Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфика хромосомной организации представителей семейства Bovidae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Специфика хромосомной организации представителей семейства Bovidae"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

СПЕЦИФИКА ХРОМОСОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ВОУЮАЕ

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

УДК 636.2:547.963.2

ТРЕУС Вероника Владимировна

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ—ПУШКИН 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А. Ф. Смирнов, кандидат биологических наук Н. С. Никитин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. И. Жигачев (Санкт-Петербургский ветеринарный институт) и кандидат биологических наук А. В. Родионов (Санкт-Петербургский Государственный Университет).

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Институт Экспериментальной Медицины, РАМН.

Защита состоится « » 1994 года в час. на

заседании Специализированного совета Д.020.07.01. по защите докторских диссертаций при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных

наук, профессор Ж. Г. Логинов

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы. Проблема видообразования и тесно связанная с ней задача преодоления репродуктивного барьера-остается одной из наиболее важных в современной биологии. Очевидно,что сопряжены с этим феноменом и вопросы, касающиеся механизмов инбридинга и ге--терозиса.К сожалению,сейчас накоплен лишь обширный материал, касающийся биологии репродуктивной изоляции и популяционных аспектов макроэволюции. Данные о цитогенетических и молекулярно-гене-, тических аспектах,этой проблемы более ограничены (Orr,1992).

Семейство Bovidae (Полорогие), подсемейство Bovlnae (Быко-вые) представляют одно из наиболее обширных и вместе с тем наименее изученных таксонов, являющихся удобной моделью для изучения-изменчивости кариотипа и генома в целом в видообразовании, межвидовой, межродовой гибридизации и т.д..Некоторые виды данной систематической группы одомашнены и представляют определенную . хозяйственную ценность. В пределах данного семейства ведется активная работа по отдаленной гибридизации для совершенствования существующих сельскохозяйственных видов. Однако эти работы зат-. руднены образованием барьера репродуктивной изоляции, при которой как правило стерильными оказываются- особи гетерогаметного пола ( Стекленев, 1989; Hainan, 1989). По ряду представлений',свыше 98% случаев видообразования сопровождаются изменениями кариотипа. При этом хромосомные перестройки играют роль ведущего фактог ра в инициации дивергенции (White,1978). Наиболее распространенным. механизмом видообразования-для многих таксонов служат Ро-бертсоновские транслокации (Heraog,1987). Известно еще два очень значимых типа изменений кариотипа, сопровождающих видообразование - это появление добавочных блоков ' гетерохроматина, вариации его количества и полиморфизм У- хромосомы. В литературе' упоминается возможность существования более тонких цитогенетических различий этой гоносомы в связи с дивергенцией видов, входящих в семейство Bovidae, отличающееся консерватизмом кариотипа (Орлов, 1983; Hainan, 1989).

Основополагающие принципы структурно- функциональной оршш-зации'хромосом теплокровных обычно связывают с R(G) рисунком.Эти данные .в основном получены благодаря, конкретным знаниям и хромосомах наиболее изученных обшстов(человека',мыши)(Но1гщиШ, 1992; .Craig,Blckmore, 1992; Sumner et al.',1993 ).Вместе с тем в литературе ; имеются указания на особенности .организации R(G.) дисков эу-'

хроматиновых участков хромосом и друшг лидов. Например,для про-, метафазных хромосом Bos taurus характерен необычно большой размер Е(С)дисков,что подтверждает существование отличительных черт организации эухроматина у этого вида (Chlryaeva et al.,1989).Это делает исследования по частной цитогенетика определенных видов теплокровных чрезвычайнб актуальными. Исследованию особенностей гетарогешостй хромосом Быковых, и посвящена наша работа.

■ ШЫШ и задачи- исследования. Целью нашей работы явилось изучение цитогенетической специфики подсемейства Быковых и сравнительный анализ кариотипических и.хромосомных особенностей близких видов эюй группы. В конкретные вадачи исследований входила:

1. Описать закономерности* компактизации G и R участков митоти-ческих хромосом Boa taurua L., сопоставить их с ранее описанными для Homo sapiens.

2. Построить цитогенетическую карту хромосом для Bison bison.

3. Проанализировать распределение гетерохроматина с помощью цитохимических методов у родственных видоё Bison bison,Bison bona-aus, Bos frontalis и сравнить с таковым Воз taurus L.

4. Проанализировать специфику морфологии и рисунка дифференциального окрашивания половых хромосом у ряда представителей Быковых (бизона, зубра, гаяла).

5. Исследовать особенности распределения в геномах диких видов Bovlnae последовательностей, родственных сателлитным ДНК (1.723 г/см3)'крупного рогатого'скота.

