Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфика околоцентромерных и теломерных районов митотических хромосом крупного рогатого скота (Bos taurus L)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Специфика околоцентромерных и теломерных районов митотических хромосом крупного рогатого скота (Bos taurus L)"

/ч

Of .

о' ^ Г

С.-1^- I- На правах рукописи

-о # ^

* ¿S

/

УДК 575.316.345

ПРОШИНА

Ольга Валерьевна

СПЕЦИФИКА О КОЛ О ЦЕНТРОМЕР НЫХ И ТЕЛОМЕРНЫХ РАЙОНОВ МИТОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (Bos taurus L)

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ — ПУШКИН 1997

Работа выполнена в отделе генетики и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А. Ф. Смирнов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. И. Жигачев; доктор биологических наук Е. Л. Паткин.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет.

дании диссертационного совета Д.020.07.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных но адресу: 189620, С.-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55-А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Защита состоится

в // часов на засе-

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук, профессор

В. И. Волгин.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PftOOTH

Актуальность темы. Хромосомы как структуры, содержание весь геном, находятся в центре внимания молекулярной биологии и генетики. Одной из точек роста их исследования является направление, связанное с изучением значимости структурно-функциональной гетерогенности хромосом, поиском взаимосвязи меядд" цитологическим и молекулярным уровнем их организации (Bernard!, 1995; Sauner, 1995; Patterton, HalfГ, 193G).

Современный этап характеризуется расяиренисм и сопоставлением данных полученных ка ограниченном количестве лабораторных объектов и человеке. Сельскохозяйственные кивотнне. в частности, становятся одновременно объектом интенсификации их хозяйственного использования и объектом фундаментальных исследований; В этой связи становятся особенно актульны все накопленные знания об их генетическом аппарате и прежде всего аспекты, имеющие отношение к генетическому картированию; поиску детерминант хозяйственных признаков. Генетические карты с раз-ревением менее 20 ей предполагается использовать для идентификации генов, контролирующих биологически и экономически важные признаки СЕТЬ), которые в большинстве своем являются количественными (QTL). (Georges etal.., 1993; Tanshley, 1993),

По масштабу цитогенетических исследований крупный рогатый скот уступает лииь человеку и некоторым лабораторным животным. Однако до сих пор существуют проблемы с идентификацией хромосом Bos taurus, номенклатурой дифференциального окрашивания, недостаточно описана цитохимическая и молекулярная специфика гетерохроматиновых районов, практически отсутствуют аутосомные маркеры, относительно невелико число работ по физическому картировании.

На настоящем этапе развития цитогенетики характерно широкое использование методов, позволяющих более полно изучить значимость структурно-функциональной гетерогенности хромосом, вести сопоставление менду цитологическим и молекулярным уровнями их исследования. В связи с этим вызывает повышенный интерес изучение прителомерннх районов хромосом, которые являются местом локализации Т-дисков - наиболее обогащенной ГЦ парами

оснований и резистентной к температуре фракцией R-дисков в которой отмечается феномен повышенной концентрации генов. Сегодня наиболее изученный в этом плане является лишь человек (11ц-trillaux, 197?; Saccone et al., 1992; Bernardi, 1992, 1995). До сих пор не было работ описывающих распределение консервативного теломерного повтора (ТТЛПТ)п по хромосомам крупного рогатого скота, который является стабилизатором концов хромосом и показателем эволюционной продвинут ости вида (Meyiie et al., 1990). , Интересный канетса и изучение околоцентромерних районов, являющихся контрастными по генетическому содержании тело-мерным участкам хромосом млекопитающих.

Таким образом, целью наиай работы являлось изучение моле-кулярно-генетических особенностей структурной организации хромосом крупного рогатого скота с поыоцьш молекулярно-цитогене-тических методов с акцентом на околоцентромерпые и теломерные районы.

При этом били поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать распределение Т-блоков на хромосомах Dos taurus с помощью ïllft и СМй дифференциального окрашивания. Описать сравнительную обогащенность Т-дисков крупного рогатого скота генами с известной локализацией.

2. Проанализировать особенности распределения консервативных телоыерних повторов tTTftG&G)п на хромосомах Dos taurus методом in situ гибридизации.

•3. Провести локализаций клонированных фрагментов сател-литной ДНК IV (1,709 г/куб.см) и сателлитной ДНК II (1.У23 г/куб.сы) на митотических хромосомах Bos taurus L. Оценить хро-мосомспецифичность .распределения сателлитных ДНК II и IU Bos taurus L.

