Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Системная красная волчанка: антитела, гидролизующие основной белок миелина

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Системная красная волчанка: антитела, гидролизующие основной белок миелина"

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВА АННА МИХАЙЛОВНА

СИСТЕМНАЯ КРАСНАЯ ВОЛЧАНКА: АНТИТЕЛА, ГИДРОЛИЗУЮЩИЕ ОСНОВНОЙ БЕЛОК МИЕЛИНА

03.01.04-биохимия 4

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2014

005554243

005554243

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.х.н. профессор Невинский Георгий Александрович

Официальные оппоненты:

Константинов Юрий Михайлович, д.б.н., профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, зав. лабораторией

Мордвинов Вячеслав Алексеевич, д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, зам. директора по научной работе

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита диссертации состоится "10" октября 2014 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте vvww.niboch.nsc.ru.

Автореферат разослан «21» августа 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Иммунная система высших организмов играет важнейшую роль в их защите от патогенного влияния окружающей среды. Исследования последних десятилетий привели к открытию новой функции иммуноглобулинов — их способности катализировать большое число различных химических реакций. При некоторых аутоиммунных и вирусных заболеваниях обнаружены каталитически активные АТ (абзимы), гидролизующие ДНК, РНК, олигопептиды, белки и полисахариды.

Наработка иммунной системой абзимов является четким признаком тех или иных аутоиммунных и некоторых вирусных заболеваний. Было показано, что иммунная система больных рассеянным склерозом (РС) способна нарабатывать АТ с ДНКазной, РНКазной и амилазной активностями, а также абзимы, которые могут гидролизовать основной белок миелина (ОБМ) оболочки аксонов нервных тканей и, как следствие, играть важную роль в патогенезе PC (Polosukhina et al., 2004, 2005, 2006).

Системная красная волчанка (СКВ) — системное аутоиммунное полиэтиологическое диффузное заболевание. На поздних стадиях заболевания происходит поражение практически всех органов, ассоциированное с образованием большого разнообразия аутореактивных АТ. Среди разнообразных клинических проявлений СКВ можно выделить подобные РС неврологические проблемы - это психозы, энцефалопатии, судорожный синдром, парестезии, цереброваскулиты. Известно, что томографией у больных СКВ на поздних стадиях заболевания в головном мозге обнаруживаются бляшки, сходные с таковыми у больных РС. Следует отметить, что СКВ и РС имеют некоторое сходство в проявлении медицинских, биохимических и иммунологических показателей. Дифференциальная диагностика этих заболеваний может быть затруднена из-за отсутствия четких различий клинических проявлений. Во многих случаях точный диагноз может быть поставлен только после длительного наблюдения и на поздних стадиях этих заболеваний. Недавно было показано, что ОБМ-гидролизующая активность является собственным свойством IgG, IgM и IgA крови больных РС. Расщепление ОБМ антителами крови было предложено в качестве нового биологического маркера РС (Ропотагепко et al., 2006). Однако в литературе нет данных об ОБМ-гидролизующей активности АТ больных СКВ и их отличительных свойствах по сравнению с таковыми для РС.

Целью работы является изучение ферментативных свойств моно- и поликлональных АТ с ОБМ-гидролизующей активностью из крови больных СКВ и сравнение поликлональных абзимов с таковыми у пациентов с РС. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• получить гомогенные препараты антител из плазмы крови больных РС, СКВ и здоровых доноров; доказать, что протеолитическая активность антител больных СКВ является их собственным свойством;

• получить гомогенные препараты АТ с различным типом легкой цепи и различных подклассов, и исследовать их ферментативные свойства (субстратную специфичность, рН- и Ме2+-зависимости, тип протеазной активности, и т.д.), а

также оценить их вклад в суммарную активность поликлональных IgG больных СКВ;

• провести анализ сайтов расщепления 17-, 19-, 21- и 25-членных олигопептидов;

• провести селекцию фаговой библиотеки генов легких цепей IgG антител больных СКВ и скрининг полученных фагов на наличие клонов, продуцирующих протеолитически активные AT; получить фракции фагов, продуцирующие моноклональные легкие цепи (МЛЦ) и изучить ферментативные свойства МЛЦ.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что гомогенные препараты поликлональных IgG (и их легкие цепи) из крови больных СКВ гидролизуют интактный ОБМ и четыре олигопептида (ОП), соответствующие сайтам расщепления, но не другие глобулярные контрольные белки. Доказано, что протеолитическая активность является собственным свойством интактных IgG их F(ab) и F(ab)2 фрагментов и легких цепей; Fc-фрагмент AT протеолитической функции не проявляют. Показано, что в отличие от AT больных PC, абзимы больных СКВ в большей степени являются металлопротеазами и в меньшей степени - сериновыми протеазами, они заметно отличаются по ферментативным свойствам от антител больных PC. IgG, содержащие легкие цепи X-, к-типа, а также IgG всех четырех подклассов (IgGl-IgG4) больных СКВ обладают каталитической активностью, все они реально отличаются по каталитическим свойствам и различаются по вкладу в общий гидролиз ОБМ поликлональными AT. Методом фагового дисплея, получены фракции фагов, продуцирующие рекомбинантные моноклональные легкие цепи антител (МЛЦ). Впервые показано, что моноклональные легкие цепи AT против ОБМ в принципе могут обладать как узкой, так и широкой специфичностью по отношению к белковым субстратам, особенно если субстраты в той или иной степени гомологичны. Впервые показано, что МЛЦ против ОБМ могут обладать не только протеолитической, но и ДНКазной активностью.