6. Определить локализацию гена SRY на хромосомах Bison bison. Научная новизна if практическая ценность работы.Впервые описаны

закономерности хромосомной конденсации и специфики слияния R(G.) блоков у Bos taurua L. и проведено . 'сравнение с таковыми у Ношо sapiens.Впервые получена онтогенетическая карта RBA-исчерченнос-ти высокого разрешения мито'тических.хромосом Bison bison.Впервые описано распределение клонированной- последовательности сателлита II на хромосомах диких представителей семейства Bovldae - Воз frontalis, Bison,bison, Bison bonasus при совмещении дифференциального окрашивания с процедурой гибридизации In situ. Получены предварительные данные по локализации на хромосомах Bison bison последовательности, гомологичной гену ЗйУ(человека) ■> „Результаты исследований могут быть использованы для изучения структурно-функциональной организации генома представителей подсемейства Bovlnae,в исследованиях по изучению молекулярно- гене-

тической детерминации пола млекопитающих,а также в частной цито-генетикэ для определения хромосомных нарушений гибридных особей данного семейства.

Апробация работы. Основные результаты работы обсуждались на аспирантских сессиях ВНИИГРЖ (1992,1993).представлялись на Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров (Минск,1992), международной конференции по. эмбриогенетике и молекулярной генетике(Варшава, 1992), на конференции по породообразованию (Киев,1993). Публикации. По тема диссертации опубликовано 5 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения,литературного обзора, изложения методов и результатов исследований,обсуждения результатов, заключения,выводов и практических предложений, списка литературы. Иллюстративный материал содержит 14 рисунков и 16 таблиц. Список литературы содержит 244 источника, из них 203 ссылки на зарубежных авторов. ' '

2.МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Материалом- для .получения препаратов митотических хромосом служили лимфоциты периферической крови быков подсемейства'Bovlnae,рода Воз - В. frontalis (гаял;4 особй) и В', tauras ( КРС; 5 быков черно-пестрой породы), рода Bison- В. bison ( бизон; 9 особей) и В. bonasus (зубр;8 особей), принадлежащих заповедникам Аскании-Нова и Приокско-ТеррзсНому, а также Санк*-Петербургскому зоопарку. ■

При постановке культуры и для получения клеток, находящихся на ранних стадиях митоза, использовали методы, разработанные Рибак (Rybalc et al., 1982)' и Икеучи(Ikeuchl,1984) с модификациями,предложенными Чиряевой (Чиряева,1988). Дифференциальное окрашивание хромосом проводили RBA- методом в модификации Чиряевой (Чиряева, 1988),С-методом по Самнеру(Sumner,1972),ХМА+ методом по Швейцеру (Schweizer,1981). Сравнительный анализ закономерностей хромосомной конденсации от профазы к поздней метафазё выполняли в соответствии с процедурами,предложенными Друи и др.№ои1п, Lemleüx, 1988;Drouln et al.,1991).B экспериментах по гибридизации ДНК-ДНК In situ в качестве зондов.были использованы .следующие последовательности: 1) плазмида.puR 222 с лигированной в BamHI сайте- повторяющейся последовательтельностью - 680 п.н.' бычьей.сателлитной ДНК II с плавучей плотностью-1.723 г/см3, предоставленная А.Плу-/ченичекоад (Польша)';;2) плазмида pY 53.3 - с лигировагашм. в EcoRI-

BainHI фрагментом предполагаемого тестис - определяющего гена SRY человека ( 800 п.н.), предоставленная А.Синклеаром (Англия). ДНК метилй БИ0-11-УТФ (НПО"Фермент") с помощью ник-трансляции по общепринятому методу (Маниатис и др,1984), согласно наборам.N5500, 16002 (Amersham). Гибридизацию ДНК-ДНК in situ проводили используя метод Геруардта (Gerhardt et al.,1981), с модификациями Логиновой (Логинова и др,1989). Детекцию гибридизационного сигнала . выполняли по методу Кремерса (Cremers et а1.,1987),в модификации Логиновой с использованием комплекса стрептавидин- щелочная фос-фатаза (Логинова и др.,1991). После гибридизации препараты окрашивали 3 -5Ж раствором красителя Гимза. Анализ распределения БК (биотигаишровашшх комплексов) по хромосомам проводили по микрофотографиям. Для внутрихромосомной'локализации исследуемых последовательностей ДНК использовали количественную версию цитоге-нетической карты хромосом Воз taurus (Чиряева, 1988). Анализ и фотографирование препаратов хромосом проводили с помощью микроскопа "Ollmpus АН-2". Микрофотосъемка осуществлялась на пленку Микрат 200 и 300. Статистическую обработку данных выполняли методом и согласно критерию знаков (Урбах, 1964; Лакин, 1990; Gerhardt et al.. 1981). '

4 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 3.1 .Закономерности хромосомной конденсации у Bos taurus от профазы до поздней метафазы .

Мы исследовали одну из основополагающих характеристик R и G дисков- закономерность их компактизации в митозе, т. е.. особенности

■ слияния R и G дисков по мере компактизации хромосом Воз taurus от профазы до поздней метафазы. Оказалось,что такой процесс про- ■ исходит в соответствии с. определенными правилами.' В течении ми-

■ тоза наблюдается слияние материала R и G дисков, сопровождаемое уменьшением числа R(G) районов(табл. 1). Чаще всего сливаются три соседних R-G-R диска, при атом центральный G-диск как бы исчезает, а краевые R-сегменты образуют новый большой й-район(поглотительный тип). Наблюдается и другой способ компактизации(соедини- . тельный тип) ,связанный с появлением константного R-диска при, соединении с G-диском. Встречаются и смешанные типы (табл.1).Слияние сегментов происходит в хронологическом порядке, характерном

V'jUfl1-каждой хромосомы. Каждая хромосома ¿¡одержит преимущественные зоны конденсации с постоянной локализацией, а также относительно.: стабильные диски,сохраняющиеся на протяжении профазы - метафазы.