4. Выявить особенности взаимной организации сателлитных последовательностей (catДНК II и IU) в гетерохроматине аутосом крупного рогатого скота с использованием специфического удлинения (деконденсации) этих участков 5-азацитидином.

Научная новизна работы. Описано распределение Т-блоков на хромосомах Bas taurus L, их доли в хромосомном наборе, оценена относительная обогащенность этих районов - Генам!и с известной

локализацией, дан сравнительный анализ Т-дисков крупного рогатого скота и Т-дисков человека.

Впервые с номошыо флуоресцентного варианта гибридизации in situ определена локализация консервативных теломерных повторов на хромосомах Bos taurus. Установлено, что в кариотиие этого вида отсутствуют- интерстициалькые сайты для (TTAGGG)n последовательностей и имеются прицентромернне участки их местом поло!ения в аутосомах.

С поиощьв Флуоресцентного варианта гибридизации in situ с совмещением дифференциального окраиивания хромосом определена локализация сателлитных ДНК II и IV на хромосомах крупного рогатого скота. Описаны различия гомологов по содержании сател-литной /|11К IU, доказано, что такие повторы содержатся во всех ■ аутосомах.

Методом флуоресцентной гибридизации с предварительно де-конденсированными 5-азацитндинои гетерохроматином установлено закономерное (1 тип для сателлитной ДНК II и 3 типа для сател-литной ДНК IV) распределение многократно повторявшихся блоков нуклеотидов в гетерохроматине аутосом Bos taurus L.

Практическая ценцностъ работы. Результаты работы могут быть использованы при построений генетической карты Bos taurus, изучении структурно-функциональной организации генома и практического поиска кариотипических аномалий у этого вида.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуядение полученных результатов, выводи, практические пред-лояениз и список литературы, вклвчавщий 173 публикаций отечественных и зарубекннх авторов. Объем диссертации составляет 112 страниц маяинописного текста, включает 11 таблиц и 11 рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

Работа выполнена на лимфоцитах периферической крови быков и коров .черно-пестрой породы, принадлежащих совхозу "Ленсове-

товский" и ÛU3T "Летсиосельский" Ленинградской области. Всего било проанализировано 16 животных.

В экспериментах но гибридизации ДИК-ДНК in situ в качестве зондов были использованы следующие последовательности;

1. Илазиида Bluescript KS с клонированным в Eco R 1 сайте фрагментом теломерного повтора £TTÍ1E&S>п длиной 181 п.н. С Weber et al.. 1990). -,

2. Клонированный в Hind Ш сайте плазмиды PBR 322 фрагментом сателлита IU быка ( 1,?09 г/см5) размером 3800 п.н. (Skouronski et al.. 19Ö4)

3. Лигированная в Ваш II сайте плазмиды PUR 222 последовательность сателлита II ( 1 ,723 г/см5) длиной öliO п.н, (Pluciennlczak et al., l'Jüö).

Культивирование лимфоцитов периферической крови проводили по методу, предложенному Рибак с соавторами ( Rybak et al., 1982), с некоторыми модификациями, прсдлсшенными Ширяевой 0.Г. (Чиряева, 1983). Для получения клеток, находящихся на ранних стадиях митоза, бил использован метод Икеучи (Ikeuchi, 1984). Приготовление препаратов прометафазных хромосом осуществляли стандартным (суховоздушним) методом. При индукции специфической задержки конденсации хромосом на последние 7 часов в культуру лимфоцитов добавляли 5-аз^цитидин в концентрации i0 6 M.

Для идентификации хромосом применяли RBA метод дифференциального окрашивания. Индукцию Т-дисков осуществляли Т1Ш методом, включающим температурную предобработку и окраску акридиновым оранжевым (ßutrillaux, 19?3). Использовали также флу-орохромирование хромомицином ñj -CMñ¿ окрашивание (Schueizer, 1981; Barros, Patton, 19ÍS5). Для определения границ и размеров Т-дисков идиограммн ï-исчерченных прометафазных хромосом сопоставляли с идиограммой RBft-исчерченних прометафазных хромосом (Чиряева, 1989).

При совмещении дифференциального окрашивания и гибридизации in situ использовали репликациойный вариант R-окрамивания хромосом основанный на инкубации препаратов хромосом, содерва-цих ОДУ, в растворе Хехст-33258 в течении 30-45 минут под ультрафиолетовой лампой с последующей инкубацией препаратов в 2xSSC в течении 60 минут при 65еС.

