Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение геномного полиморфизма представителей подсемейства Bovinae

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение геномного полиморфизма представителей подсемейства Bovinae"

На правах рукописи

УДК 575.22:599.735 „.„„^

■С

ргв ОД I

2 0 НОЯ - ^

ВАСИЛЬЕВ ВАСИЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПОДСЕМЕЙСТВА ВОУШАЕ

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории организации генома Института биологии гена РЛН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН А.П. Рысков

кандидат биологических наук С.К. Семенова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАН Л.И. Корочкин доктор биологических наук Г.Е. Сулимова

Ведущая организация: Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Севердова

Защита состоится «,..С2....» декабря 2000 года в ............ часов на заседании

Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 34/5.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 32.

Автореферат разослан «...§....» ноября 2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета канд.фарм.наук аь,/? (7 Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение геномной вариабельности различных таксономических групп животных представляет одно из важных направлений современной биологии. Ключевым моментом является поиск и характеристика полиморфных ДНК, которые могут быть использовапы для маркирования и анализа генофондов, для выявления уровней геномной дивергенции, установления родственных и филогенетических связей в процессе микро- и макроэволюции (Рысков 1999). В последнее время для изучения генетического разпообразия широко используется технологии ДНК-фингерпринтинга и RAPD PCR анализа, поскольку выявляемые при этом геномные • маркеры (гипервариабельные мини- и микросателлиты), или анонимные локусы являются чувствительными индикаторами геномного полиморфизма (Jeffreys et.al., 1985; Wayne et.al., 1991; Hillis et.al., 1994).

Молекулярное маркирование генома Бычьих (Bovidae) несмотря на большое число исследований, остается весьма актуальным в теоретическом и практическом плане, поскольку получение новых молекулярных маркеров позволяет эффективно решать вопросы, связанные с выделением нужных генов, поиска ассоциаций с количественными признаками, паспортизацией отдельных особей и дифференциацией отдельных популяций и видов. В настоящее время не существует единой точки зрения на происхождение подсемейства Быков {Bovidae). Классическая систематика выделяет внутри подсемейства два рода - род Bison, состоящий из двух видов - европейского зубра и американского бизона (B.bonasus и B.bison), и род Bus, включающий в себя домашнюю корову (B.taurus), бантенга (B.javanicus), гаяла (B.gaurus) и яка (B.mutus) (Bohlken Н. 1958;Groves 1981;Соколов 1979). Многие из этих животных существуют в настоящее время в виде диких видов и одомашненных форм, что значительно затрудняет выяснение филогенетических связей внутри данного подсемейства.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования является изучение геномной вариабельности представителей подсемейства Быков на разных иерархических уровнях организации.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи: 1) Провести поиск новых молекулярно-генетических маркеров для изучения геномного полиморфизма представителей подсемейства Быков (мини- и м и кросателлитныс, RAPD-маркеры).

2) Оценить пригодность маркеров различного типа для выявления геномной вариабельности на разных иерархических уровнях организации представителей подсемейства Быков (семейном, внутри- и межпородном, межвидовом).

3) Оценить степень генетической изменчивости на внутри- и межпородном уровнях для крупного рогатого скота, и иопуляционном для зубров и бизонов.

4) По данным мультилокусного маркирования генома Бычьих построить дендрограммы генетического сходства и филогенетического родства исследованных видов.

Научная новизна и практическое значение работы. Представители подсемейства Быков составляют широко распространенную группу животных, интенсивно используемых человеком в своей практической деятельности. Не смотря на значительную морфологическую дифференциацию, для всех видов Быков характерно постоянное число хромосом 2п=б0 (за исключением гаяла, 2п=58). Такое морфологическое разнообразие при постоянстве хромосомного набора делает эту группу одной из наиболее интересных для изучения вопросов, связанных с геномной дивергенцией и сопоставлением скоростей морфологической и генетической дифференциации. Подсемейство Быков - относительно молодое, так как почти все виды могут скрещиваться между собой и давать потомство. Эта особенность группы используется в селекционной практике для выведения более совершенных и высокопродуктивных пород сельскохозяйственных животных путем скрещивания домашних животных с их дикими сородичами. Большое научное и практическое значение имеют работы по скрещиванию крупного рогатого скота с зебу, яком, зубром, бизоном, бантенгом и гаялом (Стекленев и др., 1969,1992).

Сохранение и воспроизводство редких и исчезающих видов диких животных, таких как зубр, а также аборигенных пород крупного рогатого скота, как носителей хозяйственно значимых признаков, является одной из актуальных задач современной биологии. Для сохранения генофонда этих животных необходимо выявление производителей для оптимального подбора родительских пар при разведении. Поэтому геномная паспортизация животных становится важнейшей компонентой всей дальнейшей работы по восстановлению поголовья и его реинтродукции в природу.

В настоящем исследовании мы приводим результаты изучения геномной вариабельности представителей подсемейства Быков на разных иерархических уровнях организации. Мы использовали как стандартные, ранее описанные мультилокусные маркеры, так и получили ряд новых маркеров.

Для выяснения характера наследования маркеров разных типов и установления особенностей внутри и межпопуляционной изменчивости нами изучены разные виды Быков, разводимые в неволе на территории России и Украины. Помимо пород домашней коровы, стад зубра и бизона, мы исследовали отдельных представителей другах видов Быков, распространенных в юго-восточной Азии и Африке, а также несколько межвидовых (межродовых) гибридов. Этот материал послужил источником для установления филогенетических связей среди Быков.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международном совещании "Состояние териофауны в России и ближнем зарубежье" (Москва, 1995), XXV международной конференции по генетике животных (Франция, 1996), международной конференции по ДНК технологиям (Киев, 1997), XV рабочем совещании "Консервация генетических ресурсов" (Пущино-на-Оке, 1998), международной конференции "Изучение и охрана разнообразия фауны, флоры и основных экосистем Евразии" (Москва, 1999), II съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура п объем работы. Диссертация изложена на . .f^P.. страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Список литературы включает в себя источника. Работа проиллюстрирована

...??./..... рисунком и ....^....таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материал в виде образцов крови собран у 74 особей КРС (Bos taurus) следующих пород: черно-пестрая, голштин-фризская, холмогорская, серая украинская. Кроме того, были проанализированы ДНК отдельных представителей 7 видов, принадлежащих к двум родам Bos и Bison: бантенга (Bos javanicus), гаяла {Bos gaurus), ватусси (Bos macroceros), зебу (Bos indicus), яка (Bos mutus), бизона (Bison

bison) и зубра (Bison bonasus) (n=28), и десять межвидовых и межродовых гибридных потомков разных поколений.

Выделение ядерной ДНК, обработку рестриктазами, элекгрофоретическое фракционирование, перенос на фильтры и гибридизацию с мечеными зондами проводили стандартными методами. Реакция амплификации со случайными праймерами осуществляли в 25 мкл смеси при следующих температурных условиях -94°С (4 мин.), 35 циклов (94°С - 1 мин., 40°С - 1 мин., 72°С - 2 мин.); 72°С (10 мин.). В качестве случайных праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды следующего состава: П17 (5'-GACCGCTTGT-3'), П45 (S'-GCCGTCCGAG -3') и П29 (5'-CCGGCCTTAC-3').

Для статистической обработки дня каждого фингерпринтинга или RAPD-спектра составляли бинарные матрицы (присутствие - отсутствие фрагмента определенной длины), на основании которых рассчитывали среднее число фрагментов (N), долю полиморфных локусов (Р), среднее генное разнообразие (Н), попарное (S) и групповое сходство (APS). На основании значений S и-APS методом многомерного кластерного анализа (UPGMA) строили дендро граммы генетического сходства (NTSYS). Кладограимы, отражающие филогенетическое родство, конструировали методом "максимальной экономии" (PHYLIP).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация условий мультилокусного маркирования генома представителей подсемейства Bovinae.

С целью выявления оптимальных вариантов ДНК-фингерпринтинга для анализа генома представителей Быков была проведена серия блот-гибридизациошшх экспериментов. Протестированы несколько мини- и микросателлитных зондов (ДНК фага М 13 или химически синтезированных олигонуклеотиды) и набор рестрикционных эндонуклеаз. В результате, для проведения мультилокусного маркирования генома представителей подсемейства Bovinae с пробой М13 ДНК была выбрана рестриктаза Нае 1П, дающая наиболее полиморфный спектр с эффективной зоной разделения фрагментов в пределах 23,0 -1,8 т.п.н..

Для выявления оптимальных вариантов ДНК-фингерпринтинга были также апробированы олигонуклеотиды: (TTAGGG)4, (GGTGG)4, (GACA)4, (САС)5. В результате был отобран теломерный зонд (TTAGGG)4, дающий гибридизационные спектры, сильно отличающиеся от зонда М13. Эффективная зона разделения

фрагментов для него лежала в интервале 9.0 - 1.5 т.п.н. Существенно, что теломерный зонд ранее для анализа генома КРС не использовался. Картины распределения фрагментов по каждому из двух зондов (М13 и теломерного) не перекрываются, что свидетельствует о несцепленности, независимости наследования двух групп выявляемых локусов. При сопоставлении спектров, полученных с помощью двух зондов, очевидно, что ДНК фага М13 позволяет детектировать значительно большее (в 2-4 раза) число фрагментов, чем (ТТАОСЮЬ. Др>гие тестированные зонды на картинах блот-гибридизапии выявляли сложным снекгр с множеством полос (>50), что затрудняло правильное детектирование и сравнение спектров.

Для выявления 11АРО-полиморфизма Быков было протестировано более пятнадцати праймеров, различающихся по нуклеотидному составу, ОС-содержанию и размеру. Было отобрано три праймера (П29, П45 и П17), которые оказались наиболее информативными при дифференциации отдельных особей, популяций и видов представителей подсемейства Быков. Каждый праймер дает свою специфическую картину амплифицированных фрагментов ДНК. Число полос в ЯДРО-спектрах для различных праймеров у исследованных видов колеблегся в пределах от 10 до 25.

Изменчивости мини- и микросателлитиых маркеров в семейном аналше.

Для выявления характера наследования минисателлитнмх (МП) и теломерных маркеров нами были обследованы лесягь семей, состоящих и! родителей и одного потомка. Были исследованы чистопородные семьи ю.шпино-фризской и холмогорской породы, а также межпородные семьи (быки - голшгшю-фризской, а коровы - холмогорской породы). Для простоты изложения далее чти породы будут называться - голштинами и холмогорами. На рисунке 1 представлены спектры распределения минисателлитов М13 среди родителей и потомков в нескольких чистопородных и межпородных семья. Сравнительный анализ потомков с родителями по минисателлитному маркеру свидетельствует о том, что гююмок наследует все свои фрагменты (локусы) либо от отца, либо от матери. Ни и одной из семей не обнаружено появление новых "неродительских" локусов у потомков, та исключением семьи СЮ. Анализ распределения фрагментов у отца, матери и потомка в этой семье может указывать на ошибочное указание отцовства в племенных книгах.

