Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Катаболизм углеводов и замещение жирных кислот в клетках Крэбтри-проложительных и Крэбтри-отрицательных дрожжей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Катаболизм углеводов и замещение жирных кислот в клетках Крэбтри-проложительных и Крэбтри-отрицательных дрожжей"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

Колісник Ярина Іванівна

С,1

УДК 665.123.+547.455.623+663.13

КАТАБОЛІЗМ ВУГЛЕВОДІВ ТА ВМІСТ ЖИРНИХ КИСЛОТ У КЛІТИНАХ КРЕБТРІ-ПОЗИТИВНИХ І КРЕБТРІ-НЕГАТИВНИХ ДРІЖДЖІВ

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології Львівського національного університет імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, професор Гудзь Степан

Петрович, декан біологічного факультету, завідува кафедри мікробіології Львівського національног університету імені Івана Франка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітни

Варбансць Людмила Дмитрівна, завідувач відділ біохімії «мікроорганізмів Інституту мікробіології вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Федорович Дарія Василівна, в.о. завідувач відділу регуляції клітинного синтезу низькомолекулярна сполук Відділення регуляторних систем клітини Інститут; біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса

Шевченка, біологічний факультет, кафедра мікробіології.

Захист відбудеться “15” листопада 2000 року о і О годині на засідаш спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусолог ім Д.К.Заболотного НАН України (03143, Київ, вул.Заболотного, 154, Інстит) мікробіології і вірусології НАН України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології вірусології ім Д.К.Заболотиого НАН України.

Автореферат розісланий “ 44 ” 'ІУШУЛ’іи/Я 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук

Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність теми. Дослідження регуляції обміну речовин, в тому числі й нергетичного, відкривають складну взаємозалежність зворотних зв’язків, які ідтримують інтенсивність багаточисленних ензиматичних реакцій відповідно до отреб клітини. Одним із регуляторних механізмів обміну речовин в клітинах є фект Кребтрі, який полягає у пригніченні дихання клітин в аеробних умовах при ідвищених концентраціях глюкози [H.G.Crabtree, 1929]. Ефект Кребтрі иявлений у ракових клітинах, лейкоцитах, клітинах ембріонів і деяких видів ріжджів. Біологічна роль, і регуляторні механізми, які лежать в основі цього іеномену залишаються не з’ясованими. Вважають [З.Рекер, 1979], що причину фекту Кребтрі не можна пояснити тільки на основі конкуренції між диханням і піколізом за нерганічний фосфор і АДФ, оскільки на відносно просту регуляцію іляхом конкуренції накладаються більш складні регуляторні механізми.

Дослідження цього регуляторного явища заслуговує на увагу як з еоретичної, так і з практичної точки зору, оскільки може знайти застосування як мікробіологічній промисловості, так і в медицині. Більшість робіт, присвячених фекту Кребтрі, проведені на ракових клітинах. Вивчення цього феномену в ріжджів може сприяти кращому розумінню молекулярної біології перетворення ормальних клітин у злоякісні.

Висловлено припущення [O.Käppeli, 1986], що в розвитку ефекту Кребтрі в ріжджових клітинах можуть брати участь такі метаболіти як ацетат та етанол, івидкість утворення яких суттєво змінюються з початком дихально-іерментативного метаболізму в клітинах дріжджів. Також показано [И.Ф.Сейц, 961], що втрата регулюючого впливу дихання на бродіння супроводжується ниженням ефективності окисного фосфорилювання. Порушення цього процесу еминуче приводить до появи аеробного гліколізу. Відомо [Е.Н.Мохова и соавт., 993; N.N.Brustovetsky et al., 1990], що природними роз’єднувачами окисного юсфорилювання є вільні жирні кислоти, і, оскільки, вони є проміжними родуктами обміну ліпідів, то постає питання про можливу фізіологічну роль цих полук в регуляції енергетичного обміну.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було з’ясувати наявність з’язку між ефектом Кребтрі і якісним та кількісним складом жирних кислот у лігинах дріжджів. Завданнями роботи було дослідити: інтенсивність дихання і деякі особливості катаболізму глюкози у дріжджів Saccharomyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis і Debaryomyces occidentalis за різної концентрації глюкози в середовищі;

вплив різної концентрації глюкози на рівень жирних кислот у клітинах досліджуваних дріжджів;

вплив етанолу на вміст жирних кислот у дріжджів S.cerevisiae і D.occidentalis',

- вплив етанолу на вміст жирних кислот в клітинах лактозозасвоюючих Кребтрі позитивних дріжджів С.рьеисІоігорісаШ за наявності в середовищі глюкози т лактози. '

Наукова новизна одержаних результатів.

- вперше встановлено, що при підвищенні концентрації глюкози в середовищ вміст етерифікованих і неетерифікованих жирних кислот в клітинах Кребтрі позитивних і Кребтрі-негативних дріжджів змінюється в протилежнії: напрямках: підвищується в £>.оссісіепіаііз та знижується у Б.сегеутае

С.р&еисіоІгорісаІ ¿у;

- виявлено, що при рості дріжджів 8.сегекі$іае на середовищі з 0,1% глюкозі рівень неетерифікованих жирних кислот в клітинах є значно вищим, ніж і £>. оссісІепіаШ, вирощених в тих же умовах;

- вперше показано, що додавання етанолу до середовища з 2% глюкози понижу вміст жирних кислот у клітинах Б.сеге\і$іае, проте на середовищі з 0,1°/ глюкози, як і в дріжджів О.оссісіепіаііз (незалежно від концентрації глюкози рівень жирних кислот під дією етанолу підвищується;

- виявлено зниження вмісту жирних кислот, як етерифікованих, так неетерифікованих, при рості лактозозасвоюючих дріжджів С.рьеисіоігорісаіії і середовищі з глюкозою (2 %) або лактозою (2 %) в присутності етанолу.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані про вплиі глюкози і етанолу на вміст жирних кислот в клітинах Кребтрі-позитивних Кребтрі-негативних дріжджів розширюють і поглиблюють існуючі уявлення пре біохімічні механізми, які лежать в основі такого малоз’ясованого феномену, яі ефект Кребтрі. Результати досліджень показують, що контролюючи і змінюючі рівень глюкози чи етанолу в середовищі, можна суттєво впливати на метаболіз\ дріжджових клітин. Отримані результати про взаємозв’язок між вмістом жирнш кислот в клітинах і ефектом Кребтрі може служити експериментальною основок для розробки нових підходів у вивченні цього явища в ракових клітинах Одержані в роботі дані можна використовувати при подальшому вивченні ефект) Кребтрі і читанні спецкурсів для студентів біологічних факультетів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робот; виконана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка і рамках проведення дослідження за темою Бм-177Б: “Дослідження механізм) етанольної катаболітної репресії синтезу окремих ферментів і тетрапіролів > дріжджів та вивчення особливостей регуляції клонованих генів утилізації лактози в клітинах рекомбінантних промислових штамів пекарських дріжджів”.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Експериментальні дослідження, результати яких викладені в

з

іисертації, проведені автором особисто. Постановка завдань та обговорення і іналіз одержаних результатів проводились спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації (оповідалися і обговорювалися на щорічних наукових конференціях Львівського іаціонального університету імені Івана Франка (1996, 1997), десятій науковій есії Наукового товариства ім. Шевченка (Львів - 1999), міжнародній Другій Іарнасівській біохімічній конференції (Gdansk — 1998).

Публікації. Основні результати досліжень опубліковані в 7 наукових працях, них 5 статей в наукових журналах і збірниках та тези 2 доповідей.

Об’єм і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, гляду літератури, експериментальної частини, аналізу результатів досліджень, исновків, списку використаних джерел літератури, який включає 23 найменування. Робота викладена на 134 сторінках, ілюстрована 13 таблицями а 46 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається із трьох розділів, в яких висвітлено питання атаболізму глюкози і його регуляції в клітинах дріжджів, охарактеризовано іпідний склад дріжджових клітин і його залежність від умов культивування, а акож зв’язок між ліпідним складом мембран і адаптацією клітин дріжджів до ганолу. Розглянуто особливості катаболізму глюкози в клітинах дріжджів і оказано, що біологічна роль і регуляторні механізми, які лежать в основі ефекту ребтрі не з’ясовані.

