Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование клонированных последовательностей сателлитных ДНК и уникальных генов HPRT и ZFY на хромосомах BOS TAURUS L. методом гибридизации INSITU

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картирование клонированных последовательностей сателлитных ДНК и уникальных генов HPRT и ZFY на хромосомах BOS TAURUS L. методом гибридизации INSITU"

¡■J, ■) ■■■ -, ■

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАЗВЕДЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

КАРТИРОВАНИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ САТЕЛЛИТНЫХ ДНК И УНИКАЛЬНЫХ ГЕНОВ HPRT И ZFY НА ХРОМОСОМАХ BOS TAURUS L. МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

На правах рукописи

ЛОГИНОВА Юлия Артемьевна

УДК 636.2:547.963.2

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-ПУШКИН 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель — доктор биологических наук А. Ф. Смирнов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук А. И. Жига-чев; кандидат биологических наук А. В. Родионов.

Ведущее учреждение — Институт Цитологии и Генетики СО РАН.

Защита состоится « !ч » (^¿¿(¿ТЮ/У^ 1992 года в ' ^ час. на заседании Специализированного совета Д 020.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики сельскохозяйственных животных по адресу: '

189620, Санкт-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «/х7 » /¿¿О^с1/?!?! 1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Ж. Г. Логинов

-j 1 ■ : ■

: Lt ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА-РАБОТЫ

Актуальность темы Для лучшего понимания принципов организации и функционирования эукариотического генома необходимо не только иметь представление о молекулярной структуре конкретных последовательностей ДНК, но и знать их внутрихромосомное расположение. Подобную информацию . дают генетические карты. Эти карты являются показателем генетической изучености вида и, в тоже время, служат основой для его дальнейшего генетического изучения и рационального практического использования. Понятно, что для практических целей необходимы карты высокой- степени насыщенности и высокого уровня разрешения.

В геноме высших эукариот содержится около 50-100 тыс. генов. В настоящее время существует относительно подробная генетическая карта человека, включающая более 2 тыс. картированных генов, все хромосомы вида имеют генетические маркеры (Stephens et al. , 1990; Goodfellow, Sefton, 1991). Значительно хуже обстоит дело с картированием геномов сельскохозяйственных животных (Gillois, 1.991; Chowdhary, 1991). Так генетическая карта крупного рогатого скота ( Bos taurus L.),наиболее генетически изученного вида сельскохозяйственных животных, содержит 220 картированных генов, маркировано 12 хромосом набора (Chowdhary, 1991; Fries et al., 1991). Ясно, что карта такой степени насыщенности не может эффективно использоваться для изучения организации генома этого вида, а также для практической селекционной работы. .

Среди методов, используемых для построения генетических карт, самым универсальным и наиболее пригодным для' внутрихромосомного картирования является гибридидизация in situ. Этот методический подход позволяет установить внутрихромосомное положение лпбСго клонированного гена и фрагмента ДНК (Lichter et ah, 1991; McNeil et al., 1991). В последнее время все большую популярность приобретают неизотопные варианты гибридизации. С помощью этих методов удается быстро и с высоким уровнем разрешения картировать короткие

уникальные последовательности ДНК, проводить локализацию нескольких.последовательностей ДНК одновременно, избавляться от необходимости статистической обработки (Cherif et al. , 1989; Viegas-Pequignot et al. , 1989, 1991; Trask et al. , 1991; McNeil et al. , 1991). В настоящий момент неизотошше варианты гибридизации in situ используются в основном' для картирования генома человека.

Применение гибридизации in situ-для картирования геномов сельскохозяйственных животных только начинается. Так у Bos taurus L. с помощью изотопного варианта гибридизации картировано около 30 генов и 10 фрагментов ДНК (Chowdhary, 1991). Неизотошше варианты гибридизации пока практически не используются для картирования геномов сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось картирование на митотических хромосомах Bos taurus L. повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК с помощью изотопного и неизотопного вариантов гибридизации in situ. В связи с этим были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Подобрать условия для внутрихромосомной локализации клонированных, последовательностей ДНК на хромосомах Bos taurus L. с помощью неизотопного варианта гибридизации in situ.

