Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Каталитическое расщепление основного белка миелина антителами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Каталитическое расщепление основного белка миелина антителами"

/ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М. М Шемякина и Ю. А. Овчинникова

На правах рукописи

Белогуров Алексей Анатольевич

КАТАЛИТИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА АНТИТЕЛАМИ.

Специальность 03 00.04 - "Биохимия"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

/

Москва - 2008

ииа170187

\

003170187

Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научные руководители:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибович

Кандидат биологических наук Пономаренко Наталья Александровна

Официальные оппоненты.

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Донцова Ольга Анатольевна

Ведущая организация Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится 18 июня 2008 года, в 10 00 на заседании Диссертационного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им. академиков М М Шемя-кинаиЮА Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, г Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан я, кг 2008 года

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

В последнее десятилетие роль В-клеточного ответа, сопровождающегося образованием антител к собственным антигенам приобретает все большее значение в этиологии и патогенезе аутоиммунных заболеваний Среди патологий аутоиммунной природы особое место занимает рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к разрушению миели-новой оболочки нервных волокон На данный момент не вызывает сомнений, что аутоантитела, вырабатываемые на мажорный компонент миелиновой оболочки - основной белок миелина (ОБМ), являются одним из важных патогенных факторов, влияющих на деградацию нервных волокон в центральной нервной системе при РС Структурно-функциональные исследования патогенных аутоантител могут оказаться весьма перспективными как с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностики, так и для решения фундаментальных вопросов иммунологии

Представление о биокатализе существенно расширилось в последние два десятилетия в связи с обнаружением каталитической активности молекул РНК и антител, альтернативных эволюционно совершенным ферментам Названные «рибозимами» и «абзимами» эти новые биокатализаторы стали объектом пристального внимания широкого круга исследователей К настоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих более 30 химических реакций, для многих из которых не описано природных ферментов В начале 90-х годов было показано, что каталитические антитела способны разрушать ау-тоантигены, в частности биополимеры, белки и нуклеиновые кислоты Это свойство антител в основном было присуще иммуноглобулинам, выделенным из сывороток крови пациентов с аутоиммунными патологиями Недавно наличие подобной абзиматической активности показано и при РС Таким образом, вместе со связывающей компонентой иммунноглобулинового ответа, особый фундаментальный и практический научный интерес представляет изучение роли каталитических аутоантител к ОБМ в развитии РС

ЦЕЛЬ РАБОТЫ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В данной работе была проанализирована деградация и связывание основного белка миелина и его фрагментов аутоантителами, изолированными из сывороток крови пациентов, больных рассеянным склерозом, а также мышей ли-

нии SJL, развивающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (experimental autoimmune encephalomyelitis, ЕАЕ) - животной модели PC

Для этого были поставлены следующие задачи

1 Определение сайтов протеолиза ОБМ каталитическими аутоантитела-ми, а также кинетических параметров данной реакции

2 Создание библиотеки рекомбинантных слитных белков тиоредокси-на с фрагментами ОБМ, так называемой «эпитопной библиотеки», перекрывающей всю последовательность данного нейроантигена

3 Исследование эпитопной специфичности гидролизующей и связывающей активности поликлонального пула антител к ОБМ и его фрагментам при PC, а также сравнение полученных данных с картиной В-клегочного огвега при других нейродегенеративных заболеваниях и ЕАЕ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Определены 6 преимущественных сайтов расщепления молекулы основного белка миелина каталитическими аутоантителами, изолированными из сывороток крови больных рассеянным склерозом и модельных животных Оценены кинетические параметры данной абзиматической реакции По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности аутоантител, изолированных из сывороток крови 26 пациентов с PC, 22 больных с другими нейродегенеративными заболеваниями (other neurological diseases, OND) и 11 здоровых доноров (healthy donors, HD) Каталитические свойства проявили антитела, полученные из сывороток крови 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения PC Среди больных нейродегенеративными заболеваниями и здоровых доноров доля положительного каталитического ответа была 9% и 0% соответственно Гидролизу каталитическими антителами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ 81-103, белок-носитель и другие пептиды оставались интактными Данный фрагмент сохранял свои субстратные свойства в составе конструкции с двумя флуоресцентными белками, образующими FRET-пару (флуоресцентный резонансный перенос энергии) Гидролиз линкерного пептида, представляющего собой эпитопный фрагмент ОБМ, приводит к изменению флуоресценции, что является основой для создания биосенсора для скрининга сывороток крови больных, а также может быть использовано для

дальнейшего изучения свойств каталитических антител при PC Выделена группа фрагментов ОБМ, уровень связывания с которыми достоверно различается попарно между группами PC, OND и здоровыми донорами Таким образом, изученная связывающая и сайт-специфическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при PC и мимикрирующих других нейродегенеративных заболеваниях позволяет вплотную подойти к разработке новых дифференциальных методов диагностики, а в будущем, возможно, и эффективного лечения данной патологии

ПУБЛИКАЦИЯ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

По теме диссертации опубликовано 5 статей Результаты диссертации были представлены на 9 международных российских и зарубежных конференциях Third Al-Ain International Immunology Meeting Immunoregulation in Chronic Inflammatory Disorders, (2008, Al-Ain, United Arab Emirates), XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (2008 г, Москва), Biology of B-Cells in Health and Disease, (2007, Banff, Alberta), Biocatalysis 2007 Fundamentals & Applications, (2007, Moscow - St Petersburg, Russian Federation), 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress (2006, Kyoto, Japan), XVIII зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (2006, Москва, Российская Федерация), научная конференция «VIII чтения памяти академика Ю А Овчинникова», (2006, Москва, Российская Федерация), 1st Mediterranean workshop on Clinical Immunology, (2006, Evora, Portugal), Biocatalysis 2005 Fundamentals & Applications (2005, St Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation)

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на /2.0 страницах и содержит Я2 рисунков и Ч таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Определение сайт-специфичности гидролиза основного белка миелина ау-

тоантителами.

Выделение поликлональных IgG из сывороток крови пациентов с рассеянным склерозом и модельных мышей линии S JL с ЕАЕ осуществляли хроматографией на колонке HiTrap Protein-G Sepharose (Amersham), дальнейшее получение ОБМ-связывающих антител проводили методом аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента иммобилизованного на сефарозе основного белка миелина. Особое внимание уделялось чистоте препаратов иммуноглобулинов Процесс вели соглзено рззр&ботзнным рз.нее методикям (Sinister et al, Science 1992; Gololobov et al, PNAS 2005) с целью исключения возможных загрязнений сопутствующими протеиназами.

Активность полученных препаратов антител была охарактеризована по реакциям протеолиза с использованием неспецифических (биотинилированный

А Пациент с PC ^ SJL ЕАЕ ® SJL ЕАЕ '"пациенте PC

Нс-

Lc-ОБМ-,

(3 (5 (> Í (3 (5 Ь ^ £> г?

БСА- - Le- —

Биотин

Кумасси Стрептавидин Кумасси

Рис. 1. Электрофореграмма (А, Б, Г) и иммуноблот (В) образцов гидролиза основного белка миелина (А), БСА (В) и МОГ (Г) препаратами антител, полученными из сывороток больных рассеянным склерозом (А, Г) и модельных мышей линии БЛ_ с индуцированным ЕАЕ (Б, В). Показана протеолитическая активность суммарного пула иммуноглобулинов класса 6 (1дв фракция), а также сорбирующихся (1дС ОБМ+) и не сорбирующихся (1дС ОБМ-) на иммобилизованный ОБМ антител. Легкие и тяжелые цепи антител обозначены 1_с и Не соответственно.

