Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические аспекты переноса заряда в системе "субстрат - бактериальные клетки Gluconobacter oxydans - медиатор - электрод" в биотопливном элементе

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические аспекты переноса заряда в системе "субстрат - бактериальные клетки Gluconobacter oxydans - медиатор - электрод" в биотопливном элементе"

На правах рукописи

004Ы

АЛФЕРОВ СЕРГЕИ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕНОСА ЗАРЯДА В

СИСТЕМЕ «СУБСТРАТ - БАКТЕРИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ GLUCONOBA CTER OXYD ANS- МЕДИАТОР - ЭЛЕКТРОД» В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2010

1 с ЛЕК 2010

004617647

Работа выполнена в лаборатории биосенсоров УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, г. Пущино и на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Рсшстилов Анатолий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Офицеров Евгений Николаевич

доктор биологических наук, профессор Ярополов Александр Иванович

Ведущая организация:

Липецкий государственный технический университет

Защита диссертации состоится «27» декабря 2010 г. в 16 — ч на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru

Автореферат разослан « » ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы: В настоящее время основная часть потребностей в электроэнергии удовлетворяется путём использования невосполнимых природных ресурсов, что влечёт за собой возникновение серьёзных экологических проблем. В связи с этим актуальным направлением при поиске и создании альтернативных источников электрической энергии является разработка биотопливных элементов (БТЭ). В основе функционирования этих устройств лежат процессы биокаталитического окисления органических веществ и преобразование энергии микробного метаболизма в электрическую. Основой БТЭ является биокатализатор, в качестве которого могут выступать либо ферменты, либо целые клетки микроорганизмов. Использование бактериальных клеток в качестве биокатализатора БТЭ устраняет необходимость выделения индивидуальных ферментов, и позволяет активному биоматериалу работать в условиях, близких к их естественной среде, а, следовательно, с более высокой производительностью. Процесс медиаторного биоэлектрокатализа представляет собой последовательный перенос зарядов в системе "окисляемый субстрат - бактериальные клетки - медиатор электронного транспорта - электрод". Ранее закономерности окисления субстратов целыми клетками микроорганизмов в присутствии медиаторов электронного транспорта исследовались некоторыми научными группами. Однако внимание в этих работах было уделено особенностям взаимодействия бактериальных клеток и медиаторов электронного транспорта в биосенсорных системах, в условиях биоэлектрокаталитичсского окисления субстратов, т.е. при заданном потенциале окисления редокс-соединений. Изучение характеристик процессов переноса заряда в микробных БТЭ на основе бактерий и медиаторов электронного транспорта имеет свои особенности.

Одним из важнейших факторов функционирования БТЭ являются свойства биокатализаторов на основе целых клеток микроорганизмов. Представляется актуальным изучение вопроса использования в качестве биокатализатора бактерий рода аисопоЬас1сг, обладающих уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся высокой оперативностью электронтранспортной цепи и мембранной локализацией основных ферментов — дегидрогеназ, осуществляющих неполное окисление углеродных субстратов, что обеспечивает лёгкий доступ медиатора к активным центрам ферментов. Необходимо отметить, что представленные в литературе данные по моделям БТЭ носят в подавляющем большинстве прикладной характер и направлены на конструирование элементов с высокими энергетическими характеристиками, при этом фундаментальные основы передачи заряда в таких системах и функционирование микробных биотопливных элементов па основе бактерий С1исопоЪаЫег охус1ат ранее систематически не исследовались. Таким образом, изучение характеристик процессов переноса заряда в микробных биотопливных элементах на основе бактерий С1исопоЪас1ег охус1апя является актуальной задачей, поскольку может представить новые данные об особенностях использования уксуснокислых бактерий, как нового типа биокатализатора при разработке биотопливных элементов.

Работа выполнялась при частичной поддержке грантов ВЛ «Развитие научного потенциала высшей школы» Р.Н.П. 2.1.1.7789, и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» госконтракт № 02.740.11.0296.

Цель работы:

Выявление физико-химических особенностей и закономерностей процесса переноса зарядов в системе «окисляемый субстрат - бактериальные клетки -медиатор - электрод».

В задачи работы входило:

• Выбор водорастворимого медиатора электронного транспорта, способного эффективно взаимодействовать с ферментами, локализованными в мембране бактериальных клеток, и оценка его электрохимического поведения в изучаемой системе БТЭ.

• Сравнительная оценка эффективности окисления индивидуальных субстратов бактериями рода Gluconobacter в условиях биотопливного элемента. Изучение возможности участия цитохромов во внеклеточном переносе заряда при использовании медиаторов электронного транспорта.

• Изучение влияния концентрации субстрата, рН буферного раствора и концентрации медиатора на величину генерируемого потенциала.

• Изучение влияния температуры на величину генерируемой ЭДС и определение термодинамических и кинетических параметров процесса генерации потенциала в БТЭ.

• Определение энергетических характеристик изучаемого макета БТЭ и оценка возможности использования отходов бродильных производств в качестве топлива.

Научная новизна работы:

Проведена количественная оценка эффективности окисления субстратов бактериями Gluconobacter oxydans в условиях медиаторного биотопливного элемента. Предложено использовать величину генерируемого потенциала в БТЭ как критерий эффективности биокатализатора в окислительно-восстановительных реакциях при участии медиаторов электронного транспорта для определения субстратной специфичности бактерий. Установлено, что профиль субстратной специфичности существенно отличается для двух штаммов Gluconobacter oxydans. Наиболее широким спектром окисляемых субстратов обладает штамм Gluconobacter oxydans subsp. melanogenes (RKM B-1227), который в отличие от штамма Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM B-1280) окисляет фруктозу и сахарозу.

Впервые установлено, что введение в плазматическую мембрану бактерий дополнительных гем-содержащих субъединиц оксидоредуктаз не приводило к значительному изменению в электрохимическом взаимодействии бактерий с графитовыми электродами опосредованном медиаторами электронного транспорта.

Изучено влияние температуры на функционирование микробного БТЭ, впервые получены термодинамические параметры (температурный коэффициент ЭДС, изменения свободной энергии Гиббса, энтропия, энтальпия и константа равновесия) и эффективная энергия активации процесса генерации потенциала.

Практическая значимость:

Разработан действующий макет биотопливного элемента на основе микробных клеток Gluconobacter oxydans и медиатора электронного транспорта. Эта разработка отмечена свидетельством на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, ВВЦ, 2006 г.) и двумя медалями конкурсов молодых ученых, проводимых в рамках Московского международного

конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2007 г. и 2010 г.)

Выявленный в ходе выполнения исследований широкий спектр окисляемых субстратов для штамма Gluconobacter oxydons subsp. melanogenes (BKM B-1227) создаст реальные предпосылки для его практического использования в качестве биокатализатора в БТЭ и биосенсорах для определения БПК.

Показана возможность использования в качестве топлива для БТЭ отходов бродильного производства.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: поставлены две новые лабораторные работы «Определение энергетических параметров микробного БТЭ» и «Определение термодинамических характеристик процесса генерации потенциала в БТЭ» по курсам «Биосенсоры» и «Химические основы жизни» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 8-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология 2005» (Москва, 2005 г.) на 9 и 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2005, 2006 гг.), на Международной научной конференции «Биотехнология охране окружающей среды» (Москва, 2006 г.), на Международной научной конференция «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007 г.), на Российской школе конференции молодых учёных «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Тула-Пущипо 2006, 2009 гг.), па 6-й весенней встрече Международного общества электрохимиков «Электрохимия здоровой планете» (Фоз-до-Игуасу, Бразилия, 2008г.), на 5-м съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва 2009 г.), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007,2010 г.).

По теме диссертации опубликовано 5 статей и 9 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Структура и объем работы:

Работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка и 4 таблицы. Список литературы включает 90 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. В первой главе дастся анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям в области медиаторпого биоэлектрокатализа и в частности микробных БТЭ. Приводится описание физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов рода Gluconobacter.

Глава 2. Во второй главе дано описание материалов и методов исследования. В работе использованы бактериальные штаммы: Gluconobacter oxydans subsp. induslrius (BKM B-1280), Gluconobacter oxydans subsp. melanogenes (BKM B-1227) и Gluconobacter cerinus (BKM B-1283) (Всероссийская коллекция микроорганизмов, УРАН ИБФМ им. Г.К. Скрябина). Для изучения возможности участия цитохромов во внеклеточном переносе заряда при использовании медиаторов электронного

транспорта использованы бактерии Esherichia coli JM109, несущие различные плазмиды (коллекция микроорганизмов факультета биохимии, университета в г. Луид, Швеция).

Электрохимические измерения проводили с помощью гальванопотенциостата 1PC2L с программным управлением. Измерения концентрации глюкозы в анодном отделении БТЭ проводили при помощи биосенсора на основе кислородного электрода и фермента глюкозооксидазы. Получение вольтамперных характеристик и измерение силы тока и потенциала выполняли с помощью гальванопотенциостата IPC Micro. Определение скорости восстановления медиатора 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) проводили с использованием фотоэлектроколориметра СФ-103.

Глава 3. В третьей главе представлены данные по выбору медиатора электронного транспорта и оценке его электрохимического поведения.