ъ

Для количественной характеристики внутрихромосомной конденсации мы использовали индекс слияния(FI)(Drouln et al.,1991).Этот.Пара-, метр можно определить как' среднее число слиянйй между R й G■давками .неконденсированных хромосом,требующееся для выхода из данной дисковой стадии на 353 дисковый мзтафазный уровень разрешения. FI указывает на более быструю конденсацию R-дисков по сравнению c"G. Этот показатель выше для R-сегмейтовпрактически нэ всех стадйях компактизации(табл.2). Вероятно это озйачает.что по'зднореплициру-ющиеся участки хромосом (G-районы) уже на стадии профазы фактически конденсированы,а ранореплицирующиеся(Н-диски) еще нуждаются в завершении конденсации при переходе к метафазе. Было выполнено' сопоставление полученных нами'данных на хромосомах Bos taurus с уже • описанными результатами для хромосом Homo sapiens (Drouln et al.,1991).Изложенные в этой работе закономерности в основном совпадают для хромосом двух упомянутых видов. Однако, наблюдаются и некоторые отличия. Определенные участки хромосом КРС испытывают большее число слиянйй по сравнению с соответствующими районами на хромосомах'человека. Коэффициент слияния для исследованного нами вида для R и G дисков составил соответственно 1,50* 0.040 и 1.35* 0.025 (табл.2),а для человека - 1.24 и 1.08.(Drouln et al.,1991). Мы не обнаружили G дисков, не участвующих в слиянии у Bos taurus (FI = 0), доля же подобных блоков у Homo sapiens ■ значительна и достигает 51.% на стадии 850 дискоё. Яесколько различаются и способы слияния материала R и G блоков при митотической конденсации. Для хромосом человека закономерно так называемое правило слияния трех дисков и описано только четыре исключения.У Воз taurus также достаточно часто встречается такой трйплетный(поглотительвый) тип взаимодействия этих, блоков(N1,таблi 1).Вместе с тем,довольно высок процент других схем слияния материала 8 и G сегментов(табл.1).Накопленные, на хромосомах человека результаты, и наши данные для Bos taurus' позволяют йодтвердить представление-о R(G~) дисках как о независимых единицах конденсации¡По нашим данным существуют и так называемые .вариабельные диски'(Rv), обладающие' менее выраженными . свойствами R дисков'по критерию, особенностей .'слияния.Как правило,. . При сплавлении R и G -районов , G сегмент:'как .бы исчезает. Взаимодействие же Rv и G дисков мо:«ет протест:; в/ большинства случаев к по-;явлению последнего на более позднйх- стадиях ; конденсации-(табл.1; -тжш 5;6; 13). ..Однако'..возможен 'и обратный. взриантГпри'слийнии этой пары 1 (табл. 1,тип л 1). Вероятно,.. такие--вариации пр;т слня'ии Rv. и С

Таблица 1 : Закономерности слияния R ц G дисков на митотических хромосомах Bos taurus L. при. пароходе от профазы к метафазо.

Типы слияния диффоранциаль-но окрашенных хромосомных _дисков.

Доля определенных Т1шов слияния R(G) сегментов на разных стадиях конденсации"(%) при переходе

- ЛФ 1/ПЛШ1С1 nV '-ÍV4 ПФ

от уровня 353 К' уровню 560

отЗКГ к

521

от 353 К

400

1. Rt/iR - R

2.- R-i/tRt^R -.R

3. RiC-iRv - R

4. R\4¿ftRv •» Rv

5. ühRV - ('■

6. C+S^+Ü ч G

7. R+Rv+R - R B. RfRv - R

9. R+G - R

10.

11. Rv+G - R

12. Rvt/fRv - R

13. G+gVfGf^f - G

14. Ríj&R+Rv R

50.59 9.41

9.41 8.24 7.05 7.05 3.53 2.35 1.18 1.18

33.82 13.24

5.88 4.41 2.94 14.71 11.76 ' 4.41

1.47 1.47 2.94 1.47 1.47

75

25

Rv - R-вариаОельний диск.

W или ¡í -" потеря " Rv или G дисков при слиянии. Таблица 2 : Характеристика R и G дисков митотических хромосом Boa taurus L: на разных стадиях конденсации согласно индексу слияния.

Уровень ком-пактизации, (среднее значение индекса слияния ) Число R(G) дисков с соответствующим значением индекса слияния (FI).

i'I 1 1.1 - 175^ 1.52 - 2 2 - 2.5

R G R ' G R ■ G R G

353'д/г.н* ' 174 177 _ ~ — _ _ _

400 д/г.н R= 1.021± 0.001 G= 1.01 ± 0.007 183 .151 46 ' '33 - - .