В случае различий между отцом и матерью (по наличию или огсуктвшо фрагмента определенной длины) можно определить вклад каждого из родителей в

генотип потомка. Для семей голштинов обнаружен равный вклад каждого из родителей в генотип иотомка, а для семей холмогор в среднем вклад матери выше, чем вклад отца (42,8% и 21,4% соответственно), а в межпородных семьях у потомков наблюдается некоторое преимущественно наследование отцовских фрагментов перед материнскими. Малое число семей и малое число независимых (неродственных) производителей не позволяют нам провести детальный анализ возможных причин влияния генотипа родителей на генотип потомства. Тем не менее, на основании проведенных сравнений можно определять отцовство или материнство для каждой семьи, и это подтверждается записями в племенных книгах. Теломерный маркер также оказался пригодным для этих целей.

С6 С1 С2 СЗ С 4 С5

м "Г Т" т

23,1 -

9,4 -

23_ ö0©ee®i£

2,0 —

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 11

Рисунок 1. Наследование минисателлитных маркеров (ДНК фага М13) в чистопородных (дор 1-6, 12-17) и межпородных (дор. 7-11) семьях КРС. Обозначения : О - . и г7 голтштины (Калужская обл.) . - $ и с? холмогоры (Московская обл.), О,И - ; и межпородные (Московская обл.).

Внутрипородиая и межпородная изменчивость КРС.

Для описания внутрипородной изменчивости и выяснения диагностической возможности разных типов маркеров применяли варианты ДНК-фингерпринтинга с использованием в качестве зондов ДНК фага М13 и синтетического олигонуклеотида (TTAGGG)4, а также RAPD PCR с тремя случайными праймерами.

На рисунках 2, 3. представлены образцы спектров гипервариабельных фрагментов представителей разных пород крупного рогатого скота с использованием

тип 23,1 —

9,4 —

6,2 —

123456789 101112131415161718 19

Рис.2 ДНК-фингерпринзинг разных пород КРС, полученный при использовании в качестве зонда ДНК фага М13. ДНК гидролизовали рестркктазон Нас 111. дор. 1 - черно-пестрая порода; дор. 2-5 - голштино-фризская порола (Татарстан); дор. 6-9 - голштино-фризская порода (Московская обл.); дор. 9 - холмогорская порода (Московская обл.): дор. 10 -холмогорская порода (Калужская обл.); дор. 11-19 - серая украинская порода.

Рис.3 ДНК-фингерпрингинг холмогорской породы (Коми) (дор. 1-4) и серой украинской породы (дор-5-14), полученный при использовании зонда (TTAGGG)(. ДНК гидролизовали рестриктазой Мае III.

в качестве зондов ДНК фага М13 и теломерного олигонуклеотида (TTAGGG),). Основные характеристики этих спектров описаны выше.

В табл.1, обобщены данные для популяции серого украинского скота (СУСа), а также голштино-фризской популяции из Татарстана и холмогорских популяций из Коми и Калужской области, по вариабельности числа минисателлитных и теломерных фрагментов и даны оценки внутригруппового сходства, гетерозиготности и полиморфизма по каждому из зондов. При сравнении вариабельности минисателлитных фрагментов разной длины (на примере СУСа) оказалось, что идентификацию отдельных особей и дифференциацию популяции лучше проводить с помощью средних и коротких минисателлитных фрагментов. Так наибольшее число выявляемых фрагментов (N=13,75) находится в зоне от 4,2 до 2,0 т.п.н. В зоне (8.0 - 4.0 т.п.н.) число детектируемых фрагментов значительно меньше и составляет N=4.00, а наименьшее число фрагментов выявляется в высокомолекулярной зоне (23.0 - 8.0 т.п.н.), где N=2.00 (р<0,01). Всс зоны отличаются также и по числу полиморфных и мономорфных фрагментов, причем наибольшее число полиморфных локусов найдено в зоне 8.0 - 4.0. Аналогичные закономерности наблюдаются и при анализе ДНК-фингерпринтов других пород.

Таблица 1 .Генетический полиморфизм и оценка генетического разнообразия в популяциях Bos taurus, полученные на основе анализа вариабельности минисателлитных (М13) и теломерных (TTAGGG)4 маркеров.

Породы и популяции Маркер N ■ (ст. откл.) APS (ст. откл.) н Р

Гэлштино-фризская (Татарстан) М13 17,600 (0,980) 0,584 (0,080) 0,508 0,610

Холмогорская (Коми) М13 19,870 (1,320) 0,410 (0,100) 0,578 0,711

(TTAGGG), 8,547 (1,158) 0,290 (0,080) 0,715 0,816

Холмогорская (Калужская обл.) М13 18,930 0,521 (0,095) 0,480 0,632

(TTAGGG)4 7,903 (1,210) 0,263 (0,071) 0,735 0,719

Серый украинский скот М13 19,750 (1,982) 0,492 (0,105) 0,514 0,744

(TTAGGG)4 9,429 (2,070) 0,300 (0,096) 0,666 0,824

Графическим отображением взаимосвязей между отдельными представителями стада СУС могут служить дендрограммы генетического сходства (рис.4), построенные на основании коэффициентов S для минисателлитных (А), теломерных (Б), и суммы маркеров (В). Топология деревьев имеет много общего, при использовании разных маркеров изменяется лишь характер и уровень объединения отдельных особей.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО ОЛ 0-25 050 0.75 1Л0 I_I_I_1_I

3

4

5

Рис.4. Дендрограммы генетического сходства между представителями СУСа, рассчитанные на основе вариабельности минисателлитов (А) и теломерных маркеров (Б), суммы минисателлитных и теломерных маркеров (В).

ДНК различных пород КРС изучали также с помощью RAPD-маркеров. На рис.5 представлены RAPD-спектры, полученные с помощью трех праймеров - П45 А), 1117 (Б) и П29 (В) для нескольких пород КРС: серого украинского скота, голштино-фризской (Татарстал) и холмогорской (Коми) популяций, а также для популяции зубра, бизона и других видов Быков. Каждый из трех праймеров детектируют у всех КРС от 12 до 26 четких фрагментов размером 200-1500 п.н., а число фрагментов суммарного спектра достигает 84.

X. 1 2 3 4 5 6 7 ! 91011 12131415161718 L

Рис.5 RAPD-снектры представителей двух родов Во.* и Лион, полученные с помощью ipes праймеров- П45 (А), Г117(Б) и Г129 (В). СУС (А - 7-9; Б - 14-21; В- 19-22). холмотры (I, 22-23), гшшпинм(Б- 18), зебу (Л - 12,13; Б - 13,14; В - 13-14), вагусси (Л 10. 1 > 16; Н 16), бантенг (Л -14,16; Б - 15; В - 15), гаяя (А - 11,15; Б - 17; В - 17), як (А 18. I. 12; В 12). зубр (А - 1-3; Б - 8-1 1; В - 8-1 1). бизон (Л - 4-6; Б - 1-6, В - 1-7,15). |„ М маркеры молекулярного веса.

В табл.2 приводятся оценки уровня внутри породной изменчивое i и серою украинского скота, а также голштино-фризской популяции из 'кипрским и .холмогорских популяций из Коми и Калужской области, выявляемые при

использовании каждого из трех праймеров. Две выборки - голштинской и холмогорской (Коми) популяций, характеризуются практически полной идентичностью КАРО-спектров всех особей.

Таблица 2 Генетический полиморфизм и оценка генетического разнообразия в популяциях Hos laurus, полученные на основе анализа вариабельности RAPD-маркеров при использовании трех праймеров (1129, П45, П17).

Порода Праймер N (ст. откл.) APS (ст. откл.) Н Р

Серая украинская П29 13,750 (1,500) 0,738 (0,062) 0,278 0,510

П45 14,750 (1,893) 0,860 (0,071) 0,103 0.160

П17 15,000 (1,826) 0,807 (0,090) 0,194 0.357

X 42,500 (1,740) 0.808 (0,085) 0,199 0.372

Голштино-фрн!ская П29, П45 12 (0) 1.0 0 0

Холмогорская П29 12 (0) 1.0 0 0

1145 14,1 (0,540) 0.950 0,02 0.05

В стаде СУСа детектировано большее число полиморфных локусов. однако, их незначительная вариабельность при относительно небольшом среднем числе фрагментов определила низкий размах изменчивости коэффициентов внутри группового генетического сходства исследованных популяций (0.738 до 0.860 в зависимости от используемого праймера).

Эти закономерности нашли свое отражение на дсндрограммах, построенных па основании спектров, характерных для каждого из трех праймеров (данные не приводятся) и на основании суммарного спектра (Рис.6).

Более детальный анализ межпородной изменчивости был проведен нами с помощью минисателлитного М13 и теломерных зондов. На рис.7 приведены лендрограчмы, отражающие генетическое сходство особей трех пород - СУСа. холмогор из Коми и Калужской области и голштин из Татарстана, полученная при

0.75

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО

Q£8

Ii»

2 8

3

4

3 6 7

Рис.6 Дендрограмма генетического сходства между представителями СУСа, рассчитанная на основе вариабельности RAPD-маркеров. Нумерация животных соответствует рис.4.

использовании в качестве зонда ДНК фага М13 (А) и тсломерного повтора (TTAGGG), (Б). Очевидно, что представители каждой из трех пород объединены в три четко обособленных кластера, причем, пороговые уровни выделения серой украинской и холмогорской пород выше, чем для голштино-фризской породы. Две выборки холмогорской породы дифференцированы в меньшей степени, чем отдельные породы, и характеризуются более близким родством особей по сравнению с СУСом. Однако, самое большое однообразие и родство найдено нами в стаде племенных быков голштино-фризской породы. Сходная дендрограмма получается и при использовании тсломерного маркера (рис.7Б). К аналогичным выводам можно прийти и при сравнении межпородной изменчивости RAPD-маркеров.

Внутривидовая изменчивость представителен рода Bison.

Для описания внутривидовой изменчивости представителей рода Bison применяли, как и для Bos taurus, варианты ДНК-фингерпринтинга с использованием в качестве зондов ДНК фага М13 и синтетического олигонуклеотида (TTAGGG)4, а также RAPD PCR с тремя случайными прайм ерам и.

На рис.8 представлены образцы спектров гипервариабельных фрагментов ДНК бизона (А, дор.1-10; Б, дор. 1, 2) и зубра (А, дор.11-19; Б, дор. 3,4), полученных с использованием в качестве зондов ДНК фага М13 и теломерного олигонуклеотида (TTAGGG)4. Общее для двух видов число локусов составляет 82 для минисателлитного и 51 для теломерного зонда. Картины распределения фрагментов по каждому из двух зондов не перекрываются.