Для изучения аспектов переноса заряда в системе «окисляемый субстрат — бактериальные клетки - медиатор - электрод» в модели микробного БТЭ была сконструирована оригинальная электрохимическая ячейка, отвечающая поставленным задачам. Отличительной особенностью разработанной ячейки является использование микроколичества реактивов и биомассы. Конструкция предусматривает использование различных типов мембран и электродов. Для проведения исследований по влиянию температуры на функционирование БТЭ в конструкции ячейки предусмотрен контур термостатирования.

Важным этапом работы при изучении параметров процесса передачи заряда в системе «окисляемый субстрат - бактериальные клетки - медиатор - электрод» является выбор медиаторов, способных наиболее эффективно взаимодействовать с ферментами бактериальных клеток. Критерием, характеризующим это взаимодействие в условиях биотопливного элемента, может служить величина генерируемого потенциала при использовании одинаковых концентраций медиатора в анодном пространстве. Протестированы три медиатора: 2,6-ДХФИФ -хинониминовый краситель, способный восстанавливается флавонротеиновыми ферментами; 1,4-бензохинон (БХ) - его структура аналогична структуре кофермента Q, по в отличие от убихинона он не содержит гидрофобных заместителей; гексацианоферрат(Ш) калия K3[Fe(CN)6] (ГЦФ) - водорастворимое комплексное соединения ионов железа, способное окислять восстановленные формы флавопротеиновых и PQQ-зависимых дегидрогеназ. Установлено, что при использовании каждого из медиаторов в анодном отделении в концентрации ЗОмкМ генерируемый потенциал для 2,6-ДХФИФ составлял 80±5 мВ, для БХ - 60±7мВ и для ГЦФ - 47±7мВ. Таким образом, можно построить следующий ряд эффективности медиаторов: 2,6-ДХФИФ > БХ > ГЦФ. Учитывая это, а также то, что БХ неустойчив и отрицательно влияет на клеточную активность при длительном контакте с бактериями, для использования в БТЭ применялся водорастворимый медиатор 2,6-ДХФИФ. Достоинством используемого медиатора является его способность изменять окраску при переходе из окисленной формы в восстановленную, что позволяет регистрировать активность индивидуальных ферментов и ферментных систем бактерий с использованием этого медиатора спектрофотометрическим методом.

Для эффективного применения в БТЭ выбранный медиатор должен удовлетворять следующим требованиям: во-первых, микроорганизмы должны быстро восстанавливать медиатор, а, во-вторых, медиатор должен окисляться па электроде БТЭ. Представлялось важным провести оценку поведения медиатора в системе БТЭ методом циклической вольтамперомстрии. Суть методики сводится к ступенчатому введению в анолит компонентов анодного отделения и циклическому заданию потенциала в области от -800 до 800 мВ в каждом случае. Вольтамперные характеристики окислительно-восстановительной системы в анодном отделении приведены на рисунке 1.

0,08 0,07 0,06 0,05 0,04

<

3 0,03 о" 0,02

н

0,01 0,00 -0,01 -0,02 -0,03

-1000 -800 -600 -400 -200 0 200 400 600 800 1000 _Потенциал, мВ_

• Л Вуфср + ДХФИФ

Б Буфер 1- ДХФИФ + клетки + 10 мМ глюкозы В Буфер + ДХФИФ + клетки + 10 мМ глюкозы. 30 мМ I ЦФ

Рисунок 1. Вольтамперные характеристики окислителыю-восстановигельной системы в анодном отделении при последовательном добавлении компонентов.

Добавление медиатора в анолит (кривая А) не приводит к значительным изменениям анодной и катодной полуволн. Добавление клеток и субстрата глюкозы в систему «буфер+медиатор» (кривая Б) приводит к повышению анодной полуволны и появлению анодных пиков в области потенциалов 450 мВ и 700 мВ, что связано с интенсивным окислением глюкозы клетками и восстановлением медиатора 2,6-ДХФИФ. В классических моделях БТЭ как в анодном, гак и в катодном отделениях используют медиатор электронного транспорта. В этом случае реакция восстановления кислорода, растворенного в буферном растворе, характеризующаяся высоким потенциалом перенапряжения на графитовом электроде, заменяется на реакцию восстановления медиатора. Это необходимо для увеличения тока, протекающего через БТЭ и уменьшения внутреннего сопротивления элемента. Добавление 30 мМ ГЦФ в катодное отделение вызывает резкое повышение анодной полуволны и увеличение анодного пика в области 500мВ за счёт окисления 2,6-ДХФИФ и снятия диффузионных ограничений на стадии передачи электронов с катода на медиатор. Катодный пик в области -400 мВ свидетельствует об участии в этом процессе ГЦФ. Таким образом, полученные данные подтверждают способность 2,6-ДХФИФ восстанавливаться клетками О. охус1апх, а затем окисляться на аноде БТЭ.

Восстановление 2,6-днхлорфеполиндофеиола при протекании электрического тока в макете биотопливного элемента

Одним из этапов переноса заряда в системе БТЭ является окисление медиатора на аноде. Способность 2,6-ДХФИФ менять окраску при восстановлении и окислении использовалась при оценке соотношения восстановительной активности клеток и скорости окисления медиатора на аноде БТЭ. Эти оценки проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 610 иМ, отбирая через каждый час пробы из работающего в режиме короткого замыкания макета БТЭ. Измерения проводились как в деоксигенированной среде, так и среде,

Время, мин

Рисунок 2. А.Зависимость концентрации окисленной формы медиатора 2,6-ДХФИФ от времени при окислении глюкозы клетками G. oxydons в кислородных условиях и в атмосфере азота.

Б. Зависимость тока кислородного электрода от времели при работе БТЭ.

Зависимости концентрации окисленной формы медиатора 2,6-ДХФИФ от времени в кислородных условиях и в атмосфере азота оказались практически одинаковыми. При этом накопление восстановленной формы медиатора может свидетельствовать о том, что реакция окисления медиатора па поверхности анода БТЭ протекает медленнее его восстановления суспензией клеток G. oxydans. Необходимо отметить, что одинаковый характер кривых зависимости концентрации окисленной формы медиатора 2,6-ДХФИФ от времени в кислородных условиях и в атмосфере азота отражает отсутствие заметного влияния растворенного в анодном отделении кислорода на генерацию потенциала в условиях микробного БТЭ. Это подтверждается также оценкой зависимости концентрации кислорода от времени при работе биотопливной системы, выполненной при помощи кислородного электрода (рисунок 2 Б). Начальное значение силы тока (45 нА) соответствует максимальному равновесному содержанию кислорода в водном растворе, ток в области 3-5 нА соответствует темповому току кислородного электрода и свидетельствует об отсутствии кислорода в системе. За первые 5 минут после

добавления к суспензии клеток глюкозы концентрация кислорода снижается практически до нуля и остается постоянной в течение, по крайней мере, одного часа. Учитывая, что для одного измерения в биотопливпой системе достаточно 45-50 минут, кислород в такой низкой концентрации не является конкурентом медиатора в процессе акцептирования электронов, вследствие чего не оказывает существенного влияния на работу биотопливной системы.

Глава 4. В четвертой главе получен профиль субстратной специфичности клеток Gluconobacter oxydans и выявлена роль бактериальных цитохромов в процессе внеклеточного переноса электронов

Сравнение различных штаммов Gluconobacter при использовании в качестве биокатализатора в БТЭ.

Для выбора наиболее эффективного биокатализатора на основе клеток микроорганизмов проводили сравнительную оценку эффективности окисления различных субстратов в макете микробного БТЭ при использовании следующих штаммов рода Gluconobacter: Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM B-1280), Gluconobacter oxydans subsp. melanogenes (BKM B-1227) и Gluconobacter cerinus (BKM B-1283). Количественным критерием оценки являлась величина генерируемого потенциала в БТЭ при окислении индивидуальных субстратов.

Бактерии G. cerinus (BKM В-1283) способны восстанавливать медиатор 2,6-ДХФИФ без добавления экзогенного субстрата в анодное отделение, что для этих микроорганизмов установлено впервые. По-видимому, эти бактерии в процессе роста накапливают большое количество эндогенных субстратов окисления, которые далее могут расходоваться в процессах микробного метаболизма. При этом добавление глюкозы в анодное отделение, содержащее Gluconobacter cerinus и медиатор электронного транспорта, не вызывает генерации потенциала. Таким образом, этот бактериальный штамм не может быть использован в качестве биокатализатора в БТЭ.

Штаммы G. oxydans В-1227 и G. oxydans В-1280, напротив, не восстанавливали медиатор до внесения в анодное отделение глюкозы и, поэтому, эти микроорганизмы далее использовали в работе в качестве биокатализатора. Известно, что для бактерий рода Gluconobacter типичными субстратами являются углеводы и спирты, причем большинство этих соединений окисляются под действием мембранолокализованных дегидрогеназ, связанных с дыхательной цепью бактерий. Это является основой для регистрации окислительной активности ферментных систем бактерий с использованием искусственных акцепторов электронов. В качестве потенциальных субстратов в работе использовали: углеводы - глюкозу, галактозу, ксилозу, маннозу, сахарозу, фруктозу; спирты - метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол, 1-бутаиол, 1,2,3-пропантриол и сорбит. Для оценки эффективности окисления индивидуальных субстратов бактериями Gluconobacter использовали относительные значения генерируемых потенциалов в БТЭ (рисунок 3 А). Для сравнения биохимического поведения штаммов использовали абсолютные значения генерируемых потенциалов в изучаемом макете БТЭ (рисунок 3 Б).

