Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локализация некоторых нуклеотидных последовательностей на хромосомах курицы методом гибридизации ДНК/ДНК In Situ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Локализация некоторых нуклеотидных последовательностей на хромосомах курицы методом гибридизации ДНК/ДНК In Situ"

Р Г Б ОД

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

УДК 576.3X2.32 : 575.113 САЗАНОВ Алексей Александрович

ЛОКАЛИЗАЦИЯ НЕКОТОРЫХ НУКЛЕОТВДНШС ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НА ХРОМОСОМАХ КУРИЦЫ МЕТОДОМ ГШРИДОЗАЦЩ ДНК/ДНК in situ.

оз.оо.га - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата Сиологических наук

О.ПЕТЕРБУРГ - 1994

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научные руководители:

- кандидат биологических наук, вад.н.с

- доктор биологических наук, проф.

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, проф.

- кандидат биологических наук, ст.н.с

Ведудез учреаденяе - Институт экспериментальной медицины РШ

Защита диссертации состоится ^¿"Зкйогя 1995 г. в "1? час. на заседании Специализированного совета Д 063.57.21. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Патербургском государственном университете по адресу 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почЕвнный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория I.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Университета.

Автореферат разослан " " Х9Э4 г.

Л.Л.Алексеевич А.Ф.Смирнов

И.А.Захаров Т.В.Кузнецова

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Л.Д.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Акт2альндсть_проблемыл Задачи картирования геномов лабораторных и сельскохозяйственных животных являются приоритетна,и в частной генетике соотватствущих видов. Генетические и физические карта хромосом представляют собой инструмент анализа генотипической структуры вида, вскрытия общих закономерностей контроля биологически ваишх признаков.

Велико значение генетических карт и для практической селекция, генетики количественных признаков. При наличии множественно маркированных линий селекционная работа мокет проводиться при помощи высокоэффективного отбора по молекулярным маркерам, проявляющим сцепление со сложно детерминируемыш количественными признаками. Такой подход, являющийся по сути дела реализацией предложенного А.С.Серебровским принципа "сигналей" с Захаров, 1993 >, в наше время называется селекцией с помощью генетических маркеров

< irrarter-aüSistBd soloction >. О ПОМОЩЬЮ ЭТОГО ПОДХОДЕ! уяе УДЭЛОСЬ

добиться некоторых практических результатов < ни im et ai, 1991;

Georgoa ©t al, 1993? findarsson et al, 1994 >.

Несмотря нв то, что первая генетичекая карта z-хромосомн курицы

< груша сцепления v > была опубликована в 1Э25 году i snrobrovsicy,

Uassina, 1926, ЦИТ. ПО Bitgaotl, Эолрз, 1990 > И В 1940 ГОДУ

генетическая карта укв включьла шесть груш сцепления < Hütt»

Lamoreux, 1940,ЦИТ. ПО Bitgood, Somos, 1990 >, В НЗОТОЯЩвЗ ВрЗМЯ

генетические карты этого вида гораздо меньше насшцеш, чем у других лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Тая к началу 90-ых годов из 40 возмокних груш сцепления было известно лшь 10, причем только для пести из них по настоящее время определена хромосомная локализация. Большое число генов не проявляет сцепления ни с одним ранее картированным маркером. Не соотнесены с соответствующими хромосомами группы сцепления i, и, IV и vi, не известки группы сцепления соответствующие макрохромо-

C0M3M 2, 3, 4, 5 < Bitoood, SolílBS, 1990 ).

Применение полиморфных ДНК-маркеров позволило построить три новые генетические карты курицы, включающие в общей сложности 50 групп сцепления < Rothschild, 1994 >. Однако, проблема унификации классических и новых групп сцепления не решена.

В настоящее время ©*зичвски картированными о той или иной

стенанью точности могно считать 44 последовательности ДНК курицы с Ponco da Loon, Burt, 1W3 ». Из них 37 локализованы методом гибридизации in situ, позволяющим определить локализацию с точностью, по крайней мерз, до хромосомного плеча. Енутрихромосошая локализация определена только для 15 нуклеотидаых па еладовательностеа. Для сравнения: у человека число картированных маркеров приближается к 10000, у домовой шя - к 5000, у крупного рогатого скота - К 450 < Rothschild, 1994)

Такое положение во многом определяется особенностью структуры кариотипа птиц: больиим количеством хромосом < у курицы 2п » 7в >, основная честь которых представлена трудаоидентифщируемыми микрохромосомами. Кроме того, в настоящее время отсутствует общепринятая методика определения внутрихромосошой локализации нуклеотидаых последовательностей курицы.