Для особей каждого вида характерен свой, отличный от другого вида. ДНК фингерпринтный спектр. Исключение составляет зубр беловежской линии (Рис.8А, дор. 18), которого по большей части минисателлитных фрагментов нельзя идентифицировать ни как зубра, ни как бизона. И, хотя по теломерным маркерам эта

особь ничем не отличается от остальных зубров, мы исключили се из дальнейшего популяционного анализа.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО

0.0 1_

0.25 —I_

0.5

0.75 _I_

£

ге

1.00

- 1СУС -2СУС -ЗСУС -4СУС . 5СУС

. есус

-7СУС

. бХЦКм) . 2ХПК») . 4ХПКЯ) . 1ХЦЮг) . 5ХДКи)

. зхцвд

. 2ЩКл)

-4ЩЮ0 -зхгтк»)

- 1ГФ

- 2ГФ •ЗГФ

- 4ГФ ■ 5ГФ -6ГФ

- 7ГФ . 8ГФ

£

■ 2СУС

• 5СУС ' 4СУС

• 6СУС

■ 1СУС . 7СУС

ЗСУС

■ 1ХДКи) . 2ЩК»)

ЗХ1ТЮ0

зхгкюо

бХЦКм)

зг*

1ГФ 6ГФ , 7ГФ . 8ГФ . 2ГФ 4ГФ

Рис.7 Дендрограммы генетического сходства особей трех пород - серой украинской (СУС), холмогорской (ХГ) из Коми (Км) и Калужской области (Кл), голштино-фризской (ГФ) из Татарстана, полученная при использовании в качестве зонда ДНК фага М13 (А) и олигонуклеотида (ТТАССС)! (Б).

А Т.П.Н

23,1 -

9,4 -6,2 -

2,3 -

2,0 -

Рис.8 ДНК-фингерпринты, полученные при использовании в качестве зондов ДНК фага М 13 (Л) и синтетического олигонуклеогида (TTAGGG)4 (В) бизонов (А: дор.1-10. Б: лор. 1. 2) и зубров (А: зчбры беловежской линии,- дор.11-15, зубры кавказско-беловежской линии -дор. 16-19; Б: зубры беловежской линии-дор. 3, 4). ДНК гидролизовали рестриктаюй Пае III.

В табл.3 обобщены данные для популяций двух видов по вариабельности числа минисателлитных и теломерпых фрагментов и даны оценки внугрш рупиового сходства, гстсрозиготности и полиморфизма по каждому из зондов. При сравнении вариабельности минисателлитных фрагментов разной длины нам не \ далось обнаружить достоверных отличий между зубром и бизоном как по числу фрагментов суммарных спектров при использовании в качестве зонда ДНК фага М13, так и при использовании теломерного зонда (р < 0.01). Популяции дв>х видов отличаются лишь по числу полиморфных и мономорфных фрагментов, при пом наименьшее число полиморфных локусов найдено в спектре зубра.

При межвидовом сравнении минисателлитных маркеров разной .шины оказалось, что зона 23.0 - 8.0 наиболее вариабельна у зубра, тогда как зона 8.0 - 4.0. наоборот, - наименее полиморфна у зубра, чем у бизона. По мелким фра/ ментам бизоны окашшсь более полиморфными, чем зубры. Таким образом, зги два вида одного рода имеют различные ДНК-фингерпритные спекгры, отличающиеся числом и характером распределения гибридизациопных фрагментов. Идентификацию отдельных особей и дифференциацию популяций зубра лучше проводить с помощью длинных и средних, а бизона - средних и коротких минисателлитных фрагментов. При оценке внутригруппового сходства Al'S и

генного разнообразия стадо зубра оказалось более однородно, чем стадо бшона (р <0.01). По индексам гетерозиготности Н стадо зубров отлично от стада бизона.

Таблица 3. Генетический полиморфизм и оценка генетического разнообразия в популяциях американского бизона (Bison bison) и европейского зубра (Bison bonasus), полученные на основе анализа вариабельности минисателлитных (М13) и те.чомерных (TTAGGG)j маркеров._______________________

Вид Зонд (размер фрагментов в т. п. н.) N (ст. откл.) APS (ст. откл.) H I'

Bison М13: 1,300 0.822 0,124 0.136

bison (23,0-8,0) (0,483) (0,064)

(8,0-4,0) 3,100 (0,316) 0,596 (0,250) 0,442 0.550

(4,0-2.0) 12,600 (0.699) 0.528 (0.129) 0,514 0.777

(23,0-2,0) 17.000 (1.054) 0.573 (0.097) 0,446 0.677 1

(TTAGGG)4 4,600 (0,699) 0.615 (0.137) 0,321 0.426 ! 1 1

М13+ (TTAGGGh 21,600 (1.578) 0.571 (0.105) 0.427 0 62 1 j 1

Ri son \ bonasus М13: (23,0-8,0) 2,875 (0,354) 0.686 (0,132) 0.310 (1.544 ! !

(8,0-4,0) 3,000 (0,000) 0.726 (0.223) 0,306 0.565 J

(4,0-2.0) 11.500 (0,760) 0.921 (0.051) 0.070 0.12X

(23,0-2,0) 17.375 (0,916) 0.855 (0.082) 0,132 0.240

(TTAGGG)4 4,625 (1,188) 0.520 (0.200) 0,482 0.680

Ml 34 (TTAGGGb 22,000 (1,414) 0.789 (0.093) 0.186 0.508 J

Графическим отображением взаимосвязей между представителями лнух пилон (сIал) могу] служить дендрограмчы генетического сходства, построенные на основании коэффициентов 8 для минисателлитных (Рнс.ОА). теломерных (Рис.') 1>). и суммы маркером (Рис.913). 3)бры и бизоны объединяются в два видовых к.таск'ра.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО

0.0 L—

035

0.3

0.75 —1_

1.00

ь

-1

Lr^

.А . Д . Д . Д . Д . Д

• Д

• Д

• Д ■ Д

И

■а

г- И

La

□

□ □ □

А Д Д Д Д Д Д Д

д д

в

□

в в

в

□

в

□

д д д д д д д д д д

в

□

в

в

□

в

□

1 б 1

9

3 8 2

10

4

5 И

15 12

13

16 17

14 19

3

4

2

5 1

9

6

7

8

10 11 16 12

13

14 17

15 19 1 8 6 7

9

3

4

5 2

10 11

15 12

13

16

14 17 19

В

Рис.9 Дендрограммы генетического сходства между представителями рода Bison: бизонами (Д) и зубрами (□ - беловежская линия; а - кавказско-беловежская линия), рассчитанные на основе вариабельности минисателлита М13 (А), теломерных маркеров (Б) и суммы минисателлитных и теломерных маркеров (В). Нумерация животных соответствует рис. 8.

причем внутри каждого вида при использовании разных маркеров изменяется лишь характер и уровень объединения отдельных особей. Суммирование маркеров не изменяет принципиальное выделение в два кластера зубра и бизона, но несколько уменьшает пороговые значения для этого выделения и изменяет группировку отдельных особей по степени сходства.

Таким образом, как и в случае с породами Bos taurus, минисателлиты и теломеряые маркеры оказались пригодными для идентификации отдельных особей в стаде зубров или бизонов, определении степени родства между особями одного стада и дифференциации отдельных популяций или линий (например, линий разведения зубра). Так, зубры беловежской линии отличаются от зубров кавказско-беловежской линии. Стадо бизонов представлено единой выборкой, в которой степень родства между особями значительно ниже, чем в отдельных линиях зубра.

Вариабельность RAPD-маркеров в популяциях зубра и бизона представлена на рис. 5, а в табл. 4 приводятся оценки уровня внутривидовой изменчивости,

Таблица 4. Генетический полиморфизм и оценка генетического разнообразия в популяциях американского бизона (Bison bison) и европейского зубра (Bison bonasus), полученные на основе анализа вариабельности RAPD-маркеров при использовании трех праймеров (П29, П45.П17).

Вид Праймер N (ст. OTJCJI.) APS (ст. откл.) H P

Bison bison П29 15,250' (1,282) 0,799 (0,080) 0,202 0,360

П45 17,200 (1,789) 0,605 (0,309) 0,408 0,668

П17 14,400 (9,050) 0,572 (0,315) 0,475 0,857

£ 46,850 (2,040) 0,653 (0,230) 0,345 0,588

Bison bonasus П29 14,750 (0,957) 0,859 (0,055) 0,087 0,116

П45 19,333 (1,528) 0,810(0,032) 0,123 0,187

П17 12,000 (2,000) 0,558 (0,167) 0,489 0,752

Z 46,083 (1,495) 0,742 (0,085) 0,233 0,352

0.50

L_

Рис. 10 Дендрограмма генетического сходства между представителями рода Bison: бнюнами

(Д) и зубрами (□ - беловежская линия; 3 - кавказско-беловежская линия), рассчитанные на основе вариабельности RAPD-маркеров. Нумерация животных соответствует рис.8.

выявляемые с использованием каждого из трех праймеров, и оценки по суммарному спектру, а на рис. 10 приведена дендрограмма, отражающая генетическое сходство между особями двух видов (суммарный спектр). Средние значения APS варьирую! от 0.558 до 0.860 в зависимости от используемого праймера и изучаемого вида (популяции), однако мы не обнаружили достоверной разницы между видами ни по частным средним значениям APS, ни по значениям APS суммарных спектров. Эта тенденция сохраняется при сравнении видов по гегерочиготности. Что же касается эффективности праймеров для выявления полиморфных локусов, то оказалось, что наибольшее число полиморфных локусов детектирует П17, а наименьшее - 112У.

Независимо от состава используемого праймера, особи каждою вида образуют самостоятельные кластеры. Этот результат получен с помощью каждого праймера или суммы трех праймеров, причем П45 дает наивысшие пороговые значения для выделения видов.

Генетическая изменчивость межвидовых гибридов.