Матеріали і методи. В роботі використовували культури дріжджів, одержані Всесоюзної колекції мікроорганізмів (ВКМ, м.Москва), які зберігаються в музеї ивих культур кафедри мікробіології Львівського національного університету ім. Франка: Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-1093, Debaryomyces occidentälis ВКМ -670 і Candida pseudotropicalis ВКМ Y-209 (анаморф виду Kluyveromyces arxianus).

Дріжджі вирощували в середовищі Беркгольдера. Як джерело вуглецю юсили глюкозу (Іг/л; 20 г/л; 40 г/л) або лактозу (20 г/л; 40 г/л), або етанол 5 г/л). В дослідженнях також використовували бісубстратні середовища: іюкоза 1 г/л і етанол 15 г/л; глюкоза 20 г/л і етанол 15 г/л; лактоза 20 г/л і етанол і г/л. При вирощуванні дріжджів C.pseudotropicalis до середовища Беркгольдера ідавали дріжджовий екстракт (Difco, США).

Дріжджі культивували в колбах об'ємом 500 мл з 100 мл середовища на ічалці (200 об/хв) при 30°С. Інокулятом служила 22-годинна культура дріжджів, ірощених на качалці в середовищі з 2% глюкози.

У дослідах використовували клітини з дихально-ферментативної або їхальної фази росту. Для оцінки фази росту визначали залишкову концентрацію юкози і етанолу, а також суху масу клітин [J.G.Lewis et al., 1993]. Клітини

руйнували, використовуючи кульки Балотіні (1:1 по об’єму), протягом 6 хв прі 1000 об/хв при темпетатурі 4°С. Інтактні клітини відділяли центрифугуванням прі 18000 об/хв при 4°С. Супернатант використовували для визначення білка ферментативної активності.

Визначення біомаси дріжджів проводили ваговим методом турбідиметрично на фотоелектроколориметрі КФК-2МП (Х=590 нм, кювета 5 мм) Інтенсивність поглинання кисню клітинами визначали на полярографі LP-7. Вміс білка в безклітинних екстрактах визначали за методом O.U. Lowry et al. [1951] кількість глюкози - ферментативним методом з використанням глюкозооксидазі [В.Д. Щербухин и соавт., 1970], а концентрацію ацетату — дифузійним методом чашках Конвея за І.Д. Головацьким [1961]. Етанол в культуральній рідин визначали ферментативним методом з використанням апкогольоксидаз: [М.В. Гончар та співпр., 1991].

Активність малатдегідрогенази визначали за методом, описаним E.S.Polaki: W.Bartley [1965], НАД- і НАДФ-залежних ізоцитратдегідрогеназ - за методої A.Komberg [1955]. Активність ферментів виражали в нмолях субстрат) перетвореного за одну хвилину на один міліграм білка. Активність фруктозо-1,6 дифосфатальдолази визначали за методом J.A.Sibley та A.L.Lehninger [1949] виражали в умовних одиницях екстинкції.

Газохроматографічне визначення жирних кислот проводили за методої Й.Ф. Рівіса і співпр. [1997]. Клітини руйнували протягом 5 хв в ультразвуковом дезінтеграторі УЗДН-1 при охолодженні (22 кГц, 0,4 А). Ліпіди екстрагували з методом J.Folch et al. [1957]. *

Статистичну обробку результатів, отриманих з трьох окремих експерименті проводили, використовуючи критерій Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ Катаболізм глюкози в клітинах дріжджів S.cerevisiae і D.occidentalis залежно від її концентрації в середовищі

Згідно досліджень R.H. De Deken [1966] S.cerevisiae є Кребтрі-позитивнимі a D.occidentalis Кребтрі-негативними дріжджами. Нами вивчено вплив різног вмісту глюкози в середовищі на інтенсивність поглинання кисню клітинам досліджуваних дріжджів. При зростанні концентрації глюкози в середовищі з 11 40 г/л клітини S.cerevisiae знижують інтенсивність поглинання кисню з 65,19±0,2 до 45,85±0,92 нг атом кисню/хв-мг сухої біомаси, що свідчить про наявніс' ефекту Кребтрі. В середовищі з 2% глюкози величина ефекту Кребтрі станови' 16%, а при вмісті глюкози 4% - 30%. Дослідження дихальної здатності дріждж

C.pseudotropicalis при підвищенні концентрації глюкози в середовищі свідчит що для них також властивий ефект Кребтрі. Клітини дріжджів D.occidentalis : цих умов суттєво не змінювали поглинання кисню, що підтверджує їх належ ніс до Кребтрі-негативних.

Дослідження утворення етанолу Кребтрі-позитивними і Кребтрі-негативними дріжджами в залежності від концентрації глюкози в середовищі показало, що клітини £>.оссіс(епґа/й в середовищі з 0,1%, 2% і 4% глюкози, а дріжджі Б.сегеуіхіае в середовищі з 0,1% глюкози продукують етанол в слідових кількостях (до 0,1 г/л). При підвищенні концентрації глюкози в середовищі утворення етанолу клітинами Б.сегеуіяіае зростає.

При рості клітин Хсегт'яше в середовищі з 2% глюкози (рис. 1А) виявлено ціауксичний ріст. За 16 год культивування дріжджі використовують більше 95% глюкози, утворюючи етанол і ацетат. Після вичерпання глюкози з середовища і короткої лаг-фази вміст і етанолу, і ацетату в культуральній рідині зменшується. Очевидно, дріжджі в цей період росту, крім етанолу, одночасно використовують і іцетат.

Інша картина спостерігалася при культивуванні дріжджів в середовищі з 4%-шм вмістом глюкози (рис. 1Б). Протягом перших 16 год росту клітини використовують глюкозу з одночасним утворенням етанолу і ацетату. Коли концентрація ітанолу досягає 6,72 г/л, ацетату 0,37 г/л, а вміст глюкози в середовищі ще шсокий (20 г/л) ріст клітин сповільнюється. Слід відзначити, що утворення і :танолу, і ацетату в цих умовах продовжується з приблизно такою ж швидкістю. Іа 28 годину культивування, коли майже вся глюкоза використовується, клітини ючинають засвоювати етанол і біомаса зростає. Максимальна концентрація танолу в цих умовах досягає 12,5 г/л, а ацетату - 0,9 г/л.

А Б

ис. 1. Використання глюкози, утворення етанолу і ацетату при рості дріжджів Б.сегехтаг на середовищі з різною початковою концентрацією глюкози: А-2%; Б-4%.

Дослідження активності фруктозо-1,6-дифосфатальдолази показує; що при зеті дріжджів Б.сегехізіае в середовищі з 20 г/л глюкози активність ферменту в 8 рази вища, ніж в клітинах, вирощених в присутності 1 г/л глюкози (табл. 1). ктивності мапатдегідрогенази, НАД- і НАДФ-залежних ізоцитратдегідрогеназ 5и підвищенні концентрації глюкози в середовищі знижуються в 2,2; 1,5 і 1,7 ізи, відповідно. Подібні закономірності виявлені і при дослідженні цих

ферментів в клітинах С.рзешіоігорісаііз. Вивчення Кребтрі-негативних дріжджі О. оссісіепіаііз показало, що підвищення концентрації глюкози в середовиїї суттєво не впливає на активність досліджуваних ферментів в клітинах дани дрідждів.

Таблиця 1.

Активність деяких ферментів у клітинах дріжджів З.сегеуіяіае, С.рьеисіоігорісаііз О.осШеШаїіз, вирощених у середовищі з різною концентрацією глюкози.