U2ife_2Ji55SHSJJ£C2§S2§SS22i ¡Долью данной работы было насыщение физических карт хромосом курицы молэкулярннш маркерами методом ГИбрИДИЗаЦИИ ДНК/ДЖ in situ. В нахи задачи входило:

I» Определение хромосомы и внутрихромосомной локализации следующих ДНХ-ктрквров:

а> кластера /з-подобных глобиновых генов курицы б> гена трансферринового рецептора курицы < ста > в) последовательностей ДНК курица., гомологичных вирусному онкогену v-fas

г> ТТ-богаткх иянисателлшшх последовательностей ДНК курицы д> последовательностей ДНК курицы, гомологичных генам zfy и sry человека.

2> Определить пригодность неизотопного варианта гибридизации ДНК/ДНК in situ для внутрихромосомной локализации уникальных нуклеотидных последовательностей курицы.

3> Модифицировать способ разделения хромосом курицы на условные единицы и оценить его разрешавшую способность.

.Впервые определена хромосома и внутрихромосомная локализация кластера ^-подобных глобиновых генов, гена трансферринового рецептора, последовательностей ДНК, гомологичных вирусному онкогену v-fos, тг-богатых минисателлитных последовательностей ДНК,

нуклеотидных последовательностей семейств zfv и shy в геноме курицы.

Впорвые соотнесена коштоновская груша сцепления 10 с хромосомой I и соответствуйте!! eft классической группой

сц9пл0ния iii.

Предложен модифицированной и адаптированный к неизотопноку варианту гаЗрвдязацш'ДНКЛЩИ in situ способ разделения хромосом курмвд кз условнее адгасщы, которой позволяет определять внутрихроюсокную локализацию с точностью, принятой при картирования хромосом шю копит анздх.

Увеличение числа маркеров, картированных Енутри хромосом курицы слуии поЕншеюш рэзреяахедей способности физических карт хромосом этого вида.

Определение хромосомной локализации полиморфных ДНК~мзркаров ( гена трансферрииового рецептора, кластера /»-глоОжювцх гонов, ТГ-(Зогатых кинисатвллтшх последовательностей ) мояет бить использовано для соотнесения групп сцеплеш-.я и физических карт хромосом.

Сревнзние расстояний жзхду маркерами по физичзским и генетическим картам в д&льнойгш позволит вн.чвить раяоки ракокбинацкошоя активности и инертности хромосом курпци.

;Шро0аци2_раддтн. Результата ' исследования были доложены на заседании Научного Совета ГКТП "Приоритетные направления генетика"

< Москва, 1993 >, на Международном сюяюзиумэ "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке л игкэнмш геномов сельскохозяйственных кйеотшлс" ( С.Петербург-Пушкин, 1994 > и на семинаре лаборатории генетики яивотних БйШ СПбГУ. Полученные в ходе исследования даншэ били представлены на vr Съезда ВОГиС игл.Н.И.Вавилова

« Минск, 1992 >, на xvn Мэадународном генетическом конгрессе

< Великобритания, Бирмингем, I9S3 >, на i Международной конференции по молвкуляряо-гекзтичзским маркерам kieothkx < Украина, Киев,

Х994 > и на IX Европейской конференции по птицеводству

< Великобритания, ¿яр, 1994 >.

Щйгажации. По материалам диссертации опубликовано S работ.

Настоящая работа состоит из ввздания, обзора литературы ( глава I ), описания материалов и методов исследования ( глава 2 ), результатов исследования ( глава 3 ), обсуждения полученных результатов ( глава 4 ), выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 102 страницах и содержит 3 таблицы ( в главе 4 ) и 12 рисунков ( в главе 3 ). Список литературы содержит 134 наименования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ Препараты штотических хрошеом приготавливали из 96-часовых эмбрионов и первичной культуры эмбриональных фибробластов кур породы бурый леггорн га генетической коллекции БиНШ СШГУ.