Для изучения генетической вариабельности представителен межвидовых и межродовых гибридов, а также родительских видов, принадлежащих к двум родам -Bos и Bison, был использован ДНК фингерпрингинг с зондом М13 ДНК. Выли проанализированы ДНК половозрелых представителей шести видов: баш сиг а, гаяла, ватусси, СУСа, бизона, зубра и десяти гибридных потомков рашых поколений (6 $ и 4 с?), полученных в различных типах скрещивания между представителями рода Bos (межвидовые гибриды) и Bos и Bison (межродовые гибриды). При этом мы называем потомков от скрещивания двух видов двойными.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО 0.75

1.00

с

• Д4 ■Д 5 ■Д 2 •Д 7

■ Д 10

■ Д з •Д 8 ■в 11

■ И 12

■ □ 16 -О 13 -□ 19

трех видов - тройными, четырех — четверными гибридами. У изученных нами двойных гибридов КРС х бантенг доля примеси КРС (СУС) составляла 48% (ГБ 1), 69% (ГБ 2), 70% (ГБ 3)^1% (ГБ 4) и 87,5% (ГБ 5). Множественный гибрид ГБ 6 получен при скрещивании четырех видов из двух родов, при этом примесь КРС составила 83%, бантенга 5%, зубра и бизона по 6%. Гибриды ГБ 7 и ГБ 8 получены при участии в качестве родителей трех или четырех видов из двух родов. Для ГБ 7 примесь КРС составляет 75,8%, бантенга 8,6% и бизона 15,6%, а для гибрида ГБ 8 примесь КРС составляет 42%, ватусси 50%, бантенга 2% и бизона 6%. Два гибрида ГБ 9 и ГБ 10 (25% КРС и 75% бизона) получены при скрещивании КРС х бизон. На рисунке И представлены данные ДНК фингерпринтного анализа (Л) и соответствующая им дендрограмма генетического сходства (Б) представителей родительских видов и гибридов между ними (дор. 4-7, 12-17). Число фрагментов у представителей чистых видов варьирует в данных условиях эксперимента от 15 до 29, а у гибридов - от 16 до 31. Анализ изменчивости числа фрагментов показывает, что у двойных межвидовых гибридов КРС х бантенг увеличение доли крови домашней коровы коррелирует с появлением в спектрах большего числа фрагментов. Так, для гибрида, содержащего 48% крови КРС, оно составляет 16 (ГБ 1), 70% - 17 (ГБ 3), 69% - 19 (ГБ 2), 81% - 20 (ГБ 4), 87,5% - 24 (ГБ 5) (г - 0,94; р< 0,05). У двойных межродовых гибридов КРС х бизон оба гибрида содержат 25% КРС и имеют по 28 и 29 фрагментов, что не отличает нх от одного из родительских видов - КРС (число фрагментов 26, 29). Множественные тройные и четверные межродовые гибриды при наличии 85-88% примеси Bos обнаруживают 21 и 22 фрагмента (ГБ 6, ГБ 7), что значительно меньше, чем у одного из родительских видов рода Bos taurus. При достижении 92% примеси Bos число фрагментов у четверного гибрида ГБ 8 достигает 31 и превышает тем самым характеристики исходных родительских видов. На рис. 11Б видно, что в один большой кластер объединяются все виды рода Bos (КРС, бантенг, ватусси и гаял), а также восемь межвидовых и межродовых гибридов, содержащих больше 84,5% крови животных рода Bos. Они четко дифференцированы от зубра, двух бизонов и двух межродовых гибридов ГБ 9 и ГБ 10 с 75% содержанием крови бизона. В кластере Bos в одну группу с бантенгом попадают шесть гибридов с 5%-52% примесью бантенга, причем двойные гибриды ГБ 3. ГБ 4 и ГБ 5 (12,5%—30%) несколько ближе к бантенгу, чем два двойных гибрида ГБ 1, ГБ 2 (52% и 31%) и четверной гибрид ГБ 6 (5%). Тройной гибрид ГБ 7 (75,8% КРС + 8,6% бантенг + 15,6% бизон) располагается несколько обособленно и обнаруживает

большее сходство не с родительскими видами, а с группой вагусси - ГБ 8 (50% ватусси + 50% КРС).

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО

0.0 0.25 0.5 0.75 I_I_I-1—

_I-1 КРС

I-2 КРС

11 БН

15 О

16 О res

17 О ГБЗ

12 □ ГЕ6

13 О ГЕ;

14 О ГБ!

3 ВТ

4 □ ГБ8

5 □ ГЕ7

18 ГП

8 БЗ

9 БЗ

6 □ ГБ9

7 □ ГЕЮ

10 ЗБ

Рис. 11. ДНК-фннгерпринтинг (Л) и дендрограмма, отражающая генетическое схолсгво (Б) представителей двух родов Bos и Bison и гибридов между ними. В качестве чомда использовали ДНК фага М13, ДНК гидролизовали рестриктазой Пае III. I, 2 - серый украинский схог (КРС);. 3 - ватусси (ВТ);. 8, 9 - бизон (БЗ); 10 - зубр (ЗБ): 11 ~ шштеш (БН);. 18 - гаял (ГЛ); 4 — ГБ 8; 5 - ГБ 7; 6 - ГБ 9;. 7-ГБ 10; 12-ГБ6; 13-ГВ2; 14-11, 1; 15 - ГБ 4; 16 - ГБ 5; 17 - ГБ 3. Условное обозначение кровноети: О - межвидовые i ибриды рода Bos', □ - межродовые гибриды Bos х Bison.

1.00 I

4Z

Таким образом, использованный нами зонд дает возможность регистрировать постоянное вытеснение хромосом бантенга или ватусси в поглотительных скрещиваниях с домашней коровой, что, вероятно, связано со значительной хромосомной и геномной гомологией двух родительских видов. Характер изменения спектров тройных и четверных, а также межродовых гибридов отражает более выраженные различия в геномах зубра, бизона, гаяла и домашней коровы. Межвидовая изменчивость по RAPD маркерам.

Для описания межвидовой изменчивости представителей всех видов двух родов (Bos и Bison) мы впервые применили RAPD-PCR анализ с тремя случайными праймерами.

На рис. 5 представлены RAPD-спектры восьми видов Быков (бантенга Bos Javanicus, гаяла Bos gaurus, ватусси Bos macroceros, яка Bos mutus, зебу Bos indicus, Bos laurus - две группы пород - СУС и холмогорская из Коми, бизона Bison bison и зубра Bison bonasus), полученные с помощью трех праймеров - П45 , П17 и П29. Каждый из трех праймеров детектируют у всех трех видов от 34 до 64 четких фрагмента размером 200-1500 п.н. На рис. 12 (А) приведены дендрограммы, отражающие генетическое сходство между этими видами, построенные на основании суммарного спектра. Праймер П17 позволяет дифференцировать две группы, в одну из которых входит зубр с бизоном, а в другую все остальные представители рода Bos за исключением зебу, стоящего совершенно обособленно. Несколько иная дифференциация наблюдается при использовании П29. В один большой кластер попали холмогорская и серая украинская породы КРС, бантенг, ватусси и гаял. В другую группу объединились зебу, а также як с зубром и бизоном. И совершенно иное сходство между видами1 обнаружено при использовании П45, где в одну из групп объединены холмогоры и СУС, а также гаял и зубр, а в другую группу -ватусси, зебу и як. Бантенг и бизон стоят совершенно обособленно от этих групп. При суммировании спектров (рис.12А) в два больших кластера объединяются: домашняя корова, бантенг, ватусси, гаял и зебу (род Bos); а также зубр, бизон (род Bison). Як оказался более сходен с зубром и бизоном, чем с видами рода Bos.

Для выяснения возможных путей эволюции и происхождения изученных видов были использованы несколько парсимониальных методов построения кладограмм. Одна из таких кладограмм представлена на рис. 12(Б). Отличия в топологии двух деревьев (А) и (Б), касаются, в основном, способов группирования бантенга и яка с группами Bos и Bison. Ранее при сравнении краниологических особенностей (Groves, 1981) и полиморфизма мт-ДНК (Mijamoto et.al., 1989) было обнаружено сходство яка

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО

0.0

о зл

_J_

0.S _|_

Н±

0.75 —I_

1.00

•ХДКм)

- СУС

- БН • ЕТ -ГЛ . ЗЕ

- ЯК ■ БЗ . ЗБ

Рис. 12. Генетическое сходство (А) и филогенетическое родство (Б) представителей подсемейства Bovinae, рассчитанные на основании изменчивости RAPD-маркеров. Условные обозначения: СУС - серый украинский скот, ХГ(Км) - холмогорская порода КРС (Коми), БН - бантенг, ВТ - ватусси, ГЛ - гаял, ЗЕ - зебу, ЯК - як, ЗБ - зубр и БЗ - бизон.

с зубром и бизоном. Выделение бантенга не противоречит результатам, полученным при изучении эволюции семейств высокоповторяющейся ДНК у зубра, бизона, бантенга, зебу и домашней коровы (Modi et.al., 1996). Таким образом, полученные нами данные RAPD-анализа позволяет трактовать по-новому филогенетические связи между представителями отдельных видов подсемейства Bovinae.

выводы.

1.Впервые охарактеризована внутри- и межвидовая изменчивость теломерного повтора (ТТАСОО)4 у представителей подсемейства Быков (Bovinae). На основе этой системы маркеров возможна дифференциация отдельных семей, популяций (пород) и видов.

2.С помощью миии- и микросагеллитных, а также нескольких ЯАРО маркеров проведена оценка внутри и межпородной изменчивости крупного рогатого скота и отдельных стад зубра и бизона.

3. Определены диагностические характеристики геномных маркеров Быков. Показано, что для паспортизации особей и отдельных популяций наиболее пригодными являются минисателлиты (ДНК фага М13) и теломерный повтор (ТТАСОО)^ а для межвидовых сравнений - анонимные КАРО-маркеры.

4.На основании ЯАРО-маркеров построены дендрограммы, отражающие генетическое сходство между видами, и кладограммы, позволяющие по-новому трактовать происхождение отдельных видов подсемейства Вохчпае.

Список работ, опубликованный по теме диссертации.

1. Рысков А.П., Кудрявцев И.В., Васильев В.А., Потапов С.Г., Кудрявцев П.И., Сипко Т.П. Молекулярно-генетические подходы к анализу генетического разнообразия у представителей Bison и Bos\ геномная дактилоскопия и таксономическое типирование ДНК. // В сб. " К вопросу о возможности сохранения зубра в России". Пущино. 1993. С.74-81.

2. Рысков А.П., Кудрявцев И.В., Васильев В.А., Потапов С.Г., Кудрявцев П.И., Снпко Т.П. Диагностические возможности молекулярно-генстических подходов к таксономии трибы Bovini. // Зоол. Журн. 1994. Т.73. №11. С. 115-123.

3. Semyenova S.K., Vasilyev V.A., Chrisanphova G.G., Lebengartz J.Z., Steklenev E.P., Dunin M.I., Ryskov A.P. Study of genome heterogeneity and diversity in different Bos taurus breeds. // XXVth International Conference of Animal Genetics. Tours, France. 1996. P.40.

4. Semyenova S.K., Vasilyev V.A., Steklenev E.P., Prosnjak M.I., Ryskov A.P. DNA polymorphism in Bos and Bison genuses: DNA fingerprinting and RAPD-PCR

analysis. // XXVth International Conference of Animal Genetics. Tours, France. 1996. P.41.

5. Васильев B.A., Хрисанфова Г.Г., Стекленев Е.П., Лебенгарц Я.З., Рысков А.П., Семенова С.К. RAPD-PCR маркеры в паспортизации пород КРС и идентификации видов семейства Bovinae // В сб. "ДНК технологии." Киев. 1997. С.45-46.

6. Васильев В.А., Семенова С.К., Стекленев Е.П., Белоусова И.П., Кудрявцев И.В., Рысков А.П. ДНК фингерпринтинг представителей рода Bison и Bos.ll В сб. "Подходы к оценке современного состояния и перспектив выживания европейского зубра". Пущино. 1998. С.14-18.

7. Васильев В.А., Семенова С.К., Хрисанфова Г.Г., Стекленев Е.П., Рысков А.П. Использование ДНК фингерпринтинга при отборе материала для создания банка генома аборигенных пород крупного рогатого скота.// В сб. "Консервация генетических ресурсов". Пущино. 1998. С.43-46.

8. Семенова С.К., Васильев В .А., Стекленев Е.П., Просняк М.И., Рысков А.П. ДНК-фингерпринтинг представителей подсемейства Быковых (Bovinae) с использование теломерного маркера (TTAGGG)4.//Генетика. 1999. Т.34.№1. С.1-3.