□ Gluconobacter oxydons BKMB-I2S0 I И Gluconobacter oxydans BKM B-1227

Рисунок ЗА. Относительные значения генерируемых потенциалов для клеток G. oxydans В-1227 и G. oxydans В-1280.

Величина генерируемого потенциала при окислении каждым штаммом глюкозы принята за 100%.

Рисунок ЗБ. Абсолютные значения

генерируемых потенциалов для клеток G. oxydans В-1227 и G. oxydans В-1280.

Значения разности потенциалов, генерируемые в БТЭ за одно и то же время окисления штаммом бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM B-1280) галактозы, ксилозы, маннозы, этанола, бутанола-1 и пропанола-1 находятся в интервале 60-80% относительно таковой для глюкозы. При окислении метанола, пропанола-2, 1,2,3-проиантриола и сорбита относительные значения величин генерируемого потенциала лежат в промежутке от 30 до 60%.

При окислении субстратов штаммом Gluconobacter oxydans subsp. melanogenes (BKM B-1227) относительные значения величии потенциалов БТЭ наблюдали в следующих диапазонах (относительно глюкозы): для маннозы, галактозы и этанола - 75%, для сахарозы, фруктозы и пропапола-2 - 40%, а для ксилозы и метанола от 15 до 25%. 1,2,3-пропантриол, пропанол-1 и бутанол-1 окислялись так же эффективно, как и глюкоза. Необходимо отметить, что штамм Gluconobacter oxydans subsp. melanogenes (BKM B-1227) способен окислять сахарозу и фруктозу, что не наблюдали в системе с бактериями Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM B-1280).

Для выявления штамма, способного более эффективно окислять субстраты в условиях функционирования БТЭ проводили сравнение абсолютных величин генерируемых потенциалов за время, необходимое для достижения максимальной

10

величины генерируемого потенциала при окислении глюкозы штаммом G. oxydans В-1280. Уксуснокислые бактерии G. oxydans В-1280 на 40% более эффективно окисляют глюкозу, галактозу, маннозу и этанол. Величины потенциала, генерируемого бактериями В-1280 при добавлении в кювету ксилозы и метанола, на 70% превышают значения потенциалов, генерируемых бактериями В-1227 в тех же условиях. Величины генерируемого потенциала при окислении обоими штаммами бактерий 1,2,3-проиантриола, 1-пропанола, 2-пропанола и 1-бутанола оказались сравнимыми. Несмотря на некоторые различия в профиле субстратной специфичности двух штаммов, можно отмстить их общую способность окислять широкий спектр углеводов и спиртов, что важно при разработке микробных БТЭ, в которых в качестве возобновляемого источника энергии возможно использование отходов биотехнологических производств, представляющих собой смеси индивидуальных веществ. Следует отметить, что штамм Gluconobacter oxydans subsp. industrius (ВKM В-1280) является более эффективным биокатализатором в БТЭ при использовании в качестве субстрата биоокисления D-глюкозы.

Для выявления влияния конечного акцептора электронов (естественного -кислорода или искусственного - 2,6-ДХФИФ) на субстратную специфичность биокатализатора провели сравнительный анализ результатов измерения окислительной активности бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM В-1280) в модели микробного медиаторного БТЭ и в модели биосенсора на основе кислородного электрода. Принцип биосенсорного определения заключается в регистрации дыхательной активности иммобилизованных бактерий в присутствии различных субстратов, когда конечным акцептором электронов является кислород.

Суспензия бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM B-1280) в присутствии 2,6-ДХФИФ катализирует окисление большинства Сахаров, а также метанола, 2-пропанола и 1,2,3-пропантриола. Дыхательной активности иммобилизованных на кислородном электроде бактерий в присутствии метанола, 2-пропанола и 1,2,3-пропантриола зафиксировано не было. Соотношение ответов биосенсора на спирты и глюкозу было выше, чем соотношение величин генерируемого потенциала БТЭ при использовании этих субстратов. Важно отметить, что в условиях медиаторного БТЭ окислительная активность бактерий проявляется по отношению к большему числу субстратов.

Выявление роли бактериальных цитохромов в процессе внеклеточного переноса электронов

Известно, что у бактерий Gluconobacter oxydans во внеклеточном переносе зарядов преимущественно участвуют мембранные оксидоредуктазы, тесно сопряженные с ферментами дыхательной цепи бактерий. Представлялось важным оценить возможность изменения электрохимического взаимодействия микробных клеток с графитовыми электродами путем введения в плазматическую мембрану бактерий дополнительных гем-содержащих субъсдиниц оксидоредуктаз.

Для выявления возможного участия цитохромов во внеклеточном переносе заряда при посредничестве искусственных акцепторов электронов исследовали влияние строения искусственных акцепторов электронов и субстратов, рН, внешнего потенциала на процесс переноса электронов от микробных клеток на электрод. Исследования проводили на хорошо изученных в генетическом отношении и наиболее часто применяемых в подобных исследованиях модельных

микроорганизмах Escherichia coli в системах па основе трех вариантов штамма Е. coli (нативный JM109 и два генноинженерных). Штамм JM109/pBSD 1300 благодаря наличию плазмиды pBSD 1300 активно экспрессирует мембранный домен белка сукцинат-хинон редуктазы грамположительных бактерий Bacillus subtilis, который содержит две гемовьге группы расположенные в мембране бактерий. Штамм JM109/pLUV 1900 с плазмидой pLUV 1900 эксперессирует цитохром с550 бактерий В. subtilis, цитохромсодержащий домен которого связан с мембраной трансмембранной петлей (рисунок 4). Критерием, характеризующим активность электрохимического взаимодействия изучаемых бактерий явилась величина тока графитового электрода при приложенном потенциале.

Ц) и iiint4'KUir

пропршеша

l'Jt>'':

Першъгашшеское

npOCipaHCliO

Цш озрш i>äsir cjl^E" -+К. мВ cvl/itE'' = -13J äiB

Пргохром csst E°»+I?SsiB

Рисунок 4. Различие в мембранной локализации белков модифицированных штаммов Е. coli JM109(pBSD 1300) и Е. coli JM109(pLUV 1900).

Для трех типов клеток была проведена оценка возможности электрохимического взаимодействия с электродами в присутствии различных электронтранспортных медиаторов. Спектр используемых медиаторов был значительно расширен за счет использования водорастворимых ГЦФ, 2,6-ДХФИФ, убихипона Q„ и гидрофобного ферроцена. Для сравнения использовали осмиевые полимеры с короткой и длинной цепью боковых заместителей, которые ранее успешно использовались в качестве медиаторов электронного транспорта для бактерий Bacillus subtilis и Pseudomonas putida.

Зависимость величины генерируемого тока от приложенного потенциала изучали в диапазоне от 0 до 700 мВ относительно Ag|AgCI (0,1 М KCl) электрода сравнения в биосенсорах на основе Е. coli JM109/pßSD 1300. При использовании ГЦФ в качестве медиатора максимальную величину тока наблюдали при 400-600мВ. Доступность ферментативных сайтов, участвующих в транспорте электронов, для медиатора играет ключевую роль в процессе внеклеточного переноса электронов. Так, несмотря на то, что электродвижущая сила процесса меньше при использовании осмиевого полимера с длиной цепью (окислительно-восстановительный потенциал данного медиатора находится около ОмВ относительно насыщенного водородного электрода), транспорт электронов на электрод осуществлялся эффективнее.

В качестве потенциальных субстратов для окисления бактериями Е. coli использовали углеводы, спирты и интермедиа™ цикла Кребса (глюкозу, фруктозу, галактозу, ксилозу, сорбит, этанол, лимонную, яблочную и янтарную кислоты). Максимальные величины токов получили в присутствии глюкозы и фруктозы. Как отмечалось выше, наиболее эффективный внеклеточный перенос электронов в системах с Е. coli наблюдали в присутствии ГЦФ. Так, при использовании ГЦФ все соединения в большей или меньшей степени могут служить источником электронов в биосенсорной системе. Осмиевые полимеры передавали электроны во внешнюю цепь только в присутствии глюкозы, фруктозы и сукцината.

Таким образом, введение в плазматическую мембрану бактерий дополнительных гем-содержащих субъединиц оксидоредуктаз не приводило к значительному изменению в биоэлектрокаталитическом поведении бактерий. Возможно, для эффективного внеклеточного переноса зарядов необходимо не просто наличие цитохромов в мембране, но и их сопряжение с другими мембранными дегидрогеназами, катализирующими окисление субстратов. Глава 5. В пятой главе изучено влияние различных факторов на генерацию потенциала в макете биотонливного элемента

Зависимость потенциала биотопливпого элемента от концентрации глюкозы

Концентрация используемого субстрата влияет на энергетические параметры биотопливной системы. Работа в насыщающей концентрации глюкозы более предпочтительна, т.к. в этом случае наблюдаются наибольшие значения регистрируемой разности потенциалов. Влияние концентрации глюкозы на величину генерируемой ЭДС изучалось в диапазоне концентраций от 1мкМ до ЮмМ (рисунок 5).