521 д/г.н R= 1.66 * 0.08 G= 1.36 ± 0.05 33 35 54 125 130 92 52 ; -

560 д/Г.Н R= 1.5 ± 0.04 G= 1.35 * 0.025 15 • 13 125 244 143 9

* зьз д/г,н - ЗБЗдиска на гаплоидшЯГШШор дисков зависят от места локализации по отношению к зоне преиму1

ществонной конденсации в хромосоме, феномен взаимопревращения И и -С''сегментов по мера перехода хромосом от профазы к метафазе свидетельствует о неидентичности профазных и метофазных С(Н) дисков. Очевидно .можно лишь условно назвать метафазные й диски,включающие О районы, эквивалентами одноименных профазшх сегментов. Механизм

- '( -

слияния дисков не ясен,однако можно согласиться с канадскими учеными (Drouln et al.,1991) в том,что этот процесс сопровождается существенными изменениями в структуре хроматина на высших уровнях компактизации. Иначе ведут себя R(G) сегменты половых хромосом Воз taurus. Для обоих плеч У-хромосомы и короткого плеча Х- хромосомы практически не меняется число R(G) дисков. У-хромосома этого, йида после процедуры RBA окрашивания вообще не обнаруживает дискового рисунка в длинном плечо. Это явление косвенно указывает но "гете-рохроматичность" некоторых участков половых хромосом этого вида. Очевидно,что у Воз taurus половые хромосомы несут некоторую разновидность классических гетерохроматиновых участков, т.к. на гоно-сомах дэшгого вида не обнаружены С - диски и протяженные блоки' са-теллитной ДНК (Чиряева и др.,1990). Таким образом,существует видо-специфичность организации R(G). сегментов даже у отдельных видов млекогштающих,которую необходимо учитывать при анализе структурно-функциональной организации их'геномов.

3,2.11итогенетическое картирование хромосом Bison bison. Качественный анализ RBA - карты прометафазных хромосом бизона. С помощью RBA- метода дифференциального окрашивания- мы исследовали структурную неоднородность митотических хромосом еще одного вида Bovlnae - Bison bison. Отталкиваясь от важности G(R) рисунка как фактора структурно -функциональной организации и критерия эволюционной, изменчивости кариотипа мы рассматривали степень консерватизма картины дифференциального окрашивания у В.bison по сравнению с Bos taurus. В литературе' имеются указания но значительный консерватизм бэндинга аутосом видов Полорогих. Л X и У- хромосомы представлены как наиболее вариабельные компоненты их генома (Орлов, 1983) .Полученные нами данные частично подтверждают это положение. RBA- рисунок и маркерные диски аутосом бизона идентичны таковым КРС. Представленная нами цитогенетическая карта 'митотических хромосом В.bison по уровню разрешения примерно соответствует корте В.taurus, включающей 521- R(G) диск(Б1 Berardlno et al.,1985).Наша карта включает 491диск с учетом 31 околоцентромерного сегмента,ко- ' торые можно в большинстве случаев-рассматривать-либо как вариабельные диски (Rv),либо как G .сегменты. При-рассмотрении,результатов подсчета общего числа R и G дисков на. хромосомах В.taurus и В.bison наблюдается приблизительное соответствие, их общего числа. Поэтому нельзя исключать некоторую.-, неидентичность распределения сегментов при сопоставлери цитогецетических-карт этих.'-двух видов .

Таблица 3!Число позитивных,негативных: и вариабельных дисков, полученных на хромосомах КРС и бизона на стадиях .ранней ме'тафазы и профазы ■ ___" __

ИВА- . Воз гаигиз Ь. В130П Ыаоп

диски ранняя мета-фаза ■ . прометафаза прометафаза

число % от обще го числа Щб)диск ЧИСЛО % ЧИСЛО • % ЧИСЛО %

позитивные И+ 137 39.0 138 •35.1 • 149 26.6 168 34.3

негативные 174 47.6 257 49.3 265 47.7 217хк 44.3

С(И-)

вариабельные {IV 40 11.4 81 15.6 116 х 20.7 75 15.3

общее число дисков 351 100 521 100 560 100 491 100

х - не учитывалось 30 центромерных районов; хх - не учитывался 31 центромернный район.

(табл.3).Однако,не вызывает сомнения,что такая изменчивость крайне не значительна и это подтверждается консерватизмом И(0 рисун- ■' ка у этих видов. Выполненная нами карта содержит: 168 - -дисков (34 . 350; 75 - (15.3%); 217- С(й-)(44.3 %) и 31 й-отрицательный или Иу околоцентромерный район. Для В.Ыаоп сохраняется тенденция к преобладанию материала И сегментов ,'в.зухроматине - 49.6 %, по сравнению с 44.3$ для й сегментов, отмеченная и.для хромосом КРС (табл.3).Таким образом,у Быковых в митотических.хромосомах преобладают наиболее ; генетически информативные', ранорешшцирующиеся,: относительно богатые ГЦ .парами нуклеотвдов Н диски. X - хромосома бизона практически идентична таковой КРС. Однако, другая гоносома существенно отличается и по морфологии,и по показателю ИВА -окрашивания, а также по некоторым цитохимическим характеристикам,определяющим ее гетерохроматичность.-

-3У3.. Специфика организаций гетерохроматиновых районов ^ Быковых.