9. Васильев В.А., Стекленев Е.П., Морозова Е.В., Рысков А.П., Семенова С.К. ДНК-фингерпринтинг и эволюция представителей подсемейства Быковых.// Труды И съезда ВОГиС. 2000. Т.2. С.108.

10. Семенова С. К., Васильев В. А., Морозова Е. В., Слынько А. В., Стекленев Е. П., Белоусова И. П., Кудрявцев И. В., Рысков А. П. ДНК фингерпринтинг и генетическое разнообразие европейского зубра (Bison bonasus), американского бизона (Bison bison) и серого украинского скота (Bos taurus). // Генетика. 2000. Т.36. № 11. С. 1535-1546.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильев, Василий Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Методы изучения полиморфизма ДНК

2.1.1. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов ДНК

2.1.2. Мультилокусный ДНК - фингерпринтинг

2.1.2.1.Мини и микросателлиты

2.1.2.2.Минисателлитные последовательности Джеффриса

2.1.2.3.М 13-гипервариабельные минисателлиты

2.1.2.4.Микросателлитные маркеры ДНК

2.1.2.5.Моно- и мультилокусные зонды. Метод ДНК-фингерпринтинга

2.1.2.6.Применение мультилокусного ДНК-фингерпринтинга

2.1.3. Таксономический фингерпринт ДНК

2.1.4. Полимеразная цепная реакция 20 2.1.4. КЯАРЭ РСЯ-анализ 21 2.1,4.2.Другие варианты полимеразной цепной реакции

2.2. Генетический полиморфизм подсемейства Воутае

2.2.1. Морфологическая систематика и филогения подсемейства Быков ( Виг¡пае)

2.2.2. Полиморфизм митохондриального генома представителей подсемейства Воутае

2.2.2.1 .Структура митохондриального генома Воя 1аигт

2.2.2.1 .Структура митохондриального генома Bos taurus

2.2.2.2.Полиморфизм митохондриальной ДНК и филогения представителей подсемейства Bovinae

2.2.3. Полиморфизм ядерного генома представителей подсемейства Bovinae

2.2.3.1 .Структура и эволюция сателлитных ДНК Bos taurus

2.2.3.2.Полиморфизм генома представителей подсемейства Bovinae по мини- и микросателлитным маркерам

2.2.3.3.Полиморфизм генома представителей подсемейства Bovinae по анонимным маркерам

2.2.3.4.Молекулярная филогения по маркерам ядерного генома представителей подсемейства Bovinae

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45 3.1. Биологический материал

3.2.1. Выделение ядерной ДНК

3.2.2. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами

3.2.3. Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК

3.2.4. Перенос ДНК на нитроцеллюлозные и синтетические фильтры

3.2.5. Приготовление меченых зондов

3.2.6. Саузерн-гибридизация

3.2.7. Полимеразная цепная реакция

3.2.8. Статистическая обработка данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ■

4.1. Оптимизация условий мультилокусного маркирования генома представителей подсемейства Bovinae

4.2. Изменчивости мини- и микросателлитных маркеров в семейном анализе

4.3. Внутрипородная и межпородная изменчивость

4.4. Внутривидовая изменчивость представителей рода Bison

4.5. Генетическая изменчивость межвидовых гибридов

4.6. Межвидовая изменчивость по RAPD маркерам 86 5. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение геномного полиморфизма представителей подсемейства Bovinae"

Изучение геномной вариабельности различных таксономических групп животных представляет одно из важных направлений современной биологии. Ключевым моментом является поиск и характеристика полиморфных ДНК. которые могут быть использованы для маркирования и анализа генофондов, для выявления уровней геномной дивергенции, установления родственных и филогенетических связей в процессе микро- и макроэволюции (Рысков 1999). В последнее время для изучения генетического разнообразия широко используется технологии ДНК-фингерпринтинга и RAPD PCR анализа, поскольку выявляемые при этом геномные маркеры (гипервариабельные мини- и микросателлиты), или анонимные локусы являются чувствительными индикаторами геномного полиморфизма (Jeffreys et.aL 1985; Wayne et.al., 1991; Hillis et.al., 1994).

Молекулярное маркирование генома Бычьих (Bovidae) несмотря на большое число исследований, остается весьма актуальным в теоретическом и практическом плане, поскольку получение новых молекулярных маркеров позволяет эффективно решать вопросы, связанные с выделением нужных генов, поиска ассоциаций с количественными признаками, паспортизацией отдельных особей и дифференциацией отдельных популяций и видов. В настоящее время не существует единой точки зрения на происхождение подсемейства Быков {Bovidae). Классическая систематика выделяет внутри подсемейства два рода - род Bison, состоящий из двух видов - европейского зубра и американского бизона (B.bonasus и В.bison), и род Bos, включающий в себя домашнюю корову (B.taurus), бантенга (B.javanicus), гаяла (В.gaums) и яка (B.mutus) (Bohlken Н. 1958; Groves 1981; Соколов 1979). Многие из этих животных существуют в настоящее время в виде диких видов и одомашненных форм, что значительно затрудняет выяснение филогенетических связей внутри данного подсемейства.

Представители подсемейства Быков составляют широко распространенную группу животных, интенсивно используемых человеком в своей практической деятельности. Не смотря на значительную морфологическую дифференциацию, для всех видов Быков характерно постоянное число хромосом 2п=60 (за исключением гаяла, 2п=58). Такое морфологическое разнообразие при постоянстве хромосомного набора делает эту группу одной из наиболее интересных для изучения вопросов, связанных с геномной дивергенцией и сопоставлением скоростей морфологической и генетической дифференциации. Подсемейство Быков - относительно молодое, так как почти все виды могут скрещиваться между собой и давать потомство. Э га особенность группы используется в селекционной практике для выведения более совершенных и высокопродуктивных пород сельскохозяйственных животных путем скрещивания домашних животных с их дикими сородичами. Большое научное и практическое значение имеют работы по скрещиванию крупного рогатого скота с зебу, яком, зубром, бизоном, бантенгом и гаялом (Стекленев и др., 1969, 1992).

Сохранение и воспроизводство редких и исчезающих видов диких животных, таких как зубр, а также аборигенных пород крупного рогатого скота, как носителей хозяйственно значимых признаков, является одной из актуальных задач современной биологии. Для сохранения генофонда этих животных необходимо выявление производителей для оптимального подбора родительских пар при разведении. Поэтому геномная паспортизация животных становится важнейшей компонентой всей дальнейшей работы по восстановлению поголовья и его реинтродукции в природу.

Целью настоящего исследования являлось изучение геномной вариабельности представителей подсемейства Быков на разных иерархических уровнях организации.

Мы использовали как стандартные, ранее описанные мультилокусные маркеры, так и получили ряд новых маркеров.

Для выяснения характера наследования маркеров разных типов и установления особенностей внутри и межпопуляционной изменчивости нами изучены разные виды Быков, разводимые в неволе на территории России и Украины. Помимо пород домашней коровы, стад зубра и бизона, мы исследовали отдельных представителей других видов Быков, распространенных в юго-восточной Азии и Африке, а также несколько межвидовых (межродовых) гибридов. Этот материал послужил источником для установления филогенетических связей среди Быков.

В связи с вышесказанным были поставлены следующие задачи:

1) Провести поиск новых молекулярно-генетических маркеров для изучения геномного полиморфизма представителей подсемейства Быков (мини- и микросателлитные, ЯАРО-маркеры).

2) Оценить пригодность маркеров различного типа для выявления геномной вариабельности на разных иерархических уровнях организации представителей подсемейства Быков (семейном, внутри- и межпородном, межвидовом).

3) Оценить степень генетической изменчивости на внутри- и межпородном уровнях для крупного рогатого скота, и популяционном для зубров и бизонов.

4) 11о данным мультилокусного маркирования генома Бычьих построить дендрограммы генетического сходства и филогенетического родства исследованных видов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.2. Методы изучения полиморфизма ДНК

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Васильев, Василий Александрович

выводы.

1.Впервые охарактеризована внутри- и межвидовая изменчивость теломерного повтора (ТТАССС)4 у представителей подсемейства Быков (Воутае). На основе этой системы маркеров возможна дифференциация отдельных семей, популяций (пород) и видов.

2.С помощью мини- и микросателлитных, а также нескольких ЯАРЭ маркеров проведена оценка внутри и межпородной изменчивости крупного рогатого скота и отдельных стад зубра и бизона.

З.Определены диагностические характеристики геномных маркеров Быков. Показано, что для паспортизации особей и отдельных популяций наиболее пригодными являются минисателлиты (ДНК фага М13) и теломерный повтор (ТТАССС)4. а для межвидовых сравнений - анонимные ЯАРО-маркеры.

4.На основании ЯАРО-маркеров построены дендрограммы, отражающие генетическое сходство между видами, и кладограммы, позволяющие по-новому трактовать происхождение отдельных видов подсемейства Воутае

Считаю своим долгом принести сердечную благодарность:

Семеновой С.К. и Рыскову А.П., моим учителям и научным руководителям, за терпение, глубокий интерес и руководство исследованием.

Васильевой Е.А., моей жене, за понимание, терпение и духовную поддержку.

Всем сотрудникам лаборатории организации генома Института Ьиологии Г ена РАН за проявленный интерес к работе, постоянное внимание и поддержку.

Стекленеву Е.П., Белоусовой И.П., Кудрявцеву И.В., Лебенгарцу Я.З., Хрисанфовой Г.Г., Рыжовой Н.В за предоставленный уникальный биологический материал и интерес к работе.

Новикову C.B. за помощь в подготовке фотографий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Василий Александрович, Москва

1. Банникова A.A., Долгов В.А., Федорова Л.В., Федоров A.M. Ломов A.A., Медников Б.М. Дивергенция землероек (Insektofora, Soricldae) по данным рестриктазного анализа повторяющихся последовательностей ДНК // Зоол. журнал. 1996а. Т. 75. N. 2. С. 256—261.

2. Белоусова И. П., Кудрявцев И. В. Генетическое разнообразие в племенном стаде зубров Приокско-Террасного заповедника // Генетика, 2000, Т. 36. № 2, С. 16-20.

3. Белоусова И. П., Орлов В. Н., Кудрявцев И. В. Генетическое разнообразие и возможность микроэволюционных изменений европейского зубра (Bison bonasus) //Успехи современной биологии, 1999, №2, С. 144-150.

4. Беридзе Т.Г. Сателлитные ДНК. М.: Наука. 1982. 120 с.

5. Боголюбский С.Н. Проблема гибридизации в животноводстве.// Отдаленная гибридизация растений и животных. М.: Изд-во АН СССР. С. 263-281.

6. Булат С.А., Стрелкова М.В., Сысоев В.В. Идентификация маркерных штаммов Leismania major, L.turanica, L.gerbilli методом полимеразной цепной реакции с универсальным праймером // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. 1992. N. 1. С. 21—25.