ДНК-зонды метили Bio-11-UTP ("Feruéntas" ) методом ник-

трансляции (Маниатис и др., 1984)', Для определения эффективности мечения биотинилировашшй пробы использовали метод оценки мечения по результатам выявления различных количеств ДИК-зонда с помощью коньюгатов стрептявидин-щелочная фосфатаза (НПО "Вектор"),

Зксперементы по гибридизации in situ проводили, используя метод Герхарда (Gerhardt et al., 1981) с некоторыми модифика-' циями (Логинова, 1932).

Детекции биотин-меченых проб проводили с помоцьп флуоресценции меченного FIТС авидина (Pinkel et al., 1986). Анализ распределения гибридизациошшх сигналов на хромосомах проводили по микрофотографиям.

з. результат« и обсуйление.

3.1. Цитогенетическая характеристика Т-дисков митотических хромосом Bos taurus L.

На хромосомах крупного рогатого скота при продошйтель-ной тепловой обработке ( от 7 до 15 минут для более старых препаратов) и THft окраиивании выявляются Т-диски, восповном, с- околоцеитромерной и прител'омерний локализацией, частота встречаемости 92,5t0,85% и 93,0*1,327., соответственно. Интер-стициальные блоки обнарумоаятся с высокой частотой на хромосомах ? - 1007. , 16 - 86, li5.8% и У - 90,8*4,9 У. (табл. 1). Относительно длины гаплоидного набора наиболее крупный цектро-мёрный блок располокен на хромосоме 2 - 0,53%, а наиболее мелкий на хромосоме It - 0,29%. Наибольший теломерный Т-блок выявлен на хромосоме 2 - 0,062, а.наименьяий на хромосоме 23 - 0.23%. Суммарная доля в геноме относительно длины гаплоидного набора центромерных, теломерных и интерстициальных Т-дисков составила соответственно - 11,19%, 9,977. и 2,02%.

Все теломерные и интерстициальные Т-диски соответствуют R-блокам, однако 22% Т-дисков имеют слоянци природу, т,е, включают в себя как R, так и &-диски хромосом 1, б, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 18. 19, 20, 23, 24. 21, 28.

Таблица 1. Частота встречлеыости Т-дисков на хромосомах крупного рогатого енота.

н п Частота встречаемости 'Г-дисков, У.

Целтромерний Интерстици- Толомерний

район альный район район

1 36 86.113,7 _ 100 '

2 36 94,4*3,8 - 91,7ч4,6

3 36 94,413,8 - 100

4 36 83,716.4 - 94,413,8

5 36 91.7*4.6 5,8*3,7 100

6 36 91,114,8 - ■ 91,714,6

7 30 94,413,8 100 -

8 3(5 91,414,7 - 85,7*5,8

9 36 100 - 94,1*3,8

10 36 88,915,2 - 66.7Г/,8

11 36 100 - 100

12 36 100 16,7*6,2 100

13 35 94.313,9 - 88.615.4 .

14 зе 86.Ц5.8 - 50.0*8,3

15 35 91,414,7 - 88,6*5,4

16 36 100 80,1*5,8 31,7*4,6

17 36 97,212,? - 100

18 35 91,414.7 - 94,313,9

19 30 80,6*6.0 - 97,2*2,7

20 35 85.7*5.9 5.7*3,9 82,915,9

21 35 97,112,8 8,6*4,7. 97,1(2,8

22 35 94,813,9 - 97,1*2,8

23 36 «8,316,0 5,6*3,8 100

24 36 88,9*5,8 - 88,915,3

25 36 7?,8*6.7 - 91,714,6

2В 36 97,2*2,4 97,212,4

'27 36 83,316,0 5,613,8 94,413,9

28 36 94,4*3,9 5,6*3,8 83,3*6.0

29 35 88,6 ь5,4 - 88,71.5,3

Ь 12 - ■ 90,844,9

X 24 - -

N - номер хромосомы; . ,

п - число исследованных проыетафазиых хромосом.