2. Провести локализацию клонированного фрагмента сателлитной ДНК IV 11,709 г/куб. см ) на митотических хромосомах Bos taurup L.

3. Провести локализацию клонированного фрагмента сателлитной ДНК II (1,723 г/куб. см ) на митотических хромосомах Bos taurus L.

4. Оценить хромосомоспецифичность.распределения сател- . дитных ДНК Л и IV по хромосомам Bos taurus L.

б. Пр вести внутрихромосомную локализацию клонированного фрагмента I1PRT -гена человека на митотических хромосомах Bos taurus L.

6. Провести внутрихромосомную локализацию клонированного Фрагмента ZFY -гена человека на митотических хромосомах feos taurus L.

?. Лроьести сравнение «фиктивности и чувствительности

изотопного и неизотопного вариантов гибридизации in situ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые с помощью неизотопного варианта гибридизации in situ была проведена локализация повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК на митотических хромосомах крупного рогатого скота.

Впервые установлено, что в кариотипе Bos 'taurus L. отсутствуют аутосомы, не содержащие в прицентромерном гетерохроматине последовательностей сателлитной ДНК II.

Впервые обнаружено, что Y-хромосома крупного рогатого скота содержит небольшое количество сателлитной ДНК IV .в ГЦ-обогащенном участке короткого плеча.

. Впервые проведена внутрихромосомная локализация гена HPRT на митотических хромосомах Bos taurus L.

• Впервые проведена внутрихромосомная локализация гена ZFY на митотических хромосомах Bos taurus L.

Результаты работы могут быть использованы для построения генетической карты вида и изучения структурнофункцио-налыгой организации генома Bos taurus L. , а так же в исследованиях по изучению молекулярно-генетической детерминации пола млекопитающих.

Апробация работы Основные результаты работы обсуждались на аспирантских сессиях ВНИИРГЖ (1990, 1991 гг.), а также были представлены на I П-школе-семинаре по генетике животных (Алтай, 1989), 9- ом Европейском коллоквиуме по ци-тогенетике животных (Тулуза, Франция,1990), VII Всесоюзной-конференции "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, лите-. ратурного обзора, изложения методов и результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предлиже-ний, списка литературы. Иллюстративный материал содержит 15 рисунков и 22 таблицы. Список литературы содержит 194 источника, из них 133 на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

Материалом для исследований служили лимфоциты периферической крови быков и коров черно-пестрой породы, принадлежащих . Пушкинскому головному племпредприятйю и совхозу "Красная славянка" Ленинградской области.

В качестве зондов для гибридизации были использованы следующие последовательности: 1. фрагмент ZFY-гена человека, клонированный в плазмиде pDP 1007, любезно предоставленный доктором Д. Пейджем (США); 2. Плазмида pJY 508 с клонированным в ней фрагментом HPRT' гена человека, предоставленный доктором Г. Каскей (США); 3., Фрагмент бычьей сат ДНК IV, клонированный в плазмиде pBR 322, предоставленной доктором А. Плученничком (Польша); 4. Плазмида puR 222 с клонированным в ней фрагментом бычьей сат ДНК II, предоставленная доктором А. Плученничком (Польша).

При постановке культуры и для получения клеток, находящих на ранних стадиях митоза, использовали метод,- предложенный О. Г. Чиряевой (Чиряева и др., 1989). Дифференциальное окрашивание хромосом Bos taurus L. проводили RBA-методом в модификации 0. Г. Чиряевой (Чиряева, 1988).

В качестве ДНК-зондов для гибридизации использовали целые плазмиды или соответствующие вставки. ДНК метили с помощью ник-трансляции или олигомечения, в соответствии с общепринятыми методиками (Маниатис и др. , 1984), >с использованием китов N Б$00 и N 16002 (Amersham) соответственно. Для изотопного мечения использовали®Н- дНТФ (Amersham), для неи-8отопного Био-11-УТФ (НПО "Фермент") или Био-19-УТФ (Calblochem).