Дріжджі Вміст глюкози, г/л Альдолаза Малатдегід- рогеназа*’ НАД-залежна ізоцитрат- дегідрогеназа* НАДФ-залежна ізоцитрат- дегідрогеназа

S. cerevisiae ї 11,3±1,1 201U86 14,3±2,3 29,3±2,9

20 20,5±1,1 908±32 8,7±1,8 17,3±3,9

Gpseudotropicaiis 1 6,6±0,8 1945±62 15,1±2,2 22,4±1,5

20 15,0±0,8 1031±74 8,3±1,8 16,5±2,4

D.occidentalis І2,7±1,5 4315±242 23,4±3,1 20,8±2,1

20 14,3±1,6 4892±205 25.9±2.8 І9,4±1,8

Примітки: *- одиниці активності;

** - нмоль/мг-хв.

Одержані результати свідчать, що перетворення глюкози клітинами дріжджі D. occidentalis (незалежно від її концентрації) і S.cerevisiae в середовищі з 1 г/ глюкози відбувається в основному окислювальними шляхами. При підвищені концентрації глюкози в середовищі дріжджі S.cerevisiae зброджують ї утворюючи етанол і ацетат.

Вплив глюкози на вміст жирних кислот в клітинах дріжджів S.cerevisiae

D.occidentalis

Результати досліджень показують, що дріжджі S.cerevisiae і D.occidentali відрізняються за вмістом жирних кислот у клітинах. При культивуванні середовищі з 0,1% глюкози у клітинах S.cerevisiae виявлено вищий рівень жирни кислот, ніж у D.occidentalis (рис. 2). У дріжджів S.cerevisiae вміст насичени жирних кислот становить 37,3±0,9 мМ/кг сухої маси клітин і ненасичених 127,7±6,5 мМ/кг сухої маси клітин, а в D.occidentalis — 23,1±0,6 і 103,5±2,7 мМ/к сухої маси клітин, відповідно. При підвищенні вмісту глюкози в середовищі, кол величина ефекту Кребтрі зростає, у дріжджів S.cerevisiae рівень ненасичених

5\сегеуізіае О.оссісієпШІІх

Рис. 2. Вплив глюкози на рівень жирних кислот загальних ліпідів у дріжджі Б.се^І5Іае і й.occidentalis (концентрація глюкози в середовищі: 1-0,1°/ 2-2%, 3-4%).

загальної кількості жирних кислот знижується (порівняно з 1 г/л глюкози) при 20 г/л глюкози на 35,3 (р<0,05) і 19,4 (р<0,2) мМ/кг сухої маси клітин, а при 40 г/л глюкози - на 47,9 (р<0,01) і 48,6 (р<0,05) мМ/кг сухої маси клітин, відповідно. У

D.occidentalis за цих умов спостерігається значне зростання вмісту насичених (3,7 рази), ненасичених (2,9 рази) і загальної кількості жирних кислот (3,3 рази).

При збільшенні концентрації глюкози в середовищі до 2% в дріжджів

S.cerevisiae зростає вміст лауринової та міристинової кислот, а кількість олеїнової, пінолевої і ліноленової кислот зменшується. В клітинах також знижується лііввідношення Сів/Сів в 1,4 рази (р<0,001) і Сіб/Сн - в 3,5 рази (р<0,01). В

D.occidentalis за цих умов збільшується кількість всіх виявлених жирних кислот.

Висловлено припущення [E.Postma et al., 1989], що перехід до спиртового бродіння у Кребтрі-позитивних дріжджів може бути зумовлений роз’єднанням жисного фосфорилювання слабими кислотами. Можливо, певну роль у юз’єднанні окисного фосфорилювання відіграє підвищений рівень іеетерифікованих жирних кислот у клітинах S.cerevisiae в середовищі з 0,1% люкози (83,7±0,77 мМ/кг сухої маси клітин), порівняно з таким в клітинах ). occidental is (14,4±0,49 мМ/кг сухої маси клітин) (р<0,001) (рис. 3).

ис. 3. Вміст неетерифікованих жирних кислот у дріжджів З.се^'тае і О.осс'^епіаіів (концентрація глюкози в середовищі: 1 - 0,1%, 2 - 2%,

При зростанні концентрації глюкози в середовищі у О. ос^епіаШ рівень гетерифікованих насичених і ненасичених жирних кислот зростає: на 2% іюкозі у 4,9 і 3,9 разів (р<0,001), а на 4% глюкозі - у 6,3 і 8,1 рази (р<0,001), дповідно. У дріжджів Я.сегеуіяіае в цих умовах кількість неетерифікованих юичених жирних кислот майже не змінюється, а ненасичених - зменшується в редовищі з 2% глюкози у 1,8 разів (р<0,02), а на 4%-ній глюкозі - у 2,3 рази <0,01). В середовищі з 2 і 4% глюкози співвідношення неетерифікованих до ерифікованих, а також процентний вміст неетерифікованих жирних кислот у іітинах дріжджів S.cerevisiae є вищим, ніж у О.ос^егиаШ.

Аналіз складу неетерифікованих жирних кислот дріжджів показує (табл. 2), з із зростанням концентрації глюкози в середовищі до 4% у клітинах occidentalis підвищується рівень всіх виявлених кислот (від 1,5 раза для

S

3-4%).

пентадецилової до 11,0 раз у ліиолевої кислоти). В той час у Б.сегеутае вміс неетерифікованих С|2;о. С150, С|б:о, Сі&і, Сі80 помітно не змінюється, ; концентрація С]8:і, Сі82, Сі8;3 кислот зменшується. Серією робіт М.УобЬіпо співпр. [1981, 1982] показано, що вичерпання ненасичених жирних кислот ; фізіологічних умовах може підвищувати інтенсивність гліколізу в дріжджів.

При підвищенні концентрації глюкози в середовищі в клітинах Б.сегемта зменшується не тільки сума С)8 неетерифікованих кислот, але й відношенії С18/Сіб кислот у 2,3 рази (р<0,001) і Ск/Сі4 у 1,9 рази (р<0,02). Індек ненасиченості (І„) неетерифікованих жирних кислот в цих умовах тако> знижується в 1,7 рази на 2%-ній і в 2,3 рази на 4%-ній глюкозі. В дріжджі О.осШеШаШ таких закономірностей не виявлено.

Таблиця і

Рівень неетерифікованих жирних кислот у дріжджів Б.сегечіьіае і О.оссісігпіаііз.

Концентрація глюкози, % Жирні кислоти, мМ/кг сухої маси клітин СІ 8/ С16 І»

С 12:0 | С 14:0 | С 15:0 | С 16:0 | С 16:1 | С 18:0 | С 18:1 | С 18:2 |С 18:3 |і 12-15

S.cerevisiae

0,1 0,13 ±0,02 0,44 ±0,04 0,29 ±0,03 12,99 ±0,30 8,39 ±0,29 3,29 ±0,08 35,70 ±0,60 18,76 ±0,48 3,75 ±0,41 0,86 ±0,04 2,88 ±0,03 3,89

2,0 0,05 ±0.02* 0,53 ±0,03 0,25 ±0,02 12,56 ±0,41 6,29 ±0,44* 3,02 ±0,26 18,25 ±0,81* 11,47 ±0,84* 0,92 ±0,18* 0,83 ±0,03 1,79 ±0,03* 2,25

4,0 0,13 ±0,02 0,77 ±0,06* 0,23 ±0,05 13,07 ±0,24 7,06 ±0,66 3,20 ±0,16 15,19 ±0,45* 4,83 ±0,17* 1,89 ±0,19* 1,13 ±0,03* 1,25 ±0,04* 1,68

D.occidenlaUs

0,1 0,03 ±0,01 0,09 ±0,05 0,08 ±0,02 3,02 ±0,27 0,22 ±0,02 1,02 ±0,21 7,75 ±0,36 1,48 ±0,26 0,75 ±0,06 0,20 ±0,04 3,40 ±0,24 2,41

2,0 0,05 ±0,01 0,31 ±0,02* 0,10 ±0,01 17,20 ±0,41* 1,10 ±0,16* 2,94 ±0,20* 33,29 ±1,14* 4,10 ±0,20* 0,81 ±0,12 0,46 ±0,03* 2,25 ±0.02* 1,91

4,0 0,08 ±0,02* 0,37 ±0,05* 0,12 ±0,03 22,37 ±1,41* 2,28 ±0,12* 3,76 ±0,11* 59,84 ±1,99* 16,30 ±0,88* 4,44 ±0,14* 0,57 ±0.04* 3,44 ±0,15 3,10

* - різниця порівняно до варіанту з 0,1% глюкози вірогідна (р<0,05-0,001)

При дослідженні етерифікованих жирних кислот було виявлено (рис. 4), що середовищі з 0,1% глюкози дріжджі суттєво не відрізняються за рівнем насичени жирних кислот (20,2±1,1 і 18,9±1,0 мМ/кг сухої маси), але вміст ненасичени етерифікованих жирних кислот в О.оссісІегааШ в 1,5 раза (р<0,01) вищий, ніж Б.сегеуіяіае.