&

Сокращение времени температурной предпГфаботки до У минут при последующем 'ГИЛ окрашивании выявляет значительно больиеё число иптерстициальных дисков (ТВА-блоки, табл. 2). СМЛ 3 окра-нивание такие идентифицирует дополнительные блоки в хромосомных плечах всех ацтосом, за исключением 9, 19, ?.5. Разнообразие феноменов Т окрашивания митотических хромосом Bos taurus иллюстрирует таблица 2, Хромосомы Bos taurus характеризуются' появлением дифференциально окраиеных околоцеитромерных участков поело Tili) и 1'МА окрашивания. На наш взгляд, это результат наличия в геноме крупного рогатого скота ГЦ-богатых фракций многократных повторов с прицентромерной локализацией, способствующей выявлению таких тандемных блоков с помощью использоваиных в работе цитохимических приемов. Вряд ли, каждый такой участок' хромосом с околоцентромерным местоположением можно рассматривать как настоящий Т-блок.

Таблица 2. Разнообразие Т-днсков, идентифицируемых на митотических хромосомах Bos taurus.

Местоположение Число Т-дисков, выявляемых при определенном

■на хромосоме 'методе дифференциального окравивания

THft ТВА СМА ТВА ТВА CUA

и и и

Ш СМА ТНЙ

Чентромерное 29 23 29 29 29 29

Теломерное 28 20 23 28 28 28

Иитерсти- 6 00( 24)* 61(5 Г 6 56 6

циальное

( )*- выявление только ТВА, ( )*- выявление только СМА. .

Согласно полученным нами данным Т-рисунок дифференциального окрашивания хромосом Вой taurus имеет сложную природу.

Moîiiq условно выделить околоцентромерние блоки, обогащенные сатДНК, соответствующие R-дискам Т и Т'П'ЙА и СМА) блоки. Очевидно, первые из них соответствуют Т-дискаи человека,'наиболее обогацешше тяжелыми изохорами, а вторые недавно обозначены Т' -блоками, включающие такие 113 и 112 изохоры в более умеренной пропорции (Bernard!, 1995).Для крупного рогатого скота на фоне сходной доли собственно Т-блоков а хромосомном наборе (15 И от общего количества дисков), значительно меньше их число у этого вида имеет интерстициальное местоположение по сравнению с Ново sapiens (Saccone et al., 1992, 1995; Bernardi, 1995).Описанный нами рисунок ТНА окраиивания хромосом Uos taurus нашел подтверждение в появившейся недавно работе итальянских генетиков (Mezzelani et al., 1990), использовавшими для идентификации хромосом кпемиды. Вместе с тем, в этой работе описан рисунок, который является суммарным для 'Г и ТВЙ С СИЛ) блоков согласно нашей идентификации. Есть разночтения, касающиеся местоположения 'Г—блоков прежде всего в твлоыерной части хромосомы ?.5 и длинном плече 'J хромосомы. Ьакно, что специфика Т-рисунка хромосомы 7 описана и в цитируемой выше работе. Общее число ин-терстициальных Т-дисков -71 в работе Меззелани и дрЛMezzelani et al., 1998). Согласно нашим данным в хромосомном наборе Dos taurus 0 иитерстициальных Т-бло(юв,ЙО TBfi-дисков и 61 СМЙ-бло-ков (табл. 2). Полученные в навей работе данные свидетельствуют о специфике феномена Т окрашивания хромосом Uos taurus и необходимости накопления материала о закономерности распределения 6-.T-, и R-блоков на других объектах помимо Иошо sapiens!

Поскольку Т-диски рассматриваются как участки хромосом наиболее обогащенные генами (Bernardi, 1995), нами была предпринята попытка оценить рапределение физически картированных генов ÏHft окрашенный хромосомам. Bos taurus. Число таких генов у этого вида относительно невелико - 45. До отдельного диска картировано еще коньке - 25 (Fries et al., 1993; Eggen, Fries, 1995; Le Chalony et al., 1995; Gui et al, 1995; Castiglioni et al., 1996), из них 7 локализовано в R-дисках, 5 в G-дисках, 5 в ТВА (СМА)-дисках, к Т-блокам привязано 8 генов: RNR 3-6qter, HsPfl 3-10q34, LGB-llq28,IGHA-2ic|24, ICHC' l-21q24.1£H£ 3-21q24,

В

LTF-22q24, CGN 1 -28niO; можно говорить о возможной локализации в Т-дисках генов: iiOI.O 1-qter, FSIllM5q24-qter, Gil- 19qi7-qter. Ш 10-19qlB-qter,KRT 19-l9qlO-qLer, KRT -19ql6 -qter.KRT 8 l-10q31-qter, MSA-7q24-qter.

