнег в дыхательной цепи поддерживав'" необходимый для процессов окисления соокисления уровень окисленной формы пиридиннуклеотида.

Это предположение объясняет три явления, наблюдаемых нами в теме ние экспериментов:

. 1. Незначительное окисление хлоргидрина глицерина клетками А..асе ti ЛГ-15 в отсутствие этанола;

2. Снижение алкогольдегидрогеназноЯ активности в экстракта A.aceti ЛГ-15 ( уменьшение количества образующегося в реакционно": сре дз HADH ) в присутствии хлоргидрина глицерина:

3. Возрастание активности соокисления хлоргидрина клеточными сус пензиями A.aceti ЛГ-15 с увеличением концентрации этанола ( то есть появлением на метаболических путях "избытка" NAD ); при значительном преобладании этанола - снижение активности окисления хлоргидрина гли церина в результате резкого уменьшения частоты Естреч "фермент- хлор гидрин".

Изучение процесса кометаболизма хлоргидрина глицерина и этанол клеточными суспензиями A.aceti ЛГ-15 показало, что хлоргидрин ингиби рует окисление ростозого субстрата { рис.7 }. Отрицательное воздейс твие ксенобиотика на. процесс окисления этанола начинается с первог этапа его трансформации. ' Подобное явление - ингибировакие неростовь субстратом трансформации { окисления ) ростового субстрата - наблюдал многие исследователи, объясняя это конкуренцией субстрата за ферме» ( Малашенко и др.. 1976; Malashenko. 1976; Rcranovskaya et al,1976 ).

Результаты проведенных нами исследований по стокислению хлоргид рина глицерина -и этанола клеточными суспензиями A.aceti ЛГ-15. полу ченными из культур разного возраста, показывают, что при использован!! суспензий клеток из ранней экспоненциальной Фазы роста, соокисленп хлорированного спирта протекает более эффективно и в реакционной срех за одно и то же время < 18 часов ) образуется почти вдвое больше целе вого продукта, чем в .случае использования суспензий клеток, отобраннь из стационарной фазы роста. Это сохраняется и в отношении окислен;! ростового субстрата до уксусной кислоты.

По мнению ряда авторов, особенно четкие изменения активности фер ментативных систем в процессе роста культур микроорганизмов наблюдают

ся у ферментов, принимающих непосредственное участие в конструктивном и энергетическом кетаболнзмах { Лойцянская. 1966; Готтшалк. 1982 ).

Высокая активность алкоголь- и альдегиддегидрогеназ--Лгасб!1 ЛГ-15 в образовании_ хлормолочной-кислоты" в отличив от дегидрогеназ . других— изученных ~н*ми микроорганизмов объясняется тем, что эти фер-"-1:г'.~ для 7Коун?к;!сдух бактерий. растущих на этаноле, являются ключе-..•V.,'. участвуют в еакнеГгаих реакциях их энергетического обмена.

Совпадение диапазонов оптимальных значений рН для роста -А асе и 5 ; окисления этанола ) и процесса соокисления хлоргидрина глицерина подтверждает показанное как;*. предположение о едином механизме .кигд-иия к :еиобаогака и ростового субстрата ( рис.8 ).

Хл^рмолочная кислота является пппи^ута';;.«« йп»"К!тсЗим * <-"" собна подверг»-«.?-., «иши»»!«"" ьиздсяствиен уксусно-

С«,"«. Г*»«" ' С о?лзи с этим большую роль в достижении

максимального количества целевого продукта играет продолжительность процесса соокисления хлоргидрина глицерина суспензиями клеток А.асеЧ ЛГ-15.

15

?

ПЗ

з

211 3

п

¿1

,0 4,0 5,0 6,0 7,0 Й,0 рН

глицерина-ЙОг/л.

хлоргид

этанол-

г!'.;: глицерина-2иг/л. •55,7. Д=0Си, время-24

1 2

время, сутки

злоргидрин глицерииа-20г/я, час* этане. 1-55,7, Д=0,2, рН=4,5

Гис.а Образование хлормолочной кислоты в реакциях соокисления" хлоргидрина глицерина суспензиями плеток Асе1оЬас1ег асеИ ЛГ-15 при различных начениях рН.