Личный вклад автора состоит в участии в постановке задач, решаемых в рамках диссертационной работы, проведении основных экспериментов и обработке результатов, участии в интерпретации полученных данных, и подготовке статей к публикации.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей. Результаты работы были представлены на XL VI, XLVII международных научных студенческих конференциях "Студент и научно-технический прогресс" (2008, 2009), IV "Актуальные вопросы неврологии" (2008), XVI и XVII международной конференции "Ломоносов" (2009, 2010), XII Всероссийской конференции "Фундаментальная наука и клиническая медицина" (2009), II Всероссийской конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований», (2009), XXII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2010), III научно-практической конференции неврологов «Актуальные проблемы неврологии», (2010), конференции, посвященной памяти

профессора И.П. Протасевича, (2010), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 1000-летию г. Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки», (2010), ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (2010, 2012).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 132 страницах, включая 45 рисунков и 5 таблиц и приложение (16 страниц, 26 рисунков). Список литературы содержит 245 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Иммуноферментный анализ уровня аутоантител к ОБМ. С помощью ИФА было оценено относительное содержание АТ против ОБМ. Титры АТ против ОБМ в крови здоровых доноров изменялись в диапазоне от 0,02 до 0,16 ед. А450, средняя величина (СВ) 0,09 ± 0,04 ед. А450. Уровни анти-ОБМ АТ у больных СКВ лежали в диапазоне от 0,27 до 0,54 ед. А450, СВ = 0,38 + 0,09 ед. А450. Таким образом, у всех пациентов с СКВ титр АТ к ОБМ был выше, чем для здоровых доноров. Количество АТ против ОБМ у больных РС изменяются в диапазоне от 0,67 до 0,98 ед. А450, СВ = 0,79 + 0,08 ед. А450 (Ро1овиШпа е1 а!., 2004, 2006). Таким образом, у пациентов с СКВ уровень АТ к ОБМ был в ~ 4,2 раза выше такового уровня у здоровых людей, но он оказался в ~ 2,1 раза ниже, чем у больных РС.

Выделение из плазмы крови. Из плазмы крови больных СКВ, РС и здоровых доноров аффинной хроматографией на РгтЯет 0-5ерЬагояе были выделены индивидуальные электрофоретически и иммунологически гомогенные поликлональные Для анализа смеси использованы как индивидуальные

препараты, так и смеси равных количеств от 10 больных СКВ (СКВ-^От1Х), РС (РС-1ёОт1х), а также здоровых доноров (ЗД-^От;х). Суммарный препарат ^О крови больных СКВ разделяли на фракции, содержащие легкие цепи к- и Х- типа, а также АТ различных подклассов (^01, ^02, 1£03 и 1§04) с помощью аффинной хроматографии на сорбентах с иммобилизованными моноклональными АТ мышей к человеческим различного типа (анти-[§01, анти-^С2, анти-^ОЗ и анти-1§04, анти-Х и анти-к ЗерЬагозе).

Субстраты для протеолитической активности. Ранее были установлены специфические белковые последовательности, по которым проходит ^О-зависимый гидролиз ОБМ антителами из крови больных РС, исходя из которых синтезированы четыре флуоресцентно-меченных ОП (ОП-17, ОП-19, ОП-21, ОП-25). Показано, что индивидуальные препараты СКВ-^От|х эффективно гидролизуют интактный ОБМ (рис. 1), соответствующие ему ОП-17, ОП-19, ОП-21 и ОП-25 (рис. 2), но не контрольные глобулярные белки (рис. 3).

контроль ЗД-1дС

1 1 2 3 14 16 18 24ч 1

ОБМ

АБВ АБВ АБВ АБ

ОП-17 ОП-19 ОП-21

Рис. 1. Электрофоретический анализ (12% гель) гидролиза 0,7 мг/мл ОБМ препаратом СКВ-ДО™ (0,003 мг/мл) за различное время инкубации.

Рис. 2. ТСХ-анализ относительной

протеолитической активности СКВ-ДО™, (А), ЗД-ДО™ (6) четырех различных ОП. Для сравнения приведен контроль - инкубация в отсутствие антител (В). 0,01-0,12 мг/мл АТ больных СКВ, время инкубации -6 ч.

Доказательство принадлежности каталитической функции

антителам крови больных СКВ. Для доказательства принадлежности ОБМ-гидролизующей активности непосредственно АТ было проверено выполнение нескольких жестких критериев. Было показано, что а) АТ являются электрофоретически

гомогенными; б) при гель-фильтрации СКВ-1§От|х после их инкубации в условиях разрушения прочных комплексов антиген-антитело (рН 2,6) пик активности совпадает с пиком (рис. 4); в) АТ количественно связывались с иммобилизованными АТ мыши против легких ^С человека и пик их активности совпадал с пиком АТ при их специфической элюции кислым буфером (рис. 5).

После ЗОБ-электрофореза АТ положение пика активности соответствовало интактным ^О, а после восстановления дисульфидных связей ДТТ, протеолитическая активность СКВ-^От,х проявлялась только в участке геля, соответствующем положению легких цепей и не было обнаружено других белковых полос или протеолитической активности (рис. 6).

1 - белки инкубированные в присутсвие АТ

2 - белки инкубированные в отсутствие АТ

Рис. 3. Электрофоретический анализ гидролиза белков препаратом СКВ-ДО™* (12% ПААГ1. Белки (0,25 мг/мл) инкубировали в течение 24 ч с СКВ-ДО™, (0,03 мг/мл). 1 и 2 дорожки - белки, инкубированные в присутствии и отсутствии АТ, соответственно.

Агво 0,05

0,04 0,03 0,02

0,01 0,00

Объем, мл

Рис. 4. Профиль гель-фильтрации препаратов СКВ-ДО™, на сорбенте Эирегйех-200 в 0,1 М С1у-НС1 рН 2,6: — оптическое поглощение при 280 нм (А28о), П - относительная активность гидролиза ОП-19. За 100% принят полный гидролиз антителами 1 мМ ОП-19 за 6 ч инкубации. Ошибка определения относительной активности < 7-10 %.

0,00-

Рис. 5. Профиль аффинной хроматографии препаратов СКВ-1д<Зтй на апй-С БерИагове: — оптическое поглощение при 280 нм (А28о) и П относительная активность гидролиза ОП-19. За 100 % принят полный гидролиз 1 мМ ОП-19 за 6 ч антителами. Ошибка определения относительной активности < 710 %.

g 20-

60 80 100 120 Номер фрагмента геля

т т т т т

кДа 06 Н 45 30 I. 20

Рис. 6. А - Анализ активности легких и тяжелых цепей 1дв больных СКВ после ЗОЭ-электрофореза.

Б - Электрофоретический анализ белков (дор. 1 - 1дО после обработки ДТТ, дор. 2 - белковые маркеры). Ошибка определения < 7-10 %.