7. Гептнер В.Г., Насимович A.A., Банников А.Г. Млекопитающие Советского Союза. T.I. Парнокопытные и непарнокопытные.// М.: Высшая школа. 1961.

8. Гиннатулин A.A. Структура, организация и эволюция генома. М.: На\ка. 1984. 294 с.

9. Гречко В.В., РябининД.М., Федорова J1.В., Федоров А.Н„ Даревский И.С., Рысков А.П. Таксонопринтный анализ ДНК некоторых видов ящериц семейства Lacertidae // Молекуляр. биология. 1993. Т. 27. N. 6. С. 1404—1413.

10. Джинчарадзе А.Г., Иванов П.Л., Рысков А.П. (1987) ДАН СССР. 295. №1. 230-233.

11. Дмитриев Н.Г. Породы скота по странам мира.//Л.: "Колос". 1978.

12. Кузьмина И.Е. Лошади северной Евразии от плиоцена до современности.// С-Г16. 1977.

13. Куренова Е.В., Мейсон Д.М. Функции теломер. Обзор. // Биохимия. 1997. Г.62. №11. С. 1453-1466.

14. Медников Б.М., Банникова A.A., Ломов A.A., Мельникова М.Н. Шубина Е.А. Рестриктазный анализ повторяющейся ядерной ДНК, критерий вида и механизм видообразования//Мол. биология. 1995. Т. 29. N. 6. С. 1308—1315.

15. Мельникова М.Н., Гречко В.В., Медников Б.М. Исследование полиморфизма и дивергенции геномной ДНК на видовом и популяционном уровнях (на примере ДНК пород домашних овец и диких баранов // Генетика. 1995. Т. 3 1. N. 8. С. 1120— 1128.

16. Потапов С.Г., Кудрявцев И.В., Рысков А.П. Использование таксономического типирования ДНК для анализа геномной вариабельности представителей Bovidae Gray, 1821.// Генетика. 1994. Т. 30. С. 858-860.

17. Потапов С.Г., Токарская О.Н., Семенова С.К., Данилкин A.A., Марков Г.Г. Рысков

18. А.П Диагностические возможности мультилокусных маркеров ДНК в систематикедиких копытных животных (Artiodactyla).// Гнетика. 1997. Т. 33. С. 961-966.

19. Прошина О.В., Чиряева О.Г., Смирнов А.Ф. Распределение Т-дисков и теломерных (TTAGGG)n блоков нуклеотидов на хромосомах Bos taurus.ll Генетика. 1998. Т.34. №10. С.1405-1410.

20. Руазес Ж.Ф., Пажес М. Консервативные и дивергировавшие последовательности сателлитных ДНК теленка // Эволюция генома / Под ред. Доувера Г., Флейвелла Р./. М.: Мир. 1986. С. 101—131.

21. Рысков А.П., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И., Иванов П.Л. Лимборская С.А. Геномная "дактилоскопия" организмов различных таксономических групп: использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага MI3. // Г енетика. 1988.Т.24. №2. 227-238.

22. Рысков А.П. Геномная дактилоскопия. "Геном человека". №3. М. 1990.

23. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия.// Мол. биология. 1999. Т.ЗЗ. №.6. С.997-101 I.

24. Сипко Т.П., Ломов A.A., Банникова A.A., Медников Б.М. Оценка степени генетической дивергенции представителей Bovidae методом рестриктного анализа ДНК. // Цитол. и генет. 1997. Т.31. С.76-81.

25. Смирнов А.Ф., Павлова В.А., Слепцов М.К., Стекленев Е. 11. Изменчивость сателлитной ДНК II и IV у крупного рогатого скота, некоторых представителей подсемейства Bovinae и их гибридов// Генетика. 1996. Т. 32. N. 9. С. 1263 -1269.

26. Соколов В.Е. Систематика млекопитающих.// М.: Наука., 1979. Т.З. 528 с.

27. Соколов И.И. Опыт естественной классификации полорогих (Bovidae)//Tp. Зоол. Института. М.: 1953. Т. XIV.c. 19-25.

28. Соколов И.И. Копытные звери. Фауна СССР. Млекопитающие. Т.1. Вып.З.// М-Л.: Из-во АН СССР. 1957.

29. Спитковский Д. M. Теломерные последовательности ДНК и концепция онтогенетического сохранения клеток. // Биохимия. 1997. Т.62. № 11. С. 1503-1510.

30. Стекленев Е.П. О гибридизации домашней коровы с азиатским буйволом. // Доклады ВАСХНИЛ .1968. №1. С.31-33.

31. Стекленев Е.П. Особенности гаметогенеза гибридов яка тибетского |Bos (Poephagus) grunniens L. с гаялом Bos (Bibos) frontalis Lambert].// Цитология и генетика. 1969.T III.№3.c. 274 279.

32. Стекленев Е.П. Опыты отдаленной гибридизации некоторых свободно нескрещивающихся видов жвачных.// Проблемы зоотехнической генетики. 1969. С.15 27.

33. Стекленев Е.П. Морфологическая характеристика спермиев представителей подсемейства Быковых (Bovinae) в связи с их гибридизацией.// Сельскохозяйственная биология. 1971 .т.VI.№ 1 .с. 119-126.

34. Стекленев Е.П. Хромосомные комплексы гибридов бантенга Bos (Bibos) javanicus с домашней коровой Bos(Bos) taurus typicus.// Цитология и генетика. 1979.т.ХШ.№1 .с.31 -33.

35. Стекленев Е.П., Ясинецкая Н.И., Нечипоренко В.Х. Спонтанная изменчивость и ассоциативная способность хромосом гибридов бизона с домашней коровой.// Цитология и генетика. 1986.т.20.№4.с.284-287.

36. Стекленев Е.П. Особенности прямых и обратных скрещиваний бизона Bison (Bison) bison L. с домашней коровой [Bos (Bos) taurus typicus] и характеристика гибридного потомства.// Цитология и генетика. 1990.т.24.№5.с.50-56.

37. Стекленев Е.П., Елистратова Т.М. Характеристика воспроизводительной способности гибридов бантенга Bos (Bibos) javanicus D'Alton. с домашней коровой [Bos (Bos) primigenius taurus].//Цитология и генетика. 1992. т.26. №6.с.45-57.

38. Стекленев Е. П. Особенности размножения равнинной формы североамериканского бизона, акклиматизируемого на юге Украины // Вестник зоологии, 1996. № 4-5, С. 60-70.

39. Столповский ЮА. Популяционно-финетический анализ серой украинской породы крупного рогатого скота (Bos taurus primigenius)/У В сб. "Популяционная фи нети ка". Москва. 1997. С. 135-148.

40. Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов ДНК: Методология и свойства. // С.-х. Биология. 1986. №1. С. 14-24.

41. Сулимова Г.Е., Городецкий С.И. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов (3-казеина Bos taurus II С.-х. Биология. 1988. №3. С. 31 -34

42. Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК сельскохозяйственных животных: методология, результаты и перспективы // Успехи соврем, генетики. 1993. N. 18. С. 3—35.

43. Сулимова Г.Е., Бадагуева Ю.Н., Удина Г.И. Полиморфизм гена каппа-казеина в популяциях подсемейства Bovinae. //Генетика. 1996. Т.32. №11. С.1576-1582.

44. Треус В.Д., Стекленев Е.П. Акклиматизация и биологические особенности животных зоопарка " Аскания-Нова".// Сельскохозяйственная биология. 1968. T.III. №5. С.719-723.

45. Уханов С.В., Столповский Ю.А., Банникова J1.B. и др. Генетические ресурсы крупного рогатого скота / М.: Наука, 1993. 170 с.

46. Федоров А.Н., Гречко В.В., Слободянкж С.Я., Федорова J1.В., Тимохина Г.И. Таксономический анализ повторяющихся элементов ДНК // Мол. биология. 1992. Т. 26. N.2. С. 464—470.

47. Хрисанфова Г.Г., Калашникова JT.A. Рестриктный анализ митохондриальной ДНКкрупного рогатого скота.// Доклады ВАСХНИЛ. 1991. №9. С. 43-45.

48. Шубина Е.А., Медников Б.М. Семейства повторяющихся последовательностей в ДНК дальневосточных лососей рода (ОпсогсИипсИю) II Мол. биология. 1986. Г. 20. N. 5. С. 947—954.

49. AM S. Gauri, Bala S. Detection of genome specific monomorphic loci in Bos taurus and Bubalus bubalis with oligodeoxyribonucleotide probe.// Anim Genet. 1993. V.24. P. 199202.

50. Ali S., Muller C.R., Epplen J.T. DNA fingerprinting by oligonucleotide probes specific for simple repeats. // Hum. Genet. 1986. 74. 239-243.

51. Anderson S., De Bruijin M.H.L., Coulson A.R., Eperon L.C., Sanger F. & Young L.G. Complete sequence of bovine mitochondrial DNA, concerved features of the mitochondrial genome.// Journal of Molecular Biolodgy.1982 156. P. 683-717.

52. Avise J. C. Molecular markers, natural history and evolution.// Chapman and Hall. New York. 1994. P. 511.

53. Balajee AS, Dominguez I, Bohr VA, Natarajan AT. Immunofluorescent analysis of the organization of telomeric DNA sequences and their involvement in chromosomal aberrations in hamster cells. // Mutat Res. 1996 V.372 P. 163-172.

54. Becker J., Vos P., KuiperM., Salamini F., Heun M. Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley//Mol. Gen. Genet. 1995. V. 249. P. 65—71.

55. Beckmann J.S., Soller M. Restriction fragment length polymorphisms in genetic improvement: Methodologies, mapping and costs // Theor. And Appl. Genet. 1983. V.67. P.35-43.

56. Beckmann J.S., Soller M. Restriction fragment length polymorphisms and genetic improvement of agricultural species // Euphutica. 1986. V.35. P.l 11-124.

57. Beckmann J.S., Kashi Y., Hallerman E.M., Nave A., Soller M. Restriction fragment length polymorphism among Israeli Holstein-Friesian dairy bulls.// Anim Genet. 1986. V. 17. P.25-38.

58. Beckman J.S., Weber J.L. Wurvey of human and rat microsatellites // Genomics. 1992. V. 12. N.4. P. 627—632.

59. Bell G.I., Selby M.J., Rutter W.J. The highly polymorphic region near the human insulin gene composed of simple tandemly repeating sequences. // Nature. 1982. 295. 31 -35.

60. Bellamy R. J., Inglehearn C. F., Jalili I. K. et al. Increased band sharing in DNA fingerprints of an inbred human population // Hum. Genet., 1991, V. 87. P. 341 -347.

61. Bishop R, Morzaria S, Gobright E. Linkage of two distinct AT-rich minisatellites at multiple loci in the genome of Theileria parva.//Gene. 1998 V.216 P.245-254.

62. Blackburn EH. Telomeres: no end in sight. //Cell. 1994 V.77 V.621-633.

63. Bohlken H. Vergleichende Untersuchungen an wildrindern (Tribus Bovini Simpson, 1945).// Zoologische Jahrbucherabteilung fur Allgeneine Zoologie und Phvlogie. 1958. 68. P. 113-202.