бычий сывороточный альбумин, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ), тиоредоксин I Е coli) и специфического (основной белок миелина) субстратов Результаты, представленные на рис 1, свидетельствуют о том, что препараты антител, выделенных из сывороток больных рассеянным склерозом и модельных мышей линии SJL с индуцированным ЕАЕ, обладали каталитической активностью только в отношении основного белка миелина Контрольные антитела из пулированной сыворотки здоровых доноров проявляли фоновый уровень активности ко всем описанным субстратам

Для определения сайт-специфичности гидролиза ОБМ аутоантителами было применено сочетание методов обращенно-фазовой хроматографии, трици-нового белкового электрофореза и масспектрометрии SELDI На первом этапе продукты гидролиза были разделены с использованием обращенно-фазовой хроматографии на колонке С4 (Рис 2А) Далее образцы фракций анализировали с использованием трицинового электрофореза, с последующей детекцией низкомолекулярных пептидов при помощи флуоресцентного красителя Sypro Orange (Рис 2Б) Молекулярная масса преимущественных в количественном отношении и четко детектируемых на неразделенном гидролизате (Рис 2Б, дорожка 9) продуктов была уточнена SELDI-масспектрометрией В результате объединения экспериментальных результатов и картирования молекулярных масс продуктов протеолиза относительно аминокислотной последовательности ОБМ удалось идентифицировать каждый фрагмент в структуре основного белка миелина (Рис 2Б, обозначены стрелками) В итоге было показано присутствие шести основных сайтов гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (Рис 2В)

При анализе характера расщепления основного белка миелина антителами (Рис 2) стало очевидным, что пять из шести сайтов гидролиза расположены в иммунодоминантных районах ОБМ, опознаваемых молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, ассоциированными с рассеянным склерозом, а два локализованы на энцефалитогенном пептиде - индукторе ЕАЕ у модельных животных

Для определения различий в скорости гидролиза ОБМ по отдельным сайтам было необходимо ввести специфическую метку с известной локализацией в молекулу ОБМ Ранее при изучении взаимодействия основного белка миелина коровы с протеин киназой С in vitro, было показано, что фосфорилированию подвергаются преимущественно Ser7, Ser54, и в малой

0.010

0.005

Мин

МБР

íaaqk...makki69 1aaqk....k.1ff154 1 aaqk...sdyk134 1 aaqk...slsr112 1ааок... vtpr96

1 2 3 i aaqk...dhar23

U3FSWG...MARR169

В

1aaqk...hffk.90

4 5 6 7 8 9

91nivt...marr169 97tppp...marr169

12 ___fl__31

aaqkrpsqrskylasasYmdharhgflprhrptgildslgrffgsdrgapkrgsgkdghh

82

AARTTHYGSLPQKAQGHRPQDENPVVHFFKNIVTPRTlWsQGKGRGL£jLSIÜ?SWGAEGQ

128 ф 144 ' JL ~_169

^GFGYGG|RASDYK"SAHKGLKGriDAQGTLSKJFlÜ.GGRDSRSGSPMARR|

srfs

Рис. 2. Обращенно-фазовая хроматография продуктов гидролиза ОБМ аутоантитела-ми (А) и анализ образцов посредством трицинового электрофореза (Б): 1 интактный ОБМ, 2-8 фракции, полученные при разделении продуктов гидролиза на обращенной фазе (соответствующие им пики на (А) обозначены одинаковыми номерами), 9 гид-ролизат без разделения; стрелками показаны идентифицированные фрагменты. (В) основные сайты гидролиза ОБМ специфическими аутоантитепами (красные стрелки). Желтым отмечены иммунодоминатные районы белка, оранжевым обозначен энцефа-литогенный пептид.

степени Ser , Ser"4 и Ser150. Данный способ модификации белка был признан подходящим для анализа. Для детекции продуктов гидролиза был применен

трициновый электрофорез с последующей авторадиографией ПААГ (Рис. 3). Полученные результаты на качественном уровне демонстрируют, что гидролиз протекает независимо и с примерно равной скоростью по всем основным сай-

Пациент с PC + + + + +

Мышь SJL с ЕАЕ + + + + +

Время (часы) 24 2 3 4 5 24

М кДа

16.9 Н.4 10.7 * " — 8.2

— 2.5

Рис. 3. Электрофореграмма гидролиза фосфорилированного основного белка миелина специфичными аутоантителами, изолированными из больных рассеянным склерозом и модельных мышей линии SJL с индуцированным ЕАЕ, визуализированная с помощью авторадиографии. Представлены точки, соответствующие 2, 3, 4/ 5 и 24 часам прохождения реакции. М -низкомолекулярный маркер.

Исследование субстратной специфичности анти-МВР аутоантител на модельных пептидах.

Дальнейшее исследование специфичности аутоантител проводили с помощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пептидов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной последовательности ОБМ. Этот подход был выбран на основании концепции предпочтительного «представления» субстратных пептидов в растворе. Доступность соответствующего эпитопа в качестве потенциального субстрата аутоантител требует придания этому пептидному фрагменту определенной структуры в растворе, что может быть обеспечено лишь в составе биополимера. Для изучения протеолиза изолированных эпитопов ОБМ специфичными антителами были созданы двенадцать генноинженерных конструкций, содержащих последовательности, кодирующие различные фрагменты основного белка миелина человека (Рис. 4) на основе экспрессионного вектора рЕТ-32Ь-СН(+). Между тиоредоксином и последовательностью пептидов основного белка миелина был помещен линкер (SGGGG^S. Подобный серин-глициновый линкер использует-

ся в большом количестве работ для придания гибкости и подвижности конструируемым рекомбинантным белкам. Наличие подобного пептидного линкера содействует корректной презентации фрагментов ОБМ в составе фьюжн-белка с тиоредоксином.

д Т7 терминатор

His кластер с-гт>сэпитоп

fl origin His кластер

фрагмент ОБМ

сайт энтерокиназы Sкластер тромбин

Ыа (агтр) ' '/ His кластер

Тиоредоксин 17 промотер lac оператор

lacl

Cola pBR322 origin

¡Tra|4Htisx6]-DDDDKIVI J ОБМ 1-12|Hisx6 K>myc^Hisx6 ¡

Б

овм вотшшшаш^

1 10 SU 30 40 SO 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

J 2/ J 5/ б/ 7/ а/ 9/ ю/ц/ i¿^ -

Рис. 4. (А) Схема плазмидного вектора, сконструированного для экспрессии фьюжн белка тиоредоксина I £ coli с фрагментами основного белка миелина (Б) Аминокислотная последовательность ОБМ человека. Показано распределение пептидов на последовательности основного белка миелина.

Фрагменты ДНК, кодирующие данные пептиды (ОБМ1-12) и серин-глициновый линкер (Link), были наработаны методом ПЦР с использованием перекрывающихся специфических олигонуклеотидных праймеров, содержащих дополнительно сайты рестрикции (Рис. 4). Для объединения фрагмента ОБМ и линкера друг с другом (Link-ОБМ), полученные ПЦР продукты пептидов ОБМ

были рестрицированы эндонуклеазой ВатШ и лигированы с рестрицированным BglH линкером, с одновременной рестрикцией ВатШ и BglJI для удаления из реакционной смеси нецелевых продуктов лигирования, у которых сохраняются сайты этих рестриктаз Лигазная смесь была использована для амплификации

Рис. 5. Схема получения экспрессионного вектора рБТ-32Ь-ОБМпептид-СН(+), содержащего фрагменты 1-12 основного белка миелина

фрагментов Link-ОБМ методом ПЦР с использованием концевых специфических олигонуклеотидных праймеров Наработанный таким образом фрагмент ДНК был рестрицирован эндо-нуклеазами Peil и Bell и лигирован в рестрицированный этими же эндонук-леазами вектор рЕТ-32Ь-СН(+) Полученным лигатом трансформировали клетки Е coli штамма DH5a Клоны были проверены на наличие вставки нужного размера методом ПЦР с использованием плазмидных праймеров STfor и T7rev Плазмиды, содержавшие фрагмент нужного размера, были выделены и проанализированы с помощью рестрикции по сайтам В glII и Xhol, а также сек-венированы с использованием плазмидного праймера T7rev

Для проведения аналитической экспрессии конструкции, содержащие се-рин-глициновый линкер совместно с фрагментами ОБМ1-12, были трансформированы методом электропорации в компетентные клетки Е coli штамма BL21(DE3) Экспрессию проводили в стандартных условиях Наличие рекомби-нантного белка нужного размера определяли методом разделения клеточных лизатов в ПААГ по Лэммли с последующей детекцией иммуноблоттингом с использованием моноклональных антител к с-шус эпитопу Проверенные таким образом клоны были использованы для приготовления музея штамма-продуцента Поскольку все рекомбинантные белки содержат (His)6 кластеры, их выделение из клеточных лизатов проводилось с применением металл-хелатной хроматографии Дальнейшая очистка велась на ионообменной смоле MonoS с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex75 Гомогенность получен-

ннп 06M1-12.7R/A

ПЦР ^

Bqlll

BamHI

Рестрикция

Лигирование t

Link-ОБМ

Г——1 ............1

ПЦР * Bell

Pol Рестрикция t

t

Лигирование в вектор pET-32b-CH(+) Ncol-BamHI

ных препаратов контролировалась электрофорезом с окрашиванием Кумасси и иммуноблоттингом и составляла более 95%