гидролиз ОП-19 фрагментами протекал литературными данными о повышении

С помощью протеолиза IgG папаином получены Fab-фрагменты IgG. Показано, что они гидролизуют ОБМ; Fc-фрагмент активностью не обладал (рис. 7). Кроме того, Fab-фрагменты IgG эффективно гидролизовали ОП-19 (рис. 8). Таким образом, проверка ряда описанных выше критериев показала, что ОБМ-гидролизующая активность является собственным свойством не только интактных IgG-абзимов крови больных СКВ, но и их легких цепей.

Значения Ки и kcat гидролиза ОП-19 и интактного ОБМ Fab-фрагментами составили Ки = 6,0±1,5мМ, £са,=36±5 мин"1 и = 30±6 мкМ, icat=l,0±0,15 мин' соответственно. В отличие от ОБМ, значения Км для ОП-19 в случае интактных IgG и его фрагментов были сопоставимы, в то время как в 3-4 раза быстрее. Это согласуется с скорости гидролиза субстратов при

переходе от интактных абзимов к их Fab- и Р(аЬ)2-фрагментам и изолированным легким цепям (Nevinsky et al.t 2002-2013).

к Fab Fc

Рис. 7. Электрофоретический анализ (12 % ПААГ) гидролиза ОБМ в течение 12 ч в присутствии: к - препарата интактных 1дв больных СКВ, РаЬ-фрагмента и Рс-фрагмента 1дв после отщепления РаЬ-фрагмента от интактной молекулы.

О 0,02 0,08 0,14 0,20 0,26 мг/мл _Fab-фрагменгоз

-й ::::: [

# ф Ш Ф j ж Ш ж Щ Щ: ш \

* t I I I I i ж 4 *> * * #!

Рис. 8. ТСХ-анализ продуктов гидролиза ОП-19 РаЬ-фрагментами 1д(3 больных СКВ в различной концентрации.

Исследование ферментативных свойств !дС. Среди 12 индивидуальных препаратов ^О больных СКВ относительная протеолитическая активность гидролиза ОБМ при его фиксированной концентрации (0,2 мг/мл), варьировала от 1,3 до 3,2 мкМ ОБМ/ч/мг АТ. Среднее значение относительной протеолитической активности составило 2,5±0,5 мкМ ОБМ/ч/мг АТ (кажущееся значение £са, = (3,2±0,6) х 10"2 мин"').

Исследована зависимость относительной скорости реакции гидролиза ОБМ от рН реакционной среды для препаратов из крови больных СКВ. рН-зависимость для каждого препарата АТ уникальна, все препараты гидролизуют ОП-19 в широком диапазоне значений рН. Активность большинства препаратов повышена при рН 7,5-8,5. Ранее показано, что препараты АТ из крови 6 больных РС имеют преимущественно два максимума активности: в гидролизе ОБМ при рН 6,0 и 9,5 {Ро1озиШпа е? а1„ 2004, 2006).

Протеазы классифицируют в соответствии с характером их каталитической активности и природой функциональных групп: металлопротеазы, сериновые, цистеиновые и кислые протеазы. Протеазы, относящиеся к этим группам, можно различить по чувствительности к различным специфическим ингибиторам. Ингибиторный анализ показал, что анти-ОБМ абзимы больных СКВ более чувствительны к ЭДТА: в среднем активность препаратов СКВ-^Оть, составила 57,2±2,8 % в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, и 43,5±1,2 % - в присутствии ЭДТА, в среднем активность препаратов РС-1§От;х составила 47,7±1,5 % в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, и 88,9±2,3 % - в присутствии ЭДТА.

Таким образом, РС представлены в большей степени сериновыми

протеазами и в меньшей - металлопротеазами, а больных СКВ в большей степени представлены металлопротеазами и в меньшей степени - сериновыми протеазами (рис. 9). А ингибиторы цистеиновых и кислых протеаз (йодацетамид, лейпептин и пепстатин А) не оказывали существенного влияния на протеолитическую активность абзимов при РС и СКВ.

Анализ зависимости протеолитической активности абзимов больных СКВ и РС от экзогенных ионов различных металлов показал, что влияние ионов различных металлов (в концентрации 2 мМ) на ОБМ-гидролизующую активность уменьшается в следующем ряду: Са2+ > М£2+ > 2п2^ > №2+ > Со2+ > Си2+ > Бе2+ > Мп2+ в случае АТ крови больных СКВ. Несколько иной порядок: Со2+ > Са2+ > М£2+ > №2+ ~Мп2+ > гп2+ > Си2+ > Бе2" наблюдался для абзимов крови больных РС (рис. 10). В тоже время, для каждого из двенадцати препаратов был характерен индивидуальный набор ионов металлов, оказывающих различное влияние на активность абзимов.

□ РС-1дСт» Н СКВ-1дСт.>

Рис. 9. Влияние специфических ингибиторов канонических протеаз на протеолитическую активность 1дС больных СКВ и РС. За 100% гидролиз ОП-19 в отсутствие ингибиторов. Ошибка определения < 7-10 %.

. 2+.. 2+_ 2+2+ _ 2+ - Мд Си Ре гп

I СКВНдвт!. ШРСМдСт*

Ме в 2 мМ, на активность

Рис. 10. Анализ влияния фиксированной концентрации протеолитическую диализованных против ЭДТА препаратов СКВ-1дСт|х и РС-1дЗ,™х. За 100% принят полный гидролиз 1 мМ ОП-19 за 6 ч в присутствии 0,1 мг/мл АТ.

и Со2+) получены

Для четырех лучших активаторов 1£От;х (Са2+, Mg2+. концентрационные зависимости близкие к колоколообразному типу: зависимости протеолитической активности от концентрации ионов металлов для СКВ-^От;х имеют максимум для Са2+ и Г^2+при концентрации ~2 мМ, при ~1 мМ для Zn2+, и

-1 мМ и 2п2+: как лучшего

4 мМ (рис. 11). активатора ОБМ-

металлов на

2+

4 мМ для Со^, для РС - Са^ и -1,5 мМ; Со2+:

Проанализированы эффекты 2 мМ Са2+. гидролизующих абзимов, в сочетании с ионами других протеолитическую активность. Из рис. 11 видно, что только добавление ионов Со или М£2т приводит к значительному и сопоставимому увеличению активности [§0, в то время как Тх?*, Си2+, М2+ и Ре2+ снижают каталитическую активность, а Мп2+ не оказывал значительного эффекта.