110 -и 100 -

i 90" 1 80" о 70 -

602

0

1 50'

I 40 -

- I

tu

30 ;

20 -

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 10,0 11,0 Концентрация глюкозы, мМ Рисунок 5. Зависимость генерируемого потенциала от концентрации глюкозы Характер зависимости величины генерируемого потенциала от концентрации глюкозы соответствует уравнению гиперболы. Установлено, что насыщение субстратом происходит уже при концентрации глюкозы 1 мМ, что согласуется с оценками насыщающей концентрации субстрата, проведенной ранее для бактерий Gluconobacter oxydans в условиях медиаторного биосенсора. Для выявления закономерностей работы БТЭ использовали заведомо большую концентрацию субстрата — 10 мМ.

Влияние концентрации медиатора 2,6-дихлорфенолипдофенола на генерацию потенциала

В режиме разомкнутой внешней цепи величина генерируемого потенциала определяется в основном количеством восстановленной формы медиатора в анодном пространстве. Поэтому необходимо оценить зависимость величины генерируемого потенциала от концентрации используемого медиатора. Влияние концентрации медиатора на величину генерируемой ЭДС изучали в диапазоне концентраций медиатора от 1 до 100 мкМ (рисунок 6).

ю -

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Концентрация медиатора 2,6-ДХФИФ, мкМ Рисунок 6. Зависимость генерируемого потенциала от концентрации медиатора Установлено, что с увеличением концентрации медиатора происходит рост потенциала. По достижении концентрации медиатора 70 мкМ наблюдалось падение потенциала. Кроме того, высокие концентрации 2,6-ДХФИФ так же вызывали сокращение времени стабильной работы клеток. Это, предположительно, связано с ингибированием мембранлокализованных ферментов клеток и нарушением нормальной физиологической активности бактерий.

Для дальнейшей работы БТЭ с глюкозой в качестве субстрата использовали концентрацию медиатора 30 мкМ. Эта концентрация позволяет генерировать практически максимальные значения потенциала, при этом негативное влияние 2,6-ДХФИФ на бактерии минимально.

Влияние рН на величину генерируемого потенциала в биотопливного элемента

Одним из факторов, влияющих как на биологическую, так и на электрохимическую составляющую микробного БТЭ является рН буферного раствора. Ранее было установлено, что для бактерий G. oxydans при естественном окислении субстратов в условиях биосепсора на основе электрода Кларка оптимальным значением рН буферного раствора является 6,0. Условия работы и проведения измерений в макете микробного БТЭ отличаются от таковых на биосенсоре, поэтому представляется важным провести оценку влияния рН буферного раствора на величину генерируемой разности потенциалов. Полученные данные приведены cía рисунке 7.

6,5 7,0 рН

Рисунок 7. Зависимость генерируемого потенциала БТЭ (кривая А) и зависимость ответа биосенсора (кривая Б) от рН буферного раствора.

В диапазоне рН от 5,6 до 7,6 (рисунок 7. кривая А) наблюдалось возрастание потенциала с максимальным значением в области рН 7,0 - 7,6. Необходимо отметить, что полученные оценки рН отличаются от его оптимального значения, полученного при изучении влияния изменения рН рабочего раствора на каталитическую активность клеток С7. охус1апя, в условиях естественного окисления субстратов, измеренную при помощи кислородного электрода (рисунок 7, кривая Б). Увеличение генерируемой разности потенциалов в макете микробного БТЭ, по-видимому, связано с чувствительностью стандартного окислительно-восстановительного потенциала 2,6-ДХФИФ к изменению рН раствора. По существующим данным потенциал 2,6-ДХФИФ снижается на 120 мВ при изменении рН от 6 до 8, что сказывается на результирующей разности потенциалов между анодом и катодом в БТЭ.

Влияние температуры па генерацию потенциала и определение термодинамических характеристик процесса

Для оценки возможности, направления и глубины протекания химического процесса, лежащего в основе работы микробного БТЭ как гальванического элемента, необходимо определение термодинамических параметров процесса генерации потенциала (температурного коэффициента ЭДС, изменения свободной энергии Гиббса, энтропии, энтальпии) и константы равновесия. Для этого была изучена зависимость ЭДС от температуры в диапазоне от 283 до 313 К (рисунок 8).

280

315

285 290 295 300 305 310 Температура в кювете, К Рисунок 8. Зависимость ЭДС от температуры в кювете.

В диапазоне температур от 283 до 308 К наблюдалось возрастание на 10% электродвижущей силы, генерируемой макетом БТЭ. При 313 К величина ЭДС снижалась более чем на 30%, что может быть связано с температурной инактивацией ферментов клетки.

Для расчета температурного коэффициента использовали линейный участок зависимости ЭДС от температуры в кювете. Для изучаемой системы

{1Е -4

температурный коэффициент — составил 2,ЗАО,6* 10 В/К.

¡¡Т

с!Е

Зная температурный коэффициент ЭДС — для гальванического элемента,

<1Т

были рассчитаны значения термодинамических функций (изменение свободной энергии Гиббса, энтропии, энтальпии) и константа равновесия (таблица 1).

Таблица 1. Расчетные значения термодинамических функций процесса генерации потенциала в микробном биотопливном элементе.______

Термодинамические функции до", кДж Д5", Дж/К Дн , кДж ка

Значение -20±2 44±11 -6±3 -2400±1600

Значения термодинамических функций позволяют оценить возможность, направление и глубину химического процесса, лежащего в основе работы этого гальванического элемента. А6'<0 отвечает критерию самопроизвольности процесса, |АО|=9,6 кДж отвечает за глубину процесса, ДНО соответствует экзотермическому процессу, Д8>0 соответствует увеличению беспорядка в системе при самопроизвольном процессе.

Для определения эффективной энергии активации процесса генерации потенциала в модели медиаторного БТЭ на основе бактерий С1исопоЬас1ег охус1апх изучали зависимость времени генерации одинаковой ЭДС от температуры в кювете. При увеличении температуры от 283 до 313 К значительно сокращалось время генерации одинакового потенциала. Расчетное значение энергии активации в выбранном интервале температур составило 67±4 кДж/моль. Определенная энергия активации является эффективной, т.е. включает в себя энергии активации всех отдельных стадий процесса. Вероятнее всего лимитирующей стадией является передача электрона от медиатора на электрод и регенерация медиатора, что подтверждается накоплением восстановленной формы медиатора в процессе генерации потенциала в условиях протекания максимального тока (см. гл. 3).

Глава 6. В шестой главе приведены результаты исследований по определению энергетических характеристик макета микробного биотопливпого элемента Энергетические характеристики в модели микробного биотопливпого элемента па основе бактерий С1исопоЬас(ег охус1апз

Одним из параметров, определяющих процесс переноса заряда в системе "окисляемый субстрат - бактериальные клетки - медиатор - электрод" являются внутреннее сопротивление и максимальная мощность элемента. Максимальная мощность, развиваемая БТЭ, достигается, когда внутреннее сопротивление равно внешнему сопротивлению. Для определения максимальной мощности и внутреннего сопротивления в изучаемой модели микробного БТЭ использовали метод пика максимальной мощности. Для этого во внешнюю цепь последовательно

16

подключались сопротивления в интервале от 1 кОм до 510 кОм и изучалась зависимость мощности БТЭ от внешнего сопротивления при использовании одного медиатора 2,6-ДХФИФ в анодном пространстве и при использовании ГЦФ в катодном пространстве (рисуиок 9).

Внешнее сопротивление, кОм Рисунок 9. Зависимость мощности БТЭ от внешнего сопротивления при использовании медиатора 2,6-ДХФИФ в анодном и ГЦФ в катодном пространстве (кривая А) и при использовании 2,6-ДХФИФ в анодном пространстве (кривая Б)

При использовании медиатора 2,6-ДХФИФ в анодном пространстве максимальная мощность БТЭ, наблюдается при приложенном внешнем сопротивлении 240 кОм: Ртах=2±1 нВт. Для описания БТЭ и сравнения разработанных моделей между собой рекомендуется использовать понятие мощности, приведенной к единице поверхности рабочего электрода. Расчетное значение мощности отнесенной к геометрической поверхности анода составило 7±1мкВт/м2.

При использовании ГЦФ в качестве медиатора в катодном пространстве пик максимальной мощности наблюдается при внешнем сопротивлении 50 кОм, Ршах=0,9±0,1 мкВт. Расчетное значение максимальной мощности на единицу поверхности анода составило 3±1 мВт/м2. Таким образом, при добавлении ГЦФ в катодное пространство величина генерируемой ЭДС возрастала в 2,5 раза, внутреннее сопротивление снижалось в 5 раза, а удельная мощность увеличивалась в 500 раз.

Необходимо отметить, что разработанная модель БТЭ при использовании медиатора 2,6-ДХФИФ в анодном отделении характеризуется довольно высоким внутренним сопротивлением и низкой удельной мощностью. По существующим данным в подобных моделях БТЭ внутреннее сопротивление составляет от 10 до 100 кОм, а удельная мощность, отнесенная к рабочей поверхности электрода, варьирует от 1 до 80 мВт/м2. Однако значения энергетических характеристик могут быть значительно улучшены при использовании второго медиатора ГЦФ в катодном пространстве, что позволяет получать значения энергетических характеристик, сравнимые по порядку величин с данными, полученными ранее другими исследователями.