Высокая концентрация генов в Т-дисках и околотеломерных районах описана для ряда видов позвоночных и других зукариот СSaccone et al., 1992; Bernard!. 1995: Carels et al., 1995;' Zonbak et al., 1996). Крупный рогатый скот - один из наиболее интенсивно генетически изучаемых объектов (Efigen, Fries 1995; Barendze et al.,1396). Однако, из 25 генов с точной внутрихро-мосомной локализацией лишь 8 согласно навей оценке связано с Т-дисками и еще 5 с 'ГВА (СМЙ)-блоками. О каком-то достоверном предпочтительном местополояении генов в Т-дисках пока говорить рано, речь может идти только о тенденции. Поскольку для млекопиТакщих предположительное число генов достигает 60-70 тысяч (Fields et al., 1994), даже выборка из примерно 1000 генов, которой оперируют применительно к человеку С Holnquist, 1992; Bernardi.1995, Zonbak et al, 1996) недостаточна для точной оценки их меяхромосомного распределения между T-.TBft(CMft)-, В- и R-блоками. Необходимо дальнейшее развитие исследований по физическому картированию геномов животных.

3.2. Гибридизация in situ специфических теломерннх повторов с митотическими хромосомами Bos taurus L.

Согласно результатам определения местоположения в хромосомном наборе крупного рогатого скота консервативных теломер-ных повторов (ТТЙГГГ)п с помощью гибридизации in situ такие блоки локализуются в прицентромерных и теломерннх участках аутосом и прителомерных районах половых хромосом. Интерстици-альннх сайтов гибридизации не выявлено. Специфичность реакции подтверждается высокой частотой мочения сестринских хроматид (табл. 3). •

Сателлитные ДНК крупного рогатого скота не содержат достаточно протяженных ТТПГГГ последовательностей, которые могли бы инициировать специфическую гибридизация использованной нами пробы, как описано для ряда объектов (Lee et al., 1993; 36bse et al., 1995). Отсюда сопоставление результатов T окравивания-

TdÓJIHqa 3. 'IdC'fUTil liaCllpUAUJIÜIIH.'A l'H(H)HftH3tUtK0lljiUl'U CW'llüJia TejiuuBpHoru iiOBTQpa rio xpoM<rrnAaM MeTaipaniux xponoco* Uos laurus

Kojihmbctdo Küjih'ioctbo

N ti we'ienux xpoMaTHA X-tm K 11 MÜMOIIUX xpüuatHA - Xm

1 15 3,5i0,09 17 15 3,íit0,03

2 15 3,41.0,12 líi 15 3,510,12

3 15 3,tíi0,0íi Í9 15 3, ti 10, o y

4 15 3, C¿0,1 i 20 15 . 4,()l0,03 ^

5 15 3,fJí0,0íl 21 15 ""3,üi0.09

6 15 3,8t0.0íl 22 15 3,ík0,12

7 15 4,0i0,0e 23 15 3,Vl0,09

íi 15 3,fii0,07 24 15 3.8t0.10

3 15 3,8i0,00 25 15 3,ÍJt0,07

10 15 3,9i0,QG 2Ü . ili 3.7t0,0tí

11 15 3,íit0,0ti 27 15 3, ti l0 ,12

12' .15 4,0t0,03 21) líi 3,7\.0,09

13 15 3. 7*0,12 29 15 3.71.0,09

14 Ib' 4,0t0,0fi X 10 3,íii0,07

15 15 3,8t0.08 . V 5 3,«l0.07

15 15 3,7i0,06

Houep xpDiáocoiíu;

4Hcjio HccjieAQBaHHUX ueTa$a3Hux n/iac thhdk

N -

n -

наличии иколицинтроиорных ярко шфамсщ.шх блоков и гибридиза-ни« .in iiitu с теломершецифичосиими блоками нуилоптидоп ука-айнам на низыииность ирисутитииь! п аутосомах атиги вида короткого плеча с небольшим 'Г блоком. Паи на изиеспш работы, п которых било (¡к описано распределение теломерпых повторов на хромосомах lio:; Laura:;. О работе'Мейне с соавторами (Меуое el "<il., Hi'jO) приводятся данный такого рода применительно к олиз-ким «идам -- опце (i)vi;i an'fiis) и козе (Сарга hirsui»). Сообщается только о теломерспецифическом рисунке гибридизации. Наличие дополнительных сайт»» гибридизации и икояоцоитромпрных участках акроцеитрическнх С субмотацеитричееких) аут ос ом Но;! Ьчши:; ставит дополнительные попроси в связи с эволюцией партийна у Гшкоимх.