Для характеристики субстратной специфичности антител, фьюжн-белки тиоредоксина с фрагментами основного белка миелина инкубировались с иммуноглобулинами (суммарная IgG фракция), изолированными из сыворотки крови 26 больных рассеянным склерозом, 22 пациентов с OND, 11 здоровых доноров (HD) и мышей аутоиммунной линии SJL с ЕАЕ, индуцированным иммунизацией ОБМ Как видно из приведенных электрофореграмм (Рис 6), в случае пациентов с PC и остеохондрозом протеолизу подвергались только пептиды, содержащие энцефалитогенную последовательность ОБМ С другой стороны у мышей SJL с ЕАЕ, предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, наблюдался множественный гидролиз перекрывающихся эпитопов ОБМ Каталитические свойства проявили антитела, изолированные из 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения PC Среди больных нейродегенеративными заболеваниями и здоровых доноров доля положительного каталитического ответа была 9% и 0% соответственно Исключение составили два случая остеохондроза, при которых было отмечено наличие каталитической деградации пептида ОБМ под действием аутоантител Причем эти больные характеризовались значительной длительностью патологического процесса и серьезными нейрональными поражениями Контроль специфичности гидролиза осуществлялся разрезанием рекомбинантных белков бычим трипсином, катеп-сином D и металлопротеазой матрикса 3 (ММР-3) (Рис 6, нижняя часть) Для всех исследованных антител методом масспектрометрии SELDI сайты гидролиза были локализованы исключительно в рекомбинантных фрагментах основного белка миелина (Рис 7, Таблица 1), белок-носитель и линкерная часть оставались интактными Причем, сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов повторяют таковые в нативном белке (Рис 7) При детальном анализе продуктов расщепления энцефалитогенного пептида антителами было обнаружено, что сайтами гидролиза являются как Lys91 так и Arg97, причем лишь у двух пациентов степень расщепления по двум приведенным сайтам оказалась сравнимой (Таблица 1) В большинстве случаев при PC наиболее предпочтительным для гидролиза являлся аргининовый сайт Приведенные результаты свидетельствуют о том, что каталитические антитела, специфичные к участку МВР81"103, составляют подавляющее большинство в общем пуле МВР-гидролизующих иммуноглобулинов Полученные данные находятся в соответствии с сообщениями

Тгх-

Эпитопная библиотека ОБМ

А <§> $

«V

Л' ^

■9 -О- 3

Контроль

Рассеянный склероз, 1дС

Остеохондроз, 1дС

Мышь линии 5Л, 1дб

Трипсин

N

Катепсин О

Металлопротеаза матрикса 3

Рис б Сверху - вниз Контроль, гидролиз модельных пептидов протеоли-тическими антителами, изолированными из пациента с рассеянным склерозом, остеохондрозом, аутоиммунных мышей линии 531. с ЕАЕ, индуцированным ОБМ, бычим трипсином, катепсином 0 и металлопротеазой матрикса 3

____ относительно В-клеток, изолированных из больных рассеянным склерозом, узнающих преимущественно данный эпитоп, а также хорошо согласуются с фактом значительной иммунодоминантности этого фрагмента при представлении молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса патогенных Т-клеток В случае мышей линии БЛ., предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, репертуар протеолитических """* специфичных к основному белку миелина, намного шире и включает в себя антитела практиче-

,___ ски на все исследованные пептиды

(Рис 6,7). Сайты гидролиза реком-бинантных фрагментов данными антителами (Рис 6,7) в целом аналогичны действию на них неспецифической протеазы, однако по сравнению с ограниченным трипсинолизом не распространяются на тиоредоксин и линкерную часть Объяснением возникновения такого разнообразия МВР- специфичных протеолитических антител у мышей линии при иммунизации основным белком миелина может служить уже упоминавшаяся ранее особенность данной модельной линии - крайнее высокая частота индукции клонов В-клеток, продуцирующих каталитические антитела Сравнение сайтов расщепления рекомбинантных субстратов из сконструированной

Таблица 1 Сайты гидролиза модельных пептидов аутоантите-лами, выделенными из сывороток крови пациентов с рассеянным склерозом и протеоли-тическими ферментами (RR - ремиттирую-щий, РР - первично-прогрессирующий, SP - вторично прогрессирующий тип PC; Е -обострение, R - ремиссия, основные сайты отмечены желтым цветом, серым показаны минорные)

нами библиотеки под действием аутоанти-тел и набора протеи-наз, в том числе специфичных к ОБМ (Рис 7, Таблица 1), приводит к выводу о

достаточно значительных отличиях в специфичности этих биокатализаторов Этот факт позволил нам поставить вопрос о «специфическом модельном субстрате» для возможного скринингового анализа сывороток больных рассеянным склерозом и гибридом, продуцирующих моноклональные каталитические антитела к ОБМ

На основании данных по «дифференциальной специфичности» по сравнению с расщеплением протеиназами для реакции с аутоантителами нами был выбран фрагмент 81-103, содержащий энцефалитогенную последовательность ОБМ, для интеграции во FRET-napy Для этого на основе вектора pQe30 была создана генно-инженерная конструкция, экспрессирующая два флуоресцентных белка PS-CFP2 и TurboYF, соединенные вышеуказанным пептидом ОБМ, так называемый «EPeFRET» - от fincephalitogenic Peptide fluorescence .Resonance £negy Transfer (Рис 8A) При разрезании линкера прекращается резонансный перенос энергии и происходит падение флуоресценции (Рис 8Б,В)

№ Пациента/ фермент Стадия PC "QDENPW H F F К N I V Т Р R T PPPSQ103

MS32 RR/R 1 1

MS37 MS38 RR/R RR/E

MS39 RR/E 1 1

MS40 RR/R

MS41 RR/R

MS43 RR/R

MS75 RR

MS78 MS 79 RR/R RR/E

MS8Û RR/R

MS81 RR/R 1 1

MS82 RR/R

MS28 SP 1 1 1

MS31 РР

MS33 SP/E

MS34 SP/E

MS35 SP/E

MS36 SP/E 1 ]

MS42 SP/E

MS44 РР/Е

MS4S РР/Е

MS46 SP/R

MS76 SP

MS77 SP

MS83 SP I

Трипсин 1 1

ММР-3 1

Cathepsin D

SJLEAED РСИ

MBPMASQKfiPSQRHGSKYLATASTMDMARHGFLPRHRDTGILDSIGRFPGGDRGAPKRGSGKDSHHPARTAHYGSLPQKSHGfiTQDEN 1 MASQKRPSQRHGSKVLATASTMDHAEFfc 4 RFFGGDRGAPKÄ3SGKD5HHPARTAH 7 ODEN

3 RFfjFLPRHRDTGILDSIGRF- F G6DRG APKR 6 RTAHYGSLPQKSHGRTQDEN

2TASTMDHARHGFLPRHRDTGILDSI S^RfcSGKDSHHPAFiTAHYGbLPQKSHÜRlQ

MBPPWHFFKNIVTPRTPPPSOGKGRGL5L5RF5WGAEGQRPGFGYGGRA5DVK5AHKGFKGVDAOGTLSKirKLGGRDSR5GSPMARR 7PWHFK3)VT(iT)PPPSQG lOPGFGYGGRASDYgsfcHKGF

6PWHFFkM 9RGlSLSfiffcWGAEGQRPGFGYGGRA5 12 AOGTLSKIFlÖfcGRDSRSGSPMARR

8 ^VTfßUPPPSQGKGRGLSL^ä > 1 RASDYED\HKGFKGVDAQGTLSKIFjttj

Рис. 7. Схема слитных белков, содержащих различные последовательности ОБМ че ловека. Сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов основного белка миелина спе цифичными иммуноглобулинами, изолированными из пациентов с рассеянным скле розом (обозначены красным) и мышей линии SJLc ЕАЕ (отмечены белым).

А _

Абзим

Рис. 8 (А) Принципиальная схема РЯЕТ-подхода к исследованию кинетики абзимати-ческой реакции. (Б,В) Расщепление белка ЕРеРЯЕТ абзимами и модельными протеа-зами соответственно. Во врезке показано изменение спектра флуоресценции во времени.

Кинетические исследования гидролиза ОБМ и БРеШЕТ (ОБМ81-

103).

Для определения кинетических констант гидролиза ОБМ специфичными иммуноглобулинами высокоочищенные антитела ОБМ+ фракция) инкубировали с основным белком миелина, а затем аликвоты реакционной смеси наносили на обращенно-фазовую колонку С4 для определения степени гидролиза субстрата На основе полученных данных была построена полная кинетическая кривая, а соответствующие кинетические константы определены из графика в координатах Уокера-Шмидта (Рис 9) Каталитическая эффективность к£а/Кт

М0- м (мкМ) Рис. 9 Полная кинетическая кривая гидролиза основного белка миелина специфическими аутоантителами (А) На врезке данные представлены в коорди-— ------натах Уокера-Шмидта

составила 1 1 103 и 3 0 1 03 М"1 сек"1 в Чч1 случае антител человека и мыши, со-

ответственно (Таблица 1) Данные ве-

125

100

75

50

25

/

г'

/

7

73-ГЗ-гг

сек

личины более чем на два порядка ниже по сравнению с специфичными протеазами, например, энтерокиназой

0 5 10 15 20 25 30

время (часы) быка, эффективность которой по отношению к природному субстрату трипсиногену составляет 7 1 105 М"1 сек'1 В то же время, каталитическая эффективность изучаемых антител в большинстве

к„(М) к«, (сек1) Кг/к«, (сек'м') Таблица 1 Кинетические кон-

пациентсрс (70±3 0) ю6 (08±02) ю2 (11 ±о5)■ ю3 станты гидролиза ОБМ аутоантителами.