Нами были исследованы'описанные для. Воз 1аигиз.особенности распределения' гетерохромйтина по хромосомам применительно к другим ■ видам Быковых (бизон,зубр,гаял).. Оказалось!,что околоцентромерные

Таблица 4:' Распределение меченного БИ0-Т1-УТФ фрагмента бычьей

сатДНКИ по аутосомам бизона,зубра,гаяла.

суммарное число БК по аутосомам

Число БК по участкам аутосом

'чис-'ло ме-гтафаз

центромер

набл. '¿'¿2 ожид.1060.7

X2 35783.4 Р 0.001

плечи аутосом

н. 1131] о; 7291

X3 - 5205.58 Р ^ 0.001

8352

60

Т.-Г0205-

о. 1626,36 X? - 45244 Р ^ 0.001 1П ТТЖ2 о. 1678.69 X3 - 50232.025 Р ^ 0.001

"1С 2сОТ о. 11179.64 X3 - 6582

Р ^ 0.001_

1П 2356 о. 11539.31 X3 - 7307.54 Р ^ 0.001

12806

70

•13218

60

2.Y ±илУЖ-доля центромерных районов.аутосом согласно Чйряовой и др.,.1989 Н.-наблюдаемое;о

в гаплоидном наборе, -ожидаемое число БК.

Таблица 5! Распределение меченного БИ0-11-УТФ фрагмента ' бычьей

сат ДНК II по половым хромосомам диких прадбтавителей родов Воз и Bison

в сум- число ис-. X Относительная число БК 1 ха

и д марное чис - ло БК следованных мета-фазных пластинок Р 0 м 0 с. длина от гаплоидного набо- » ра, % * н ' а б л. 0 !К и д.

Й 8397 60 X 5.32 * 0.097 36 223.36 156.32

S У 1.77 ^ 0.070 ■ 5 74.31 63.71

f 12916 70 X У 5.32 * 0.097 1.77 * 0.070 104 . б 687.13 228.61 494.02 215.79

п й 13254 60 X 5.32 ± 0.097 28 705.11 649.26

I У 1.77 *'0.070" 8 234.59 217.9

районы всех .пар аутосом у исследуемых нами' видов содержат четкие и-диски.Зто касается и единственной §субметацентрич'еской пари хромосом гаяла ИЬ2/27.Интересно,что при таком слиянии теряется большая часть прицвнтромерного геТерохроматина, поэтому для этой маркерной аутосомы Воз ГгопгёаИа характерно небольшое,по сравнению с другими акроцентрическими аутосомами,количество материала с-диска. Результаты,полученные нами, после обработки препаратов ГЦ - специфичным ХМАэ+ фдуорохрсмом только подтверждают получение ранее с ггомощьы С - метода данные об обогащенности ГЦ параш нуклеотидов гетерохроматжа у всех этих видов. Мы такхэ исследовали распредо*

- ju -

лонио сйт ДНК II в геноме диких видов Быков.Для ее локализации мы использовали неизотопный вариант гибридизации In situ с применением дифференциального окрашивания хромосом (RBA- метод).Как следует из полученных донных (табл.4) этот сателлит локализуется в прицентромерном геторохроматине аутосом у всех трех исследованных видов. Ни у одного из видов но обнаружено аутосом с достоверным отсутствием гибридизации. Сроднее число немечешшх аутосом на пластинку для бизона- 8.3 * 0.76; для'зубра - 7.06 * 0.86;гаяла -9.92 1.15,скорее говорит не об отсутствии этого сателлита в ау-тосокпх, а о существовании количественных различий в содержании сат ДНК II в прицентромерных районах аутосом.Это подтверждается и фактом отсутствия какой-либо определенной помеченной пары аутосом при совмещении процедуры дифференциального окрашивания и гибридизации In situ.В пользу такого предположения говорят и результаты, полученные на препаратах гаяла.Обращает на себя внимание довольно высокий процент встречаемости намеченной пары аутосом Rb2/27(66.6 Ж). Объяснение этому феномену кроется в потере большей части при-центроморного гетер,охроматина при центрическом слиянии во время образования метацентричоской аутосомы Rb2/27(см.стр.8). Таким об-• разом,в случае сатДНК II наблюдается существенный консерватизм ее хромосомного распределения у Быковых, согласно критерию in situ гибридизации. Можно предположить, что изменения для этой фракции при дивергенции видов Bos taurus.Bos frontalis.Bison bison,Bison bonasus .рыли не значительны. Полученные нами данные подтвердили закономерность постоянства локализации гетерохроматина у Быков -довольно редкое явление для млекопитающих.

З.л. Анализ половых хромосом по цитохимическим и молекулярным

критериям.

