Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Катионизация альбумина и изучение его взаимодействия с очагами патологии с применением радиоактивной метки

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Деева, Валентина Семеновна, Обнинск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

КАТИОНИЗАЦИЯ АЛЬБУМИНА И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ОЧАГАМИ ПАТОЛОГИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ

(03. 00. 01. - радиобиология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: кандидат биологических наук В.Г.СКВОРЦОВ кандидат медицинских наук В.К.ПОДГОРОДНИЧЕНКО

на правах рукописи

ДЕЕВА Валентина Семеновна

Обнинск - 1998

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИЧ - человеческий иммунодефицитный вирус

ВФМ - водорастворимая фракция матрицы

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер

КБ - катионизированный белок

кБСА - катионизированный бычий сывороточный альбумин

ЛМТК - лимфометастазирующая тератокарцинома Льюиса

МКА - моноклональные антитела

нБСА - нативный бычий сывороточный альбумин

р1 - изоэлектрическая точка

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ЭГЭ - этилглициновый эфир

ЭДА - этилендиамин

ЭФП - электрофоретическая подвижность

ИФА - иммуноферментный анализ

Препараты катионизированного БСА:

(I) - БСА-,251

(И) - БСА-ЭГЭ-14С

(III) - БСА-ЭГЭ-,251

(IV) - БСА-ЭДА-1251

(V) - БСА-ОАЕ-1251 или А1-БСА

(VI) - БСА-0АЕ№С1 -1251 или А2-БСА

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................10

1.1. Заряд нормальных и опухолевых животных клеток..............................13

1.2. Использование катионизированных структур в качестве носителей диагностических и терапевтических препаратов......................................21

1.3. Катионизированные белки, их терапевтическое использование и значение в медицинской практике........................................................................................34

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................50

2.1. Материалы..........................................................................................................................................50

2.2. Методы................................................................................................................................................51

2.2.1. Синтезы меченных радиоактивными изотопами соединений ..................................................................................................................................................51

2.2.2. Методы катионизации альбумина .. ..........................................................53

2.2.3. Методы изучения механизма катионизации бычьего сывороточного альбуминана на QAE-сефадексе А50....................................57

2.2.4. Методы изучения взаимодействия альбумина с опухолевыми клетками экспериментальных животных..............................................59

2.2.5. Методы изучения действия катионизированного бычьего сывороточного альбумина в опытах in vivo ....................................................61

2.2.6. Расчетные методы......................................................................................................63

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .... 66

3.1. Исследование механизма катионизации бычьего сывороточного альбумина на QAE-сефадексе А 50......................................................................................68

3.2. Взаимодействие катионизированного альбумина с клетками in

vitro..................................................................................................................................................................82

3.2.1. Сравнительное связывание альбумина, катионизирован-ного различными способами с клетками асцитной карциномы Эрлиха........................................................................ 82

3.2.2. Взаимодействие катионизированного альбумина с клетками различных опухолей экспериментальных животных........ 88

3.2.3. Взаимодействие катионизированного бычьего сывороточного альбумина с клетками асцитной опухоли Эрлиха, подвернутыми тепловому воздействию и гамма-облучению............... 95

3.3. Поведение катионизированного альбумина в организме экспериментальных животных................................................. 99

3.3.1. Распределение катионизированного бычьего сывороточного альбумина по органам и тканям животных с лимфомета-стазирующей тератокарциномой Льюиса.............................. 99

3.3.2. Связывание катионизированного бычьего сывороточного альбумина с суставной поверхностью коленных суставов крыс с индуцированным ревматоидным артритом........................... 102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................ 106

ВЫВОДЫ........................................................................... 113

ЛИТЕРАТУРА................................................................. 115

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Целенаправленная доставка химиотерапевтиче-ских и радиофармацевтических препаратов к очагам патологии в организме является до настоящего времени одной из самых актуальных задач в медицинской практике. Селективная химиотерапия снижает побочное вредное действие лекарственных препаратов и позволяет снизить их расход. За счет более длительного удержания фармпрепаратов в очагах патологии упрощается процедура и стоимость лечения. Предлагаемые в настоящее время способы доставки лекарственных форм заключаются в применении различных носителей, задерживающихся в пораженном органе в силу биологических, физических или химических свойств, например, антител, липосом и других корпускулярных частиц, таких как альбуминовые микросферы [53]. Все эти способы доставки имеют ограниченное применение из-за присущих им недостатков.

Ряд известных свойств катионизированных белков (КБ) позволяет рассматривать их в качестве потенциальных носителей для лекарств. В работах, посвященных исследованию возможности использования КБ в качестве транспортеров химиотерапевтических и радиофармацевтических препаратов, показана их способность преодолевать гемато-энцефалический барьер и проникать в живую клетку. Однако, не изучена способность КБ доставлять химиопрепараты в очаг поражения, хотя для этого есть некоторые необхо-

димые предпосылки. Установлено, что в организме имеются участки ткани, обладающие ярко выраженным отрицательным зарядом, например, в гломе-рулах почек, в суставах, причем, тем больше, чем сильнее воспалительный процесс [20, 23, 29, 92]. По данным авторов, исследовавших поверхность клеточных мембран [122, 124] более выраженный по сравнению с нормальными клетками отрицательный заряд имеют мембраны опухолевых клеток.