64. Bohlken H. Haustiere und Zoologische Systematik.// Zeitschrift fuer Tierzuechtung und Zucehtungsbiologie. 1961.76. P. 107-113.

65. Bois P, Stead JD, Bakshi S, Williamson J, Neumann R, Moghadaszadeh B. Jeffreys AJ. Isolation and characterization of mouse minisatellites. // Genomics. 1998.V50. P.317-330.

66. Botstein D., White R.L., Scolnick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. // Am. J. Hum. Genet. 1980. 32. 314-331.

67. Bradley D.G., MacHugh D.E., Cunnigham E.P., Loftus R.T. Mitochondrial diversity and the origins of African and European cattle. // Proc. Natl. Sei. USA. 1996. Vol 93. P.5131-5135.

68. Bailey JF, Richards MB, Macaulay VA, Colson IB, James IT, Bradley DG. Hedges RE, Sykes BC. Ancient DNA suggests a recent expansion of European cattle from a diverse wild progenitor species. // Proc R Soc Lond B Biol Sei. 1996. V.263. P. 1467-1473

69. Brown W.M. The mitochondrial genome of animals. In: " Molecular evolutionary genetics" Maclntire R.J. ed. 1985. N.Y.L. Plenum Press. P.95-124.

70. Brown W.M., Gerge M.J. & Wilson A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. // Proceeding of the National Academy of Sciences. USA. 1979.76. p. 1967-1971.

71. Brown WM, George M Jr, Wilson AC. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. // Proc Natl Acad Sei USA. 1979 V.76. P. 1967-1971.

72. Brown WM. Polymorphism in mitochondrial DNA of humans as revealed by restriction endonuclease analysis. // Proc Natl Acad Sei USA. 1980 V.77. P.3605-3609.

73. Burke T, Bruford MW. DNA fingerprinting in birds.//Nature. 1987.V.20.P. 149-152.

74. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition //BioTechnology. 1992. V.10. N.5. P.937—943.

75. Capon D.J., Chen E.Y., Levinson A.D., Seeburg P.H., Goeddel D.V. Complete nucleotide sequence of the T24 human bladder carcinoma oncogene and its normal homologue. // Nature. 1983. 302. 33-37.

76. Cho Y.G., Blair M.W., Panaud O., McCouch S.R. Cloning and mapping of variety-specific rise genomic DNA sequences: amplified fragment length polymorphism (AF1.P) from silver-stained polyacrilamide gels // Genome. 1996. V. 39. P. 373—381.

77. Christmann A., Ladoga P.J.L., Zang K.D. Non radioactive in situ hybridization pattern of the M13 minisatellite sequences on human metaphase chromosomes.// Hum. Genet. 1991. V.86. 487-490.

78. Cornall R.J., Aitman T.J., Hearne C.M., Todd J.A. The generation of a library of PCRanalyzed microsatellite variants for genetic mapping of the mouse genome // Genomics.1991. V. 10. N. 4. P. 874—879.

79. D'Erchia AM, Gissi C, Pesole G, Saccone C, Arnason U. The guinea-pig is not a rodent. // Nature. 1996. V.381 P.597-600.

80. De Woody J.A., Honeycutt R.L., Skow L.C. Microsatellite markers in white-tailed deer // J.Hered. 1995. V. 86. N. 4. P. 317—324.

81. Dolf G, Glowatzki ML, Gaillard C. DNA fingerprinting in cattle using the probe pV47.// Anim Genet. 1992. V.23. P.63-69.

82. Epplen J.T., McCarrey J.R., Sutou S., Ohno S. Base sequence of a cloned snake W-chromosome DNA fragment and identification of a male specific putative mRNA in the mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. 79. 3798-3802.

83. Epplen J.T. On simple repeated GATA/GACA sequences in animal genomes: a critical reappraised. //J. Of Heredity. 1988. 79. 409-417.

84. Epplen JT, Melmer G, Schmidt P, Roewer L, Hundrieser J, Epplen C. Buitkamp J. On the potential of simple repetitive DNA for fingerprinting in clinical, forensic, and evolutionary dynamic studies.// Clin Investig. 1992. V.70 P. 1043-51.

85. Epstein H. The origin of the domestic animals of Africa.// Africana Publishing Corporation.

86. Eyre-Walker A. Evidence of selection on silent site base composition in mammals: potential implications for the evolution of isochores and junk DNA.// Genetics. 1999. V.152 P.675-683.

87. Gatesy J., Yelon D., DeSalle R. & Vrba E.S. Phylogeny of the Bovidae (Artiodactyla, Mammalia), based on mitochondrial ribosomal DNA sequences.// Mol.Biol.Evol. 1992. 9 (3). P.433-446.

88. Georges M, Lathrop M, Hilbert P, Marcotte A, Schwers A, Swillens S. Vassart G. Hanset R. On the use of DNA fingerprints for linkage studies in cattle.// Genomics. 1990. V.6. P.461-474.

89. Georgies M., Lequarre A.-S., Castelli M. et al. DNA fingerprinting in domestic animals using four different minisatellite probes // Cytogen. Cell Genet. 1988. V. 47. P. 127-131.

90. Georges M, Lequarre AS, Castelli M, Hanset R, Vassart G. DNA fingerprinting in domestic animals using four different minisatellite probes. // Cytogenet Cell Genet. 1988. V.47. P. 127-131.

91. Gilbert D. A., Packer C., Pusey A. E., Stephens JC, O'Brien SJ. Analytical DNA fingerprinting in Lions: parentage, genetic diversity and kinship // Journal of Heredity. 1991. V. 82. P. 378-386.

92. Good P. Permutation Tests.// Springer-Verlag. New York. 1993. P. 384.

93. Grodzicker T„ Williams J., Sharp P., Sambrook J. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses.// Cold spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1974. Vol.39. P.439-446.

94. Groves C.P. Systematic relationships in the Bovini (Artiodactyla, Bovidae).// Zeitschriftfur Zoologische Systematik und Evolutionsforschung. 1981. 19 . p. 264-278.

95. Gwakisa P. S., Kemp S. J., Teale A. J. Characterization of Zebu cattle breeds in Tanzania using random amplified polymorphic DNA markers // Animal Genetics. 1994. V. 25. P. 89-94.

96. Hadrys H., Balick M., Schierwater B. Applications of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology//Molecular Ecology. 1992. V.l. P. 55-63.

97. Ol.Haltenorth Th. Klassifikation der Säugetire: Artiodactyla. Handbuch der Zoologie.// 8 B. 32 Lieferung. Berlin. 1963.

98. Hamada H„ Petrino M.G., Kakunaga T. // Proc. Natl. Acad. Sei. 1982. 79. 6465-6469.

99. Harris AS, Wright JM. Nucleotide sequence and genomic organization of cichlid fish minisatellites.//Genome. 1995. V.38. P. 177-184.

100. Hassanin A., Dourzery. Evolutionary affinities of the enigmatic saola (Pseudoryx nghetinhensis) in the context of the molecular phylogeny of Bovidae.// Proc. R. Soc. Lond.B. 1999.226., p.893-900.

101. Hillis DM, Huelsenbeck JP, Cunningham CW. Application and accuracy of molecular phylogenies.// Science. 1994. V.264. P.671-677.

102. Janecek L.L., Honeycutt R.L., Adkins R.M., Davis S.K. Mitochondrial gene sequences and the molecular systematics of the artiodactyl subfamily bovinae.// Mol. Phylogenet. Evol. 1996. V.6. P.107-119.

103. Jeffreys A.J. DNA sequence variants in the Gy-, Ay-, 8- and ß-globin genes of man. // Cell. 1979. 18. 1-10.

104. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable "minisatellite" regions in hyman DNA. //Nature. 1985a. V. 314. P. 67-74.

105. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Individual-specific "fingerprints" of hyman DNA. // Nature. 1985b. V. 316. P. 76-78.

106. O.Jeffreys AJ, Morton DB. DNA fingerprints of dogs and cats.// Anim Genet. 1987. V.18. P.1-15.

107. Kunieda T., Kobayashi E., Tachibana M., Ikadai H., Imamichi T. Polymorphic microsatellite loci of the rat (Rattus norvegicus) // Mamm. Genome. 1992. V. 3. N. 10. P. 564—571.

108. Lewin R. // Science. 1986. 233: 521.

109. Lichtenstein A.V., Moiseev V.L., Zaboikin M.H. A proceder for DNA and RN A transfer to membrane filters avoiding weight-induced gel flattening. // Anal.Biochem. 1990. 15:187-191.

110. Litt M., Luty J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 397-401.

111. Lloyd M.A., Fields M.J., Thorgaard G.H. Bkm minisatellite sequences are not sex associated but reveal DNA fingerprint polymorphisms in rainbow trout. // Genome. 1989. 32. 865-868.

112. Loftus R.T., MacHugh D.E., Ngere L.O., Balain D.S., Badi A.M. Bradley D.G., Cunnigham E.P. Mitochondrial genetic variation in European, African and Indian cattle populations.//Animal Genetics. 1994.25. P.265-271.

113. Loftus RT, Ertugrul O, Harba AH, El-Barody MA, MacHugh DE, Park SD. Bradley DG. A microsatellite survey of cattle from a center of origin: the Near East.// Mol Ecol. 1999. V.8. P. 2015-2022.

114. Lubjuhn T, Schwaiger FW, Epplen JT. The analysis of simple repeat loci as applied in evolutionary and behavioral sciences.// EXS. 1994. V.69. P.33-43.

115. Lunt DH, Hyman BC. Animal mitochondrial DNA recombination. // Nature. 1997.V.387 P.247.

116. Lunt DH, Whipple LE, Hyman BC. Mitochondrial DNA variable number tandem repeats (VNTRs): utility and problems in molecular ecology. // Mol Ecol. 1998. V.7 P. 1441-1455.

117. Lynch M. Estimation of relatedness by DNA fingerprinting// Mol. Biol. EvoL 1988. V. 5, P. 584-599.

118. Lynch M. The similarity index and DNA fingerprinting // Mol. Biol.EvoL 1990. V. 7, P.478-484.

119. Lynch M. and Milligan B. G. Analysis of population genetic structure with RAPD markers// Molecular Ecology ,1994, V. 3, P. 91-99.

120. Ma RZ. Beever JE, Da Y, Green CA, Russ I, Park C, Heyen DW, Everts RE. Fisher SR. Overton KM, Teale AJ, Kemp SJ, Hines HC, Guerin G, Lewin HA. A male linkage map of the cattle (Bostaurus) genome.//J Hered. 1996. V.87. P.261-271.

121. Macaya G., Cortadas J., Bernardi G. An analysis of the bovine genome by densitygradient centrifugation: preparation of the dG+dC-rich DNA components // Eur.J.Biochem. 1978. V. 84. N. 1. P. 179—186.