Длительность единичного цикла функционирования модели биотопливного элемента

Важным фактором, указывающим на практическую значимость изучаемой модели микробного БТЭ, является долговременная работа. Для выяснения длительности работы модели БТЭ изучали зависимость генерируемого потенциала от времени как при использовании 2,6-ДХФИФ в анодном отделении, так и при совместном использовании 2,6-ДХФИФ в анодном и ГЦФ в катодном отделениях. Измерения проводили в режиме фиксированной нагрузки, для чего во внешнюю цепь подключали техническое сопротивление, при котором развивается максимальная мощность (240 кОм для одного медиатора и 50 кОм для двух медиаторов). Типичные зависимости генерируемого потенциала от времени приведены на рисунке 10.

Рисунок 10. Типичный вид зависимости Рисунок 11. Зависимость концентрации

генерируемого потенциала от времени при глюкозы от времени в анодном отделении использовании 2,6-ДХФИФ в анодном БТЭ

отделении (кривая А) и ГЦФ в катодном отделении (кривая Б)

Количественным критерием, характеризующим длительность работы БТЭ является количество электричества генерируемое системой за время падения потенциала до начального уровня (7 часов для одного медиатора и 5,5 часов при совместном использовании 2-х медиаторов). При использовании одного медиатора величина О составила 13-103 Кл/моль глюкозы, а при использовании двух медиаторов в анодном и катодном пространствах величина О составила 37-103Кл/моль. Снижение величины генерируемого потенциала во времени связано с уменьшением концентрации глюкозы в анодном отделении. Проведенная с помощью биосенсора на основе фермента глюкозооксидазы оценка зависимости концентрации глюкозы от времени показала снижении сё содержания в кювете практически в 10 раз за 7 часов (рисунок 11). Таким образом, для эффективного длительного функционирования макета БТЭ необходимо добавление новых порций субстрата.

Использование отходов бродильных производств в качестве топлива для биотопливных элементов

Сточные воды бродильных производств характеризуются высоким содержанием органических соединений. Попадание таких веществ в водоемы

приводит к существенному снижению уровня растворенного кислорода, дальнейшей эвтрофикации водоема и гибели естественных экосистем вокруг них. Использование в качестве топлива для БТЭ отходов бродильных производств является актуальным, т.к. последние представляют собой сложную смесь органических веществ и являются дешевыми легкоутилизируемыми субстратами для широкого спектра микроорганизмов и в частности для бактерий рода аисопоЬас1ег, используемых в качестве биокатализатора микробных медиаторных БТЭ. Как было показано ранее (см. глава 4) бактерии С1исопоЬас1ег охус/апя виЬзр. тс1ин!г1т (ВКМ В-1280) способны окислять широкий спектр углеводов и спиртов, которые могут входить в состав отходов. Для проведения экспериментов в настоящей работе использовали образцы барды, полученные в ходе процессов брожения ржаной муки. Значение индекса БПК определенное стандартным методом в используемой пробе составило 44 г/л, что говорит о высоком содержании биоразлагаемых органических веществ в образце барды. Типичные виды зависимости генерируемого потенциала от времени при использовании в качестве субстрата глюкозы и отходов бродильных производств приведены на рисунке 12.

Время, мин

Рисунок 12. Типичный вид генерируемого потенциала при использовании в качестве субстрата глюкозы (кривая А) и отходов спиртовых производств (кривая Б).

При использовании в качестве топлива барды спиртовых производств средняя величина генерируемого потенциала составила 150±10мВ, что превышает значения, полученные при использовании глюкозы. Таким образом, отходы спиртовых производств могут быть использованы в качестве топлива для генерации потенциала в микробном биотопливном элементе на основе бактерий аисопоЬас1ег пхуЖтч и медиатора 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Выводы.

1. Проведено систематическое изучение физико-химических особенностей и закономерностей процесса возникновения и переноса зарядов в системе «окисляемый субстрат - бактериальные клетки - медиатор - электрод».

2. На основе сравнительного анализа величин генерируемого потенциала в БТЭ в ходе окисления субстратов уксуснокислыми бактериями Gluconobacter в присутствии водорастворимых медиаторов электронного транспорта выбран наиболее эффективный медиатор в анодном пространстве — 2,6-ДХФИФ. Впервые показано, что в БТЭ реакции окисления глюкозы и восстановления 2,6-ДХФИФ, катализируемые бактериями Gluconobacter, не лимитируют процесс переноса зарядов в системе «окисляемый субстрат - бактериальные клетки - медиатор -электрод».

3. Проведен выбор биокатализатора и биоокислясмого субстрата для эффективного функционирования медиаторного микробного БТЭ. Установлено, что максимальная величина генерируемого потенциала достигается при использовании Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM B-1280) в качестве биокатализатора и глюкозы как биотоплива. Показано, что спектр окисляемых в системе БТЭ субстратов для изученных штаммов Gluconobacter oxydans различен: бактерии G. oxydans В-1227 в отличие от G. oxydans В-1280 способны дополнительно окислять сахарозу и фруктозу, что имеет существенное значение при разработке БПК-биосенсоров и БТЭ, использующих в качестве топлива отходы спиртовых производств.

4. Впервые установлено, что введение в плазматическую мембрану бактерий дополнительных гем-содержащих субъединиц оксидоредуктаз не приводит к значительному изменению в электрохимическом взаимодействии бактерий с графитовыми электродами при участии медиаторов электронного транспорта.

5. Изучено влияние различных факторов (газовой среды, концентрации субстрата, медиатора, рН буферного раствора и температуры) на величины генерируемого потенциала. Установлено, что кислород не оказывает существенного влияния на работу биотопливной системы на основе бактерий Gluconobacter, что позволяет конструировать упрощенные модели БТЭ, не требующие деоксигенирования анодного пространства. Впервые рассчитаны термодинамические и кинетические параметры процесса генерации потенциала в модели БТЭ.

6. Разработан действующий макет биотопливного элемента на основе микробных клеток Gluconobacter oxydans и медиатора электронного транспорта и определены его энергетические характеристики. Показана возможность использования отходов бродильных производств в качестве топлива в изучаемом макете БТЭ.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Алферов С.В., Томашевская Л.Г., Понаморева О.Н., Богдановская В.А., Решетилов А.Н. Аиод биотопливного элемента на основе бактериальных клеток Gluconobacter и медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорфеиолиидофенола. // Электрохимия. 2006. Т. 42. № 4. С. 456-457.

2. Anatoly Reshetilov, Sergey Alferov, Ludmila Tomashevskaya, Ol'ga Ponamoreva. Testing of bacteria Gluconobacter oxydans and electron transport mediators composition for application in Biofuel Cell. // Electroanalysis. 2006. V. 18. № 19-20. P. 2030-2034.

3. C.B. Алферов, ЕЛО. Чигрипова, А.Н. Решетилов. Биотопливные элементы на основе иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans и медиаторов электронного транспорта 2,6-дихлорофеполиндофенола, ферроцена и 1,Г-диметилферроцена. // Известия Тульского государственного университета. Серия Химия. 2006. №6. С. 173-179.

4. Алферов С. В., Воеводская О. А., Нгуен В. Т. Температурная зависимость генерации ЭДС в микробном биотопливном элементе на основе клеток Gluconobacter oxydans и медиатора 2,6-дихлорфенолиндофенола. // Бутлеровские сообщения. 2008. Т.14. №4. С.55-58.

5. Sergey Alferov, Vasile Coman, Tobias Gustavsson, Anatoly Reshetilov, Claes von Wachenfeldt, Cecilia Hagerhall and Lo Gorton. Electrical communication of cytochrome enriched Escherichia coli JM109 cells with graphite electrodes. // Electrochimica Acta. 2009. V.54. № 22. P. 4979-4984.

6. Алферов С.В., Томашевская Л.Г., Понаморева О.Н., Богдановская В.А., Решетилов А.Н. Модель биотопливного элемента на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans и медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорфенолиндофепола. // Материалы научно-практической конференции - 8-го Международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология 2005». Москва. 2005. С. 181-184.

7. Алферов С.В., Чигринова Е.Ю., Решетилов А.Н. Модель биотопливного элемента на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans и гидрофобных медиаторов электронного транспорта ферроцена и 1,1 '-диметилферроценна. // Тезисы 10-ой Путинской школы-конференции молодых учёных. Пущипо. 2006. С. 354.

8. Алферов С.В. Биотопливный элемент на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans. Доклады Московского общества испытателей природы. // Тезисы IV Международной научной конференции «Биотехнология охране окружающей среды». Москва. 2006. Т.39. С.202.

9. Алферов С.В., Решетилов А.Н. Медиаторные биотопливные элементы на основе иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans. // Материалы Четвёртого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2007. часть 2. С. 256.

1 O.Sergey V. Alferov, Ekaterina U. Chigrinova, Liudmila G. Tomashevskaia, Elena E. Babkina, Olga N. Ponamoreva, Anatoly N. Reshetilov. Biosensor approach to assessment of efficiency of mediators for their application in microbial biofuel cells. // Proceedings of the International Conference «Molecular and Nanoscale Systems for Energy Conversion». Moscow. 2007. P. 37-43.