Гибридизацию ДНК-ДНК in situ проводили используя метод Герхарда с соавторами (Gerhardt, et al., 1981), модифицирован ный нами.

Авторадиографйю проводили стандартным способом (Макгре-гор, Варли, 1986), используя фотоэмульсию LM (Amersham) или фотоэмульсию типа "Ы" (ЗТП, Москва).

Детекцию гибридиэационного сигнала после неизотопного »■варианта гибридизации проводили по методу' Кремерса с соавторами. (Сгегге г? ot al., 1987) i внеся в него некоторые модифи-

кации.

После гибридизации как в изотопном, так и в неизотопном вариантах препараты окрашивали 3-5% раствором красителя Гимза.

' Анализ распределения зерен серебра и биотинилированных комплексов по хромосомами проводили по микрофотографиям. Для • внутрихромосомной локализации исследуемых последовательностей " ДНК использовали количественную версию цитогенетической карты хромосом Bos taurus L. , предложенную Чиряевой ' (Чиряева, 1988).

Анализ и фотографирование препаратов хромосом проводили с помощью микроскопа "Olimpus АН-2". Микрофотосъемку производили на пленку Микрат-200 и Микрат-300.

2

Статистическую обработку данных проводили методом X (Урбах, 1964; Gerhardt et al. , 1981).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Локализация югогафатноповторяюиихся фракций ДНК на хромосомах Воз taurus L.

При локализации клонированных •последовательностей бычьей сателлитной ДНК нас прежде всего интересовала возможность выявления в кариотипе Bos taurus L. аутосом, не содержащих какой-либо из фракций сателлитной ДНК Наличие таких аутосом можно было предположить на основании полученных ранее данных (Kurnit et al., 1987; Чиряева, 1988). К тому же, эти эксперименты представляли определенный интерес для адаптации гибридизации in situ, в особенности ее неизотопного ■ варианта, к хромосомам Bos taurus L.

Для локализации бычьей сат ДНК IV мы применяли изотоп-' ный и неизотопный варианты гибридизации, без дифференциального окрашивания хромосом. Всего было проанализированно 114 метафазных пластинок. Из полученных нами данных следует, что. сат ДНК IV локализуется приемущественно в прицентромерном гетерохроматине аутосом, а Х-хромосома не содержит участков гибридизации с этим сателлитом. При анализе распределения метки по длине У-хромосомы, мы обнаружили отсутствие участков гибридизации в изотопном варианте опыта и в стандартном нэизотопном варианте (концентрация ДНК-зонда 10 нг под покровное стскло 24x24 кв. мм). Аналта результатов 2-й серии

опытов неизотопного варианта гибридизации (20 нг ДНК-зонда

■ под покровное стекло) показал достоверное мечение этой хро-

а

мосомы (X - 7,64; Р<0,01). Причем, 90Х всех биотинилирован-ных комплексов, расположенных на хромосоме, были сконцентрированы в ГЦ-богатом участке ее короткого плеча, соответству-

■ ющем СМА-позитивному району и одному из репликаци'онных С-блоков (Чиряева, 1988). Интенсивность гибридизационного сигнала в этом участке была значительно слабее, чем в при-центромерных районах аутосом. Это можно объяснить меньшей копийностью сат ДНК IV в У-хромосоме по сравнению с аутосо-мами.

Различие в результатах первой и второй серий неизотопного варианта гибридизации объясняется концентрацией меченного ДНК-зонда - во втором случае она больше в два раза. По всей видимости, двухкратное увеличение концентрации создает необходимую конкуренцию ДНК-зонда с хромосомной ДНК, достаточную для того, чтобы сат ДНК IV У-хромосомы, представленная небольшим количеством копий, успела прогибридизоваться с ДНК-зонда до ренатурации хромосомной ДНК.