3.3. Мел- и ниутрихрпиосомпий полиморфизм распределения

еатоллитной ДНК 1U И .VO'i г/си'-) и сатедлитний ДИК 11

• *

(1.УИЗ г/см1') по хромосомам крупного рогатого скота.

Результаты экспериментов по совмещении дифференциального окрашивания хромосом и гибридизации in situ показали, что сатДНК 11 и 1U обнарукииаштся и пколоцеитромерпых районах псих аутосом и отсутстуют и пнлшшх хромосомах (табл. 4, ii), Наблюдаются четкие различия между хромосомами » эффективности гибридизации. Так, только И|И,'.!У. хромосом 50 при рассмотрении (i0 метафаз o r !i мишгпшх и 100% хромосом 2\, '¿'¿, '¿S и 26 несли четкий гибридизациошшй сигнал сатДНК Н< Ясредиспный показатель такого рода составил W)l\ ,'i"/., что говорит о высокой эффективности гибридизации (табл. 4).Получений результат можно трактовать как наличие существенных иеххромосошшх различий п содержании блоков пуклеотидев, характерных для этого класса многократных повторе».

Полученные нами данные подтвердили 'закономерное распределение блоков сатДНК 11/ и II п прицецтроыерных районах аутосом ( KuriliЬ et al., 1В"/8; Чираглм и др., 1990; Логинова и др., 1391; Modi et al,, 1993 ), Однако, только в двух последних работах сделана попытка оценить межаутосомные различия и распре-

Таблица 4. Частота встречаемости гибридизационного сигнала сатДНК IV (1,709 г/см?) на хромосомах крупного рогатого скота

N п Количество

меченых хро-

мосом, Х+и У.

1 120 84:13,3

г 120 . 43+4,5

3 НО 72*4.4

4 114 31¿4,3

5 116 89±2,9

0 118 70*4,2

7 116 8143,6

8 118 88+3,0 '

9 120 99*0,1

10 116 14*3,2

11 120 96*1,9

12 114 99*0,9

13 120 .У7±1,е

14 120 9711,6

13 120 9И+2,0

16 120 ' 95±2,0

N п Количество

меченых хро-

мосом, Х+и У.

17 112 86±3,3

18 112 9412,2

19 120 97+1,6

20 114 79+.3.0

21 120 100

22 114 100

23 112 100

24 120 39*0,9

25 110 97+1,6

26 113 100

27 117 97*1,6

28 ИЗ 86*3,3

29 120 99+0,9

X 94 -

У 20 -

X 8М,9

К - номер хромосомы;

п - число исследованных прометафазных хромосом.

Таблица 5. Частота нстречаенооти гибридизационноги сигнала сатДИК II (1 ,723 г/смl):»¿I хромосомах крупного рогатого скота

N п Количсстии печенных хромосом, Х±в У. N n Количество меченных хромосом, X tn У.

1 40 100 17 40 90t4,7

2 40 100 18 ЗЯ 78t6,6

3 40 90+4,У 19 39 e?t?,5

4 40 901.4,7 20 40 30±7.2

5 40 'J Ol 4,7 30 88t5,3

0 40 90i4,7 22 38 50i8.1

7 10 30*1.7 23 30 50±8,1

8 39 8!)t5,Q 24 38 38t7,9

3 40 ' S0t7,7 25 38 88t5,3-'

10 40 90H.7 26 38 03+7,8

11 4о; 90i4,7 27 38 73i7,0

12 40 80*6,3 28 38 88+5.3

13 39 ?8ts,e 29 38 88+5,3

14 40 ?0i7.2 . X 31 -

15 39 78i8.6 Y 9 - '

1G 39 100 ■ X ?Ö+6,S

'N - номер хромосомы;

п - число исследованных прометафазных хромосом.

делении лтих блоков повторов мри использовании совмещения дифференциального окрашивания и гибридизации ш йН.и. И работе Моди с соавторами (МшИ с(, а1., 1!Н)3) на относительно неболь шим материале с помощью бальной оценки также продемонстрирован Феномен межхромпг.Ьмпих различий п распределении сатДНК 10. Наблюдается и частичное совпадение описанного ими полиморфизма с нашими данными. Так хромосома 4 согласно американским исследи -вателям вообще не содержит метки. По результатам нашей работы она метится относительно редко лишь в 3(14.ЗХ случаев. Обоими группами исследователей отмочена высокая эффективность гибридизации околоцеитромецннх участков хромосом ИВ, 23, 10 и 13. Однако, но иамим данным практически в 100/С случаев гибридиза-ционннй сигнал выявляется и хромосомах 21 и ?.?..