£)1 еае (4 0 ± 1 0) 106 (11 ±03) 102 (3 0 ± 1 3) 103

случаев превосходит значения, продемонстрированные для ранее полученных абзимов. Можно предположить, что достаточно медленное, но направленное действие антител по протеолизу основного белка миелина возможно играет определенную роль в разрушении миелиновых структур и патогенезе рассеянного склероза

О 0001 0001 001 01 1 10 100 1X0 0 0001 О 001 OOl Ol I Ю too 1000 Пептид 06M 81 103, цМ Пептид 06M 81 103(R97A), |iM

OE 10

00001 0001 001 01

10 100 1000 0,0001 0 001 0,01 01 Copaxone, pM

10 100 1000 Белок-носитель Тгх, дМ

Рис 10 Кривые ингибирования абзиматического и ферментативного гидролиза ЕРе-FRET слитным белком Тгх с фрагментом ОБМ81-ЮЗ (А), его мутантом R97A (Б), Copaxone (В) и белком-носителем (Г)

Кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантителами и ингиби-рование данной реакции слитными белками и Copaxone, известным лекарственным средством при PC, представляющем собой сополимер лизина, глутамино-вой кислоты, аланина и тирозина, представлены в таблице 2 и на рисунке 10

Таблица 2 Кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантителами и ингибиро-вание данной реакции слитными белками и Copaxone

Тип био- Кинетические константы гидролиза EPeFRET Ингибироеание реакции гидролиза EPeFRET (1С», цМ)

катализатора МиМ) к«г(сек') (сек 'М') 0БМ81-ЮЗ ОБМ81-ЮЗ R97A Тгх Copaxone

Трипсин [3 5±0 4) 10' 8 8±1 5 (2 5±0 7) 10® 3 140 7 1 8±0 6 2 9±0 3 (2 040 1) 101

ММР-3 6 440 8 (2 4±1 0) 101 (3 8±1 8) 104 8 240 8 (1 2±0 1) 10" (1 540 1) 10" (2 040 1) 10"

Абзии 7 6±0 9 (1 4±0 2) 102 (1 8±0 5) 103 (7 042 0) 10 3(9 0±1 0) 102 Не действ (1040 2) 101

Используя те же группы пациентов и здоровых доноров, была проанализирована связывающая активность к ОБМ и его эпитопной библиотеке поли-клонального пула иммуноглобулинов из сыворотки крови Уровни аутоантител к фрагментам ОБМ 48-70 и 85-170, а также к полноразмерным молекулам ОБМ и миелинолигодендроцитарному гликопротеину, были достоверно выше в сыворотке крови пациентов с РС в сравнении со здоровыми донорами Однако, специфическое взаимодействие всего лишь с двумя короткими фрагментами ОБМ 43-68 и 146-170 достоверно различалось в паттерне связывания аутоантител при РС и других нейродегенеративных заболеваний (Рис 11) Интересно, что корреляция уровня антител с ЕББЗ (качественный параметр, характеризующий тяжесть заболевания) была установлена для несколько других фрагментов основного белка миелина (Рис 12), что свидетельствует о разной значимости пептидов ОБМ в инициации и развитии заболевания

ОО45о Рис. 12 Корреляция параметра

2

ЕОББ с уровнем аутоантител из сывороток крови больных рассеянным склерозом к белку-носителю тиоредоксину, полноразмерным молекулам ОБМ и МОГ, а также к различным фрагментам ОБМ.

V

V ■

V

09 08 0,7 06

05

04

03

02

01

0

2 3 4 5 6 7

ЕОЭЭ

А

рр/бр I 1 ■! п виг шви павши

ШШ111К .1 ■ 1 1 11НМШ

ОШ пиши Ш1И 1«1

НО 1 (ЧИП

ОБМ И»1ИШЖ1ШЖИ

1 10 20 30 40 50 60 —

80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

1 10 20 30 40 50 60 70 80

ОБММА80КНР80ННС8КУиТА5ТМОНАННаРЬРЯНИОТС1Ш8ЮВРРССОЯ6АРКПС8СК08ННРАВТАНУа81РОК8НСЯТООЕМ

РР/БР -ЯЯ-СМО ЯЯ-ИО РР/БР - НЮ

РР/ЭР - ©N0 РН - ОНО ЯР - НО РР/ЭР - НО

90 100 110 120 130 140 150 160 170

ОБМ PVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGRGLSLSRFSWGAEGQRPGFGYGGRASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR

Белок-носительТос 1-27

оэ- о.э-

НЭ ОЫй РЯ РР^Р

53-81

НО ОМй ЯЙ РР/БР

65-92

НО ОМО ЯН РР/ЭР

81-103

НО ©N0 ЯН РР/ЭР

91-114

НО ©N0 ЯН РР/ЭР

107-132

- нп I - , Нд4- .

НО ©N0 ПП РР.5Р

НО ОМЬ рр РР/ЭР

НО ОКО РА РР/5Р

НО □N0 РР РР/ЗР

НО ОКО НЯ РР/5Р

Рис. 12. (А) Анализ паттерна связывания аутоантител из сывороток крови пациентов с ремитирующим- (ЯЯ) и прогрессирующим (РР/БР) рассеянным склерозом, а также больных дорсопатией (ОШ) и здоровых доноров (НТО) с библиотекой рекомбинант-ных фрагментов ОБМ. Обозначена последовательность ОБМ и его пептиды в составе слитного белка с тиоредоксином. Усиление цвета соответствует большему связыванию. (Б) Значение доверительной вероятности р статистически достоверного различия уровня аутоантител из сывороток крови здоровых доноров (НО), больных дорсопатией (ОШ), пациентов с ремитирующим- (ЯЯ) и прогрессирующим (РР/БР) рассеянным склерозом к полноразмерным молекулам МОГ и ОБМ, белку-носителю и фрагментам ОБМ. Значения р менее 0.05 принимались как статистически достоверные. НД - не достоверно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В последнее десятилетие роль В-клеточного ответа и сопутствующего образования антител к собственным антигенам при различных аутоиммунных заболеваниях приобретает все большее значение Нами на основе имеющейся выборки пациентов с нейрональными патологиями показано, что каталитическая активность аутоантител по отношению к ОБМ и его фрагментам выделяет рассеянный склероз в сравнении с другими нейродегенеративными заболеваниями значительно больше, чем связывание с данным антигеном Продемонстрированная сайт-специфичность в отношении основного белка миелина и его пре-зентированных пептидов позволяет вплотную подойти к созданию тест-систем на основе сконструированных модельных субстратов

ВЫВОДЫ.

1 Определены шесть основных сайтов протеолиза основного белка миелина (ОБМ) под действием аутоантител, выделенных из сыворотки крови пациентов с PC и мышей линии SJL с индуцированным ЕАЕ Показано, что расщепление молекулы белка по этим сайтам происходит с примерно равной скоростью Пять сайтов расположены в иммунодоминантных эпитопах белка, а два из пяти локализованы, кроме того, в районе энцефалитогенного пептида основного белка миелина

2 Получена эпитопная библиотека рекомбинантных фрагментов ОБМ на основе вектора рЕТ-32Ь-СН(+) для исследования субстратной специфичности выделенных абзимов Показано, что рекомбинантные белки, содержащие энце-фалитогенный пептид МВР81"103, обладают субстратными свойствами по отношению к исследованным протеолитическим антителам

3 Охарактеризованы кинетические параметры гидролиза ОБМ и белка EPeFRET специфичными аутоантителами, выделенными из сывороток крови пациентов с рассеянным склерозом и модельных мышей линии SJL, развивающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ)

4 Проанализирована связывающая активность аутоантител человека к эпитопной библиотеке ОБМ Показана возможность дифференциальной диагностики PC и мимикрирующих нейродегенеративных заболеваний

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи

1) Belogurov А А , Jr, I N Kurkova, A Fnboulet, D Thomas, V К Misikov, M Y Zakharova, S V Suchkov, S V Kotov, A I Alehin, В Avalle, E A Souslova, H С Morse, 3rd, A G Gabibov, and N A Ponomarenko Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies novel biomarker for multiple sclerosis (2008) J Immunol 180 1258-1267

2) Белогуров A A , Куркова И H , Мисиков В К , Сучков С В , Телегин Г Б, Алехин А И , Гончаров Н Г , Кнорре В Д, член-корреспондент РАН Габибов А Г и Пономаренко НА К вопросу о субстратной специфичности каталитических аутоантител при нейродегенеративных процессах (2007) Доклады Академии Наук, 413(3), 408-411

3) Ponomarenko N А , Durova О М , Vorobiev 1 1, Belogurov А А , Telegin G В , Suchkov S V , Kiselev S L , Lagarkova M A , Govorun V M , Serebryakova M V et al Autoantibodies to myelin basic protein catalyze site-specific degradation of their antigen (2006) Proc Natl Acad Set USA 103(2), 281-286