Различие в результатах изотопного и неизотопного экспериментов может быть связано с использовании сроком экспозиции (2-недели). Такой срок мог позволить выявить лишь участки хромосом, содержащие достаточно болыцое количество сат ДНК IV.

Полученные нами данные позволяют высказать предположение об отсутствии в кариотипе Bos taurus L. пар аутосом, не содержащих в прицентромерном гетерохроматине сат ДНК IV. Такой вывод был сделан из косвенных данных - в неизотопноых сериях экспериментов среднее количество аутосом. не несущих в прицентромерных участках "метки" 2¿0,6 и 1,74±0,37, в первой и второй сериях соответственно; в изотопной серии 7±1,2. . По всей видимости, наличие таких аутосом связано с условиями опыта, во всяком случее существует зависимость числа неме-ченных аутосом от условий эксперимента.

Возможно количественное различие в содержании сат ДНК ГУ различными парами аутосом. Об этом свидетельствует различная интенсивность гибридизационного сигнала в прицентро-teepiiux районах разных аутосом.

Для окончательного вывода о присутствии и содержании

сат ДНК IV в прицентромерных районах различных пар аутосом требуются эксперименты, включающие идентификацию всех хромосом набора. Такого рода исследования были поведены нами при локализации на хромосомах Bos taurus L. сат ДНК II.

Для локализации бычьей сат ДНКП мы применяли изотопный вариант гибридизации in situ, используя для гибридизации ' цитологические препараты с предварительно дифференциально окрашенными метафазными пластинками. Результаты работы показали, что характер распределения зерен серебра над хромосомами в целом совпадает с закономерностями, ' описанными ранее (Чиряева и др. , 1990; Kurnit et al. , 1978). То есть, подавляющая часть зерен серебра распологалась над прицентромерны- ■ ми районами аутосом, а.половые хромосомы оставались немечеными. Данные, отражающие характер распределения сат ДНК II по хромосомам Bos taurus L. представлены в таблице 1.

Таблица 1

Распределение меченного 3К Bell фрагмента бычьей сателлитной ДНК II по хромосомам Bos taurus L.

Число Число пластинок, на кото-

иссле- Среднее Среднее Среднее рых были обнаружены неме-

дован- .число ЧИСЛО . число не- ченные пары хромосом

ных ^хромо- мечен- мече нных

пласти- сом на ных ау- аутосом число

нок пласт- тосом на пла- хромосомы метафазных

(хро- инку на пла- стинку пластинок

мосом) стинку

19 59+0,38 36+1,7 21il.g X 19* '

(1119) 0 У 17*

17,24 5

10,11,15,20 4 .

7,8,14,19 3

2,13,16,22,29 2

6,12,18,21,23,25,27 1 1,3,4,5,9,26,28 О

Примечание: * - Наблюдается достоверное отсутствие гибридизации согласно критерию знаков (Урбах. 1964)

Эти данные позволяют с высокой степенью достоверности утверждать лишь отсутствие сат ДИК II в половых хромосомах вида. Вызывают' интерес результаты гибридизации сателлита с хромосомами 17 и 24. Для них достаточно часто встречаются немеченными оба гомолога, и общее число немеченных хромосом больше по сравнению с остальными - 18 из 37 и 20 из ' 37 для 17 и 24 соответственно. Скорее всего существуют количественные различия в содержании сат ДНК 11 в прицентромерном гете-рохроматине различных пар аутосом. По-видимому, в хромосомах 17 и 24 содержится относительно небольшая'часть фракции сат ДНК II. Об этом свидетельствуют и результаты гибридизации этого сателлита с другими аутосомами (табл. 1).

Данные, полученные нами .при 'локализации сателлитных последовательностей на хромосомах Bos taurus L. подтвердили негетерохроматиновую природу половых хромосом вида. Лишь в коротком плече У-хромосомы было установлено наличие небольшого количества сат ДНК II. Однообразие молекулярной структуры гетерохроматина аутосом и отсутствие гетерохроматиновых участков в половых хромосомах - довольно редкое явление для млекопитающих. Подобная специфика известна лишь для немногих видов, например, для Mus musculus (Kipling et al. ,1991).