Согласно результатам предварительных зкенвримеитон Логиновой п соавторами (Логиншм и др., 1У:М ) предполагалось пони ионное содержании сатДНК Им» аутосомах Г/ и Результаты пашей роботы нодтнерпдают эти дашше для хромосомы 24 (30*7,УХ иечения), но не для хромосомы 17 (У014,7Х мочения, табл.У). Низкий процент встречаемости сигнала гибридизации отмечен нами для хромосомы 20 (30:17,2%), что также отмечено в цитируемой выше работе. Наиболее часто согласно нашим данным ( 1007.) обнаруживается метка в хромосомах 1, 2 и 10.

Идентификация хромосомных пар с помощью дифференциального окрашивания позволила нам наблюдать гетероморфизм гомологичных хромосом по содержанию сатДНК 10. Этот феномен был отмечен для хромосом 1, 2, 3, 7, Я, 11 и 1-3. Срндний процент гетероморфпых хромосомных пар составил для них соответственно '№/., 742. №. 717-, 77/.. 02У. и 1002 (результат достоверен согласно критерию знаков).

Таким образом, на основе наших экспериментов можно с уверенностью говорить о постоянном присутствии блоков многократных повторов сатДНК II и 11) » нрицентромерных районах всех ацтосом. о наличии феномена межхромосомпых различий к содержании блоков многократных повторов, существовании межиндивиду-«лыюй или межпородной вариабельности таких блоков нуклеоги-дов так«п можно предположит из-за некоторого несовпадения результатов ( Погииова и др., Г,НИ ; ИшИ е(, а I., ЯШ). Не

исключено, что имеищиеса тут расхождения связаны и с недостаточной выборкой исследованных хромосом и животных, а так se различной степенью эффективности-гибридизации.

I) своей работе мы попытались описать специфику внутрихро-мосоыного распределения сатДНК И и III, используя феномен "удлинения" - деконденсации гетерохроматиновых районов в ауто-сомах этого вида при воздействии15-азацитидином и гибридизации in situ. Анализ распределения сатДНК II и IU показал строго специфическое местоположение этих блоков нуклеотидов' в гетеро-хроыатине аутосом. Так, для сатДНК IU нами было установлено три типа локализации (рис. 1): 1) мелкие блоки в дистальной области прицентромерного гетерохроматина; 2) крупные блоки в дистальной области прицентромерного гетерохроматина; 3) два блока сатДНК IU, занимающих большую часть деконденсированного прицентромерного гетерохроматина. Различные типы распределения прицентромерного гетерохроматина. Различные типы распределения сатДНК IU вероятнее всего связаны с её разным количеством в отдельных аутосомах.

X

т

г-А-^

в

Рисунок 1. Схема распределения сатДНК Ш по деконденсирован-ному Н-азацитидином гетерохроматина аутосом крупного рогатого скота: а. Мелкие блоки в дистальной области прицентромерного гетерохроматина; б. Крупные блоки в дистальной области при-центромерного гетерохроматина; в. Два блока сатДНК-IV, занимающих большую часть деконденсированного прицентромерного гетерохроматина;

СатДНК II согласно нагайм данным локализуется в дистальной части уплотнения, наблюдаемого при деконденсаций гетерохроматина, в виде двух точек на отдельных хроматидах (рис. 2).

Можно предположить, чти такие сайты гибридизации расположены на границе гетеро- и эцхроматина в районе предполагаемого короткого плеча. Его наличие в аутосомах такве следует из ре. зулътатов наших экспериментов по оценке местоположения Т-бло-ков и консервативных теломерных повторов.

X :

Рисунок 2. Схема распределения сатДНК 11 по деконденсирован-ному S-азацитидином гетерохроматину аутосом крупного рогатого скота.

\ ■ ■ ВЫВОДИ. ■

1. На хромосомах крупного рогатого скота Г-диски соответствующие R-дискам, составляющие 23И длины гаплоидного набора, локализованы в теломерной и околоцентрсмсрной области большинства аутосом. Исключение составила хромосома 7, которая не имеет теломерного Т-диска. Хромосомы 7 и 16 имеют интерстици-алыше 'Г-диски X хромосома не. имеет Т-блоков, У хромосома со— дерзит на коротком плече Т-диск, соответствующий ранее опи-саному CMflf району.