Учитывая, что электростатическое взаимодействие противоположных зарядов является одним из самых сильных в физическом плане, целесообразно исследовать возможность модифицированного по заряду природного белка в качестве носителя лекарственных и (или) диагностических препаратов, имея ввиду, что положительно заряженный белок вступит в электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными участками ткани в живом организме. Не исключено, что КБ могут оказаться полезными для оценки тяжести лучевого поражения, так как известно, что на облученных клетках отрицательный заряд изменяется количественно и, следовательно, изменится степень взаимодействия катионизированного белка с такими клетками.

Поскольку в качестве носителей предпочтительно использование распространенных в животном мире, присутствующих в больших количествах и легковыделяемых белков, то в качестве модели в нашем эксперименте использован бычий сывороточный альбумин.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Выяснить возможность создания носителя хими-опрепаратов и радионуклидов на основе катионизированного белка, пригодного для лечения патологических процессов в органах и тканях, содержащих более выраженные, по сравнению с остальными отрицательно заряженные участки (например, при артритах и некоторых онкологических заболеваниях).

ОСНОВНЫМИ ЗАДАЧАМИ данного исследования были:

1. Получить катионизированный разными химическими способами БСА.

2. Получить катионизированный БСА, меченный радиоактивными изотопами до, в процессе и после катионизации.

3. Изучить взаимодействие меченого кБСА с известными отрицательно заряженными участками в организме и в опытах in vitro:

- с поверхностями суставов в норме и при развитии ревматоидного артрита;

- с клетками АКЭ;

- с клетками других видов опухолей.

4. Для изучения возможности нехимического способа катионизации белка исследовать механизм феномена приобретения способности альбумина, пропущенного через QAE-сефадекс, реагировать с отрицательно заряженными структурами.

5. Изучить поведение катионизированного белка, меченного радиоактивным изотопом в опытах in vivo.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Разработана методика введения радиоактивной метки С14 на основе процесса катионизации белка. Методика может оказаться полезной в тех случаях, когда мягкое бета-излучение предпочтительнее

/125т 131Т\

жесткого гамма-излучения ( 1, 1).

Проведен сравнительный анализ взаимодействия катионизированного альбумина с различными видами опухолевых клеток при разных способах катионизации, а также с интактными, облученными и инактивированными высокой температурой клетками АКЭ.

Установлен механизм катионизации альбумина при хроматографирова-нии на QAE-сефадексе. Показано, что катионизация альбумина на QAE-сефадексе происходит путем взаимодействия положительно заряженного четвертичного аммонийного основания из постоянно вымывающихся с се-фадекса полисахаридов с карбоксильными группами белка, что приводит к появлению на белке избыточного положительного заряда.

При сравнении взаимодействия катионизированного и нативного БСА с тканью коленного сустава крыс с индуцированным ревматоидным артритом установлено, что связывание кБСА многократно выше, чем связывание нативного БСА. Результаты могут оказаться полезными для создания лечебных препаратов пролонгированного действия.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Установленная in vitro и подтвержденная in vivo способность катионизиро-

ванного альбумина взаимодействовать с опухолевыми клетками является предпосылкой для создания носителей лекарств на основе КБ. Закономерности взаимодействия катионизированного альбумина с суставными тканями могут быть использованы при разработке транспортеров препаратов для лечения и диагностики воспалительных заболеваний суставов. Раскрытие механизма катионизации, свидетельствующего о том, что в процессе хроматографии на С)АЕ-сефадексе альбумин может химически взаимодействовать с ионообменником следует учитывать при интерпретации экспериментальных данных и при получении белковых препаратов, применяемых в лечебных целях, в частности, при получении иммуноглобулинов для внутривенного введения.

ПУБЛИКАЦИИ. Материалы, изложенные в работе, оформлены в виде Д. статей, приняты к опубликованию 4 статьй.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Общепризнанно, что повышение эффективности фармакологических препаратов может быть достигнуто за счет их избирательного накопления в очаге патологии. Большинство химиотерапевтических агентов не обладает специфичностью, и наряду с пораженными тканями оказывают влияние на нормальные, неизмененные ткани и клетки. Особо наглядно этот феномен выражен при химиотерапии раковых заболеваний, медленный прогресс в лечении которых в значительной степени связан с тем обстоятельством, что применяемые для лечения этих заболеваний химиотерапевтические препараты действуют не только на перерожденные, но и на нормальные клетки. Отсутствие селективности у фармакологических препаратов часто сопровождается их неспособностью проникать в клетку. Так, в определенных случаях развития резистентности к лекарствам, клетки становятся непроницаемыми для них, например, при антимикробной терапии антибиотики не могут поразить микробы, находящиеся внутри клетки [56]. Наконец, доступ лекарств к мишени может быть затруднен из-за анатомического препятствия, например, такого как гемато-энцефалический барьер.