З.сегеуізіае О.оссігіепіаііз

Рис. 4. Вміст етерифікованих жирних кислот у клітинах дріжджів З’.сегеушае В.оссісіепіаііз (концентрація глюкози в середовищі: 1 - 0,1%, 2 - 2%, 3- 4%]

При зростанні концентрації глюкози в середовищі до 2% кількість гтериф¡кованих жирних кислот в О.оссіЛегйаІіз збільшується: ненасичених в 3,0 з ази, а насичених у 2,7 рази. У дріжджів Б.сегемівіае рівень ненасичених гтерифікованих жирних кислот при підвищенні концентрації глюкози знижується і 61,1±3,9 до 51,0±2,4 мМ/кг сухої маси (р<0,1), а насичених - зростає на 2%-ній 'люкозі у 1,8 раза (р<0,01) і знижується на4%-ній глюкозі до попереднього рівня.

Аналіз складу етериф¡кованих жирних кислот показав (табл. 3), що в іріжджів И.оссісіепґаііз при збільшенні концентрації глюкози в середовищі іростає рівень всіх виявлених жирних кислот (крім пентадецилової при 2%-ному імісті глюкози). При культивуванні З.сегеуіяіае в середовищі з 2% глюкози іиявлено підвищення рівня лауринової, міристинової і стеаринової кислот та ниження вмісту лінолевої і ліноленової кислот. В середовищі з 4% глюкози в літинах знижується вміст міристинової, пентадецилової, олеїнової жирних :ислот, але підвищується концентрація пальмітоолеїнової та лінолевої кислот.

Таблиця 3.

Рівень етерифікованих жирних кислот у дріжджів S.cerevisiae і D.occidentalis.

Концентрація глюкози,% Жирні кислоти, мМ/кг сухої маси клітин С18/ С16 I«

С 12:0 | С 14:0 | С 15:0 | С 16:0 | С 16:1 | С 18:0 | С 18:1 | С 18:2 | С 18:3 |іС 12-15

S. cerevisiae

0,1 0,47 *0,02 3,79 ±0,27 0,45 ±0,10 11,54 ±0,65 6,12 ±0,46 3,95 ±0,28 35,17 ±0,36 16,49 ±1,28 3,36 ±0,13 4,71 ±0,35 3,34 ±0,02 3,03

2,0 1,12 ±0,11» 14,84 ±0,71* 0,84 ±0,11 14,62 ±1,58 6,33 ±0,95 5,51 ±0,41* 36,78 ±1,49 11,12 ±1,11* 1,20 ±0,23* 16,80 ±0,63* 2,61 ±0,07* 1,50

4,0 0,24 ±0,13 1,86 ±0,34* 0,24 ±0,03* 12,89 ±1,22 8,00 ±1,34 3,87 ±0,54 23,71 ±0,69* 18,01 ±0,46 1,28 ±0,48* 2,34 ±0,40* 2,25 ±0,13* 2,65

D.occidentalis

0,1 0,27 ±0,05 1,05 ±0,19 0,23 ±0,03 14,02 ±1,38 2,30 ±0,67 3,30 ±0,35 46,23 ±2,32 22,81 ±0,74 21,95 ±0,84 1.55 ±0,14 5,94 ±0,65 4,94

2,0 0,72 ±0,02* 2,69 ±0,34* 0,17 ±0,03 37,36 ±0,80* 66,06 ±1,45* 10,56 ±0,64* 141,68 ±1,46* 42,60 ±1,26* 28,66 ±0,76* 3,58 ±0,30* 2,16 ±0,01* 5,42

4,0 1,19 ±0,13* 8,61 ±0,37* 0,46 ±0,05* 38,80 ±3,08* 37,02 ±2,86* 9,91 ±0,78* 139,59 ±6,59* 43,29 ±1,03* 30,01 ±1,22* 10,26 ±0,25* 2,96 ±0,19* 4,24

* - різниця порівняно до варіанту з 0,1% глюкози вірогідна (р<0,05-0,001)

Загальна кількість етерифікованих С[8 кислот і відношення СІ8/СІб в дріжджів сегеуізіае знижується при підвищенні концентрації глюкози в середовищі (див. ібл. 3). Концентрація коротколанцюгових етерифікованих жирних кислот в цих іітинах в середовищі з 2% глюкози підвищується у 3,6 рази, а Ія знижується у 2 ізи; на 4% глюкозі - кількість коротколанцюгових кислот знижується, проте двищується І„ етерифікованих жирних кислот. Очевидно, при різних шцентраціях глюкози в середовищі плинність мембран клітин З.сегехтае дтримується різними механізмами.

Отже, одержані результати свідчать, що при збільшенні концентрації юкози в середовищі вміст жирних кислот у клітинах Кребтрі-позитивних ііжджів Б.сегехізіае і Кребтрі-негативних Д оссійепіаіії змінюється в ютилежних напрямах: знижується в Б.сегехіїіае і підвищується в О.оссі^еп/аііз.

Вплив етанолу на жирнокислотний склад дріжджів &сегеуіхіае

Б.оссісіепіаііз

Існує припущення [О.КарреІі, 1986], що етанол регулює метаболізи вуглеводів у Кребтрі-позитивних дріжджів. Вивчення впливу етанолу н; жирнокислотний склад клітин дріжджів показує, що при культивуванні і середовищі з 1,5% етанолу (єдиному джерелі вуглецевого живлення) досліджуван дріжджі суттєво не відрізняються за вмістом ненасичених жирних кислот (222,7±10,0 і 218,1±12,4 мМ/кг сухої маси клітин), а кількість насичених ( більшою у Б.сегехІБІае (108,9±3,7 мМ/кг сухої маси порівняно з 76,4±2,3 мМ/кі сухої маси у £>. оссісіепіаііь, р<0,01). Дослідження жирнокислотного склад) загальних ліпідів клітин свідчить, що у дріжджів Хсегеушае (порівняно :

О. оссісІепіаШ') в середовищі з етанолом виявлено більшу кількісті пальмітоолеїнової, стеаринової та лінолевої кислот, меншу концентрацік ліноленової і коротколанцюгових жирних кислот при однаковому рівн пальмітинової та олеїнової кислот.

При рості дріжджів Б.сегеуі.чіае в середовищі з 2% глюкози і 1,5% етанол) (порівняно з 2% глюкози) в клітинах знижується рівень етерифіковани) ненасичених жирних кислот у 1,9 рази (р<0,001) та насичених у 2,3 рази (р<0,01) а неетерифікованих у 7,4 рази (р<0,001) і 5,8 рази (р<0,001), відповідно (рис. 5, 6) В О. оссісіепіаііз додавання етанолу до середовища з 2% глюкози підвищує вміс етерифікованих жирних кислот у 1,6 рази (р<0,001) і неетерифікованих - в 1,‘ рази (р<0,01). Результати дослідження жирнокислотного складу клітиі Б.сегехіпае показують (табл. 4), що в присутності етанолу в середовищі з 2°/ глюкози знижується рівень пальмітинової, стеаринової, пальмітоолеїиової олеїнової і коротколанцюгових етерифікованих жирних кислот (порівняно з 2°А глюкози), а в £). оссісіепіаііх за даних умов підвищується кількість всіх виявленш жирних кислот, крім пальмітоолеїиової, концентрація якої знижується у 8 раз.

Рис. 5. Вплив етанолу на рівень етерифікованих жирних кислот дріжджів Б.сегечізіае і О. оссісіепіаііз (1-глюкоза (2,0%); 2-етанол (1,5%); 3-глюкоза (2,0%) і етанол (1,5%); 4-глюкоза (0,1%); 5-глюкоза (0,1%) і . етанол (1,5%).