3.2. Локализация НРКГ на митотических хромосомах Bos taurus L.

Ген HPRT кодирует белок гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-' трансферазу, фермент, участвующий в синтезе пуринов. Локус HPRT является очень удобной системой для генетического мониторинга и изучения мутагенеза (Albortlni et al. , 1989; Zhang ot al. , 1992). Мутации гена приводят к серьезным наследственным болезням (Kfonk et al. ,1987).

Ген HPRT бил локализован в кариотипах многих видов мле-. копитоющих, а так же сумчатых и первозверей. >У всех исследованных видов, в том числе и у крупного рогатого скота, этот ген оказался сцеплен с Х-хромосомой (Drayna, White, 1985; Womack, Moll, 1986; Graves, 1988).

Для локализации гена HPRT на хромосомах Bos taurus L. иаыи было проведено три независимых эксперимента - два в "«аотопнои варианте, один в неизотопном. Bôero было проанализировало Ê2 метафазные пластинки от Ь быков и одной коровы.

» •« » т

« • • 0 • • »

• Л

I" » • »

Рисунок 1. Распределение зерен серебра и биотинилирован-них комплексов по Х-хромосоме Bos taurus L. после гибридизации in situ с фрагментом HPRT гена человека

• - зерна серебра - первый опыт; о -зерна серебра --третий опыт; А -биотинилированные комплексы - второй опыт ■

Полученные нами данные свидетельствует о локализации гена HPRT в Х-хромосоме (Р <0,001), что подтверждают результаты, полученные ранее с помощью методов гибридизации соматических клеток (Forster et al. , 1980; Shimizu et al. , 1981; Womack, Moll, 1986). Однако, в вышеуказанных работах внуг-рихромосомная локализация гена проведена не была. Наши эксперименты ставились именно с целью внутрихромосомной локализации гена.

Совместный анализ результатов всех трех независимых опытов выявил специфическую гибридизацию фрагмента к-Д5Ш HPRT - гена человека с- блоком дисков Хр12-'14 (Х-11,05; Р <0,01) и со всей средней частью короткого плеча хромосомы Хр12-21 (Ха -9,17; Р <0,01). Рисунок 1 дает наглядное представление о распределении зерен серебра и биотинилиро-ванных комплексов по длине хромосомы. Из полученных нами данных очевидно, что ген HPRT у Bor. tauru3 L. локализуется в средней чести короткого плеча У-хромосомы.

- 10 -

3.3. Локализация гена, гомологичного ZFY гену человека, на хромосомах Bos taurus L

Ген ZFY' кодирует цинк-связываюший "пальгевый" белок, который является регуляторным белком, участвующей в генетической детерминации пола. Этот белок каким-то образом включается в каскадную цепочку детерминации пола, обеспечивающую дифференцировку гонад по мужскому типу. Гену ZFY отводится одна из ключевых ролей в детерминации пола у млекопитающих • (Daminiani et al. , 1990; Mardon et al. , 1990).

В настоящее время опубликованы данные о хромосомной локализации гена ZFY лишь для трех видов млекоп ггаюищх (Affara et al. , 1989; Muller, Schemp, 1989; Ma et al , 1989; Nagamine et al. , 1989). Следовательно, локализация :ена ZFY на хромосомах Bos taurus L. имеет ценность как фа .тический материал, дальнейший анализ которого полезен для понимания принципов молекулярно-генетической детерминации пола и, кроме Того, это первый шаг в направлении получения особей желаемого пола, получение которых имеет практическую ценность для животноводства (Максимовский, 1988; Cotinot et al. , 1988).