4) Ponomarenko N A , Durova О M , Vorobiev I I, Belogurov A A , Telegin G В , Suchkov S V, Misikov V К, Morse H С, III, & Gabibov A G Catalytic activity of autoantibodies toward myelin basic protein correlates with the scores on the multiple sclerosis expanded disability status scale (2006) Immunol Lett, 103(1) 45-50

5) Белогуров Ал А Протеолиз миелина аутоантителами (2006) Природа 3, 8485

Опубликованные тезисы конференций и доклады

1) Alexey A Belogurov Jr, Inna N Kurkova, Natalia A Ponomarenko, Alain Fri-boulet, Daniel Thomas, Maria U Zakharova, Berangere Avalle, Herbert С Morse III and Alexander G Gabibov Recognition and degradation of mbp peptides by serum autoantibodies novel biomarker for MS Poster presentation Third Al-Am International Immunology Meeting Immunoregulation in Chronic Inflammatory Disorders, March 17-20, (2008) - AlAin, United Arab Emirates

2) Белогуров A A , Куркова И H , Пономаренко Н А , Захарова МIO, Габибов А Г Связывание и деградация рекомбинантных фрагментов основного белка миелина каталитическими антителами как новый биомаркер рассеянного склероза Доклад XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления фи-

зико-химической биологии и биотехнологии», 11-15 февраля (2008) г, Москва, Российская Федерация

3) Alexey A Belogurov, N A Ponomarenko, О М Durova, I N Kurkova, Н С Morse III, A Friboulet, D Thomas, Alexander G Gabibov Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies as a novel biomarker for Multiple Sclerosis Poster presentation Biology of B-Cells in Health and Disease, February 6-12 (2007), Banff, Alberta

4) Belogurov Jr A A , Kurkova IN, Ponomarenko N A, Friboulet A, Thomas D, Zakharova M U , Avalle В , Morse III H С and Gabibov A G Recognition and Degradation of Myelin Basic Protein Peptides by Serum Autoantibodies Novel Biomarker for Multiple Sclerosis Poster presentation Biocatalysis 2007 Fundamentals & Applications, June 17-22, (2007), Moscow - St Petersburg, Russian Federation

5) Alexey A Belogurov, Natalia A Ponomarenko, Oxana M Durova, Ivan I. Voro-biev, InnaN Kurkova, Herbert С Morse III, Alain Friboulet, Daniel Thomas, Alexander G Gabibov Site-specific degradation of myelin basic protein by autoantibodies from MS patients and EAE mice Poster presentation 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress, June 18-23 (2006), Kyoto, Japan

6) А А Белогуров, H А Пономаренко, О M Дурова, И И Воробьев, И Н Куркова, А Г Габибов Специфический протеолиз основного белка миелина каталитическими аутоантителами Доклад XVIII зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 7-10 февраля (2006), Москва, Российская Федерация

7) А А Белогуров, Н А Пономаренко, О М Дурова, И И Воробьев, И Н Куркова, А Г.Габибов Связывание и протеолиз фрагментов основного белка миелина аутоантителами при рассеянном склерозе и других нейродегенеративных заболеваниях Постер Научная конференция «VIII чтения памяти академика Ю А Овчинникова», 23-27 октября (2006), Москва, Российская Федерация

8) Alexey A Belogurov, N A Ponomarenko, О М Durova, I I Vorobiev, I N Kurkova, H С Morse III, A Friboulet, D Thomas, Alexander G Gabibov Site-specific degradation of myelin basic protein by autoantibodies from MS patients and EAE mice Poster presentation 1st Mediterranean workshop on Clinical Immunology, October 26-29 (2006), Evora, Portugal

9) Belogurov A Definition of site-specific cleavage of myelin basic protein by auto antibodies Poster presentation Biocatalysis 2005 Fundamentals & Applications, June 1923 (2005), St Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation

Заказ № 18/05/08 Подписано в печать S OS 2008 Тираж 70 экз Уел п л ¡,25

^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 J/1 www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Белогуров, Алексей Анатольевич

оглавление. список сокращений. введение. искусственные каталитические антитела.

АНТИТЕЛА НА АНАЛОГИ ПЕРЕХОДНЫХ СОСТОЯНИЙ РЕАКЦИИ.

ВВЕДЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В СВЯЗЫВАЮЩИЙ ЦЕНТР АНТИТЕЛА ПУТЕМ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ИЛИ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА.

СОЗДАНИЕ АНТИТЕЛ ДЛЯ КАТАЛИЗА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИ НЕВЫГОДНЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ.

АНТИИДИОТИПИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

ПОЛУЧЕНИЕ АБЗИМОВ ПУТЕМ РЕАКЦИОННОЙ ИММУНИЗАЦИИ.

АБЗИМЫ, СОДЕРЖАЩИЕ КОФАКТОРЫ.

ГРАНИЦЫ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ АБЗИМОВ. природные каталитические антитела.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ВАЗОАКТИВНОМУ ИНТЕСТИНАЛЬНОМУ ПЕПТИДУ.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АКТИВНЫЕ ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ТИРОГЛОБУЛИНУ.

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ VIII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ.

ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩИЕ АНТИТЕЛА.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА НЕОБЫЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ.

ПРИРОДНЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА КАК ЧАСТЬ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ.

МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИРОДНЫХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ. 37 ОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ. рассеянный склероз.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.

Т-КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ В ПАТОГЕНЕЗЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА.

РОЛЬ В-КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА.

РОЛЬ НАТИВНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА. ЗНАЧЕНИЕ TLR.

КРОСС-РЕАКТИВНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ КАК ВОЗМОЖНАЯ ПРИЧИНА

ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА. основной белок миелина. строение, свойства, функции.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МИЕЛИНА.

ОСНОВНОЙ БЕЛОК МИЕЛИНА, СТРОЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. результаты и обсуждение.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧНОСТИ ГИДРОЛИЗА ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА

АУТОАНТИТЕЛАМИ.

ИССЛЕДОВАНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АНТИ-ОБМ АУТОАНТИТЕЛ НА МОДЕЛЬНЫХ

ПЕПТИДАХ.

КИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГИДРОЛИЗА ОБМ И EPEEFRET (ОБМ81-ЮЗ).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Белогуров, Алексей Анатольевич

выводы.

1. Определены шесть основных сайтов протеолиза основного белка миелина (ОБМ) под действием аутоантител, выделенных из сыворотки крови пациентов с PC и мышей линии SJL с индуцированным ЕАЕ. Показано, что расщепление молекулы белка по этим сайтам происходит с примерно равной скоростью. Пять сайтов расположены в иммунодоминантных эпитопах белка, а два из пяти локализованы, кроме того, в районе энцефалитогенного пептида основного белка миелина.

2. Получена эпитопная библиотека рекомбинантных фрагментов ОБМ на основе вектора рЕТ-32Ь-СН(+) для исследования субстратной специфичности выделенных абзимов. Показано, что рекомбинантные белки, содержащие энцефалитогенный пептид ОБМ81"103, обладают субстратными свойствами по отношению к исследованным протеолитическим антителам.

3. Охарактеризованы кинетические параметры гидролиза ОБМ и EPeFRET специфичными аутоантителами, выделенными из сывороток крови пациентов с рассеянным склерозом и модельных мышей линии SJL, развивающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ).

4. Проанализирована связывающая активность аутоантител человека к эпитопной библиотеке ОБМ. Показана возможность дифференциальной диагностики PC и мимикрирующих нейродегенеративных заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Белогуров, Алексей Анатольевич, Москва

1. Jenks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymology. New York: McGraw-Hill., 1969.

2. Raso, V. and B.D. Stollar, The antibody-enzyme analogy. Comparison of enzymes and antibodies specific for phosphopyridoxyltyrosine. Biochemistry, 1975. 14(3): p. 591-9.

3. Kohen, F., et al., Antibody-enhanced hydrolysis of steroid esters. Biochim Biophys Acta, 1980. 629(2): p. 328-37.

4. Kohen, F., et al., Monoclonal immunoglobulin G augments hydrolysis of an ester of the homologous hapten: an esterase-like activity of the antibody-containing site? FEBS Lett, 1980. 111(2): p. 427-31.

5. Kohler, G. and C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975. 256(5517): p. 495-7.

6. Pollack, S.J., J.W. Jacobs, and P.G. Schultz, Selective chemical catalysis by an antibody. Science, 1986. 234(4783): p. 1570-3.

7. Tramontano, A., K.D. Janda, and R.A. Lerner, Catalytic antibodies. Science, 1986. 234(4783): p. 1566-70.

8. Shokat, K.M. and P.G. Schultz, Catalytic antibodies. Annu Rev Immunol, 1990. 8: p. 335-63.

9. Schultz, P.G., The interplay between chemistry and biology in the design of enzymatic catalysts. Science, 1988. 240(4851): p. 426-33.