11.Л.Г. Томашевская, С.В. Алферов, О.Н. Понаморева, В.А. Богдановская, А.Н. Решетилов. Использование клеток Gluconobacter для получения электрической энергии в микробном биотопливном элементе. // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Москва. 2007. С. 128-129. 12.Sergey Alferov, Vasile Coman, Tobias Gustavsson, Cecilia Hagerhall and Lo Gorton. Wiring of Escherichia coli With Different Electron Transport Mediators. // Book of abstracts 6th Spring Meeting of the International Society of electrochemistry «Electrochemistry for a healthy planet». Brazil. 2008. P. 183.

13.Воеводская O.A., Нгуен B.T., Алферов С.В. Влияние температуры на генерацию ЭДС в микробном биотонливном элементе. // Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионапотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Овчинникова Ю.А. Москва. 2009. С. 34-37.

14.Алферов С.В., Воеводская О.А., Решетилов А.Н. Микробный биотопливный элемент, использующий отходы спиртовых производств в качестве топлива. // Московская международная научно-практическая конференция «БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов», проводимая в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2010. С. 298-299.

Подписано в печать 22.11.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Алферов, Сергей Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 .Устройство и принципы функционирования биотопливных элементов

1.1.1 Конструкция ячейки БТЭ.

1.1.2. Электроды используемые в БТЭ.

1.1.3. Мембраны, используемые в БТЭ.

1.1.4. Схема работы ячейки и перенос заряда в БТЭ.

1.2 .Биотопливные элементы, основанные на микроорганизмах.

1.3 .Микробные медиаторные биотопливные элементы.

1.3.1. Взаимодействие медиаторов с микроорганизмами.

1.3.2 Краткая характеристика применяемых медиаторов.

1.4 .Характеристики БТЭ и факторы, влияющие на работу элемнта.

1.5 . Модели МБТЭ.

1.6 .Особенности метаболизма и физиологии Gluconobacter oxydans.

1.6.1. Особенности рода Gluconobacter.

1.6.2. Метаболизм.

1.6.3. Дыхательная цепь Gluconobacter oxydans.

1.6.4. Мембраносвязанные дегидрогеназы Gluconobacter oxydans.

1.6.5. Окисление Сахаров и этанола клетками Gluconobacter oxydans.

1.6.6. Образование глюконата и кетоглюконатов.

1.6.7. Применение Gluconobacter oxydans в биосенсорах.

1.6.8. Биосенсоры на основе целых клеток Gluconobacter oxydans.

1.6.9. Биосенсоры на основе дегидрогеназ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические аспекты переноса заряда в системе "субстрат - бактериальные клетки Gluconobacter oxydans - медиатор - электрод" в биотопливном элементе"

В настоящее время основная часть потребностей в электроэнергии удовлетворяется путем использования невосполнимых природных ресурсов, что влечёт за собой возникновение серьезных экологических проблем. В связи с этим актуальным направлением при поиске и создании альтернативных источников электрической энергии является разработка биотопливных элементов (БТЭ). В основе функционирования этих устройств лежат процессы биокаталитического окисления органических веществ и преобразование энергии микробного метаболизма в электрическую. Основой БТЭ является биокатализатор, в качестве которого могут выступать либо ферменты, либо целые клетки микроорганизмов. Использование бактериальных клеток в качестве биокатализатора БТЭ устраняет необходимость выделения индивидуальных ферментов, и позволяет активному биоматериалу работать в условиях, близких к их естественной среде, а, следовательно, с более высокой производительностью. Процесс медиаторного биоэлектрокатализа представляет собой последовательный перенос зарядов в системе "окисляемый субстрат - бактериальные клетки — медиатор электронного транспорта — электрод". Изучение характеристик процессов переноса заряда в микробных биотопливных элементах на основе бактерий и медиаторов электронного транспорта имеет свои особенности, связанные с типом субстрата, видом микроорганизмов, природой используемого медиатора и выявление этих закономерностей представляет важную задачу, малоизученную к настоящему времени. При разработке биотопливных элементов представляется важным изучение вопроса использования в качестве биокатализатора уксуснокислых бактерий рода аисопоЪасгег, обладающих уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся высокой оперативностью электронтранспортной цепи и мембранной локализацией основных ферментов — дегидрогеназ, осуществляющих неполное окисление углеродных субстратов, что обеспечивает легкий доступ медиатора к активным центрам ферментов. Необходимо отметить, что представленные в литературе данные по моделям БТЭ носят в подавляющем большинстве прикладной характер и направлены на конструирование элементов с высокими энергетическими характеристиками, при этом фундаментальные основы передачи заряда в таких системах, равно как и процессы в микробных биотопливных элементах на основе бактерий С1исопоЬаМег охуйат и медиаторов электронного транспорта ранее систематически не изучались. Таким образом, изучение характеристик процессов переноса заряда в микробных биотопливных элементах на основе бактерий СЫсопоЬаМег охуйат является важной задачей, поскольку может представить новые данные об особенностях использования данных микроорганизмов при разработке биотопливных элементов.

Работа выполнялась при частичной поддержке грантов ВП «Развитие научного потенциала высшей школы» Р.Н.П. 2.1.1.7789, и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» госконтракт N9 02.740.11.0296.

Цель работы:

Выявление физико-химических особенностей и закономерностей процесса переноса зарядов в системе «окисляемый субстрат - бактериальные клетки — медиатор — электрод».

В задачи работы входило:

• Выбор водорастворимого медиатора электронного транспорта, способного эффективно взаимодействовать с ферментами, локализованными в мембране бактериальных клеток, и оценка его электрохимического поведения в изучаемой системе БТЭ.

• Сравнительная оценка эффективности окисления индивидуальных субстратов бактериями рода 01исопоЪа&ег в условиях биотопливного элемента. Изучение возможности участия цитохромов во внеклеточном переносе заряда при использовании медиаторов электронного транспорта.

• Изучение влияния концентрации субстрата, рН буферного раствора и концентрации медиатора на величину генерируемого потенциала.

• Изучение влияния температуры на величину генерируемой ЭДС и определение термодинамических и кинетических параметров процесса генерации потенциала в БТЭ.

• Определение энергетических характеристик изучаемого макета БТЭ и оценка возможности использования отходов бродильных производств в качестве топлива.

Научная новизна работы:

Проведена количественная оценка эффективности окисления субстратов бактериями аисопоЬаМег охуйат в условиях медиаторного биотопливного элемента. Предложено использовать величину генерируемого потенциала в БТЭ как критерий эффективности биокатализатора в окислительно-восстановительных реакциях при участии медиаторов электронного транспорта для определения субстратной специфичности бактерий. Установлено, что профиль субстратной специфичности существенно отличается для двух штаммов ОЫсопоЬаМег охуйат. Наиболее широким спектром окисляемых субстратов обладал штамм 01исопоЬа&ег охуйат эиЬзр. melanogenes (ВКМ В-1227), который в отличие от штамма аисопоЪасгег охуйат БиЬэр. тйизМт (ВКМ В-1280) окислял фруктозу и сахарозу.

Впервые установлено, что введение в плазматическую мембрану бактерий дополнительных гем-содержащих субъединиц оксидоредуктаз не приводило к значительному изменению в электрохимическом взаимодействии бактерий с графитовыми электродами опосредованном медиаторами электронного транспорта.

Изучено влияние температуры на функционирование микробного БТЭ, впервые получены термодинамические параметры (температурный коэффициент ЭДС, изменения свободной энергии Гиббса, энтропия, энтальпия и константа равновесия) и эффективная энергия активации процесса генерации потенциала.

Практическая значимость:

Разработан действующий макет биотопливного элемента на основе микробных клеток 01исопоЬас1ег охус1ат и медиатора электронного транспорта. Эта разработка отмечена свидетельством на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, ВВЦ, 2006 г.) и двумя медалями конкурсов молодых ученых, проводимых в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2007 г. и 2010 г.)

Выявленный в ходе выполнения исследований широкий спектр окисляемых субстратов для штамма ОЫсопоЬаМег охуйат БиЬэр. те1апо§епез (ВКМ В-1227) создает реальные предпосылки для его практического использования в качестве биокатализатора в БТЭ и биосенсорах для определения БПК.

Показана возможность использования в качестве топлива для БТЭ отходов бродильного производства.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: поставлены две новые лабораторные работы «Определение энергетических параметров микробного БТЭ» и «Определение термодинамических характеристик процесса генерации потенциала в БТЭ» по курсам «Биосенсоры» и «Химические основы жизни» для студентов специальностей 020100 Химия и 240900 Биотехнология.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 8-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология 2005» (Москва, 2005 г.) на 9 и 10-ой Пущинской школы-конференции молодых учёных (Пущино, 2005, 2006 гг.), на Международной научной конференции «Биотехнология охране окружающей среды» (Москва, 2006 г.), на Международной научной конференция «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007 г.), на Российской школе конференции молодых учёных «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Тула-Пущино, 2006, 2009 гг.), на 6-й весенней встрече Международного общества электрохимиков «Электрохимия здоровой планете» (Фоз-до-Игуасу, Бразилия, 2008г.), на 5-м съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009 г.), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2010 г.).

По теме диссертации опубликовано 5 статей и 9 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Алферов, Сергей Валерьевич

выводы

1. Проведено систематическое изучение физико-химических особенностей и закономерностей процесса возникновения и переноса зарядов в системе «окисляемый субстрат - бактериальные клетки - медиатор - электрод».