Увеличение каталитической активности в присутствии второго иона металла может быть следствием двух разных причин. Возможно, что пул поликлональных ^О больных СКВ может содержать субфракции АТ, зависимые только от ионов Са2+, 1У^2+ или Со2+, взаимодействие которых с другими ионами металлов может приводить к снижению их активности. Тем не менее, нельзя исключать, что некоторые субфракции ^О, как и некоторые ферменты, могут быть активированы одновременно двумя различными ионами металлов.

7

Л" 45 I-

Л

с;

15

о о

5

О

о

X

о

5 о

» гп АМд ■ Са «Со

Рис. 11. Зависимости относительной

2+

4

2+

6 8 10 [Ион металла], мМ

2+

2+

К 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

[Второй металл], мМ

Шгп' »Со" АМд!*ТРег* ♦Мп" +№'* X Си2'

Рис. 12. Зависимость относительной

протеолитической активности 1дС-СКВШ|Х протеолитической активности СКВ-1д<ЗтЬ< в от концентрации ионов двухвалентных гидролизе ОП-19 от концентрации Ме* при металлов: Са2*, Со2+, Мд2+ и За фиксированной концентрации Са * (2 мМ). к -

100 % принят полный гидролиз ОП-19 за активность АТ без ионов металлов. За 100% 6 ч 0,1 мг/мл АТ. Ошибка определения принят полный гидролиз 0,33 мМ ОП-19 за 6 ч относительной активности не превышала мг/мл АТ. Ошибка определения < 7-10 %. 7-10 %.

Исследование сродства антител-протеаз к ОБМ Аффинной хроматографией на ОБМ-сефарозе поликлональные были разделены на 9 фракций по сродству

к ОБМ (рис. 13, А, Б). Для фракции элюированной 0,2 М №С1, Ки составила 89±10 мкМ (¿са, = 0,01 мин"1), для фракции, элюированной 0,4 М №С1, Кы = 46+5 мкМ (ксЯ = 0,28 мин"1), а для фракции, элюированной 2,0 М MgCl2, Км = 20±5 мкМ (^са! = 0,08 мин"1). Таким образом, сродство фракций к ОБМ (в терминах величин Км) постепенно возрастает с увеличением концентрации соли, использованной для элюции.

Все фракции анти-ОБМ абзимов из крови больных СКВ (рис. 13, А) более чувствительны к ЭДТА, чем абзимы крови больных РС (рис. 13, Б). Следовательно, в суммарном препарате АТ больных СКВ содержится больше металлопротеаз с разным сродством к ОБМ, чем в случае больных РС.

Характеристика различных подклассов и с различным типом

легкой цепи. С помощью ИФА было оценено относительное содержание в индивидуальных сыворотках крови больных СКВ ^О различных подклассов, которое уменьшается в ряду: (77,6±2,0 %) > 1^2 (22,5±3,3 %) > ^03

(7,3±1,7 %) > 1§04 (2,1+1,1 %). Аналогичная закономерность получена для ^О из крови больных РС: (67,6+2,2%) > (18,1±1,5%) > ^вЗ (10,8+2,6%) > 1§04 (3,4±1,4%). Как у больных СКВ, так и РС концентрация ^О содержащих легкие цепи типа к, выше, чем легкие цепи типа X: к-^в (55,3+7,3) > Х-^С (44,6+7,3) - для больных СКВ, для больных РС: к-1§0 (51,8+9,3) > (48,1±9,3).

Объем, мл

Рис. 13. Профили оптической плотности (-) аффинной хроматографии СКВ-1дОт|>( (А) и РС-1дОтк (Б) на ОБМ-сефарозе и анализ относительной протеолитической активности фракций 1дв без ЭДТА (□) и в присутствии ЭДТА (и).За 100% принят полный гидролиз ОП-19 в концентрации 1 мМ за 6 ч, 0,1 мг/мл АТ. Ошибка определения < 7-10 %.

Аффинной хроматографией на специфических сорбентах были получены IgG с легкими цепями типа к и типа X, а также четырех подклассов IgGl-IgG4. При этом ОБМ-гидролизующей активностью обладали все полученные фракции абзимов больных СКВ и PC. Активность к-IgG была сопоставимой с активностью A.-IgG. Для IgGl-IgG4 величины ксм возрастали в следующем порядке: IgG4 < IgG2 < IgG3 < IgGl. На основании приведенных выше данных ИФА и относительной активности рассчитан вклад разных AT в общую ОБМ-гидролизующую активность абзимов больных СКВ (табл. 1).

Таблица 1. Относительная протеолитическая активность CKB-IgG различных типов в

гидролизе ОБМ и их относительный вклад в активность суммарного препарата_

Относительная

п _ Относительное активность, Кажущаяся xl О2 Вклад в общую

" " ® содержание, % (игОБМ/MrIgG (min"') активность, %

_за 1 ч)_

Нефракционированный препарат IgG IgGmix 100 1,95±0,05 2,6±0,1 100

IgG, содержащие легкие цепи к- и 1,-типа K-IgG 55,4±5,0 1,8±0,2 2,4±0,2 51,6±4,3

WgG 44,6±4,0 2,1±0,2 2,8±0,2 48,4±4,0

IgG, содержащие подклассы тяжелых цепей: IgG l-IgG4 IgGl 70,8±2,0 2,3±0,1 3,0±0,1 73,0±3,4

lgG2 20,6±3,0 2,0±0,2 2,7±0,3 19,1±1,8

IgG3 6,7±1,5 2,2±0,1 2,9±0,1 6,7±0,3

IgG4 1,9±1,0_1,3±0,1_1,7±0,1_1,2±0,2

Значения крассчитаны согласно уравнению: fcat = V (М / мин) / [IgG], Вклад препараты к-IgG, X-IgG, IgGl - IgG4 в общую активность нефракционированных AT был рассчитан с учетом относительного содержания этих типов AT в суммарном препарате IgG.

Анализ активности к- и X-IgG, IgGl-IgG4 (рис. 14) в гидролизе ОП-17, ОП-19, Оп-21 и ОП-25 показал, что A,-IgG более активны, чем к-IgG в гидролизе всех ОП.

Однако, среди содержащих тяжелые цепи разных подклассов, наблюдались более существенные различия: ^02 наиболее активны по отношению ОП-19 и ОП-21, 1ёОЗ - ОП-25, а ^04 - ОП-19 и ОП-25.