В качестве зондов для локализации кластера /?-шдобнкх глобкновых генов использовали слэдущиа последовательности ДНК:

- Есонх фрагмент < 2,5 т.п.н. > плазмиды pAibuq, содержащий ген эмбрионального г-глобинв курицы

- EcoRi/BjmHi фрагмент < 4 т.п.н. > плазмиды píubris, содержащий ген взрослого /í-гдобина курицы < Dodgson et al., 1983 >.

Для определения хромосомной локализации гена трансфзрринового рецептора курицы в качестве ДНК-зонда использовали плазмвду рт7/тз, вклшавдую участок 3'-концевой нетранслируемой области этого гена

I Chan et al., 1939 >.

В качестве еоада для локализации ТГ-богатых ыинисателлитных последовательностей ДНК курицы использовали плазыиду pgb725 < 3,7 т.п.н. >, содержащую минисателлит <тв>п - втоы крупного рогатого

СКОТа < Kashi et al., 1990а >-

Peta фрагмент < I т.п.н. > плазмиды pfbj-2, содержащий вирусный онкоген v-fas, был использован для локализации последовательностей ДНК курицы , ГОМОЛОГИЧНЫХ атому онкогену < Curran et al., 1902 >.

Для локализации последовательностей ДНК семейства sby использовали в качестве ДНК-зонда EcoBi/eamHi фрагмент < 0,8 т.п.н. ) плазмиды pvsa.s, включающий участок гена sby человека

< Sinclair nt al., 1VVO >.

Плазмиду pDPioo7, содергащую одна из екзонов гена zfy человека использовали в качестве ДНК-зондв для хромосомной локализации последовательностей ДНК курицы, принадлежащих к этому семейству

< Paga et al., 1990 >

Использованные в данном исследовании плазмида были любезно предоставлены:

Р/ПВН4 и рдт«15 - В. 3. Таранту лом, институт молекулярной биологии РАН, Москва

PGB723 — Dr. I.Gruenbaum, Hebrew University , Jerusalem, Israel pT7/T3 - Dr. L.Chan, The University of Texas, US«

pKBj-2 - т.Ф.Андреевой, ЕйШ СПбГУ, Санкт-Петербург

pY33,3 — Dr. F.Sinclair, Impririal cancar Research Fund, London, 1Ж PDP1007 - Dr. n.Pages, Whit ahead Institute of Biomedical Researches, CanbridgB, USft.

Фибробласты куриных эмбрионов культивировали по общепринятой методике с FechJraimer et al., 1970 ) О НЭКОТОрЫМН МОДйфИКаЦИЯМИ.

Материал для препаратов митотических хромосом Эб-часовых эмбрионов курицы приготавливали по стандартной методике < Родионов и др., 1981 ).

Генетическую трансформации культуры компетентных клеток е. coi i, выделение плазмидной ДНК, препаративное выделение фрагментов ПЛ22МИД и олигонуклоотидноэ качение ДНК-зсндов проводили по методикам Маниатиса и сотрудников < Маниатис и др., 1984 >.

Гибридизации in situ проводили по стандартной методика

< Gerhardt et al., 19Я1 > с МОДИфИКВЦИЯМИ.

Анализировали мэтафазные пластинки со средней и слабой степенью сшрализации хромосом, имеицие на более двух наложений макрохромосом. При подсчета числа зерен серебра или биотинилированных комплексов учету подлежала только те из них, которые находились непосредственно над хроматидами.

Статистическую обработку результатов проводили путем сражения теоретически овдвемых значений числа зерен серзбра или еиотшшлироввнных комплексов с реально наблвдЕекыми при помощи критврия х2 « Лакин, 1990 >.

Для удобства учета результатов гибридизации in situ Енутри хромосом последние разделили на условные единицы < у.е. >, каждая из которых составляет 1,4% генома. При этом, внутренние районы плеч хромосом разделили на целое число у.е. « за исключением района <i?I, величина которого 1/2 у.е. >. Теломерныэ и центромерше районы хромосом составляют 1/4 у.е.

Теоретически озшдеемые значения меток над кавдыы районом

какрохрокосон вычислял! по формуле:

no-*0,014»k»n

гдэ ко - ожидаемое количество меток к - величина района в у.е. N - сбщае количество маток над всеми хромосомами. В группе микрохромоссм 8 - 12теоретически ожидаемые значения вычисляли путем умножения общего количества меток над всеми хромосомами на долю хромосом этой группы в геноме - 0,079 < siwn et ai., iva? >. Аналогичным образом вычисляли теоретически ожидаемые значение количеств меток для мякрохромосом 13 - ЗВ, доля которых в геноме 0,3 < Shaw et al., 1989 >.