Рис.9 Динамика образования хлор-молочной кислоты при сс.кисленш' хлор адрина глицерина суспензиями клеток АсеюЬас1ег асеи ЛГ-Т

Проведенные исследования являются теоретическим обосновали : для создания нового биологического способа получения ^-хлормолочной кислоты, основанного на окислении хлоргидрина глицерина уксуснокислой бактерией A.aceti ЛГ-15. Проведение процесса соокисления хлоргилрина глицерина и этанола нерастущими интактными клетками A.aceti ЛГ-15 In vivo в условиях, оптимизированных пи соотношению концентраций спиртов, рН реакционной среды, плотности и " возраста" используемой суспензии, длительности процесса, условиям предварительного выращивания культурь позволяет получать хлормолочную кислоту с высоким выходом 15 г/л. Степень конверсии хлоргидрина до целевого продукта в этих условиях составляет 66.6г.

Способ микробиологического синтеза £ -хлормолочной кислоты зарегистрирован в авторском свидетельстве Но 1678836,1991 г.

ВЫВОДЫ

1. Уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans (шта :ы 18 и 95} и Acetobactir acetl ЛГ-15, а также Pseudomonas fluorescens 890, Pseudomonas aeruginosa 889, Pseu..amonas stutzeri -1136 и 10 штаммов мпкро-мицета Geotrichum candidum способны к образованию ^-хлормолочной кислоты при окислении хлоргидрина глицерина. Эпихлоргидрин не подвергается трансформации при воздействии перечисленных микроорганизмов.

2. Впервые показано, что Acetobacter acetl ЛГ-15 - активный продуцент уксусной кислоты является таюке наиболее активным продуцентом Js- хлормолочной кислоты, в связи с чем этот штамм рекомендован для её промышленного получения.

3. Эффективное образование хлормолочной кислоты Acetobacter acetl ЛГ-15 при окислении хлоргидрина глицерина происходит только в условияv кометаболнзма при наличии в среде этилового спирта.'.

4. Концентрации этанола выае 1%, а также хлоргидрина глицерина выше 0,1% отрицательно воздействует на рост уксуснокислых бактерий, что обуславливает необходимость проведения процесса получения целевого продукта в две стадии: выракугаание культ/ры с высокой окислительной активностью и получение хлормолочной кислоты при соокислении хлоргидрина глицерина с этанолом суспензией клеток Acetobacter aceti ЛГ-15.

5. Количество продуцируемой хлормолочной кислоты зависит от соотношения концентраций косубстратов, "возраста" культуры, плотности клеточной суспензии, рН реакционной среды.

6. Установлено, что хлормолочная кислота является промежуточный юединением в метаболизме Acetobacter aceti . ЛГ-15. —В- связи-пим соличество продуцируемой—кислоттгопрёделяется продолжительность» про-1<?сса'соокисления. Максимальное образование целевого продукта в принятых нами условиях происходит через 24 часа от начала ферментации.

7. Результаты поведенных исследований легли в основу промашлен-!о-значимого микробиологического метода синтеза^-хлормолочтй кислс"-: высоким выходом продукта 15 г/л и степенью конверсии субстрата

спися^ он»ляг??:зйа«л >>» твмл ^гссь^^да;

1. Семина и.Г. Окисление хлоргидрина глицерина микроорганизмами. -Материалы 6 научной конференции молодых ученых Казанского Института Зиологии КФ АН СССР. 1986 - За - Леп. В ВИНИТИ. 1990 N01014 - В90.

2. семина И.Г.. Беляева М.И.. Левин Я.А., Кияшко С.В. Получение 6 - хлормолочной кислоты /ХЖ/ - полупродукта аналога пестици/'чого препарата текто методами биотехнологии // Всесоюзное координационное совещание по пестицидам. Тез. докл. Черноголовка, 1&в8. -с. 8?1.

3. Сомина И.Г. .Беляева М.'Л. Оптимизация процесса образования ^-хлормолочной кислоты при бактериальном окислении «¿-хлоогидршв 'лиН'-.рина. //SyrrpoGlufii on biotechnology. Merseburg. 1989. 172

l. Вбляс-г-а .4.И., Семина И.Г. Способ получения ^-хлсрко,точной кислоты. ас ссср г; ; с>7вазе 22.05.1991.

Заказ й 303. Подпнсако в печать 22.12.94. Форкаг 60 х 84 16 Бука га писчая. Почап офсетная. I я.л. Тярая 100 экя. Уавогет: оЖсзныиЗ гтатд КВП. Кагэнз>-4200?4. Вея:яотп?уэ.