2. На основе сравнительного анализа величин генерируемого потенциала в БТЭ в ходе окисления субстратов уксуснокислыми бактериями Gluconobacter в присутствии водорастворимых медиаторов электронного транспорта выбран наиболее эффективный медиатор в анодном пространстве - 2,6-ДХФИФ. Впервые показано, что в БТЭ реакции окисления глюкозы и восстановления 2,6-ДХФИФ, катализируемые бактериями Gluconobacter, не лимитируют процесс переноса зарядов в системе «окисляемый субстрат -бактериальные клетки - медиатор - электрод».

3. Проведен выбор биокатализатора и биоокисляемого субстрата для эффективного функционирования медиаторного микробного БТЭ. Установлено, что максимальная величина генерируемого потенциала достигается при использовании Gluconobacter oxydans subsp. industrius (BKM В-1280) в качестве биокатализатора и глюкозы как биотоплива. Показано, что спектр окисляемых в системе БТЭ субстратов для изученных штаммов Gluconobacter oxydans различен: бактерии G. oxydans В-1227 в отличие от G. oxydans В-1280 способны дополнительно окислять сахарозу и фруктозу, что имеет существенное значение при разработке БГЖ-биосенсоров и БТЭ, использующих в качестве топлива отходы спиртовых производств.

4. Впервые установлено, что введение в плазматическую мембрану бактерий дополнительных гем-содержащих субъединиц оксидоредуктаз не приводит к значительному изменению в электрохимическом взаимодействии бактерий с графитовыми электродами при участии медиаторов электронного транспорта.

5. Изучено влияние различных факторов (газовой среды, концентрации субстрата, медиатора,. рН буферного раствора, и температуры) на величины генерируемого потенциала. Установлено, что кислород не оказывает существенного влияния на работу биотопливной системы на основе бактерий аисопоЪасХег, что позволяет конструировать упрощенные модели БТЭ, не требующие деоксигенирования анодного пространства. Впервые рассчитаны термодинамические и кинетические параметры процесса генерации потенциала в модели БТЭ.

6. Разработан действующий макет биотопливного элемента на основе микробных клеток ОЫсопоЬаМег охус1ат и медиатора электронного транспорта и определены его энергетические характеристики. Показана возможность использования отходов бродильных производств в качестве топлива в изучаемом макете БТЭ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признательность коллективу лаборатории биосенсоров УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина и коллективу кафедры химии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и интерпретации результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Алферов, Сергей Валерьевич, Москва

1. Hong Liu, Shaoa Cheng, Bruce E. Logan Power generation in fed-batch microbial fuel cells as a function of ionic strength, temperature and reactor configuration. //Environ. Sci. Technol. 2005. №39. P. 5488-5493.

2. Ikeda Т., Капо К., Bioelectrocatalysis-based application of quinoproteins and quinoprotein-containing bacterial cells in biosensors and biofuel calls. // Biochimica et Biophysica Acta. 2003. V. 1647. P. 121-126.

3. Daniel R. Bond, Dawn E. Holmes, Leonard M. Tender, Derek R. Lovley. Electron-reducing microorganisms that harvest energy from marine sediments. // Science. 2002. V. 295. P. 483-485.

4. Higgins I.J. and Hill H.A.O. // Bioelectrochemistry Essays in Biochemistry 1985. V. 21. P. 119-145. edited by R. D. Marshall and K. Tipton Published for The Biochemical Society by Academic Press.

5. Katz E., Shipway A.N., Wilner I. Biochemical fuel cells // Handbook of fuel cells Fundamentals, Technology and Application. / Eds. Vielstich W., Lamm A., Gasteiger H.A., John Wiley & Sons, Ltd. 2003.

6. Park D.H., Zeikus J.G. Electricity generation in microbial fuel cells using neutral red as an electronophore. // Appl. and Env. Microb. 2000. V. 66. P. 12921297.

7. Davis G., Hill H.A.O., Aston W.J., Higgins I.J., Turner A.P.E. Bioelectrochemical fuel cell and sensor based on a quinoprotein, alcohol dehydrogenase. // Enzyme Microb. Technol. 1983. №5. P.383- 388.

8. Ringeisen B.R., Henderson E., Mu P.K., Pietron J., Ray R., Little В., Biffinger J.C., Jones-Meehan J.M. // Environ. Sci. Technol. 2006. V. 40. P. 26292634.

9. Allen M.J. The electrochemical aspects of some biochemical systems—IX. The anomalous behavior of E. coli with mixed substrates. // Electrochim. Acta. 1966. V. 11. P. 1503

10. Bennetto H.P., Delaney G.M., Mason J.R., Roller S.D., Stirling J.L., Thurston C.F. // Biotechnol. Lett. 1985. V. 7. P. 699.

11. Plotkin E.V., Higgins I.J., Hill H.A.O. Methanol dehydrogenase bioelectrochemical cell and alcohol detector. // Biotechnology Lett. 1981. V. 3. P. 187-279.

12. Park D.H., Kim B.H., Moore B., Hill H.A.O., Song M.K., Rhee H.W. // Biotechnol. Techniques. 1997. V. 11. P. 145

13. Park, D. H., Zeikus, J. G. Utilization of electrically reduced neutral red by Actinobacillus succinogenes: physiological function of neutral red in membrane-driven fumarate reduction and energy conservation. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 2403-2410.

14. Chaudhuri, S. K.; Lovley, D. R. Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells. // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 1229-1232.

15. He, Z., Minteer, S. D., Angenent, L. T. Electricity generation from artificial wastewater using an upflow microbial fuel cell. //. Environ. Sci. Technol. 2005. V. 39. P. 5262-5267.

16. Kim, N., Choi, Y., Jung, S., Kim, S. Development of microbial fuel cell using Proteus vulgaris. II Bull. Korean Chem. Soc. 2000. V. 21. P. 44-49.

17. Rabaey, K., Clauwaert, P., Aelterman, P., Verstraete, W. Tubular microbial fuel cells for efficient electricity generation. // Environ. Sci. Technol. 2005. V. 39. P. 8077-8082.

18. Sell, D., Kramer, P., Kreysa, G. Use of an oxygen gas diffusion cathode and a three-dimensional packed bed anode in a bioelectrochemical fuel cell. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 211-213.

19. Rabaey, K.; Boon, N.; Siciliano, S. D.; Verhaege, M.; Verstraete, W. Biofuel cells select for microbial consortia that self-mediate electron transfer. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 5373-5382.

20. Rabaey, K.; Boon, N.; Hofte, M.; Verstraete, W. Microbial phenazine production enhances electron transfer in biofuel cells. // Environ. Sci. Technol. 2005. V. 39. P. 3401-3408.

21. Bond, D. R.; Lovley, D. R. Electricity production by Geobacter sulfurreducens attached to electrodes. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 1548-1555.

22. Logan, B.E. Microbial Fuel Cells. // John Wiley and Sons. New York, NY, USA. 2007. P. 216.

23. Logan B., Cheng S., Watson V., Estadt.G, Graphite fiber brush anodes for increased power production in air-cathode microbial fuel cells. // Environ.Sci.Technol. 2007. V. 41. P. 3341-3346.

24. Tender, L. M.; Reimers, C. E.; Stecher, H. A.; Holmes, D. E.; Bond, D. R.; Lowy, D. A.; Pilobello, K.; Fertig, S. J.; Lovley, D. R. Harnessing microbial generated power on the seafloor. // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. 821-825

25. A. J. Bard, L. R. Faulkner, Electrochemical Methods Fundamentals and Applications. // Wiley. New York. 2001. P. 856.

26. Cheng, S.; Liu, H.; Logan, B. E. Power densities using different cathode catalysts (Pt and CoTMPP) and polymer binders (Nafion and PTFE) in single chamber microbial fuel cells. // Environ. Sci. Technol. 2006. V. 40. P. 364-369.

27. W. Habermann, E.-H. Pommer, Biological fuel cells with sulphide storage capacity. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. V. 35. 128.

28. Т. H. Pham, J. K. Jang, I. S. Chang, В. H. Kim, Improvement of cathode reaction of a mediator-less microbial fuel cell. // J. Microbial. Biotechnol. 2004. V. 14. P. 324.

29. P. Aelterman, K. Rabaey, H. T. Pham, N. Boon,W. Verstraete, Microbial fiiel cells for wastewater treatment. // Environ. Sci. Technol. 2006. V. 40. P. 3388.

30. Rhoads, A.; Beyenal, H.; Lewandowski, Z. Microbial fuel cell using anaerobic respiration as an anodic reaction and bio-mineralized manganese as a cathodic reactant. //Environ. Sci.Technol. 2005. V. 39. P. 4666-4671.

31. Thai A. C., Yeo P.P.B. Stable blood glucose test strips and reflectance meters. // Singapore Medical Journal. 1983. V. 24. P. 45-53.

32. Тимонов A.M. Твердые полимерные электролиты: структура, свойства и применение. // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 8. С. 69-75.

33. Rabaey, К., Ossieur, W., Verhaege, М. and Verstraete, W. Continuous microbial fuel cells convert carbohydrates to electricity. // Water Science and Technology. 2005. V. 52. № 1-2. P. 515-523.