10. Napper, A.D., et al., A stereospecific cyclization catalyzed by an antibody. Science, 1987. 237(4818): p. 1041-3.

11. Hilvert, D., et al., Catalysis of concerted reactions by antibodies: the Claisen rearrangement. Proc Natl Acad Sci USA, 1988. 85(14): p. 4953-5.

12. Jackson D. Y., J.H.W., Sugasawara R., Reich S. H., Bartlett P. A., Schultz P.G., An Antibody-catalyzed Claisen Rearrangement. J. Am. Chem. Soc., 1988. 110: p. 4941-42.

13. Bencovic S. J., N.A.D., Lerner R. A., Catalysis of a Stereospecific Bimolecular Amide Synthesis by an Antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1988. 85(5355-8).

14. Braisted A. C., S.P.G., An Antibody-catalyzed Bimolecular Diels-Alder Reaction. J. Am. Chem. Soc., 1990. 112: p. 7430-1.

15. Hilvert D., H.K.W., Nared K. D., Auditor M. Т. M., Antibody Catalysis of a Diels-Alder Reaction. J. Am. Chem. Soc., 1989. Ill: p. 9261-9262.

16. Mundorff, E.C., et al., Conformational effects in biological catalysis: an antibody-catalyzed oxy-cope rearrangement. Biochemistry, 2000. 39(4): p. 627-32.

17. Reshetnyak, A.V., et al., Routes to covalent catalysis by reactive selection for nascent protein nucleophiles. J Am Chem Soc, 2007. 129(51): p. 16175-82.

18. Tawfik, D.S., et al., Efficient and selective p-nitrophenyl-ester-hydrolyzing antibodies elicited by a p-nitrobenzyl phosphonate hapten. Eur J Biochem, 1997. 244(2): p. 619-26.

19. Suzuki, H., et al., A catalytic antibody that accelerates the hydrolysis of carbonate esters. Prediction of the binding-site structure of the substrate. J Protein Chem, 1998. 17(3): p. 273-8.

20. Janda, K.D., et al., Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond. Science, 1988. 241(4870): p. 1188-91.

21. Miyashita, H., et al., Prodrug activation via catalytic antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(11): p. 5337-40.

22. Landry, D.W., et al., Antibody-catalyzed degradation of cocaine. Science, 1993. 259(5103): p. 1899-901.

23. Landry, D.W., Immunotherapy for cocaine addiction. Sci Am, 1997. 276(2): p. 42-5.

24. Mets, В., et al., A catalytic antibody against cocaine prevents cocaine's reinforcing and toxic effects in rats. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(17): p. 10176-81.

25. McKenzie, K.M., et al., Identification and characterization of single chain anti-cocaine catalytic antibodies. J Mol Biol, 2007. 365(3): p. 72231.

26. Benkovic, S.J., et al., The enzymic nature of antibody catalysis: development of multistep kinetic processing. Science, 1990. 250(4984): p. 1135-9.

27. Pollack, S J., G.R. Nakayama, and P.G. Schultz, Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites. Science, 1988. 242(4881): p. 1038-40.

28. Baldwin, E. and P.G. Schultz, Generation of a catalytic antibody by site-directed mutagenesis. Science, 1989. 245(4922): p. 1104-7.

29. Luo, G.M., et al., Generation of selenium-containing abzyme by using chemical mutation. Biochem Biophys Res Commun, 1994.198(3): p. 1240-7.

30. Qi, D.H., et al., Protection of myocardial mitochondria against oxidative damage by selenium-containing abzyme m4G3. Appl Biochem Biotechnol, 1999. 82(3): p. 167-73.

31. Janda, K.D., C.G. Shevlin, and R.A. Lerner, Antibody catalysis of a disfavored chemical transformation. Science, 1993. 259(5094): p. 490-3.

32. Gruber, K., et al., Structural basis for antibody catalysis of a disfavored ring closure reaction. Biochemistry, 1999. 38(22): p. 7062-74.

33. Shabat, D., et al., Antibody catalysis of a reaction otherwise strongly disfavoured in water. Nature, 1995. 374(6518): p. 143-6.

34. Shuster, A.M., et al., Anti-idiotypic and natural catalytically active antibodies. Mol Biol (Mosk), 1991. 25(3): p. 593-602.

35. Bronshtein, I.B., et al., DNA-specific antiidiotypic antibodies in the sera of patients with autoimmune diseases. FEBS Lett, 1992. 314(3): p. 25963.

36. Avalle, В., D. Thomas, and A. Friboulet, Functional mimicry: elicitation of a monoclonal anti-idiotypic antibody hydrolizing beta-lactams. Faseb J, 1998.12(11): p. 1055-60.

37. Izadyar, L., et al., Monoclonal anti-idiotypic antibodies as functional internal images of enzyme active sites: production of a catalytic antibody with a cholinesterase activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(19): p. 8876-80.

38. Ponomarenko, N.A., et al., Anti-idiotypic antibody mimics proteolytic function of parent antigen. Biochemistry, 2007. 46(50): p. 14598-609.

39. Lerner, R.A. and C.F. Barbas, 3rd, Using the process of reactive immunization to induce catalytic antibodies with complex mechanisms: aldolases. Acta Chem Scand, 1996. 50(8): p. 672-8.

40. Wirsching, P., et al., Reactive immunization. Science, 1995. 270(5243): p. 1775-82.

41. Barbas, C.F., 3rd, et al., Immune versus natural selection: antibody aldolases with enzymic rates but broader scope. Science, 1997. 278(5346): p. 2085-92.

42. Sinha, S.C., C.F. Barbas, 3rd, and R.A. Lerner, The antibody catalysis route to the total synthesis of epothilones. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(25): p. 14603-8.

43. Shabat, D., et al., Multiple event activation of a generic prodrug trigger by antibody catalysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(12): p. 692530.

44. Shamis, M., H.N. Lode, and D. Shabat, Bioactivation of self-immolative dendritic prodrugs by catalytic antibody 38C2. J Am Chem Soc, 2004. 126(6): p. 1726-31.

45. Sinha, S.C., et al., Prodrugs of dynemicin analogs for selective chemotherapy mediated by an aldolase catalytic Ab. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(9): p. 3095-9.

46. Shabat, D., et al., In vivo activity in a catalytic antibody-prodrug system: Antibody catalyzed etoposide prodrug activation for selective chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(13): p. 7528-33.

47. Rader, С., et al., A humanized aldolase antibody for selective chemotherapy and adaptor immunotherapy. J Mol Biol, 2003. 332(4): p. 889-99.

48. Wentworth, P., Jr., et al., A bait and switch hapten strategy generates catalytic antibodies for phosphodiester hydrolysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998.95(11): p. 5971-5.

49. Iverson, B.L. and R.A. Lerner, Sequence-specific peptide cleavage catalyzed by an antibody. Science, 1989. 243(4895): p. 1184-8.

50. Savitsky, A.P., et al., Kinetics of oxidation of o-dianisidine by hydrogen peroxide in the presence of antibody complexes of iron(III) coproporphyrin. Appl Biochem Biotechnol, 1994. 47(2-3): p. 317-27.

51. Mahy, J.P., et al., Hemoabzymes. Different strategies for obtaining artificial hemoproteins based on antibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1998. 75(1): p. 103-27.

52. Hilvert, D., Critical analysis of antibody catalysis. Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 751-93.

53. Stewart, J.D. and S J. Benkovic, Transition-state stabilization as a measure of the efficiency of antibody catalysis. Nature, 1995. 375(6530): p. 388-91.

54. Paul, S., et al., Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science, 1989. 244(4909): p. 1158-62.

55. Paul, S., et al., Site specificity of a catalytic vasoactive intestinal peptide antibody. An inhibitory vasoactive intestinal peptide subsequence distant from the scissilepeptide bond. J Biol Chem, 1990. 265(20): p. 11910-3.

56. Mei, S., et al., Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains. J Biol Chem, 1991. 266(24): p. 15571-4.

57. Paul, S., et al., Peptidolytic monoclonal antibody elicited by a neuropeptide. J Biol Chem, 1992. 267(19): p. 13142-5.

58. Gao, Q.S., et al., Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J Biol Chem, 1994. 269(51): p. 32389-93.

59. Sun, M., et al., Proteolytic activity of an antibody light chain. J Immunol, 1994. 153(11): p. 5121-6.

60. Gao, Q.S., et al., Site-directed mutagenesis of proteolytic antibody light chain. J Mol Biol, 1995. 253(5): p. 658-64.

61. Bangale, Y., et al., Vasoactive intestinal peptide binding autoantibodies in autoimmune humans and mice. Peptides, 2002. 23(12): p. 2251-7.

62. Bangale, Y., et al., VIPase autoantibodies in Fas-defective mice and patients with autoimmune disease. Faseb J, 2003. 17(6): p. 628-35.