' Еще один тип хромосомного полиморфизма,возможно, способствующий кариотипической эволюции -это полиморфизм гоносом. Результаты на-ш'лх исследований в целом ' согласуются с описашшми в литературе закономерностями. Х-хромосома изученных нами видов имеет одинаковую морфологию и относительные размеры.Эта гоносома у бизона,зубра, гэяла соответствует таковой КРС, т.е. она субметацентрик, RBA-рисунок у всех четырех видов одинаков. Она не несет цитохимически выявляемого гетерохроматина (табл 6) и. не-имеет значительных блоков с?тДНКН( табл.5). В отличии от Х-хромосомы У-хромосома рассмотрении! вздов различается по чисто морфологическим критериям, B.taurus и В.frontalis, имеют субметацентрнческую хромосому, B.bl-

son - акроиентрическую.В.Ьопазиз -субметацентрическую.нооущув редуцированные р-плечи. Отличаются они и по содержании разных типов гетерохроматина. Классический С-метод не выявляет в У -хромосомах четких С-блоков,сравнимых с околоцентроморнши районами аутоеом у всех трех исследуемых нами видов. Вместе с тем У-хрсмосома бизона содержит слабо выявляемый С-методом материал, 84% таких акроцепт-рических гоносом практически целиком окрашиваются несколько томнее плеч аутосом(табл.б).Частота и степень окрашипаемооти с-м&то-дом У-хромосомы зубра н гаяла ниже,чем у бизона и составляет Y7.1 % и 62.2 % соответственно. Можно предположить,что в данном случае мы наблюдаем какую-то специфику организации У -хромосом исследуемых видов,некую особую разновидность гетерохроматина. Следует еще раз особо подчеркнуть тот факт, что половые хромосомы Воз taurus не содержат тандемшх блоков многократных повторов - непременную молекулярную составляющую классического конститутивного гетеро-хрсматкна (Чиряева,1988; Чиряева и др.,1990). Наши результаты по гибридизации In situ с сатДККП подтверждают это положение (табл. 5), т.о. половые хромосомы бизона, зубра,гаяла не содержат сайтов гшзридизеш.к с сат ДКК II. С помощью RBA - метода нами обнаружены отличия У - хромосом сизоиа и КРС (pact). Срзвнивая АЗА-рисунки и морфологическое строение вып:е указанных хромосом, ксжио провести аналогию со способом образования акроцентрическлх У - хромосом у Bos Indlcus и Bubalua,согласно Иануззи и Ди БерардшюС1ага.:^й1,DI Berarvllno, 1987). Вероятное всего,что акроцоптричаска.ч У-хромосомя бизона образовалась путем отрь'ва теломорного участка хромосомы общего предка (схожей по строению с У -хромосомой КРС ) и присоединения этого участка к большему q-плечу с инверсией.

Таким образом, наиболее изменчивым элементом кариотнпа у Bovina g можно считать У-хромосому.Эта хромосома у большинства видов Быковых проявляет необычные молекулярные' характеристики.Ее нельзя назвать образцом классического гатерохроматина (согласно критерию интенсивности С- окрашивания,обогащенности многократны™ повторами). Она обладаот некими его "промежуточными" характеристиками, которые я разной степени выражены у исследуемых наш объектов. 3.4.1. Локализация тестис-определяющего фактора SRY (человека)

М хромосомах Bison bison. ■ SRY-ключовоД ген р системе первичной детерминации 'пола у челово ■ ка, мыши и, очевидно других видов млекопитающих. Он локализован в. геноме человека недалеко от псевдоаутосомалыюй области в районе

Таблица б! Распределение С-дисков в Х-хромосоме и типы С-окрас-ки в У-хромосоме у диких представителей подсемейства Bovlnaa

Вид ' Х-хромосома ' У-хромосома

% хромосом, имею ¡¡mx участки ,по-добныеСд красящиеся районы, % типы с-окраскид

прицент-ромерный р-он Р-пле чи . q- пле чи р; q светлее Одисков аутосом как плечи аутосом на плечах, более тем-ноокрашен. участки

Bison bison 21.0 * 0.052 70.5 0.113 29.4 i 0.11 84.2 * 0.040, 11.0* 0,035 4.8 ± 0.026

Bison bona-sug 13.5 ± 0.087 .40.0 * 0.080 - 60 * 0.08 - 77.1 * 0.062 17.1* 0.065 5.7 * 0.039

Воз frontalis 22.0 * 0.057 46.1 * .0.112 15.4 л 0.08 23 ± 0.09 15 0.1 62.2 * 0.063 6.6 0.031 26.2 * ' 0.065

Рисунок 1! Предполагаемая схема • образования акроцентрической У-хрбмосомы бизона • , • .