122. Macgregor R. The domestic buffalo.// Vet.Rec. 1941.53. P. 443-450.

123. MacHugh DE, Shriver MD, Loftus RT, Cunningham P, Bradley DG. Microsatellite DNA variation and the evolution, domestication and phylogeography of taurine and zebu cattle (Bos taurus and Bos indicus).// Anim Genet. 1997. V. 146. P. 1071 -1086.

124. MacHugh DE, Loftus RT, Cunningham P, Bradley DG. Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 microsatellite markers.// Anim Genet. 1998. V.29. P.333-340.

125. Mackill D.J., Zhang Z., Redona E.D., Colowit P.M. Level of polymorphism and genetic mapping of AFLP markers in rice // Genome. 1996. V. 39. P. 969—975.

126. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

127. Marinelli L., Messier F., and Y. Plante. Use of DNA fingerprinting to determine parentage in muskrats (Ondatra zibethicus) // Journal of Heredity, 1992. V. 83. P. 356360.

128. Mathew C.G.P. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA. Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M.N.Y. L.: Humana Press. 1984. V.2. P. 31-34.

129. Matsumoto L.H. Enrichment of satellite DNA of the nuclear matrix of bovine cells // Nature. 1981. V. 294. P. 481—493.

130. Meksem K., Leiser D., Peleman J., Zabeau M., Salamini F., Gebhardt C. A higt-resolution map of the vicinity of the R1 locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers // Mol. Gen.Genet. 1995. V. 249. P. 74—79.

131. Meyne J, Ratliff RL, Moyzis RK. Conservation of the human telomere sequence

132. TTAGGG)n among vertebrates.//Proc Natl Acad Sci USA. 1989 V.86. P.7049-7053.

133. Miyamoto M.M., Tanhauser S.M., Laipis P.J. Systematic relationships in the Artiodactyla tribe Bovini ( family Bovidae), as determined from mitochondrial DNA sequences.// Syst. Zool.1989. 38 (4). P.342-349.

134. Ml.Moazami-Goudarzi K, Laloe D, Furet PJ, Grosclaude F. Analysis of genetic relationships between 10 cattle breeds with 17 microsatellites.// Anim Genet. 1997. V.28. P.338 -345.

135. Modi WS, Gallagher DS, Womack JE. Evolutionary histories of highly repeated DNA families among the Artiodactyla (Mammalia).// J Mol Evol. 1996. V.42. P.337-349.

136. Mommens G, Van Zeveren A, Peelpan LJ. Effectiveness of bovine microsatellites in resolving paternity cases in American bison, Bison bison L.//Anim Genet. 1998. V.29. P. 12-18.

137. Nakamura Y., Leppert M., 0' Connell P., Woler R., Holm T., Culver M. Martin C., Fujimoto E., Holy M., Kumlin E., White R. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. // Science. 1987. 235. 1616-1622.

138. Nave A, Kashi Y, Soller M. Minisatellite and microsatellite length variation at a complex bovine VNTR locus.// Anim Genet. 1997. V.28. P.52 -54.

139. Naylor G.J.P., Brown W.M. Amphioxis mt-DNA, chordate phylogen>. and limits of interence based on comparison of sequences. // Syst.Biol. 1998. V.47. P.61 -76.

140. Pech M., Igo-Kemenes T., Zachau H.G. Nucleotide sequence of a highly repetitive component of rat DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. N. 2. P. 417—424.

141. Pegoraro L., Yong Z., Samake S., Meirelles F.V., Bordingnon V. Moquin L., Smith L.C. Sequence comparison of mitohondrial tRNA genes and origin of strand repl ication in Bos taurus and Nellore (Bos indicus) breeds.// Animal Genetics. 1996. 27. 91-94.

142. Perret J, Shia YC, Fries R, Vassart G, Georges M. A polymorphic satellite sequence maps to the pericentric region of the bovine Y chromosome.// Genomics. 1990. V.6 P.482-490

143. Plucienniczak A., Skowronski J., Jaworski J. Nucleotide sequence of bovine 1.715 satellite DNA and its relation to other bovine satellite sequences // J.Mol.Biol. 1982. V. 158. N. 2. P. 293—312.

144. Plucienniczak G., Skowronski J., Plucienniczak A., Jaworski J. Nucleotide sequence of bovine 1.723 satellite DNA // Z.Naturforsch.C., 1985. V. 40. N. 3. P. 242—249.

145. Poschl E., Streeck R.E. Prototype sequence of bovine 1.720 satellite DNA //J.Mol.Biol. 1980. V. 143. N. 1. P. 147—152.

146. Qi X., Lindhout P. Development of AFLP markers in barley// Mol.Gen.Genet. 1997. V. 254. N. 3. P. 330—333

147. Rand DM, Dorfsman M, Kann LM. Neutral and non-neutral evolution of Drosophila mitochondrial DNA.//Genetics. 1994. V.138 P.741-756.

148. Rao KB, Bhat KV, Totey SM Detection of species-specific genetic markers in farm animals through random amplified polymorphic DNA (RAPD).// Genet Anal. 1996. V. 13. P. 135-138.

149. Ritz LR, Glowatzki-Mullis ML, MacHugh DE, Gaillard C. Phylogenese analysis of the tribe Bovini using microsatellites. // Anim Genet. 2000. V.31. P. 178-185.

150. Royle NJ, Clarkson RE, Wong Z, Jeffreys AJ. Clustering of hypervariable minisatellites in the proterminal regions of human autosomes.// Genomics. 1988. V3. P.352-360.

151. Ryskov A.P., Jincharadze A.G., Prosnyak M.I., Ivanov P.L. Limborskaya S.A. M13 phage DNA as a universal marker for DNA fingerprinting of animals, plants and microorganisms. // FEBS Let. 1988. V. 233. P. 388-392.

152. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of b-globingenomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia//Science. 1985. V. 230. N. 6. P. 1350-1356.

153. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S., Higuchi R.,Horn G. 1. Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase //Science. 1988. V. 239. N. 2. P. 487-491.

154. Schafer R., Zischler H., Epplen J.T. (CAC)s a very informative oligonucleotide probe for DNA fingerprinting. //Nucl. Acid Res. 1988. 16. 5196.

155. Serikawa T., Kuramoto T., Hilbert P., Mori M., YamadaJ., DubayC.J. Lindpainter K. Ganten D., GuenetJ.L., Lathrop G.M. Rat gene mapping using PCR-analyzed microsatellites//Genetics. 1992. V. 131 N. 3. P. 701—706.

156. Singh L., Jones K.W. Bkm sequence are polymorphic in humans and are clustered in pericentric regions of various acrocentric chromosomes including the Y. // Hum. Genet. 1986. 73. 304-308.

157. Sneath P. H. A. and Sokal R. R. Nymerical Taxonomy.// W. H. Freeman. San Francisco. 1973. P. 442.

158. Takezaki N, Nei M. Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA. // Genetics. 1996. V.144. P.389-399

159. Taparowsky E.J., Gerbi S.A. Sequence analysis of bovine satellite I DNA1715 gm/cm3)// Nucleic Acids Res. 1982a. V.10.N.4. P. 1271—1279.

160. Taparowsky E.J., Gerbi S.A. Structure of 1.711b gm/cm(3) bovine satellite DNA: evolutionary relationship to satellite I // Nucleic Acids Res. 1982b. V. 10. N. 18. P. 5503—5512.

161. Tautz D., Trick M., Dover G.A. Cryptic simplisity in DNA is a major source of genetic variation.//Nature. 1986. V. 322. P. 652-656.

162. Teale AJ, Wambugu J, Gwakisa PS, Stranzinger G, Bradley D. Kemp SJ. A polymorphism in randomly amplified DNA that differentiates the Y chromosomes of Bos indicus and Bos taurus.// Anim Genet. 1995. V26. P.243-248.

163. Tokarskaya ON, Kalnin VV, Panchenko VG, Ryskov AP. Genetic differentiation in a captive population of the endangered Siberian crane(Grus leucogeranus Pall.).// Mol Gen Genet. 1994. V.l. P.658-660.

164. Travis S.E., Maschinski J., Keim P. An analysis of genetic variation in Astragalus cremnophylax var. cremnophylax, a criticallyendangered plant, using AFLP markers // MoI.Ecol. 1996. V. 5. N. 7. P. 735—738.

165. Trommelen G. I. J., Den Daas J. H. G., Vijg J. Et al. DNA profiling of cattle using micro-and minisatellite core probes // Animal Genetics, 1993, V. 24, P. 235-241.

166. Vassart G., Georges M., Monsier R., Brocas H., Lequarre A.S. Christophe D. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA. // Science. 1987. V. 235. P. 683-684.

167. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M„ Frijters A. Pot J. Peleman J., Kuiper M., Zabeay M. AFLP: a new techniques for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4407—4414.

168. SS.Wall DA, Davis SK, Read BM. Phylogenetic relationships in the subfamily Bovinae

169. Mammalia: Artiodactyla) based on ribosomal DNA. //J. Mamm. 1992. V. 73. P.262-275.

170. Wal lance R.B. DNA recombinant technology.// Ed.S.Wao.Boca Raton (Fla): CRC press. 1983.

171. Watanabe T, Hayashi Y, Semba R, Ogasawara N. Bovine mitochondrial DNA polymorphism in restriction endonuclease cleavage patterns and the location of the polymorphic sites. // Biochem Genet. 1985. V.23. P.947-957.

172. Watanabe T., Masangkay J.S., Wakana S., Saitou N., Tomita T. Mitohondrial DNA polymorphism in native Philippine cattle based on restriction endonuklease cleavage patterns. // Biochemical Genetics. 1989. 27. P. 431-443.

173. Weber JL, Wong C. Mutation of human short tandem repeats.//Hum Mol Genet. 1993 V.2. P.I 123-1128.

174. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCRwith arbitory primers // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18.N.22. P.7213—7219.

175. Williams I., KubelikA.R., Livak K.I., Rafalski I.A., Tongey S.N. DNA polymorphism amplifed by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. N.22. P. 6531—6535.

176. Wilson GA, Strobeck C. Genetic variation within and relatedness among wood and plains bison populations.//Genome. 1999. V 42. P.483-496.

177. Wolstenholme D.D., Clary D.O., MacFarlane J.L., Wahleithner J.A. Wilcox L. Organization and evolution of invertebrate mitohondrial genoms. In: "Achievement and Perspectives of mitochondrial reserch". 1985. V.2 P.61-69.

178. Wyman A.R., White R.L. A highly polymorphic locus in human DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. 77. 6754-6758.

179. Wyman A., Wolfe L., Botstein D. // Ibid. 1985. 82. 2880.

180. Yu S, Mangelsdorf M, Hewett D, Hobson L, Baker E, Eyre HJ, Lapsys N. LePaslier D. Doggett NA, Sutherland GR, Richards RI. Human chromosomal fragile site I RAI6B is an amplified AT-rich minisatellite repeat.// Cell. 1997 V.88 P.367-374.

181. Zhang DX, Hewitt GM. An effective method for allele-specific sequencing using restriction enzyme and biotinylation (ASSURE B). // Mol Ecol. 1996. V.5. P.591-594.

182. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polimerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V. 20. N. 2. P. 176—181.