Хсегеушсгг

О.оссіскпіаііз

Рис. 6. Вплив етанолу на рівень неетерифікованих жирних кислот дріжджів 5. сегехІБіае і £>. оссісІеШаШ (1-глюкоза (2,0%); 2-етанол (1,5%); 3-глюкоза (2,0%) і етанол (1,5%); 4-глюкоза (0,1%); 5-глюкоза (0,1%) і етанол (1,5%).

Таблиця 4.

Вміст етерифікованих жирних кислот у дріжджів Б.сегеуізіае і О.оссісІепІаШ.

Джерело вуглецю Жирні кислот. мМ/кг сухої маси клтш С18/ С16 1«

С 12:0 І С 14:0 І С 15:0 І С 16:0 І С 16:1 1 С 18:0 1 С 18:1 І С 18:2 | С 18:3 ІЕС12-15

глюкоза (2,0%) 1,12 iO.ll 14,84 ±0,71 0,84 ±0,11 14,62 ±1,58 6,33 ±0,95 5,51 ±0.41 36,78 ±1.49 11,12 ±1.11 1,20 ±0.23 16,80 ±0.63 2,61 ±0.07 1,50

етанол (1,5%) 0,39 ±0,03* 2,24 ±0,12* 0,29 ±0,06* 23,88 ±1.57* 5,09 ±0,47 59,81 ±2,15* 103,31 ±4.22* 52,43 ±3,44* 3,91 ±0.35* 2,92 ±0.14* 7,61 ±0.22* 1,90

глюкоза (2,0%) і етанол (1,5%) 0,30 ±0,02* 6,13 ±0,37* 0,27 ±0,01* 7,04 ±0,09* 1,20 ±0,10* 1,97 ±0,06* 18,45 ±1,14* 9,00 ±0,67 0,90 ±0,01 6,70 ±0.38* 3,68 ±0.05* 1,88

глюкоза (0,1%) 0,47 ±0,02 3,79 ±0,27 0,45 ±0,10 11,54 ±0,65 6,12 ±0,46 3,95 ±0,28 35,17 ±0.36 16,49 ±1.28 3,36 ±0,13 4,71 ±0.35 3,34 ±0.02 3,03

глюкоза (0,1%) і етанол (1,5%) 0,20 ±0,03* 5,15 ±0.12* 0,25 ±0,04 14,45 ±0,76* 5,72 ±0,37 2,76 ±0.17* 53,44 ±0.53* 24,20 ±1,44* 1,61 ±0,13* 5,60 ±0.06 4,07 ±0.11* 3,73

й.ОССІІІепШІК

глюкоза (2,0%) 0,72 ±0,02 2,69 ±0,34 0,17 ±0,03 37,36 ±0,80 66,06 ±1,45 10,56 ±0,64 141,68 ±1.46 42,60 ±1.26 28,66 ±0,76 3,58 ±0.30 2,16 ±0,01 5,42

етанол (1,5%) 2,20 ±0,09* 11,76 ±1,29* 0,56 ±0,05* 28,86 ±1,12* 2,88 ±0.26* 14,24 ±1,11* 106,95 ±4.27* 25,50 ±2.11* 11,21 ±0,87* 14,52 ±1.27* 4,98 ±0.16* 2,54

глюкоза (2,0%) і етанол (1,5%) 1,15 ±0,04* 4,99 ±0,27* 0,47 ±0,07* 56,30 ±0,74* 8,12 ±1.03* 21,05 ±1.90* 245,01 ±2,40* 127,89 ±4.77* 56,65 ±1.31* 6,61 ±0.28* 7,00 ±0.10* 5,21

глюкоза (0,1%) 0,27 ±0,05 1,05 ±0,19 0,23 ±0,03 14,02 ±1,38 2,30 ±0.67 3,30 ±0.35 46,23 ±2.32 22,81 ±0.74 21,95 ±0,84 1,55 ±0.14 5,94 ±0.65 4,94

глюкоза (0,1%) і етанол (1,5%) 0,82 ±0,07* 4,09 ±0,11* 0,33 ±0,10 38,89 ±1.52* 4,07 ±0,78 11,97 ±0.43* 174,17 ±8,44* 79,49 ±4.36* 53,30 ±1,40* 5,24 ±0.22* 7.45 ±0.35.' 5,54

* - різниця порівняно до варіанту з глюкозою вірогідна (р<0,05-0,001)

При дослідженні складу неетерифікованих жирних кислот (табл. 5) в Б.сегехізіае виявлено зниження вмісту всіх досліджуваних жирних кислот, а в Б.оссісіепіаііз підвищення рівня пентадецилової, стеаринової, олеїнової, лінолевої і ліноленової кислот. . • '

Співвідношення Сі8/С]6 етерифікованих жирних кислот при додаванні зтанолу до середовища з 2% глюкози підвищується у обидвох досліджуваних зидів дріжджів.

Оскільки катаболізм глюкози в дріжджів S.cereví5шe залежить від її сонцентрації в середовищі, ми дослідили вплив етанолу на рівень жирних кислот / клітинах дріжджів при культивуванні в середовищі з 0,1% глюкози. Одержані

результати показують (див. рис. 5, 6), що додавання етанолу до середовища з 0,1% глюкози по-іншому впливає на вміст жирних кислот в клітинах S.cerevisiae, ніж в середовищі з 2% глюкози: кількість насичених етерифікованих жирних кислот суттєво не змінюється, а рівень ненасичених етерифікованих жирних кислот ' зростає на 23,9 мМ/кг сухої маси клітин (р<0,02). Концентрація неетерифікованих жирних кислот в присутності етанолу в середовищі з 0,1% глюкози знижується (р<0,05), але їх рівень є вищим у 6,2 рази, ніж на середовищі з 2% глюкози і етанолу. В D. occidentalis додавання етанолу до середовища з 0,1% глюкози, як і з 2% глюкози, підвищує вміст етерифікованих та неетерифікованих жирних кислот.

Таблиця 5.

Вміст неетерифікованих жирних кислот у дріжджів S.cerevisiae і D.occidentalis.

Джерело вуглецю Жирні кислоти, мМ/кг сухої маси клітин СІ 8/ С16 Ін

С 12:0 1 С 14:0 1 С 15:0 | С 16:0 1 С 16:1 1 С 18:0 1 С 18:1 | С 18:2 | С 18:3 12С12-15

S.cerevisiae

глюкоза (2.0%) 0,05 ±0,02 0,53 ±0.03 0,25 ±0,02 12,56 ±0.41 6,29 ±0.44 3,02 ±0,26 18,25 ±0,81 11,47 ±0.84 0,92 ±0,18 0,83 ±0.03 1,79 ±0.03 2,25

етанол (1.5%) 0,08 ±0,08 0,48 ±0,03 0,21 ±0,02 15,76 ±0,26* 1,45 ±0,15* 5,76 ±0,04* 49,33 ±1,57* 6,63 ±0,70* 0,56 ±0,07 0,77 ±0.05 3,62 ±0,15* 2,60

глюкоза (2.0%) і етанол (1.5%) 0,02 ±0,01 0,13 ±0,03* 0,06 ±0,01* 1,93 ±0,30* 1,00 ±0,18* 0,67 ±0,10* 2,43 ±0,09* 1,43 ±0,11* 0,16 ±0,05* 0,21 ±0.01* 1,73 ±0.41 1,80

глюкоза (0,1%) 0,13 ±0,02 0,44 ±0,04 0,29 ±0,03 12,99 ±0,30 8,39 ±0,29 3,29 ±0,08 35,70 ±0,60 18,76 ±0.48 3,75 ±0,41 0,86 ±0,04 2,88 ±0,03 3,89

глюкоза (0.1%) і етанол (1.5%) 0,05 ±0,02* 0,26 ±0,02* 0,08 ±0,02* 8,15 ±0.22* 2,89 ±0,40* 1,97 ±0,11* 27,96 ±1,73* 6,33 ±0,36* 0,47 ±0.03* 0,39 ±0.05* 3,34 ±0,26 3,60

D. occidentahs

глюкоза (2.0%) 0,05 ±0,01 0,31 ±0,02 0,10 ±0,01 17,20 ±0,41 1,10 ±0,16 2,94 ±0,20 33,29 ±1,14 4,10 ±0,20 0,81 ±0,12 0,46 ±0.03 2,25 ±0,02 1,91