Для решения перечисленных проблем предложено применять лекарственные препараты совместно с носителями. Идеальный носитель должен обладать, во-первых, избирательностью, во-вторых, если это необходимо, облегчать проникновение лекарственных препаратов в клетку, и, в-третьих, при

необходимости, способствовать проникновению препарата через анатомический барьер. Кроме того, носитель должен быть нетоксичным для живого организма, разрушаться в организме с освобождением лекарственных препаратов и иметь подходящие для введения размеры и форму.

В настоящее время разработано большое количество носителей, предлагаемых, главным образом, для доставки цитостатиков к опухолевым клеткам, поскольку именно цитостатики имеют много побочных эффектов.

Среди всех предлагаемых для использования носителей сродством к опухоли обладают только антитела, индуцированные к опухолевым антигенам. Однако несмотря на многочисленные работы, посвященные использованию антител в качестве носителей эти белки находят ограниченное применение в клинической практике и используются, главным образом, в диагностических целях. Это отчасти связано с тем, что лекарство, присоединенное к иммуноглобулинам, может снижать антительную активность или изменять третичную структуру белковых молекул, вследствие чего они быстро удаляются ретику-лоэндотелиальной системой. При многократном использовании мышиных моноклональных антител, которые наиболее часто используются в качестве носителя, в организме человека образуются антитела и, как следствие, иммунные комплексы, вызывающие неблагоприятные эффекты. Кроме этих, существует еще ряд не решенных до конца проблем, ограничивающих применение антител в качестве носителя для лекарств. Липосомы и альбумино-

вые микросферы, разработанные вначале для внутривенного введения, до настоящего времени не нашли широкого применения из-за повышенного включения в ретикулоэндотелиальную систему и нестойкости заключенной в них лекарственной формы, разрушающейся при длительном хранении. Другие предлагаемые носители также обладают рядом качеств, которые препятствуют широкому применению их в клинической практике. Поэтому поиск новых потенциальных носителей для целенаправленной доставки к опухолевым клеткам химиотерапевтических препаратов и радионуклидов остается актуальным. Основываясь на известных данных о том, что опухолевые клетки обладают значительно большим отрицательным зарядом, чем нормальные [122, 123, 124], можно предположить, что носители основанные на принципе электростатического взаимодействия, могут оказаться полезными для доставки химиотерапевтических или иных препаратов в очаг патологии. Не исключено, что принцип электростатического удержания носителя в очаге поражения может быть использован в транспортерах иного вида, для усиления их эффективности. Например, предложены системы доставки препарата, состоящие из агрегатов белковых макромолекул различной величины, поведение которых в организме достаточно хорошо изучено. Такие агрегаты в зависимости от их размеров обтурируют кровеносные сосуды различного диаметра. Частицы, менее чем 50 нм, могут проходить сквозь печеночный эндотелий и локализуются в селезенке и костном мозге; при внутривенном вве-

дении доставка частиц размером 7-12 микрометров приводит к их механической фильтрации легкими, тогда как частицы размером 3-12 микрометров задерживаются в капиллярной сети легких, печени и почек; внутриартери-альная доставка частиц размером более 12 микрометров приводит к их удержанию в первичном капиллярном ложе, блокировка которого может привести к направленной доставке, например, к печени или почкам, а для опухоле-содержащих органов - к селективной доставке к опухоли. Этот последний эффект, вероятно, зависит количественно и качественно от различия в капиллярных сетях опухоли во многих органах. Наряду с попытками модифицировать природу микросфер посредством введения магнитных частиц в сферы 1-2 микрона в диаметре для возможности доставки экстракорпоральных управляемых систем с двумерными магнитными полями и покрытием поверхности одними из биоадгезивных неионными поверхностно-активными или специфическими клеточными или тканевыми антителами предложено изменять поверхностный заряд частиц [31].

1.1. Заряд нормальных и опухолевых животных клеток.

Важнейшей физической характеристикой поверхности клетки является ее заряд, или дзета-потенциал, вычисленный на основании электрофоретиче-ской подвижности (ЭФП). Клетки млекопитающих несут на своей поверхности суммарный отрицательный заряд, который при постоянных условиях

среды является стабильной величиной. Компоненты клеточной мембраны содержат гидрофильные ионизированные группы, ориентированные в сторону водной фазы, которые и обусловливают характер и величину заряда клетки. Зависимость дзета-потенциала от ЭФП вытекает из теории электрокинетических явлений Гельмгольца-Смолуховского. Согласно ей дзета-потенциал находится в прямой зависимости от ЭФП клеток. Его величина выводится с учетом вязкости среды и напряженности электрического поля. Обычно ЭФП определяется по времени прохождения частицей заданного расстояния при известном токе и удельной эле