1 -2 ■

р i_rL..rT - \ /Л / \ I / -■■и q \ 1 г > / \

q U ■1 Ы и р'

Boa tauru3 L. Bison bison

1.отрыв теломерного участка(а.в) на р-плече У-хромосомы Bos taurus

2.инверсия с участием р-плеча(в.а) .образование акроцентрической У-

хромосомн Bison bison. . ■ ;

Ш У-хромйсомы.Амино-кислотНая последовательность, им кодируемая высококонсервативна и обнаруживает связь о гетерогамегным полом у всех исследованных видов млекопитающих. .Результаты гибридизации, проведенной при более мягких условиях, предполагают существование родственных аутосомальных или X -хромосомных последовательностей. Активизацию гена SRY можно рассматривать, как первую ступень в каскаде генетических событий,которые приведут к формированию тести-сов(Sinclair et al.,1990;Goodiellow,Lovell-Badge,1993). Поскольку ген SRY (sex-determlng region of the Y-chromosome) связан с половыми хромосомами.возник вопрос о его локализации у представителой изучаемого нами семейства.Полученные предварительные .данные говорят о существовании гомологичных этому гену последовательностей и на X и на У- хромосомах бизона.На Х-хромосоме нами обнаружено два района предположительной локализации один-в коротком р-плече(р21-12;Х2-10.86;Р^0.01).другой в длинном q21-23.5;Xa -5.21 ;Рг 0.05).. На У- хромосома один район в теломерной зоне, соответствующей R+ дискам(21- 22.3;Ха - 68; Р <£. 0.001)(рис 2). Отметил.что если справедлива предложенная нами схема происхождения У-хромосомы бизона, то ген гомолог SRY у Воз taums должен располагаться в соответствующем районе бе короткого плеча.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наша работа посвящена изучению хромосом в подсемействе Bovlnae, соответствию их цитогенетйческих особенностей основополагающим принципам структурно - функциональной организации хромосом теплокровных, которые связывают с R(G) рисунком.Нас интересовала и возможность существования более тонких цитоганетичвеких различий в связи с дивергенцией видов,входящих в семейство,отличающееся высоким консерватизмом генома (Орлов,1983;Halnan,1989). Исследовалась одна из основополагающих характеристик R и G блоков - закономерность их компактизации в митозе.Оказалось,что для 'хромосом B.taurus характерны теже закономерности,которые ранее были описаны для Homo sapiens(Drouln et al.,1991).Т.q.материал Идисков,который рано реплицируется и обогащен ГЦ парами оснований,значительно менее компвктизирован в профазо - метафазе по сравнению с относительно поздаореплицирующимися в S фазе G дисками.Некоторые G блоки уже в профазе практически полностью компактизированы. Можно предполагать, что эта их особенность предопределяет меньшую концентрацию генов в этих участках генома (Craig,Blckmore, 1992; Suniner et al., !993). Вместе с тем для хромосом Boa taurua выявлен целый ряд от-

. - .14 -

личитальных- особенностей компактизации .включающих наличие не встречающихся в митозе у человека сложных вариантов "слияния" R блоков,большее число слияний на средний R или вдаск,четкое проявление "слабых" вариабельных R дисков.Нужно также отметить относительно меньшие различия , по параметрам слияния( Н-коэффицие.нт )меж-ду R и G дисками по сравнению с тенденциями,отмеченными на хромосомах человека (соответственно 10 % и Ш). Последняя особенность хромосом КРС-недавно нашла подтверждение при оценке ' внутрихромо-ссмиой локализации Alu повторов. У этого вида (также как и у Ovis ovis) не обнаружено предпочтительного местоположения этих богатых AT парами оснований коротких инторсперсных повторов в Слисках-как ранее было описано для человека и'мыши ( RaJcan-Separovlc.Sabour, 1993).Таким образом,существует видоспецифичность организации R(G) сегментов даже у отдельных видов млекопитающих, которую необходимо учитывать при анализе структурно-функциональной организации их геномов.К такой специфике можно отнести и существенно больший размер отдельного R и. G диска на хромосомах Bos taurus(4HpfleBa и др., 1989)' или Bison blsön по сравнению с Homo sapiens на прометафаз-ных хромосомах С соответственно около 12.6 -8.4 хЮ3т.п.н. и 3.2 -5.8 к Юэт.п.н.). Создавая цитогенетическую карту хромосом Bison bison,изучая закономерности'распределения гетерохроматина и локализацию нуклэотидных блоков по хромосомам.бизона,зубра,гаяла нами исследовались возможные кариологические составляющие репродуктивной изоляции у этих видов. Считается,что именно хромосомные перестройки сопровождают До-98 % случаев видообразования(Ш1е,1978). однако,у Быков лииь для гаяла выявлена Робортсоновская транслока-.ция Rb(2/27), опосредованная потерей гетерохроматина. У бизона и зубра на. найдено каких -либо принципиальных отличий при сравнении с каолотшюм Воз 1аиги$.Цитогейетиче'ские карты прометафазных хро-. мосом Bos taurus и Bison bison оказались практически идентичными. Все исследованные виды обладают полностью тождественным распреде- ' лэниеМ гетерохроматина по.аутосомам и-Х-хромосомам и сходной степенью его «Зогащенности сателлитной ДНК11. Кариотищческие различи между хромосомными'наборами использованных нами видов касеют- . с;.! /ада, морфологии и степени гетерохроматичности У-хромосомы.Следовательно, видообразование у Быковых не сопровождается значительными карйот1Щйчест№ ИзмеНешта1, Это один из сравнительно редких. ;случаев, описанных Например для мышей рода Mus (Bauchau'et al., 1990;Nance et al., 19?0). и дрозефил группы mslano§iflter(],eiriGunler',

Asburner,1976, 1984). Кариологическая составляющая репродуктивной изоляции в этом случае связана с "тонкими" изменениями в геноме, которые цитологически затрагивают У-хромосому. Тагам образом, исследование цитогенетики представителей рода Воз имеет далеко не "частное значение" и может помимо решения конкретных практических задач.генетики и разведения КРС,помочь-решению вопросов связанных с исследованием принципов структурно - функциональной организации хромосом эукариот.