На рис. 15 представлено влияние специфических ингибиторов сериновых протеаз фенилметилсульфонилфторида (РМ8Б) и металлопротеаз ЭДТА на гидролиз ОБМ различными препаратами Так же как и для СКВ-^От1Х, Х-^О, и к-^в более значительное ингибирование активности наблюдается в случае инкубации с ЭДТА, чем с РМ8Б, который снижал активность ^О1, 1§02 и 1§03 в гидролизе ОБМ на 20-30 %, в то время как влияние ЭДТА на эти препараты АТ было значительно больше: 40-60 %. РМББ не значительно влиял на активность в то время как ЭДТА подавлял эти абзимы на ~ 65 %.

ИоП-17 □ ОП-19 □ОП-21 □ ОП-25

Рис. 14. Относительная протеолитическая активность препаратов к-1дв, А-1дС и 1дС1-1д04 крови больных СКВ в реакции гидролиза ОП. За 100 % принят полный гидролиз ОП за 6 ч 0,1 мг/мл АТ.

^100

л

□ РМЭР ■ ЭДТА

Рис. 15. Влияние ингибиторов на протеолитическую активность

препаратов к-1дС, Л-1дв и 1дв1-1дС4 крови больных СКВ. За 100% принят гидролиз ОБМ в отсутствие ингибиторов.

Как и суммарные СКВ-1§От)х, индивидуальные препараты АТ, к- и и

^С1-1£04 гидролизовали ОБМ в широком диапазоне рН (5,3-9,5), профили рН-зависимости различались для каждого типа (рис. 16). Например, не имели какого-либо ярко выраженного оптимума рН и гидролизовали ОБМ с сопоставимой активностью почти при любом значении рН. ^БЗ обладали наибольшей активностью при рН 7,0-7,5. Максимальный уровень гидролиза ОБМ в случае ^01 наблюдается при рН 7,5, а в случае - рН 8,2. к-^в- и Х-^О-абзимы

демонстрировали сходные зависимости относительной скорости от рН с основным максимумом в области рН = 8,0.

Следует отметить, что после выделения АТ по стандартным методикам, они существенно, но не полностью теряют связанные с ними ионы двухвалентных металлов. Учитывая это, сначала было оценено влияния диализа против ЭДТА на относительную протеолитическую активность полученных препаратов (рис. 17).

После диализа активность к-^й уменьшалась значительнее, чем в случае X-^О. были представлены в большей степени абзимами с активностью типа

сериновых протеаз, их активность после удаления эндогенных металлов была существенно выше, чем для

А Б

Рис. 16. Зависимость относительной протеолитической активности препаратов различного типа крови больных СКВ в гидролизе ОБМ от величины рН реакционной смеси. За 100 % принят полный гидролиз 1 мг/мл ОБМ за 6 ч инкубации в присутствии 0,1 мг/мл АТ. Ошибка определения относительной активности не превышала 7-10 %.

Добавление пар ионов Са2++1У^2+ или Са2++Со2+ в реакционную смесь приводила к сопоставимому увеличению относительной активности (в 1,6-1,7

раза), к-^в (в 2,0-2,3 раза). В то время как Са2++Со2+ не активировали 1§01, его активность возрастала ~ в 1,6 раза в присутствии Са2++М§2+. Интересно, что Са2++Со2+ сильно активировали ^02 (~2,9 раза), ^ОЗ (-6,4 раза), и ^04 (-6,0 раза). Сопоставимое увеличение активности наблюдалось в присутствии 1§02 (-5,7 раза), ^йЗ (-3,5 раза), и ^04 (-4,4 раза). Соотношение относительной активности л-^С, к-^О, 1§С1 - ^04 до и после диализа с ЭДТА и их активность в присутствии различных ионов металлов были индивидуальными для каждого типа анализируемых препаратов ^О.

20-

о о

1

Рис. 17. Относительная

протеолитическая активность в гидролизе ОБМ препаратов нефракционированного СКВ-1дСтЬ1, Х-1дС, к-1дО и 1дС1-1д04 до и после диализа АТ против ЭДТА, а также после добавления к диализованным препаратам экзогенных ионов металлов. За 100 % принят полный гидролиз пептида за 6 ч в присутствии 0,1 мг/мл АТ.

1дв1 1дБ2 1дСЗ 1дС4 А-1дС к-1дС СКВЧдСЗтх | ДО диализа □ после диализа с ЭДТА □ Са2'+Со" ОСа2*+Мдг*

МАЬОМОР-МЭ анализ продуктов гидролиза олигопептидов. Для

выявления основных и второстепенных пептидов ^О-зависимого протеолиза ОБМ были проанализированы продукты расщепления ОП-17, ОП-19, ОП-21 и ОП-25 с помощью обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ), масс-спектрометрии и ТСХ. На рис. 18, А представлены данные ОФХ ОП-17. Было выявлено пять основных и несколько дополнительных очень маленьких пиков, соответствующих

флуоресцентным продуктам гидролиза ОП. Продукты пяти основных пиков были проанализированы с помощью ТСХ (рис. 18, Б) и масс-спектрометрии (рис. 18 В, Г). Аналогичные данные были получены и для других ОП.

А

ts.fi

3

3 ;

3

а о,5

е.! й I 3

з

1Л

Ащгкжгггрка

J

А

В

Я5Х10 1.0

2 3; 1; 4{5);4 в».»

Номер пика етлсле хррчятрграфин

4(5); 5; 5; 5; 5; 5

1885.6

658.4 , 955.4

1Т43.8 I I Я**-0

21М. 4

1. .!.. 1. .. А,

880 вм 1090 1200 1480 1800 1(00 2000 2200 2400

1200 1480 1800 1800 2800

Стуштчатк .чккса.Ьярял

2200 2400

Рис. 18. Профиль ОФХ продуктов глубокого гидролиза ОП-17 с помощью СКВ-1дС™ (Л), данные анализа продуктов гидролиза с помощью ТСХ, соответствующих пикам ОФХ (Б), а также масс-спектрометрии (В). Номера дорожек графика Б совпадают с номерами пиков на панели А, дорожка с1 соответствует ОП-17, инкубированному в отсутствие АТ, а дорожка с2 - полной реакционной смеси до разделения продуктов ОФХ. На графике В приведены МА1_01-ТОР-спектры: исходного ОП-17 и отдельных продуктов гидролиза. На графике Г приведен МАЮ1-ТОР-спектр всех продуктов гидролиза ОП после 24 ч инкубации, присутствующих в конечной нефракционированной реакционной смеси.