Эффективность гибридизации вычисляли по формуле: м

Е - -JJ3 • 1001

где е - аффектишюсть гибридизации < %% >

n - число меток над районами специфической гибридизации N - общее количество меток над всеми хромосомами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВШЯЩ.1 Кластер д-подобных глобиновых генов является удобной моделью для оптимизации условий гибридизации ДНК/ДНК in situ, поскольку его организация позволяв'!1 использовать несколько клонированных последовательностей в качестве ДНК-зондов. Существуют предварительные дагаыв о связи нуклеотидашх последовательностей этого кластера с одной из крупнейших макрохромосом курицы, полученные методом фракционирования хромосом с последующей блот-гибридазацией ПО Сзузерну < Hughe» et al., 197? ). таким сбразом, до проведения экспериментов было известно, что ганы Р-подобшх глобинов курицы находятся либо в хромосоме I, либо в

XpOMOCOMe Z teitgood, Sotvre, 1990 >.

Для определения хромосомной локализации клалтера /»-подобных глобиновых генов нема поставлены три аксперимента по гибридизации in с»tu с использованием изотопного к неизотопного вариантов этого метода. В качэстве ДНК-зовдов использованы два геномные последовательности этого кластера, одна из которых содержит

структурный ген «-мгСина я часть его 5 -концэеой регуляторяой области, другая - структурный ген л-глобгаэ с участка!.« 3-й 5 -концевых регуляторннх областей. Поскольку посладовательности кодируядас частей имеют слабую гомологию, а регуляторам 5 -конц9еш1 области реЗКО ОТЛИЧаВТСЯ < Roninson, Ingram, 1732, ЦИТ. ПО Dndason at ¿>1., 19S3 >, Оба ЗОВДЗ ДОЛЛИ СПвЦИфИЧвСКИ

гибридизораться с разными последовательностга.м кластзра (^-подобных глобиновых генов на хромосома. Поэтому совпадение результатов гибридизации m ■situ при использовании этих ДКК-зондоа свидетельствует о том, что выявлен именно искомый кластер, а кэ другая единичная последовательность, гомологичная глобиновкм генам ( например, псевдогвн >.

Рззультаты трех проведенных экспериментов свидетельству»! о локализации кластера ^-подобных глобиноЕкх генов а длинном плеча хромосом 2 « район 2ч5-6 > ( рисунок I ), что хсрозо согласуется с данными Хугеса и сотрудников ' Hughes et ai.,

1979 >.

ЗЗСвхткпнопть гибридизации с использованием в качестве ДНК-зонда биотинилирозанной последовательности гена с-глобина составила 29,4S, что cpaasraso с эффективностью гибридизации с использованием меченых изотопом 33р фрагментов этого кластзра < 37,8% и 38,13 >. Принимая во внимание отсутствие статистических различий эффективности двух вариантов гибридизации и сравнительную простоту и удобство ноизотспного варианта, (.и его использовали в поеледунцих экспериментах.

Локадазация__гена__дансфеШгШО£2Ш__Е2ЦШШЭ5_BS___хромосомах,

ВШЙШ Для локализации гена трансферриносого рецептора на хромосомах курщц катодом гибридизации in situ нами' бала использована в качество ДНК-зонда последовательность 3 -ногтевой кетранслируемой области этого гана < сьап at ai., 19В9 >, что долгно было исключить неспбщфичэскув гибридизацию о еозмоеными псввдогенама. Поскольку явка выявлен только один район достоверной гибридизации - район 1ч1 - мозаю считать, что связывание молекул ДНК-зонда происходило именно с геномной последовательность» гона трансфдрринового рецептора ( рисунок I ).