63. Paul, S., et al., Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities ofBence Jones proteins and VL fragment. J Biol Chem, 1995. 270(25): p. 15257-61.

64. Tyutyulkova, S., et al., Efficient vasoactive intestinal polypeptide hydrolyzing autoantibody light chains selected by phage display. Biochim Biophys Acta, 1996. 1316(3): p. 217-23.

65. Li, L., R. Kalaga, and S. Paul, Proteolytic components of serum IgG preparations. Clin Exp Immunol, 2000. 120(2): p. 261-6.

66. Kalaga, R., et al., Unexpected presence ofpolyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis. J Immunol, 1995. 155(5): p. 2695-702.

67. Hifumi, E., et al., Removal of catalytic activity by EDTA from antibody light chain. Biometals, 2000.13(4): p. 289-94.

68. Hifumi, E., Y. Okamoto, and T. Uda, How and why 41S-2 antibody submits acquire the ability to catalyze decomposition of the conserved sequence of gp41 ofHIV-1. Appl Biochem Biotechnol, 2000. 83(1-3): p. 209-19; discussion 219-20, 297-313.

69. Hifumi, E., et al., Targeted destruction of the HIV-1 coat protein gp41 by a catalytic antibody light chain. J Immunol Methods, 2002. 269(1-2): p. 283-98.

70. Mitsuda, Y., et al., Catalytic antibody light chain capable of cleaving a chemokine receptor CCR-5 peptide with a high reaction rate constant. Biotechnol Bioeng, 2004. 86(2): p. 217-25.

71. Hifumi, E., et al., Specific degradation ofH. pylori urease by a catalytic antibody light chain. FEBS J, 2005. 272(17): p. 4497-505.

72. Ohara, K., et al., Improvement of catalytic antibody activity by protease processing. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 315(3): p. 612-6.

73. Mitsuda, Y., et al., Investigation of active form of catalytic antibody light chain 41S-2-L. Immunol Lett, 2005. 96(1): p. 63-71.

74. Thiagarajan, P., et al., Monoclonal antibody light chain with prothrombinase activity. Biochemistry, 2000. 39(21): p. 6459-65.

75. Thiagarajan, P. and S. Paul, Prothrombin cleaving antibody light chains. Chem Immunol, 2000. 77: p. 115-29.

76. Paul, S., et al., Characterization of thyroglobulin-directed and polyreactive catalytic antibodies in autoimmune disease. J Immunol, 1997. 159(3): p. 1530-6.

77. Li, L., et al., Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J Immunol, 1995. 154(7): p. 3328-32.

78. Kreuz, W., et al., Epidemiology of inhibitors and current treatment strategies. Haematologica, 2003. 88(6): p. EREP04.

79. Towfighi, F., et al., Comparative measurement of anti-factor VIII antibody by Bethesda assay and ELISA reveals restricted isotype profile and epitope specificity. Acta Haematol, 2005. 114(2): p. 84-90.

80. Lacroix-Desmazes, S., et al., Catalytic activity of antibodies against factor VIII in patients with hemophilia A. Nat Med, 1999. 5(9): p. 10447.

81. Lacroix-Desmazes, S., et al., The prevalence of proteolytic antibodies against factor VIII in hemophilia A. N Engl J Med, 2002. 346(9): p. 6627.

82. Shuster, A.M., et al., DNA hydrolyzing autoantibodies. Science, 1992. 256(5057): p. 665-7.

83. Gololobov, G.V., et al., DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1994. 47(2-3): p. 305-14; discussion 314-5.

84. Baranovskii, A.G., et al., Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis. Immunol Lett, 2001. 76(3): p. 163-7.

85. Breusov, A.A., et al., Comparison of the Level ofDNA-Hydrolyzing Polyclonal IgG Antibodies in Sera of Patients with Hashimoto's Thyroiditis and Nontoxic Nodal Goiter. Russ J Immunol, 2001. 6(1): p. 17-28.

86. Ponomarenko, N.A., et al., Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. J Immunol Methods, 2002. 269(1-2): p. 197-211.

87. Gabibov, A.G., et al., DNA-hydrolyzing autoantibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1994. 47(2-3): p. 293-302; discussion 303.

88. Gololobov, G.V., et al., Cleavage of supercoiledplasmidDNA by autoantibody Fab fragment: application of the flow linear dichroism technique. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(1): p. 254-7.

89. Kozyr, A. V., et al., Novel functional activities of anti-DNA autoantibodies from sera of patients with lymphoproliferative and autoimmune diseases. Appl Biochem Biotechnol, 1998. 75(1): p. 45-61.

90. Gololobov, G.V., et al., DNA hydrolysis by monoclonal anti-ssDNA autoantibody BV 04-01: origins of catalytic activity. Mol Immunol, 1997. 34(15): p. 1083-93.

91. Kit, Y., D.V. Semenov, and G.A. Nevinsky, Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A. Biochem Mol Biol Int, 1996. 39(3): p. 521-7.

92. Gorbunov, D.V., et al., Phosphorylation of Minor Lipids of Human Milk Tightly Bound to Secretory Immunoglobulin A. Russ J Immunol, 2000. 5(3): p. 267-278.

93. Buneva, V.N., et al., Catalytic DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers. Appl Biochem Biotechnol, 1998. 75(1): p. 63-76.

94. Stepaniak, L., Isolation and partial characterization of catalytic antibodies with oligonuclease activity from bovine colostrum. Prep Biochem Biotechnol, 2002. 32(1): p. 17-28.

95. Semenov, D.V., et al., Catalytic nucleotide-hydrolyzing antibodies in milk and serum of clinically healthy human mothers. Med Sci Monit, 2004. 10(2): p. BR23-33.

96. Savel'ev, A.N., et al., Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk. Clin Chim Acta, 2001. 314(1-2): p. 141-52.

97. Janeway, C., Immunobiology : the immune system in health and disease. 5th ed. 2001, Edinburgh. New York: Churchill Livingstone ; Garland, xviii, 732 p.

98. Planque, S., et al., Ontogeny of proteolytic immunity: IgMserine proteases. J Biol Chem, 2004. 279(14): p. 14024-32.

99. Tawfik, D.S., et al., Unexpectedly high occurrence of catalytic antibodies in MRL/lpr and SJL mice immunized with a transition-state analog: is there a linkage to autoimmunity? Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(6): p. 2145-9.

100. Lacroix-Desmazes, S., et al., High levels of catalytic antibodies correlate with favorable outcome in sepsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(11): p. 4109-13.

101. Rangan, S.K., et al., Degradation of beta-amyloid by proteolytic antibody light chains. Biochemistry, 2003. 42(48): p. 14328-34.

102. Polosukhina, D.I., et al., Hydrolysis of myelin basic protein by polyclonal catalytic IgGs from the sera of patients with multiple sclerosis. J Cell Mol Med, 2004. 8(3): p. 359-68.

103. Wentworth, P., Jr., et al., Evidence for antibody-catalyzed ozone formation in bacterial killing and inflammation. Science, 2002. 298(5601): p. 2195-9.

104. Nieva, J. and P. Wentworth, Jr., The antibody-catalyzed water oxidation pathway—a new chemical arm to immune defense? Trends Biochem Sci, 2004. 29(5): p. 274-8.

105. Zhu, X., et al., Probing the antibody-catalyzed water-oxidation pathway at atomic resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(8): p. 224752.

106. Paul, W.E., Fundamental immunology. 5th ed. 2003, Philadelphia, Penn. ; London: Lippincott Williams & Wilkins. xxi, 1701.

107. Sospedra, M. and R. Martin, Immunology of multiple sclerosis * Annu Rev Immunol, 2005. 23: p. 683-747.

108. Madaio, M.P., В cells and autoantibodies in the pathogenesis of lupus nephritis. Immunol Res, 1998. 17(1-2): p. 123-32.

109. Katz-Levy, Y., et al., Endogenous presentation of self myelin epitopes by CNS-resident APCs in Theiler's virus-infected mice. J Clin Invest, 1999. 104(5): p. 599-610.

110. Ota, K., et al., T-cell recognition of an immunodominant myelin basic protein epitope in multiple sclerosis. Nature, 1990. 346(6280): p. 183-7.

111. Wekerle, H. and R. Hohlfeld, Molecular mimicry in multiple sclerosis. N Engl J Med, 2003. 349(2): p. 185-6.

112. Li, Y., et al., Structure of a human autoimmune TCR bound to a myelin basic protein self-peptide and a multiple sclerosis-associated MHC class II molecule. EMBO J, 2005. 24(17): p. 2968-79.

113. Hori, S., et al., Specificity requirements for selection and effector functions of CD25+4+ regulatory T cells in anti-myelin basic protein T cell receptor transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(12): p. 8213-8.

114. Astier, A.L., et al., Alterations in CD46-mediated Trl regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Clin Invest, 2006. 116(12): p. 32527.