На основании совокупности полученных данных найдены основные, умеренные и второстепенные сайты расщепления, соответствующие полученным продуктам гидролиза ОП-17, ОП-19, ОП-21 и ОП-25 (рис. 19).

Из рис. видно, что для ОП-17 существует по меньшей мере, четыре основных сайта расщепления (после второго, третьего, четвертого и тринадцатого

аминокислотных остатков) отличающихся от таковых для глобулярного ОБМ (рис. 19).

ОБМ ЕМР\Л/НРРК|Ы1\Л"РРТР

44 ПП 17 Х-ЕЫ4Р|У|УНРРК1М1\Л"^Р1РДР 24ч и//- Х-1ЕМ|Р|У1УНРРК1М11У1Т1Р1Р1ТР

4ч 24ч ОБМ§ ОП-19 1-ЗРЦРЗ\ЛЛЗАЕС(ЖР6РСУСС Х-1_311ЧХР|3\ЛЮАЕССЖРС1РСУС0 Х-ЬЗ^^ЗУУ^АЕ'ССЖРС'РкЗУСС

4ч 24ч ОБМ§ ОП-21 У1_АЗАЗТМОУАК|1-ЮР1-РККУК Х-У1_АЗАЗТМОУАРЦ|-ЮР1-Р1ЧРУК Х-|У*[_*АЗ|А,131Т*М1ОУ|АК|1-ЦСР1-РКР!УК

ОБМ АаСТЬЗК^КХЮСКОЗВЗСЗРМАКК

44 ПП Х-АСЮПЗЮРКЦиЗСРЦОЗРЦЗСЗРМАРЦК

24ч ип-^о х-'А'СГСЧ^З'Ю^Ю-СкЗРОЗРЗ^ЗР^АРР!

Рис. 19. Сайты расщепления ОП-17, ОП-19, ОП-21 и ОП-25, установленные после частичного (4ч) и глубокого (24ч) гидролиза этих ОП с помощью СКВ-1дСт|Х. Основные Ц), умеренные (') и второстепенные (*) сайты расщепления. 5 - сайты, найденные ранее в случае гидролиза ОБМ антителами больных РС.

Аналогичная картина наблюдается и для ОП-19. После частичного гидролиза было выявлено только четыре основных продукта: Х-1,8КР > > Х-ЬЯК > Х-1.,8Я1:8\¥ОАРХ;0КРО > (рис. 19). После глубокого гидролиза

найдено, три основных сайта расщепления: после второго, четвертого и четырнадцатого аминокислотного (АК) остатка, отличающиеся от сайтов гидролиза в случае интактного ОБМ. В результате частичного гидролиза ОП-21 образуется три продукта: (12 > 13 > 10 АК остатков). В случае глубокого гидролиза выявлено пять основных сайтов расщепления ОП: 4, 5, 10, 12 и 13 АК остатков. Скорость образования продуктов, содержащих 6 и 8 АК остатков, была значительно ниже. Относительное содержание продуктов с 1, 2, 3, 7 и 9 АК остатков не превышала 1— 3 %. Более глубокий гидролиз ОП-21 (7 ч) приводит к деградации длинных продуктов до более коротких дополнительных продуктов: 4 > 5 > 8 АК остатков. В результате практически полного гидролиза ОП образуется шесть продуктов: 4 > 2 > 7 > 6 > 8 АК остатков. Обнаружено несколько сайтов, соответствующих относительно низкой (6 и 8) и очень низкой скорости гидролиза (1, 2, 3, 7, 9 АК остатков). Все сайты 1§0-зависимого гидролиза ОП-21 показаны на рис. 19.

Аналогичная картина наблюдалась и для ОП-25. После глубокого гидролиза продукты, содержащие 5, 4 и 18 АК остатков, были основными продуктами. Только эти три сайта являются основными, в то время как гидролиз по другим сайтам протекает с умеренной или низкой скоростью (рис. 19).

При анализе сайтов расщепления интактного глобулярного ОБМ абзимами больных РС и СКВ реакционные смеси инкубировали до появления ранних фрагментов ОБМ. Интактные глобулярные белки взаимодействуют как с легкой, так и тяжелой цепями абзимов, последняя обеспечивает специфику узнавания и расщепления белка-антигена. Такое взаимодействие обеспечивает высокое сродство ОБМ к абзимам, Км = 20-89 мкМ. Эти "ранние" сайты расщепления ОБМ

препаратами AT больных PC и СКВ совпадали. При переходе от глобулярного ОБМ к соответствующим ОП сродство уменьшается примерно в 10-100 раз: ОП-17 (Км= 1,1+0,1 мМ, kQM = (2,4+0,2)х 10~2 мин1), ОП-19 (£„ = 0,38 + 0,04 мМ, ксЛ = 0,44+0,04 мин1), ОП-21 (Км= 0,16+0,02 мМ, кт = 1,4+0,15 мин-1), ОП-25 (Км= 4,4±0,4 мМ, кса

= 0,66+0,06 мин"1). В силу своей пространственной структуры ОП не могут | взаимодействовать одновременно с легкими и тяжелыми цепями абзимов, и взаимодействуют главным образом с легкими цепями, которые обладают более низким сродством к субстратам и, следовательно, в зависимости от последовательности, гидролиз олигопептидов может протекать менее специфично.

Выделение МЛЦ и доказательство наличия у них каталитических функций. В работе использована фаговая библиотека, содержащая кДНК генов легких цепей к-типа AT больных СКВ в составе гена белка оболочки pill нитчатого бактериофага М13. кДНК клонирована в фагмиду pCANTABHis6. Библиотека была получена с использованием мРНК лимфоцитов периферической крови больных СКВ и предоставлена S. Paul (США). После амплификации титр фага VCSM13 составил 1011 БОЕ/мл.

Аффинной хроматографией на ОБМ-сефарозе из исходной фаговой библиотеки (1012 КОЕ/мл) были отобраны фаги, несущие легкие цепи AT, с различным сродством к ОБМ. Был проведен анализ эффективности гидролиза ОП-17, ОП-19, ОП-21 и ОП-25 фракциями фагов, продуцирующих МЛЦ с разным сродством к ОБМ. Все 9 фракций фаговых частиц эффективно гидролизовали все четыре ОП. При этом фракция, элюированная 1 М NaCI, проявляла максимальную активность в гидролизе всех четырех ОП.