етанол (1.5%) 0,12 ±0,02* 0,48 ±0,06* 0,29 ±0,04* 12,36 ±0,38* 0,84 ±0,04 5,57 ±0,35* 43,63 ±0,69* 17,19 ±0,52* 9,93 ±0,31* 0,89 ±0,09* 5,79 ±0,21* 3,80

глюкоза (2.0%) і етанол (1.5%) 0,05 ±0,01 0,33 ±0,05 0,19 ±0,01* 16,89 ±0,98 1,77 ±0,29 5,15 ±0,55* 54,11 ±1,01* 25,37 ±0,73* 8,87 ±0,38* 0,57 ±0,05 5,01 ±0,29* 3,99

глюкоза (0,1%) 0,03 ±0,01 0,09 ±0.05 0,08 ±0,02 3,02 ±0,27 0,22 ±0,02 1,02 ±0,21 7,75 ±0,36 1,48 ±0,26 0,75 ±0,06 0,20 ±0,04 3,40 ±0,24 2,41

глюкоза (0.1%) і етанол (1.5%) 0,03 ±0,01 0,35 ±0,03* 0,21 ±0,07 15,46 ±0,61* 0,92 ±0,19* 4,83 ±0,23* 47,10 ±1,97* 12,43 ±0,53* 3,29 ±0,15* 0,59 ±0,07* 4,14 ±0.16 3,05

* - різниця порівняно до варіанту з глюкозою вірогідна (р<0,05-0,001)

Ін загальних ліпідів та етерифікованих жирних кислот і співвідношення Сі8/С|б етерифікованих та неетерифікованих жирних кислот в присутності етанолу в середовищі з 0,1% вмістом глюкози зростає в обидвох досліджуваних видів дріжджів.

Отже, одержані результати показують, що додавання етанолу до середовища з глюкозою по-різному впливає на вміст жирних кислот в клітинах досліджуваних дріжджів. У D.occidentalis в присутності етанолу в середовищі з глюкозою вміст насичених і ненасичених жирних кислот, як етерифікованих, так і неетерифікованих зростає. В S.cerevisiae вплив етанолу на рівень жирних кислот в клітинах залежить від концентрації глюкози в середовищі.

Вплив глюкози та етанолу на рівень жирних кислот у клітинах дріжджів C.pseudotropicalis.

C.pseudotropicalis відносять до Кребтрі-позитивних лактозозасвоюючих дріжджів [С.П. Гудзь і співпр., 1995]. При культивуванні цих дріжджів в

середовищі з 2% глюкози вміст жирних кислот у клітинах досягає 129,7+6,3 мМ/кг сухої маси, а ненасичені жирні кислоти становлять 80,3% від загальної кількості. При рості С.ряеисіоІгорісаШ у середовищі з лактозою виявлено меншу кількість жирних кислот: ненасичених - 67,6±4,6 мМ/кг сухої маси, а насичених -21,6±1,2 мМ/кг сухої маси. Значно вищий рівень жирних кислот містять клітини досліджуваних дріжджів в середовищі з 1,5% етанолу: вміст ненасичених жирних кислот порівняно з 2% глюкози зростає на 63,9 мМ/кг сухої маси (р<0,01), а насичених— на 12,3 мМ/кг сухої маси (р<0,01).

При підвищенні концентрації глюкози в середовищі з 20 г/л до 40 г/л у клітинах дріжджів С.рьеисіоігорісаііз в загальних ліпідах знижується вміст насичених жирних кислот на 16% (р<0,2), а ненасичених - на 24% (р<0,05). Аналіз жирнокислотного складу показує, що вміст олеїнової кислоти зменшується на 5,79 мМ/кг сухої маси клітин, а лінолевої - на 12,86 мМ/кг сухої маси клітин.

У досліджуваних дріжджів при збільшенні концентрації глюкози в середовищі знижується вміст в клітинах ненасичених етерифікованих (з 60,1+2,4 до 52,2±1,0 мМ/кг сухої маси клітин; р<0,05) та неетерифікованих (з 44,0±3,8 до 26,8±0,4 мМ/кг сухої маси клітин; р<0,02) (рис. 7). Результати дослідження складу жирних кислот показують, що в етерифікованих жирних кислотах вміст олеїнової кислоти зменшується на 4,9 мМ/кг сухої маси клітин (табл. 6), а в неетерифікованих-лінолевої на 12,82 мМ/кг сухої маси клітин (табл. 7).

насичені ненасичені сума насичені ненасичені сума

А Б

Рис. 7. Вміст етерифікованих (А) та неетерифікованих (Б) жирних кислот у клітинах дріжджів С.рзеисіоігорісаійі (1 - глюкоза (2%); 2 - етанол (1,5%); З - лактоза (2%); 4 - глюкоза (4%); 5 - глюкоза (2%) і етанол (1,5%); 6 - глюкоза (2%) і лактоза (2%); 7 - лактоза (2%) і етанол (1,5%)).

Слід відзначити, що зниження вмісту жирних кислот у клітинах дріжджів С.ряеисіоігорісаііз виявлено при підвищенні глюкози в середовищі з 20 г/л до 40 г/л, але внесення лактози 20 г/л до середовища з глюкозою 20 г/л не викликає суттєвих змін у досліджуваних показниках (див. табл. 6, 7).

Дослідження впливу етанолу на вміст жирних кислот в клітинах дріжджів С.рзеисіоігорісаііз свідчить, що за наявності в середовищі глюкози (20 г/л) внесення етанолу 15 г/л знижує рівень цих сполук в загальних ліпідах (насичених

на 6,0 мМ/кг сухої маси клітин; р<0,05, ненасичених - на 31,2 мМ/кг сухої маси клітин; р<0,05), в тому числі неетерифікованих (насичених на 5,7 мМ/кг сухої маси клітин; р<0,001, і ненасичених - на 22,6 мМ/кг сухої маси клітин; р<0,01) (див. рис. 7Б) та ненасичених етерифікованих на 8,6 мМ/кг сухої маси клітин (р<0,05) (див. рис. 7А).

Таблиця 6.

Джерело вуглецю Жирні кислоти, мМ/кг сухої маси клітин

12:0 14:0 15:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3

глюкоза (2,0%) 0,16 ±0.01 0,93 ±0,01 0,09 ±0,01 10,13 ±1,43 8,89 ±0,48 3,65 ±0,31 29,92 ±0,64 17,42 ±0,47 3,84 ±0,20

етанол (1,5%) 0,31 ±0,02* 1,70 ±0.07* 0,65 ±0,14* 17,04 ±0,77* 15,01 ±0,43* 635 ±0,10* 56,22 ±1,98* 50,61 ±0,56* 7,29 ±0,12*

лактоза (2,0%) 0,07 ±0,01* 0,49 ±0,02* 0,24 ±0,02* 7,96 ±0,37 5,36 ±0,34* 3,30 ±0,09 26,22 ±0,19* 7,31 ±0,18* 1,16 ±0,33*

глюкоза (4,0%) 0,10 ±0,01* 0,76 ±0,04* 0,12 ±0,03 7,88 ±0,67 7,76 ±0,24 1,96 ±0,22* 25,02 ±0,61* 17,38 ±0,78 2,05 ±0,22*

глюкоза (2,0%) і етанол (1,5%) 0,04 ±0,01* 0,43 ±0,08* 0,09 ±0,02 11,64 ±0,48 5,54 ±0,19* 2,52 ±0,15* 27,69 ±1,13 15,94 ±0,26 2,40 ±0,09*

глюкоза (2,0%) і лактоза (2,0%) 0,16 ±0,01 1,04 ±0.10 0,11 ±0,01 11,09 ±0,90 9,02 ±0,36 3,59 ±0,22 29,81 ±0,42 18,74 ±0,39 3,18 ±0,18

лактоза (2,0%) і етанол (1,5%) 0,07 ±0,02 0,44 ±0,09 0,07 ±0,82* • 8,25 ±0,51 5,54 ±0,06 1,88 ±0,22** 24,50 ±0,59** 8,36 ±0,27 ** 1,69 ±0,30

* - різниця порівняно до варіанту з глюкозою вірогідна (р<0,05-0,001)

** - різниця порівняно до варіанту з лактозою вірогідна (рО.05-0,001)

Таблиця 7.