Каши эксперименты по локализации гена ZFY проводились в двух, повторностях. В каждой повторности независимо проводили гибридизацию в изотопном и неизотопном вариантах. Всего было ■ проанализировано 53 метафазные пластинки после изотопного варианта гибридизации и 80 пластинок после неизотопного ва- ' рианта. Для проведения экспериментов использовали лимфоциты от шести быков.

Результаты наших экспериментов свидетельствуют о наличии в Х- и У-хромосомах копий сена -ZFY (Р <0,001). Нами было проанализировано распределение зерен серебра и биотинилиро- ■ , ванных комплексов по длине половых хромосом, рисунки 2 и 3 дакгг представление' о характере этого распределения. Можно ' предположить, что в Х-хромосоме Bos taurus L. существуют две копии гена, гомологичного гену ZFY человека - одна из копий локализована в диске Xq21 (Р <0,01), а другая - в диске Xq23.1 (Р <0,01). Между ними находится крупный G-диск, в котором не выявлено последовательностей гомологичных гену ZFY человека. Следует отметить, что исследуемый ген локализуется

Рисунок 2. Распределение зерен серебра о и биотинилирован-ных комплексов - • по Х-хромосоме Bos taurus. L. после гибридизации in situ с фрагментом ZFY гена человека.

в R-дисках Х-хромосоми, ведь R-диски рассматривают как участки предположительно содержащее общеклеточные гены (Holmquist, 1988). В У-хромосоме, согласно нашим данным существует одна копия гена, гомологичного гену ZFY, расположенная в проксимальной части длинного плеча (Р <0,01). Здесь следует указать, что ввиду отсутствия маркеров в длинном плече хромосомы, мы условно разделили ее часть, начиная от последнего R-диска - Ypl2.1, на четыре равных по длине части.'

Рисунок 3. Распределение зерен серебра. - О и Оиотинилиро-ванных комплексов - • по У-хромосоме Bos taurus L. после гибридизации in situ с Фрагментом ZFY гена человека.

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что в

Таблица 2. Эффективность изотопного и неизотопного вариантов гибридизации in situ.

Гибридизация с плазмидой,

содержащей фрагмент НРЯТ Гибридизация

Показатели гена человека с фрагментом

___гена че-

номера опытов • ловека

1-й(изо- 2-й(неи- 3-й(изо- изото- неизотопный зотопный топный пный опный вариант вариант) вариант) вариант вариант

Доля метки (ЗС или БК). приходящаяся 5,4 на Х-хромосому,X 'Доля метки (ЗС или БК), приходящаяся на У-хромосому, % Доля метки(ЗС или 1,6 БК), приходящаяся (Хр14-21) на область Х-хромосомы, в которой наблюдалась специфическая гибриди- 1,4 зацияД №32)

Доля метки(ЗС или БК), приходящаяся на' область У-хромосомы, в которой наблюдалась специ-'фическая гибридизация, %

7.3

9,2

8,9

1.0

(Хр12-14)

2,2 (Хр12-14)

1.0

(Хр12)

2,1

(Хр12-14)

3

1.4

(Xq21)

5,5

2,3

0,7 (Xq21)

0,6 (Xq23.1)

2,4 1,7 (Xq21-23. 1)

1,2

0,9

геноме Bos taurus L. имеется три хромосомных локуса, содержащих последовательности ДНК в той или иной степени гомологичные гену ZFY человека.

- 13 -

3. 4. Эффективность и чувствительность изотопного и неизотопного вариантов гибридизации in situ

Данные, накопленные во время проведения нашей работы, позволяют провести сравнение эффективности и чувствительности изотопного и • неизотопногс! вариантов гибридизации in situ. В таблице 2 представлены некоторые результаты гибридизации митотических хромосом Bos taurus L. с плазмидой, со»-держащей фрагмент HPRT гена человека, и с фрагментом ZFY гена человека. Сравнение эффективности и чувствительности использованных нами приемов изотопной и неизотопной гибридизации показывает, что последний из методов как минимум не уступает радиоактивному. При этом стоит отметить быстроту и" безопастность неизотопного варианта гибридизации in situ.