ВЫВОДЫ

ЦТолученц данные о закономерностях слияния материала R и G дисков в митозе у Воз taurus,свидетельствующие об относительно-полной конденсации материала G дисков и их болед медленной компактизацип в профазе-метафазе.Показано,что материал R(G)дисков хромосом этого вида испытывает большее число слияний и подчиняется несколько отличающимся правилам по сравнению с Homo, sapiens. ^Построена цитогенетическая карта высокого уровня разрешения хромосом В.bison ( 491даск на гаплоидный набор ). Сопоставление ее с картой В.taurus(560, 521диск на гаплоидный набор) выявило соответствие RBA рисунка и маркерных дисков аутосом. ЗДна;шз распределения гетерохроматина на ' хромосомах £яда родст-вб1иых видов (бизон, зубр, гаял) показал,что межвидовых различий в распределении гетерохроматина не обнаруживается и наблюдается соответствие распределения гетрохроматина с таковым у КРС. Е; ¡явлена существенная однородность гетерохроматина аутосом, его обогащен-ность ГЦ- пара?я нуклеотидов.

^Методом гибридизации in situ изучено распределение по хромосомам диких видов л/сеч Bovldaé (бизона,зубра,гаяла) клонированных Фрагментов бычьей сателлитной ДНКП (1.723г/см3). Установлено, что его распределение консервативно- сателлит.преимущественно локализуется в прицентромерных районах аутосом,что соответствует специфике распределения дтих блоков нуклеотидов у КРС. ' . . б^Анализ с помощью йВА-метода,С-окраски,Шз-процбдуры,1г> situ гиб« ридизации с са-тДНКИ половых хромосом показал, что Х-хромосомы бизона, зубра, гаяла соответствуют таковой КРС, являются субмэтацент-рчками, не имеют-цитологически регистрируемого гетерохроматина, по несут значительных блоков сат ДНКП,обладают сходным RBA-рисунком. бЛ1оказано,что v-хромооома исследованных видов является единственным существенны.-,! элементом кариотипов Виковых, различающимся по мор-фологичоеким критериям.Предполагается,что ara акроцентричвекад

• - 16 -

гоносома бизона образовалась с помощью транслокации теломерного участка короткого точа соответствующей хромосомы КРС. Материал У-хромосомы у разных видов обладает разной степенью гетерохроматич-ности по критерию С-окрашивания.не содержит блоков сатДНК.что указывает на особый характер эволюции этого элемента кариотипа у Бы- . ковых. '

^Согласно результатам гибридизации In eltu у бизона существуют X. и У хромосомные блоки нуклеотидов,гомологичные гену тестис определяющему фактору SRY.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: .

1.В.В.Треус Кариотин бизона(В1зоп bison),его сравнение с кариоти-псм крупного рогатого скота (Воз taurus L.) // Бюллетень ВНИИГРЖ.-1993.-Вып.137.- С.48-50. -

2.В.В.Троус,Н.И.Ясиноцкая Гетерохроматиновые участки митотических хромосом некоторых представителей семейства Bovlnaè(зубр.бизон,га-ял) и их сравнение с таковыми крупного рогатого скота // Бюллетень ВНИИГРЖ.-1993.-Вып.137.-С.51-54.

3.Треус В.В.,Чиряева 0.Г..Логинова Ю.А..Смирнов А.Ф.Количественная характеристика.онтогенетической карты митотических хромосом Bos taurus L.// Сб.Молекулярно-генетические маркеры животных.Киев,"Аграрная наука".-1994.-С. 119

'4.В.А.Павлова,В.В.Треус,Н.И.Ясинецкая,Е.П.Стекленев,M.К.Слепцов,А. Ф.Смирнов Особенности эволюционной изменчивости сателлитных ДНК и гетерохроматиновых районов у быковых // Сб. Молекулярно-генетичес-кие маркеры животных. Киев ¡"Аграрные науки".-1994.-С._117 S.Smlrnov A.F..Bosak. N.P.,Erimov A.M..Loglnova J.A..Derusheva S.E..Chlryaeva 0.G.,Treu3 V.V..Smaragdov M.G.,Pavlova V.A.,Kozakov V.K.,Cliurftlna I.V..Zakarova J.V..Geneilc mapping and marking pi animal genomes // Anlm.Scl.Paper a Rep.-1993.-Vol.11.- P.99-102.

РТП,Тип.Вй?.Зак.24B;Тлр.100, 30.05.94. .