Вплив різних джерел вуглецю на вміст неетерифікованих жирних кислот

Джерело вуглецю Жирні кислоти, мМ/кг сі ■хої маси клітин

12:0 14:0 15:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3

глюкоза (2,0%) 0,02 ±0,00 0,03 ±0,00 0,03 ±0,01 8,61 ±0,22 8,52 ±0,10 1,96 ±0,05 15,20 ±0.83 17,44 ±0,10 2,88 ±0,17

етанол (1,5%) 0,02 ±0,01 0,03 ±0,01 0,71 ±0,15* 10,34 ±0,60 5,71 ±0,19* 0,75 ±0.15* 26,24 ±0,69* 5,95 ±0.12* 0,97 ±0,09*

лактоза (2,0%) 0,01 ±0,00 0,02 ±0,00* 0,05 ±0,01 7,86 ±0,11* 5,43 ±0,23* 1,60 ±0,14 13,55 ±0,43 7,21 ±0,41* 1,34 ±0,11*

глюкоза (4,0%) 0,03 ±0,01 0,03 ±0,01 0,05 ±0,01* 8,95 ±0,30 6,86 ±0,17* 1,61 ±0,19 14,31 ±0,27 4,62 ±0,22* 1,02 ±0,13*

глюкоза (2,0%) і етанол (1,5%) 0,01 ±0.00 0,01 ±0,00* 0,03 ±0,00 3,08 ±0,20* 4,52 ±0,32* 1,72 ±0,21 14,35 ±0,20 2,03 ±0.40* 0,49 ±0,06*

глюкоза (2,0%) і лактоза (2,0%) 0,02 ±0,01 0,03 ±0,01 0,03 ±0,00 8,41 ±0,42 9,02 ±0,19 1,95 ±0,10 16,00 ±0,47 17,08 ±0,16 2,55 ±0,23

лактоза (2,0%) і етанол (1,5%) 0,01 ±0,00 0,02 ±0.01 0,01 ±0,00** 2,84 ±0,12** 4,27 ±0,27** 0,77 ±0,10** 2,33 ±0,12** 4,96 ±0,09** 0,43 ±0,05**

* - різниця порівняно до варіанту з глюкозою вірогідна (р<0,05-0,001)

** - різниця порівняно до варіанту з лактозою вірогідна (р<0,05-0,001)

Аналіз жирнокислотного складу показує, що найбільше знижується рівень пальмітоолеїнової (на 3,35 мМ/кг сухої маси клітин), олеїнової (на 2,23 мМ/кг сухої маси клітин) і лінолевої (на 1,48 мМ/кг сухої маси клітин) етерифікованих кислот (див. табл. 6) та пальмітинової (на 5,53 мМ/кг сухої маси клітин), пальмітоолеїнової (на 4,00 мМ/кг сухої маси клітин) і лінолевої (на 15,41 мМ/кг сухої маси клітин) неетерифікованих жирних кислот (див. табл. 7).

Подібна картина спостерігається і при внесенні етанолу до середовища з лактозою. Вміст жирних кислот загальних ліпідів під дією етанолу знижується: насичених з 21,6±1,2 до 14,3±0,6 мМ/кг сухої маси клітин (р<0,01), а ненасичених з 67,5±4,6 до 52,1+2,6 мМ/кг сухої маси клітин (р<0,05). Рівень неетерифікованих насичених жирних кислот зменшується у 2,6 рази (р<0,001), а ненасичених у 2,3 рази (р<0,001) (див. рис. 7Б), проте кількість етерифікованих і насичених, і ненасичених суттєво не змінюється (див. рис. 7А). Аналіз жирнокислотного складу показує, що найбільшого впливу зазнає вміст неетерифікованих пальмітинової (на 5,02 мМ/кг сухої маси клітин) і олеїнової (на 11,22 мМ/кг сухої маси клітин) кислот (див. табл. 7).

Отже, і підвищення концентрації глюкози в середовищі до 4%, і внесення етанолу до середовища з глюкозою або лактозою подібно впливає на вміст жирних кислот у клітинах дріжджів С.ряегиіоігорісаШ.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової проблеми, що стосується вивчення регуляторних механізмів ефекту Кребтрі. Досліджено вміст неетерифікованих і етерифікованих жирних кислот ліпідів у клітинах Кребтрі-негативних дріжджів Д оссісіепІаШ і Кребтрі-позитивних -З.сегех'тае і С.рзеисіоігорісаііз в залежності від концентрації глюкози в середовищі. Встановлено, що між величиною ефекту Кребтрі та вмістом жирних кислот у клітинах дріжджів Б.сегехізіае і С.рзеїиіоігорісаііз існує обернений зв’язок.

2. Дріжджі О.оссісіепіаііз в середовищі з 0,1%, 2% і 4% глюкози, а клітини Б.сегешзіае в середовищі з 0,1% глюкози продукують етанол в слідових кількостях (до 0,1 г/л). При концентрації глюкози (2-4%) дріжджі Б.сегеуізіае утворюють і етанол, і ацетат, продукція яких пропорційна до використання глюкози.

3. При зростанні кількості глюкози в середовищі у дріжджів Б.сегеуізіае і

С.рзеїиіоігорісаШ виявлено зменшення швидкості дихання, зниження активності малатдегідрогенази, НАД- і НАДФ-залежних ізоцитратдегідрогеназ і підвищення активності фруктозо-1,6-дифосфатальдолази.

4. При рості в середовищі 3 0,1% глюкози в дріжджів Б.сегехіхіае виявлено вищий рівень неетерифікованих жирних кислот, ніж в О.оссіскМаШ. При підвищенні концентрації глюкози в середовищі вміст жирних кислот загальних чіпідів у Кребтрі-позитивних і Кребтрі-негативних дріжджів змінюється в іротилежних напрямках: знижується в Б.сегехізіае і С.рзеисіоігорісаііз та тідвищується в Б.оссісІепШІіа. При цьому в клітинах Б.сегехізіае знижується півень С]8 ненасичених, у С.ряеисІоігорісаШ - Сі6:і і Сі8 ненасичених кислот, а в

0. оссійепіаііз зростає кількість насичених і ненасичених жирних кислот.

5.. При зростанні концентрації глюкози в середовищі до 2% у дріжджів S.cerevisiae виявлено зниження співвідношення С18/С16, Сіб/Сі4 етерифікованих та неетерифікованих жирних кислот і підвищення вмісту коротколанцюгових етерифікованих жирних кислот.

6. При рості в середовищі з етанолом дріжджі S.cerevisiae і D.occidentalis суттєво не відрізняються за вмістом ненасичених жирних кислот. Проте у клітинах S.cerevisiae виявлено більшу концентрацію пальмітоолеїнової, стеаринової, лінолевої кислот та меншу кількість ліноленової і коротколанцюгових жирних кислот, ніж у D.occidentalis.

7. При культивуванні дріжджів в середовищі з 0,1% глюкози в присутності етанолу вміст етерифікованих жирних кислот підвищувався і в D.occidentalis, і в S.cerevisiae. При додаванні етанолу до середовища, яке містило 20 г/л глюкози або лактози, вміст ненасичених жирних кислот (як етерифікованих, так і неетерифікованих) у клітинах дріжджів S.cerevisiae та C.pseudotropicalis зменшувався, а в D.occidentalis рівень етерифікованих жирних кислот підвищувався.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гудзь С.П., Колісник Я.І. Утворення ацетату клітинами дріжджів S.cerevisiae на середовищі з різною концентрацією глюкози // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія,- 1998.- №3-4.- С. 22-26.

2. Гудзь С.П., Колісник Я.І. Деякі особливості катаболізму глюкози в дріжджів Saccharomyces cerevisiae і Schwanniomyces occidentalis II Біологія тварин,-1999.-Т.1, №2,- С. 117-121.

3. Колісник Я.І. Вплив етанолу на жирнокислотний склад дріжджів Candida pseudotropicalis II Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства,- 1998,- №4,- С.203-205.