ВЫВОДЫ

1. Показана возможность, внутрихромосомной локализации повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК на хромосомах Bos taurus L.- с помощью неизотопного варианта гибридизации in situ.

2. Продемонстрировано,что неизотопный вариант гибридизации in situ не уступает изотопному по эффективности и чувствительности.

3. С помощью гибридизации in situ изучено распределение . по хромосомам Bos taurus L. клонированных последовательностей сателлитных ДНК II (1,723 г/куб. см) и IV (1,709 г/куб', см). Установлено, что оба сателлита локализуются прие-мущественно в прицентромерном гетерохроматине аутосом, а половые хромосомы не несут значительных блоков этих последовательностей. Однако, в коротком плече У-хромосомы, в районе, который соответствует ГЦ-богатому участку, обнаружено небольшое количество сат ДНК IV.

4. Установлено, что в кариотипе крупного рогатого скота отсутствуют аутосомы, несодержащие в прицентромерном районе сат ДНК II. Но весьма вероятны количественные различия и незначительная дивергенция между блоками этого сателлита, находящимися в разных аутосомах.

5. С помощью гибридизации in situ установлено, что геа HPRT расположен в Хр12-21 участке Х-хромосомы крупного рогатого скота, f

6. С помощью гибридизации щ situ обнаружено,«по в гено-

Ms Bos taurus L. имеется по крайней мере 3 хромосомных' ло-куса,содержащие последовательности ДНК, гомологичные ZFY гену человека. Два^локуса распологаются в R-дисках длинного плеча Х-хромосомы-Xq21 и Xq23.1, и один в проксимальной области длинного плеча У-хромосомы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложенный неизотопный вариант гибридизации in situ может быть использован для локализации повторяющихся и уни-. кальных последовательностей ДНК на хромосомах животных.

2. Предложенные неизотопный и изотопный варианты гибрндиза-ци in situ в сочетании с репликационной R-окрасксЯ (RBA) хромосом крупного рогатого скота могут быть использо аны для внутрихромосомного картирования повторяющихся и у ¿кальных последовательностей ДНК на хромосомах этого вида.

Список работ, опубликованных по теме диссертации : • 1. Финашин С. А. , Павлова В. А. > Логинова ftt А. , Чиряева О. Г. , Слепцов М. К , Смирнов А. Ф. Анализ сателлитных последовательностей у крупного рогатого скота и яка // Бюллетень ВНИИРГЖ. 1989. - Вып. 112.- С. 3-6.

2. Логинова КХ А. , Дерюшева С. Е. , Чиряева 0. Г. . Ефимов

A. М. , Босак Е П. , Смарагдов М. Г. , Смирнов А. Ф. Предварительная локализация гена тестисопределяющего фактора (ТДФ) на митотических хромосомах Воз taurus L. // Бюллетень ВНИИРГЖ. 1989. - Вып. 112. - С. 28-33.

3. Логинова Л. 1Q , Дерюшева С. Е. , Чиряева 0. Г. , Босак ЕЕ, Ефимов А. М. , Смарагдов М. Г. , Смирнов А. Ф. Выявление локализации в хромосомах крупного рогатого скота гена предполагаемого определения развития тестисов // Цитология. -1990. -Т. 32,12. - С. 1182-1186.

4. Логинова Ю. А. , Рассказова О. В. , Финашин С. А. , Павлова

B. А. , Смирнов А. Ф. Хромосомоспецифпчность распределения сателлита II (1,723 г/куб. см) у крупного рогатого скота// Бюллетень ВНИИРГЖ. - 1991.- Вып. 124.-С. 7-10.

5. Босак Е Е , Смарагдов М. Г. , Ефимов А. М. , Логинова Ю. А. , Смирнов А. Ф. , Пол-определяюшие последовательности в геноме крупного рогатого скота //Новые методы селекции и биотехнологии в животноводстве. Часть II. Репродукция, популя-ционная генетика и биотехнология, - Киев. - 1991.- С. 41.