2. Продемонстрировано разнообразие вариантов Т-блоков. Сокращение времени температурной предобработки хромосом при ТНЙ окрашивании и флуорохромирсвании СМА 3 выявляет дополнительные инторстициальные сегменты, которые мокпо классифицировать как аналогичные 'Г'-дискам Homo sapiens. Из 147 R-блоков Bos taurus выявлено 63 Т- и 8b Т' (ТЙ11 и СМЙ)-блоков.

3. Анализ распределения 2Я генов с известной внутрихромо-сомной .локализацией ие обнаружил какой-либо избирательности местоположения в G-, R- и Т-хромосокннх блоках.

4. С помочью гибридизации in situ определена локализация консервативной теломерной последовательности (ТТАГГПн в при-центромерных районах всех аутосом и'е теломерных районах всех

хромосом. Интерстициалышх сайтов гибридизации не обнаружено.

5. Дифференциальное окрашивание и"гйбридизация in situ но оюнаружили аутосом, не содержащих сателлнтной ДНК II и IU в околоцентромерных районах. Описаны только количественные мев-хроносошше различна. Обнаруяеи гетероморфизм гомологов по со-дераанив сатДНК 1U.

ß. С помочь» гибридизации in situ и избирательной декои-денсации гетерохроматиновых районов при использовании 5-аза-цитидина показано несколько форм внутрихоиосомной локализации сатДНК IU н околоцентромерних районах всех аутосом: мелкие блоки в дистальной области прицентромерного гетерохроматина; крупные блоки в дистальной области прицентромерного гетерохро-матина;два блока, распределенные в большей части деконденсиро-ванного прицентромерного гетерохроматина. Для сатДНК II выявлено лишь дистальное местополоаение в виде двух сайтов.

7. Полученные результата о местоположении консервативного околотоломерного повтора, Т-блоков, специфике локализации сатДНК по деконденсироваплому прицентромерному гетерохроматина хромосом свидетельствуют о возможном наличии короткого плеча акроцентрических аутосом Bos taurus.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ •'

1. Полученные данные могут быть использованы при построении генетической карты вида, изучении структурно-Функциональной организации генома Oos taurus.

2, Результаты работы могут использоваться для практического поиска кариотипических аномалий у крупного рогатого скота.

СПИСОК (ШВЛИКОВАШШХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сцдаренкова (Проиипа) 0.В., Чиряева 0.Г.,,Смирнов Й.Ф. Т-диски и теломерспецифические последовательности на хромосомах свиньи и крупного рогатого скота// Сб. Актуальные прблемы биологии нивотиых. - Боровск. ВНИИФиВ, 1995.- С.223.

2. Пронина О,В., Чиряева О.Г., Попов A.B., Смирнов Й.Ф.

Внутрихромосомная и меяхромосомная специфика рас-

пределения сателлитной ДИК П и IV Bos taurus L.// Сб. Мояеку-лярногенетические маркеры животных. - Киев, Аграрная наука, 1996.-С.85-06.

3. Пронина 0',В., Чиряева 0.Г., Смирнов d.U. Распределение Т-дисков и (TTA6GG)n теломерных последовательностей на хромосомах крупного рогатого скота// Сб. Молекулярно-генетические маркеры кивотных. - Киев, Аграрная наука, 1996. - С.85.

4. Proshina O.U., Efinov А.К., Loginova З.А., Chiryaeva O.G., Snirnov A.F. Molecular and cytochemical peculiarities of

* heteroclironatin of cattle chromosomes// 47th Annual Meeting of the EAAP, Lillehamaer, Norway, 1996. - p.214.

5. Proshina O.V., Chiriaeva O.G., Smirnov A.F. Telomeric bands on Bos taurus mitotic chrooosomes//Archivos de Zootechnia С 12th European Colloquin on cytogenetics of doaestic animals), 1996. - Vol. 45, - p.361-365.

6. Prochina 0., ChiriaeOa 0,, Snirnov A. The interchrono-. Sonal and intrachrooosoual specificity of distribution of bovine satDNA II and IV// 12th European Coiioq. Cytogenet. Domestic Aninals, Zaragnsa, Spain, 1996. - p.70.

7. Prochina 0., Chiriaeva 0., Sairnov A. The distribution of T bands and (TTA£&G)n teloneric sequences in cattlc chroao-somes// 12th European Colloq. Cytogenet. Domestic Animals, Zaragosa, Spain, 1996.. - p.7i.

16

i