115. Zhang, X., et al., IL-10 is involved in the suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by CD25+CD4+ regulatory T cells. Int Immunol, 2004. 16(2): p. 249-56.

116. Colombo, M., et al., Accumulation of clonally related В lymphocytes in the cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients. J Immunol, 2000. 164(5): p. 2782-9.

117. Reindl, M., et al., Antibodies against the myelin oligodendrocyte glycoprotein and the myelin basic protein in multiple sclerosis and other neurological diseases: a comparative study. Brain, 1999. 122 ( Pt 11): p. 2047-56.

118. Kuhle, J., et al., Antimyelin antibodies in clinically isolated syndromes correlate with inflammation in MRI and CSF. J Neurol, 2007. 254(2): p. 160-8.

119. Baranzini, S.E., et al., В cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol, 1999.163(9): p. 5133-44.

120. McFarland, H.F., The В cell—old player, new position on the team. N Engl J Med, 2008. 358(7): p. 664-5.

121. Gerritse, K., et al., The involvement of specific anti myelin basic protein antibody-forming cells in multiple sclerosis immunopathology. J Neuroimmunol, 1994. 49(1-2): p. 153-9.

122. Egg, R., et al., Anti-MOG andanti-MBP antibody subclasses in multiple sclerosis. Mult Scler, 2001. 7(5): p. 285-9.

123. Berger, Т., et al., Antimyelin antibodies as a predictor of clinically definite multiple sclerosis after a first demyelinating event. N Engl J Med, 2003. 349(2): p. 139-45.

124. Lyons, J.A., et al., В cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenie peptide. Eur J Immunol, 1999. 29(11): p. 3432-9.

125. Antel, J.P. and A. Bar-Or, Do myelin-directed antibodies predict multiple sclerosis? N Engl J Med, 2003. 349(2): p. 107-9.

126. Warren, K.G. and I. Catz, Administration of myelin basic protein synthetic peptides to multiple sclerosis patients. J Neurol Sci, 1995. 133(1-2): p. 85-94.

127. Warren, K.G. and I. Catz, The effect of intrathecal MBP synthetic peptides containing epitope P85 VVHFFKNIVTP96 on free anti-MBP levels in acute relapsing multiple sclerosis. J Neurol Sci, 1997. 148(1): p. 67-78.

128. Bischof, F., et al., A structurally available encephalitogenic epitope of myelin oligodendrocyte glycoprotein specifically induces a diversified pathogenic autoimmune response. J Immunol, 2004. 173(1): p. 600-6.

129. Marta, M., et al., Unexpected regulatory roles ofTLR4 and TLR9 in experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur J Immunol, 2008. 38(2): p. 565-75.

130. Wucherpfennig, K.W. and J.L. Strominger, Molecular mimicry in T cell-mediated autoimmunity: viral peptides activate human T cell clones specific for myelin basic protein. Cell, 1995. 80(5): p. 695-705.

131. Lang, H.L., et al., A functional and structural basis for TCR cross-reactivity in multiple sclerosis. Nat Immunol, 2002. 3(10): p. 940-3.

132. Li, Y., et al., Structural basis for the binding of an immunodominant peptide from myelin basic protein in different registers by two HLA-DR2 proteins. J Mol Biol, 2000. 304(2): p. 177-88.

133. Olson, J.K., T.N. Eagar, and S.D. Miller, Functional activation of myelin-specific T cells by virus-induced molecular mimicry. J Immunol, 2002. 169(5): p. 2719-26.

134. Stern, J.N., et al., Amelioration of proteolipidprotein 139-151-induced encephalomyelitis in SJL mice by modified amino acid copolymers and their mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(32): p. 11743-8.

135. Hafler, D.A., Multiple sclerosis. J Clin Invest, 2004. 113(6): p. 788-94.

136. Ransohoff, R.M., Natalizumab for multiple sclerosis. N Engl J Med, 2007. 356(25): p. 2622-9.

137. Arkfeld, D.G., The potential utility of В cell-directed biologic therapy in autoimmune diseases. Rheumatol Int, 2008. 28(3): p. 205-15.

138. Hauser, S.L., et al., B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. N Engl J Med, 2008. 358(7): p. 676-88.

139. Nachreiner, Т., et al., Depletion of autoreactive B-lymphocytes by a recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein-based immunotoxin. J Neuroimmunol, 2008.

140. Xu, L.Y., et al., Suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in Lewis rats: synergistic effects of myelin basic protein (MBP) peptide 68-86 and IL-4. Clin Exp Immunol, 2000. 120(3): p. 526-31.

141. Bar-Or, A., et al., Induction of antigen-specific tolerance in multiple sclerosis after immunization with DNA encoding myelin basic protein in a randomized, placebo-controlled phase 1/2 trial. Arch Neurol, 2007. 64(10): p. 1407-15.

142. Kuhle, J., et al., Lack of association between antimyelin antibodies and progression to multiple sclerosis. N Engl J Med, 2007. 356(4): p. 371-8.

143. O'Connor, K.C., et al., Myelin basic protein-reactive autoantibodies in the serum and cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients are characterized by low-affinity interactions. J Neuroimmunol, 2003.136(1-2): p. 140-8.

144. Chamczuk, A.J., et al., A rapid ELISA-based serum assay for myelin basic protein in multiple sclerosis. J Immunol Methods, 2002. 262(1-2): p. 21-7.

145. Чехонин, В.П., et al., Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике дшшелинизирующих заболеваний. Вопросы медецинской химии, 2000. 6: р. 10-27.

146. Beniac, D.R., et al., Cryoelectron microscopy of protein-lipid complexes of human myelin basic protein charge isomers differing in degree of citrullination. J Struct Biol, 2000. 129(1): p. 80-95.

147. Riederer, В., et al., The effect of age on the microheterogeneous pattern of human myelin basic protein. Gerontology, 1984. 30(4): p. 234-9.

148. Zand, R., et al., Determination of the sites ofposttranslational modifications in the charge isomers of bovine myelin basic protein by capillary electrophoresis-mass spectroscopy. Biochemistry, 1998. 37(8): p. 2441-9.

149. Amur, S.G., G. Shanker, and R.A. Pieringer, Regulation of myelin basic protein (arginine) methyltransferase by thyroid hormone in myelinogenic cultures of cells dissociated from embryonic mouse brain. J Neurochem, 1984. 43(2): p. 494-8.

150. Musse, A. A., J.M. Boggs, and G. Harauz, Deimination of membrane-bound myelin basic protein in multiple sclerosis exposes an immunodominant epitope. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(12): p. 4422-7.

151. Husted, C., Structural insight into the role of myelin basic protein in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(12): p. 4339-40.

152. Pritzker, L.B., et al., Deimination of myelin basic protein. 1. Effect of deimination of arginyl residues of myelin basic protein on its structure and susceptibility to digestion by cathepsin D. Biochemistry, 2000. 39(18): p. 5374-81.

153. D'Souza, C.A. and M.A. Moscarello, Differences in susceptibility of MBP charge isomers to digestion by stromelysin-1 (MMP-3) and release of an immunodominant epitope. Neurochem Res, 2006. 31(8): p. 1045-54.

154. Medveczky, P., et al., Myelin basic protein, an autoantigen in multiple sclerosis, is selectively processed by human trypsin 4. FEBS Lett, 2006. 580(2): p. 545-52.

155. D'Souza, С. A., et al., Autocatalytic cleavage of myelin basic protein: an alternative to molecular mimicry. Biochemistry, 2005. 44(38): p. 12905

156. Libich, D.S., et al., Myelin basic protein has multiple calmodulin-binding sites. Biochem Biophys Res Commun, 2003. 308(2): p. 313-9.

157. Hafler, D.A., et al., Multiple sclerosis. Immunol Rev, 2005. 204: p. 20831.

158. Kishimoto, A., et al., Studies on the phosphorylation of myelin basic protein by protein kinase С and adenosine 3': 5'-monophosphate-dependentprotein kinase. JBiolChem, 1985. 260(23): p. 12492-9.

159. Poser, C.M. and V.V. Brinar, Diagnostic criteria for multiple sclerosis. Clin Neurol Neurosurg, 2001. 103(1): p. 1-11.

160. Current protocols on CD. cited; computer laser optical discs.

161. Coligan, J.E. and National Institutes of Health (U.S.), Current protocols in immunology. 1992, New York: Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience. 5 v. (loose-leaf).

162. Ponomarenko, N.A., et al., Autoantibodies to myelin basic protein catalyze site-specific degradation of their antigen. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(2): p. 281-6.

163. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

164. Wisdom, G.B., Molecular weight determinations usingpolyacrylamide gel electrophoresis with tris-tricine buffers. Methods Mol Biol, 1997. 73: p. 97-100.

165. Lee, S.Y. and S. Rasheed, A simple procedure for maximum yield of13.high-qualityplasmidDNA. Biotechniques, 1990. 9(6