4. Гудзь С.П., Колісник Я.І. Вплив етанолу на вміст жирних кислот в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae і Schwanniomyces occidentalis II Мікробіол. журн,- 2000.- Т.62, №3,- С.9-16.

5. Гудзь С.П., Колісник Я.І. Вплив глюкози на рівень жирних кислот в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae і Schwanniomyces occidentalis II Мікробіол. журн,- 2000.- Т.62, №2,- C. 11 -18.

6. Gudz S., Kolisnyk Ya. The influense of different carbon sources on the content of fatty acids in cells of the Crabtree-positive yeast Candida pseudotropicalis II Abstr. of the 2“1 Parnas conf. 11-13 Sept. Gdansk (Poland).- 1998.- P.45.

7. Kolisnyk Ya., Gudz S. An examination of the Crabtree effect in Saccharomyces cerevisiae and Schwanniomyces occidentalis II Abstr. of the 2nd Parnas conf. 11-13 Sept. Gdansk (Poland).- 1998.- P.45.

АНОТАЦІЯ

Колісник Я.І. Катаболізм вуглеводів та вміст жирних кислот у клітинах Кребтрі-познтивних і Кребтрі-негативних дріжджів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія,- Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено вивченню ефекту Кребтрі у дріжджів. Показано, що в дріжджів Б.сегеуіьіае та С.рзеисіоігорісаііз на відміну від О.оссісІепІаШ спостерігається ефект Кребтрі, і величина його зростає при збільшенні концентрації глюкози в середовищі.

Встановлено, що при рості 5. сеге\і$іае в середовищі з 0,1% глюкози рівень неетерифікованих жирних кислот в клітинах цих дріжджів є значно вищим, ніж в Д оссісІеШаїіз. При зростанні концентрації глюкози в середовищі вміст жирних кислот у Кребтрі-позитивних і Кребтрі-негативних дріжджів змінюється в протилежних напрямках: знижується в Б.сегехіі'іае і С.рзеисІоігорісаІЬ та підвищується в Б.оссісІеМаІіз. При цьому в клітинах З.сегехізіае знижується рівень С|8 ненасичених, у С.рзеисіоіїорісаііз — Сіб:і і С(Я ненасичених кислот, а в Д оссісІепІаШ зростає кількість насичених і ненасичених жирних кислот.

У середовищі з 0,1% глюкози в дріжджів З.сегеуіїіае, а в Д оссісіепіаііз, незалежно від концентрації глюкози в середовищі, рівень етерифікованих жирних кислот в присутності етанолу підвищується. При додаванні етанолу до середовища з 2% глюкози або лактози вміст жирних кислот у дріжджів £ сегеушае і С.рзеис/оігорісаіія зменшується. Внесення лактози в середовище з глюкозою не впливає на рівень жирних кислот в клітинах С.ряеисіоігорісаііз. Ключові слова: дріжджі, ефект Кребтрі, глюкоза, ацетат, етанол, жирні кислоти.

АННОТАЦИЯ

Колиснык Я.И. Катаболизм глюкозы и содержание жирных кислот в клетках Крэбтри-положительных и Крэбтри-отрицательных дрожжей. -

Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук ю специальности 03.00.07-микробиология. — Институт микробиологии и шрусологии НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена изучению эффекта Крэбтри у дрожжей. Показано, іто у дрожжей Б.сегеміхіае и С.рхеисіоігорісаііх в отличие от О.оссісІепІаІЬ іроявляетея эффект Крэбтри. Клетки Б.сегемІБІае при выращивании в среде с 0,1% ■люкозы, а й.оссісіепіаііз при концентрации 0,1 - 4,0% глюкозы в среде, інтенсивно поглощают кислород, а этанол образуют в следовых количествах. При ювышении концентрации глюкозы в среде скорость поглощения кислорода

клетками S.cerevisiae понижается, а образование этанола и ацетата увеличивается. У дрожжей S.cerevisiae и C.pseudotropicalis, выращенных в среде с 0,1% глюкозы обнаружено более высокий уровень активности малатдегидрогеназы, НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ, но низшую активность фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы, чем у клеток культивированных в среде с 2% глюкозы. У дрожжей D.occidentalis таких закономерностей не выявлено.

При культивировании дрожжей S.cerevisiae в среде с 0,1% глюкозы в клетках обнаружено более высокий уровень неэтерифицированных жирных кислот, чем в

D.occidentalis. Соотношение неэтерифицированных жирных кислот к этерифицированным, а также процентное содержание неэтерифицированных жирных кислот у дрожжей S.cerevisiae более высокое, чем у D.occidentalis.

При повышении концентрации глюкозы в среде содержание жирных кислот общих липидов у Крэбтри-положительных и Крэбтри-отрицательных дрожжей изменяется в противоположных направлениях: уменьшается в S.cerevisiae и C.pseudotropicalis, а в D.occidentalis — увеличивается. В клетках S.cerevisiae в среде с 2,0% глюкозы содержание жирных кислот снижается на 11,8%, а при концентрации глюкозы 4,0% - на 29,4% по сравнению с 0,1 % глюкозы. При этом в клетках S.cerevisiae понижается уровень Ci8 ненасыщенных, у

C.pseudotropicalis— Ci&i i С is ненасыщенных кислот, а в D.occidentalis увеличивается количество насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. При увеличении концентрации глюкозы в среде до 2% у дрожжей S.cerevisiae уменьшается соотношение Cig/C^ и С^Сц этерифицированных и неэтерифицированных кислот, а уровень краткоцепочечных этерифицированных жирных кислот повышается.

При культивировании дрожжей в среде с этанолом обнаружен более высокий уровень жирных кислот в клетках S.cerevisiae и C.pseudotropicalis, чем в среде с глюкозой. При добавлении этанола в среду с 2,0% глюкозы в дрожжей S.cerevisiae содержание жирных кислот уменьшается. В среде с 0,1% глюкозы в клетках

S.cerevisiae, а в D.occidentalis, независимо от концентрации глюкозы в среде, уровень этерифицированных жирных кислот в присутствии этанола увеличивается. Уменьшение содержания этерифицированных и неэтерифицированных ненасыщенных жирных кислот обнаружено и в клетках лактозоусваивающих дрожжей C.pseudotropicalis при добавлении этанола к среде с 2,0% глюкозы или лактозы. Введение лактозы в среду с глюкозой не влияет на уровень жирных кислот в клетках этих дрожжей.

Ключевые слова: дрожжи, эффект Крэбтри, глюкоза, ацетат, этанол, жирные кислоты.

SUMMARY

Kolisayk Ya.I. The catabolism of carbohydrates and the content of fatty acids in cells of the Crabtree-positive and Crabtree-negative yeasts.- Manuscript.

Thesis for the scientific degree of the candidate of biological sciences on the speciality 03.00.07- microbiology. -Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

Dissertation is devoted to study of the Crabtree effect in yeasts. It was shown that the Crabtree effect is observed in the yeasts S.cerevisiae and C.pseudotropicalis unlike

D.occidentalis. Its value enhances with the increase of glucose concentration in the nedium.

It was established that during growth of S.cerevisiae in the medium with 0,1% >lucose the level of nonetherifled fatty acids in cells of these yeasts is higher in :omparison with D.occidentalis. The content of fatty acids in Crabtree-positive and Crabtree-negative yeasts changes in opposite directions at the increase of glucose :oncentration in the medium: it is reduced in S.cerevisiae and C.pseudotropicalis and ncreased in D.occidentalis. In this case the level of Ci8-unsaturated fatty acids in Icerevisiae and Ct6;1, Qg-unsaturated fatty acids in C.pseudotropicalis decreased and he amount of saturated and unsaturated fatty acids in D.occidentalis increased.

In the medium with 0,1% glucose and ethanol the amount of etherified fatty acids icreased in both species of investigated yeasts. The fatty acid content in S.cerevisiae nd C.pseudotropicalis is reduced when ethanol was added to the medium containing % of glucose or lactose. The addition of lactose (2%) to the medium with glucose (2%) id not change significantly the content of fatty acids in the cells of investigated yeasts. 'ey words: yeasts, Crabtree effect, glucose, acetate, ethanol, fatty acids.