т ipl

/Л ZFY SRY pal yTG

4

t ?

zpz

7 J т

X

ppolyTG cTH

Zpi

гл 2

X

POlyTO ZFY SHY

SRY palyTG

/3-81

ZTY , SHY PolyTG

Г

С

<

5" ^ TO

^v polyTS ZFY

_ Jssv

llv-fo

PolyTC

ZFY

SRY

polyTB

zfy ^jzfy sry IpolyTS

polyTG

palyTG

SRV polyTB My POINTS

Iv-fo*

Рисунок I. Локализация кластера /з-подобных глобиновнх генов (Р-о»), гена трансферринового рецептора курицц (стя), нуклеотидных последовательностей курица, гомологичных вирусному онкогену v-fo» (v-fos), ТГ-богатых минисателлитных последовательностей (poiyTG), нуклеотидных последовательностей курицы, гомологичных генам shy

(SHY) И ZFY (ZFY) ЧвЛОВВКВ.

10

Среда девяти кодарукщп: генов, последовательности которых использованы для построения комптоновских генетических карт

< Bumstoad, Pal уда, 1992 >, бЫЛ Г6Н ТраНСфЭррИНОВОГО рОЦЭПТОра,

который оказался сцеплен с двумя аношпяпаги последовательностями ДНК. Вместе они составляют комптоновскув группу ецэплзния 10. Поскольку, ган трансферринового рецептора локализован нами в хромосоме I, можно сделать внеод о соответствии ксмптоновской группы сцопления 10 хромосома I и классической группе сцепления in.

Царгщх2В2Ш19_нгмаа1Идаах_т2Л2Шва1ельв0£!1еа._ЕеЕ01аа__вургШд Есуологачинх. БИВУСШУУ-ОЩОгену.угГоч^ При блот-гибридизации по Саузерну тотальной ДНК курицы о последовательности) ДНК, содержащей v-fo<s, выявляется ОДИН фрагмент величиной 9,1 - 9,3 Т.П.Н. < Curran ot ai., 1982 >. Авторы, предполагают, что данный фрагмент содержит клеточный протоонкоген с-ta*. Высокий эволюционный консерватизм нуклеотидных последовательностей известных онкогенов дает основания полагать, что клеточный протоонкоген с-гм курицы имеет значительную ГОМОЛОГИЮ С v-fo» < Curran at al., 1982 >-

Вероятно, и в случае гибридизации »n «»tu мишенью является именно клеточный протоонкоген с-гоя, хотя • priori нельзя исключить наличие других точек специфической гибридизации.

Полученные нами двнша свидетельствуют о локализации нуклеотидных последовательностей курицы, гомологичных вирусному онкогену v-foe, в хромосоме 3 ( район 3ч1 ) и в группе микрохромосом 8 - 12, м ( рисунок I ). Поскольку клеточный протоонкоген с-го» представлен в геноме, скорее всего, одной копией

< Curran et ai., 1982 >, трудно предлогить однозначную интерпретацию результатов гибридизации in situ последовательности вирусного онкогена v-fo» на хромосомах курицы. Неясно, в каком из двух районов достоверной гибридизации находится клеточный протоонкоген c-fos, а в каком другие возможные гомологи этого гена.

Наличие достоверного района локализации последовательностей ДНК курицы, гомологичных вирусному онкогену v-ros, в хромосоме 3 не подтверждает гипотезу Тереби и Лая о жесткой приуроченности твкого рода последовательностей к группе микрохромосом 8-12, и < Тагвьа, Lai, 1982 > и хорошо согласуется с предположением Copera и сотрудников о присутствии в геноме курица нескольких районов

локализации онкогенов < scret Bt ai-, гччо >.

Эффективность гибридизации в этом эксперименте составила 25,2%, что сопоставимо со значением этого показателя при использовании в качества ДНК-зондов геномных последовательностей курну ( например, для гана трансферринового рецептора эффективность гибридизации составляла 24,4% ).

Однако, слогогасть иктерпрэтацш данных, полученных при исподьзозагнш ДНК-зон,?,ов вирусного происхождения, свидетельствует в пользу того, что использование в атом качестве геномных последовательностей является предпочтительным для физического картирования хромосом.

Йспрвд9лагс50„ТГ-всга2ш;__^ДС§2§Л:Ш1Щ,__Шслоддвате^

при гибридизации m situ последовательности < то >п - итси с ДНК штотичэских хромосом куриод достоверно выявляются все телокэрназ районы макрохромосом, цектрокарный район хромосома X и мнкрохромосомы ( рисунок X ). Следовательно, ТГ-богатые минксателлптаые последовательности ДКК на дкЗДузно распределит в геноме курицы, а образуют кластеры, которые, как правило, приурочены к теломаршгм районам хромосом.