Растворимые МЛЦ выделяли из периплазматической фракции с помощью металло-хелатной хроматографии на Ni-NTA-агарозе (NTA - нитрилотриуксусная кислота). Полученные препараты МЛЦ были гомогенными. Получено 25 препаратов эффективно гидролизующих ОБМ и его ОП (рис. 20). По аналогии с доказательством принадлежности ОБМ-гидролизующей активности непосредственно интактным IgG, был проведен анализ для препаратов МЛЦ.

Анализ ферментативных свойств МЛЦ. Как указано выше, активные центры IgG больных СКВ, гидролизующие ОБМ, расположены на легких цепях и поэтому могут содержать лишь часть участка узнавания антигена. Основная часть сайта связывания антигена, как известно, расположена на тяжелых цепях. В этом случае легкие цепи могут функционировать менее специфично, эффективно расщепляя олигопептиды различных последовательностей. Кроме того в ряде работ показано, что каталитически активные антитела способны гидролизовать неспецифические, короткие пептиды (Li, L., et al., 1995, Kalaga, R., et al, 1995), что, вероятно, обусловлено в стерическими различиями между глобулярным белком и ОП.

□ ОП-17 Н ОП-19 ■ ОП-21

Рис. 20. Анализ относительной протеолитической активности гидролиза четырех ОП препаратами различных МЛЦ. Ошибка определения < 7-10 %.

Действительно, МЛЦ, продуцируемые некоторыми фагами гидролизовали в разных сочетаниях два, три и даже четыре ОП (рис. 20)

ОБМ-гидролизующая активность

МЛЦ. Анализ относительной протеолитической активности полученных МЛЦ в зависимости от величины рН показал, что большинство препаратов активны в широком диапазоне рН.

Для определения типа протеолитической активности МЛЦ проведен ингибиторный анализ (рис. 21). Электрофоретическое разделение продуктов показало подавление активности АТ в большей степени ЭДТА в случае большинства МЛЦ, активность нескольких МЛЦ уменьшалась практически в равной степени как под действием ЭДТА, так и ингибиторов сериновых протеаз, ряд МЛЦ ингибировались в большей степени

Далее был проведен детальный анализ зависимости относи-тельной протеолитической активности МЛЦ от ионов различных Ме2+. Эндогенные металлы удаляли диализом против 0,1 М ЭДТА. ЭДТА был удален диализом против буфера, деионизованного с помощью С11е1ех-100,

хелатирующим преимущественно двухвалентные катионы металлов.

РМ8Р

Ю0-1

л н

о 80

ш

Б 60 га

к

5 40

1- § 20 О X

о 0

1 2 3 4 5

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ■ РМЭР □ ЭДТА № МЛЦ

Рис. 21. Влияние ингибиторов на протеолитическую активность МЛЦ. За 100 % принят гидролиз ОБМ без ингибиторов.

Увеличение протеолитической активности наблюдали для большинства МЛЦ при добавлении ионов Са2+, но некоторые МЛЦ увеличивали свою активность при добавлении Со" или Zn2+ (рис. 22).

Таким образом, каталитически активные МЛЦ характеризуются различными рН-зависимостями, отличаются по влиянию ингибиторов и ионов металлов на их активность.

2+ 2* 2* 2* 2* 2* 2* 4 ■ В Со 0 Мп □ N1 ИСа ШМд ПСи игп

Рис. 22. Влияние Ме2+ на протеолитическую активность МЛЦ (приведены данные для 10 МЛЦ). За 100 % принят полный гидролиз 1 мг/мл ОБМ за 24ч.

ДНКазная активность МЛЦ-15. Все МЛЦ были проанализированы в реакциях гидролиза ДНК. МЛЦ-15, эффективно гидролизовала ДНК. Для доказательства принадлежности ДНКазной активности МЛЦ-15 был использован метод in situ, при этом в ПААГ была заполимеризована ДНК тимуса теленка (рис. 23). В участках геля, где происходит расщепление ДНК, окраска геля бромистым этидием исчезает. Как видно из рис. 23, участок геля, не окрашенный бромистым этидием, соответствует положению легких цепей. Это свидетельствует о том, что способность гидролизовать ДНК является собственным свойством МЛЦ-15.

Легкие цепи могут функционировать менее специфично по сравнению интактными молекулами IgG. Кроме того, в литературе описан препарат моноклональных AT против вируса мозаики огурцов (Frese S. et al., 2011), который обладает двумя активностями: протеолитической и ДНКазной.

Рис. 23. Анализ принадлежности ДНКазной активности непосредственно МЛЦ-15 с помощью электрофореза (SDS-электрофорез в 5-20 % ПААГ) в геле с заполимеризованной ДНК. Дорожки 1-3 соответствуют окраске геля Кумасси: дорожка 1 - белковые маркеры, 2 - интактные IgG человека, 3 - IgG человека, обработанные ДТТ. Дорожка 4 соответствует анализу активности МЛЦ-15 методом in situ. Окрашен бромистым этидием.

Определены величины Км для ОБМ (2,0±0,3 мкМ) и ксм (0,04 мин"1) в МЛЦ-15-зависимой реакции гидролиза ОБМ, а также величины Ки для суперскрученной ДНК (0,14±0,03 нМ) и ксл (5,5±0,6)х 10"6 мин"1.

МЛЦ, соответствующие трем клонам (с номерами 5, 11 и 15) были проанализированы более детально. Плазмиды трех клонов отсеквенированы с

Кб 1 2 3 4

150 — ж

66 — If S,,

30 — Ш' ,:;,:.,:

20 — Ш:

14,4— т

помощью автоматического анализатора на основе капиллярного электрофореза с четырехцветной лазериндуцированной флуоресцентной детекцией (ЦКП Геномика ИХБФМ СО РАН). Нуклеотидная последовательность транслирована в аминокислотную.

Показано, что последовательности МЛЦ-5, МЛЦ-11, МЛЦ-15 соответствуют легким цепям AT: структурные элементы V и J последовательностей ДНК вариабельных доменов всех трех МЛЦ с эффективностью от 82,3 до 100 % совпадают с таковыми для ряда описанных в литературе легких цепей иммуноглобулинов. Это свидетельствует о том, что все три МЛЦ являются ! типичными легкими цепями иммуноглобулинов.