34. Liu, H.; Logan, В. E. Electricity generation using an air-cathode single chamber microbial fuel cell in the presence and absence of a proton exchange membrane. // Environ. Sci. Technol. 2004. V. 38. P. 4040-4046.

35. Stenina, I. A.; Sistat, P.; Rebrov, A. I.; Pourcelly,G.; Yaroslavtsev, A.B. Ionmobility in Nafion-117 membranes. // Desalination. 2004. V. 170. P. 49-57.

36. Willner I., Arad G., Katz E. A biofiiel cell based on pyrroloquinoline quinine and microperoxidase-11 monolayer-fimctionalized electrodes. // Biochem. Bioenerg. 1998. V. 44. P. 209-214.

37. Potter M.C. Electrical effects accompanying the decomposition of organic compounds. // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1911. V. 84. P. 260-276.

38. R.A. Bullen , T.C. Arnot, J.B. Lakeman, F.C. Walsh., Biofuel cells and their development. // Biosensors and Bioelectronics. 2006. №21. P. 2015-2045.

39. Scott Calabrese Barton, Josh Gallaway and Plamen Atanassov, Enzymatic Biofuel Cells for Implantable and Microscale Devices. // Chem. Rev. 2004. №104. P. 4867-4886.

40. Bond D.R., Holmes D.E., Tender L.M., Lovley D.R., Electrode-reducing microorganisms that harvest energy from marine sediments. // Science. 2002. V. 295. P. 483-485.

41. Chandhuri S.K., Lovley D.R., Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells. // Nature Biotechnol. 2003. V. 21. P. 1229-1232.

42. Aston W. J., Turner A. P. F., Biosensors and biofuel cells. // In Biotech. Genet. Eng. Rev. (ed. G. Russell). 1984. V. 1. P. 89-120.

43. Gunsalus I. G., Schuster C. W., Metabolism. // In The bacteria (eds. I. Gunsalus, R. Y. Stanier). 1961. V. 2.

44. Chibata I., Wingard L.B. Jr., Immobilized cells. // Applied biochemistry and bioengineering. 1983. V. 4.

45. Delaney G.M., Bennetto H.P., Mason J.R., Roller S.D., Stirling J.L., Thurson C.F., Electron transduction from enzymes and bacteria. // Anal. Proc. 1986. V. 23. P. 143-146.

46. Karube I., Suzuki S., Application of biosensor to fermentation processes. // Ann. Rep. Ferment. Processes. 1983. V. 6. P. 203-236.

47. Guilbault G. G. Analytical uses of immobilized enzymes. // Marcel Dekker. 1984. V. 3. P. 211-237.

48. Katz E. Biofuel Cells Review. //http://chem.ch.huii.ac.il/~eugeniik/biofuel/biofuel cells contents.html

49. Ikeda T., Kurosaki T., Takayama K., Kano K., Measurements of Oxidoreductase-Like activity of Intact Bacterial Cells by an Amperometric Method Using a Membrane-Coated Electrode. // Anal.Chem. 1996. V. 68. P. 192-198.

50. Roller S.D., Bennetto H.P., Delaney G.M., Mason J.R., Stirling J.L., Thurston C.F., Electron-transfer coupling in microbial fuel cells. // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1984. V. 34B. P. 3-12.

51. Bennetto H. P., Dew M. E., Stirling J. L, Tanaka K., Rates of reduction of phenothiazine 'redox' dyes by E. coli. II Chem and Ind. 1981. V. 8. P. 776.

52. Habermuller K., Mosbash M., Schuhmann W., Electron-transfer mechanisms in amperometric biosensors. // J. Anal. Chem. 2000. V. 366. P. 560568.

53. Rawson D.M., Willmer A.J., Turner A.P.F., Woll-cell biosensors for enviromental monitorig. //Biosensor. 1989. V. 4. P. 299-311.

54. Дебабов В.Г., Производство электричества микроорганизмами // Микробиология. 2008. Т. 77. № 2. С. 149-157.

55. Colquhoun I. J., Jay A. J., Eagles J., Structure and conformation of a novel genetically engineered polysaccharide P2. // Carbohydr. Res. 2001. № 330. P. 325333

56. Б. Эггинс., Химические и биологические сенсоры. // Москва: Техносфера. 2005. С. 336.

57. Smolander М., Marko-Varga G., Gorton L. Aldose dehydrogenase-modified carbon paste electrodes as amperometric aldose sensors. // Anal. Chim. Acta, 1995. V. 302. P.233-240

58. K. Tanaka, C.A. Vega, R. Tamamushi., Thionine and Ferric Chelate. Compounds as Coupled Mediators in Microbial Fuel Cells. // Bioelectrochem Bioenerg. 1983. №11. P. 289.

59. Y. Ahn, B.E. Logan, Effectiveness of domestic wastewater treatment using microbial fuel cells at ambient and mesophilic temperatures. // Bioresource Technology. 2010. V. 101. P. 469-475.

60. Xia Oxincao, Xia Huang, Peng Liang, Kang Xiao,Ying В. E. Logan, A new method for water desalination using microbial desalination cells. // Environ. Sci. Technol. 2009. V. 43. №. 18.

61. Rabaey K., Rodriguez J., Blackall L.L., Keller J., Batstone D.J., Verstraete W., Nealson K., Microbial ecology meets electrochemistry: electricity driven and driving communities. // ISME J. 2007. V. 1. P. 9-18.

62. О. Schaetzle, F. Barriere, К. Baronian, Bacteria and yeasts as catalysts in microbial fuel cells: electron transfer from micro-organisms to electrodes for green Energy. // Environmental Science. 2008. V. 1. P. 607-620.

63. Y. Hubenova, M. Mitov. Potential application of Candida melibiosica in biofuel cells. // Bioelectrochemistry. 2010. V. 78. P. 57-61.

64. Луста К.А., Решетилов A.H., Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах (обзор). // Прикл. биохимия и микробиол. 1998. Т. 34. Вып. 4. С. 339-353.

65. Tonouchi, N., Sugiyama, М., and Yokozeki, К., Construction of a vector plasmid for use in Gluconobacter oxydans. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. №67. P. 211-213.

66. Muynck C. De, Pereira C. S. S., Naesseus M., Parmentier S., Soetaert W., The Genus Gluconobacter Oxydans: Comprehensive Overview of Biochemistry and Biotechnological Applications. // Critical Reviews. 2007. № 27. P. 147-171.

67. Butters, T. D., Dwek, R. A., and Piatt, F. M., Imino sugar inhibitors for treating the lysosomal glycosphingolipidoses. // Glycobiology. 2005. № 15. P. 1143-1152.

68. Sievers. M., Swings. J., The genus Acetobacteraceae. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. 2nd Edition. // New York. 2005.

69. Colquhoun, I. J., Jay, A. J., Eagles, J., Morris, V. J., Edwards, K. J., Griffin, A. M., and Gasson, M. J., Structure and conformation of a novel genetically engineered polysaccharide P2. // Carbohydr. Res. 2001. № 330. P. 325-333.

70. Matsushita K., Fujii Y. Ano., 5-Keto-D-gluconate production is catalyzed by a quinoprotein glycerol dehydrogenase, major polyol dehydrogenase, in Gluconobacter species. // Applied and Environmental Microbiology. 2003. №69. P. 1959-1966.

71. Enzyme electrodes (Marco Cardosi, University of Paisley) (сайт) URL: http://www-biol.paisley.ac.uk/marco/EnzymeElectrode/Chapterl/Start.htm

72. Bennetto Н. P. Electricity generation by microorganisms. // Biotechnology Education. 1990. V. 1. № 4. P. 163-168.

73. Arlyapov V.A., Chigrinova E. Yu., Ponamoreva O.N., Reshetilov A. N., Express detection of BOD in wastewaters of starch-processing industry. Starch science and technology. // Editor: G.E. Zaikov. 2008. P. 188.

74. S. Timur, B. Haghighi, J. Tkac, N. Pazarlioglu, A. Telefoncu, L. Gorton., Electrical wiring of Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens withosmium redox polymers. //Bioelectrochemistry. 2007. V. 71. P. 38.i

75. S. Timur, U. Anik, D. Odaci, L. Gorton., Development of a Microbial Biosensor Based on Carbon Nanotube (CNT) Modified Electrodes. // Electrochem. Commun. 2007: V. 9. P. 1810-1831.

76. S. Timur, Y. Yigzaw, L. Gorton. Electrical'wiring of pyranose oxidase with osmium redox polymers. // Sens. Actuators. 2006. V. В 113. P. 684-691.

77. I. Vostiar, E.E. Ferapontova, L. Gorton., Electrical "wiring" of viable Gluconobacter oxydans cells with a flexible osmium-redox polyelectrolyte. // Electrochem. Commun. 2004. V. 6 P. 621.

78. F. Mao, N. Mano, A. Heller, Long Tethers Binding Redox Centers to Polymer Backbones Enhance Electron Transport in Enzyme "Wiring" Hydrogels. //J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125 P. 4951-4957.

79. Бабкина Е.Е. Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans: Дисс. канд. хим. наук. Тула. 2006. 129 с.

80. Еремин B.B., Каргов С.И., Успенская И.А., Кузьменко Н.Е., Лунин В.В., Основы физической химии. Теория и задачи: Учеб. пособие для вузов. — М.: Издательство «Экзамен». 2005. 480 с.