! На основании данных о первичной последовательности сотрудниками

лаборатории Иванисенко В.А. (ИЦиГ) построена пространственная структура белковой молекулы МЛЦ-15. Для этой МЛЦ-15, обладающей протеазной и ДНКазной активностями, обнаружено сходство рассчитанной пространственной структуры с кристаллической структурой легких цепей антител с активностью сериновой протеазы (PDB leap) (рис. 24, А). Проведен расчет потенциального комплекса МЛЦ-15 с фрагментом ДНК (рис. 24, Б). По структурному сходству МЛЦ-15 с кристаллической структурой антител против V3 пептидной петли ВИЧ-1 построен комплекс МЛЦ-15 с олигопептидом (рис. 24, В).

Рис. 24. Модели построенные с помощью математического моделирования пространственных структур МЛЦ-15 и ее комплексов с ДНК и олигопептидом. Структура МЛЦ-15 в сравнении с кристаллической структурой каталитических антител с протеазной активностью (PDB leap цепь L) (А) и структуры комплексов легкой цепи с фрагментом ДНК (Б) и олигопептидом (ß), построенные соответственно по структурному сходству химерной легкой цепи с "Antibody 64М-2 Fab complexed with dTT(6-4)TT" и антител против V3 пептидной петли ВИЧ-1.

Эти данные свидетельствуют о том, что структурные особенности белковой молекулы МЛЦ-15 сходны с таковыми для легких цепей, описанных в литературе антител.

МЛЦ относится к V(D) легким цепям AT и обладают несколькими разными активностями: сериновой, металлопротеазной и ДНКазной. Следовательно, фрагменты их последовательностей должны совмещать в себе элементы специфичные для V(D) легких цепей AT, сериновых и металлопротеаз, а также ДНКаз первого типа.

Проведен сравнительный анализ белковых последовательностей в целом, а также отдельных фрагментов и мотивов трех МЛЦ с таковыми для сериновых и Ме2+-зависимых протез, а также Ме2+-зависимых ДНКаз первого типа. Найдены белковые мотивы с высоким и умеренным сходством, а также близкие по структуре

А

Б

В

последовательности с заменами некоторых АК остатков на другие с аналогичной функцией в плане возможности образования гидрофобных или электростатических контактов, а также водородных связей. На основании совокупности полученных данных предложены гипотетические схемы возможного расположения в последовательностях МЛЦ белковых мотивов, узнающих гидролизуемые субстраты; кластеров, предназначенных для хелатирования ионов металлов, а также отдельных АК остатков, принимающих непосредственное участие в катализе гидролиза ОБМ (МЛЦ-5, МЛЦ-11 и МЛЦ-15).

В целом, АК остатки, связанные с разными ферментативными активностями не совпадают. Это несколько неожиданная ситуация. В литературе пока нет данных о классических ферментах или каталитических антителах с подобным типом организации совмещенных активных центров. Не исключено, что такая ситуация может быть реализована только в случае абзимов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что поликлональные IgG (и их легкие цепи) крови больных системной красной волчанкой (СКВ) гидролизуют основной белок миелина (ОБМ) и его олигопептиды. Доказано, что протеолитическая активность является собственным свойством анти-ОБМ-IgG, а каталитический центр расположен в легких цепях.

2. Поликлональные IgG, содержащие легкие цепи лямбда и каппа типа, а также тяжелые цепи всех четырех подклассов (IgGl-IgG4) отличаются по каталитическим свойствам и их относительному вкладу в гидролиз ОБМ.

3. Впервые установлены основные, умеренные и второстепенные сайты расщепления четырех олигопептидов, соответствующих гидролизуемым антителами последовательностям интактного ОБМ.

4. Показана каталитическая гетерогенность 25 препаратов моноклональных легких цепей антител (МЛЦ), гидролизующих ОБМ. Впервые обнаружены МЛЦ, гидролизующие от одного до четырех различных олигопептидов ОБМ. Анализ ферментативных активностей, нуклеотидных и аминокислотных последовательностей трех МЛЦ показал, что одна из них является металлопротеазой, другая одновременно протеазой серинового типа и металлопротеазой, а третья протеазой серинового типа, металлопротеазой и ДНКазой.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Legostaeva, G.A., Polosukhina, D.I., Bezuglova, A.M., Doronin, B.M., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Affinity and catalytic heterogeneity of polyclonal myelin basic protein-hydrolyzing IgGs from sera of patients with multiple sclerosis // J. Cell Mol. Med. - 2010. - V. 14. - P. 699-709.

2. Bezuglova, A.M., Konenkova, L.P., Doronin, B.M., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Affinity and catalytic heterogeneity and metal-dependence of polyclonal myelin basic protein-hydrolyzing IgGs from sera of patients with systemic lupus erythematosus // J. Mol. Recognit. - 2011. - V. 24. - P. 960-974.

3. Безуглова, A.M., Бунева, B.H., Невинский, Г.А. Системная красная волчанка: моноклональные легкие цепи иммуноглобулинов против основного белка миелина, обладают протеолитической и ДНКазной активностью // Рос. иммунологический жур. — 2011. - Т. 5. - №3-4. — С. 215-227.

4. Bezuglova, A.M., Konenkova, L.P., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. IgGs containing light chains of the lambda- and kappa- type and of all subclasses (IgGl-IgG4) from the sera of patients with systemic lupus erythematosus hydrolyze myelin basic protein // Int. Immunol. - 2012. - V. 24. - P. 759-770.

5. Bezuglova, A.M., Dmitrenok, P.S., Konenkova, L.P., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Multiple sites of the cleavage of 17- and 19-mer encephalytogenic oligopeptides corresponding to human myelin basic protein (MBP) by specific anti-MBP antibodies from patients with systemic lupus erythematosus // Peptides. - 2012. - V. 37. - P. 69-78.

6. Timofeeva A.M., Dmitrenok, P.S., Konenkova, L.P., Buneva, V.N., Nevinsky, G.A. Multiple sites of the cleavage of 21- and 25-mer encephalytogenic oligopeptides corresponding to human myelin basic protein (MBP) by specific anti-MBP antibodies // PLoS One. - 2013. - V. 8. - P. 1-13.

Подписано в печать 18.08.2014 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 150 экз. Заказ № 223

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07