В генома курицы содержится почти в 10 раз меньше пучков ПОЛИ(ТГ), чем У человека И МЫШИ < Hamad* at al., 1982 ), что безусловно ограничивает применение таких пучков для геномного каргаровакия. Выявленная нами кластеризация ТГ-богатых минксателлитных последовательностей курицы в теломерных районах, хромосом накладывает еще болыига ограничения на их применение для этой цели . Вероятнее всего, такие последовательности можно будет использовать только для маркирования локусоа, расположенных в кзпооредстзенноГ; близости от теломэров.

___ищвотидкух___последовательностей

На хромосомах курицы

наш обнаружено насколько районов локализации нуклеотидкых последовательностей, гомологичных генам бяу и zfy человека. Этим гонам, и, прежде всего, гену shy приписывается определящее значение в процесса диК£нрещировки первичной бисексуальной гонады В семенники < рлвв ot al., 1907; Sinclair ot al., 1990 >. ]1рвдполагают, что продукты этих генов выступает в качество своеобразных "ростовых факторов", обеспечиващих опережащее

развитие особей гетерогомэтного кола - самцов у млекопитающих и

самок у ПТИЦ < Zwinewan et al., 1993» Goodfellow, Lowel 1 -Badge,

1993 >. В то se время, на все авторы допускают существовать подобного мэхвтзмэ определения пола у птиц.

Нуклеотидные последовательности, гомологичные генам shy и zfy человека, классврздируют по степени гомологии и относят к

семействам SHY И ZFV ( Griffiths, 1991; Lanfaar, Holland, 1991 >.

Особенностью птиц, согласно полученным нам данным, является мно»9стЕвнная локализация последовательностей ДНЧ семейств sry и zfy в хромосомах. Подобная закономерность показана также в экспериментах по амплификации методом полимервнной цепной реакции генов семейства sry двух отрядов класса Aves < enfftths, 1991 >. Вместе с тем, сообщается только о двух нуклеотидных последовательностях семейства zfy у птиц, которые в значительно менызей степени дивергировали от своего гомолога у млекопитавщих, чем гены смейства sry t Lanfear, Holland, 1991 >.

Наши данные согласуются и с шводами цитируемых вьгае авторов

< Griffiths, 1991? Lanfaar, Holland, I'm i об ОТСУТСТВИИ ПОЛОВОГО

диморфизма по качественному составу нуклеотидных последовательностей семейств shy и zfy. Нами не было выявлено районов их локализации в w-хромосомо.

В геноме курицы нуклеотидные последовательности семейств buy и zfy имеют пять общих сайтов локализации: 1рт, 2рт, 4qT, zpt и zPc

< рисунок I ). Наличие в составе возможных продуктов этих последовательностей доменов связывания с ДНК позволяет сделать предположение о кластеризации в геноме курицы некоторых генов специфических транскрипционных факторов. Другим вариантом интерпретации полученных данных является предположение о совмещении во времени экспрессии последовательностей семейств sry и zty, как это Оыло показано Цвиягмансм и сотрудниками < zwinenan *t ai., 1993 > на эмбрионах мыши. В утом случеэ пространственная близость могла бы облегчить вовлечение этих последовательностей в транскрипционные процессы.

Механизм определения пела у птиц гораздо менее изучен, чем у млекопитающих. Показано, что у курицы развитие особей по самачьому типу связано с экспрессией гена ароматазн < wiison at «i., i9o/5

Elbracht, Saith, 1992 >- ЦЗВЗСТН0 т8ккэ, ЧТО ЦрОДУКТЫ ГвНа SRY у

млекопитающих регулируют активность ароматазы и антимюллерова гормона t ндво в»- ai-, 1Ч9з >. Таким образом, участка генов семейства shy в начальных этапах определения пола у млекогатавдих, а также его более раннее включение у того пола, у которого раньше в эмбриогенезе закладываются гонада ( у млекопитающих это самцы, у птиц - самки ) « zwinBoian et ei., 1993 >, дает основания полагать, что у птиц гены самайства shy направляй? развитие по сашчьеку пути.

Пейда и сотруднши в 1987 году < Pag» at ai., 19В7 > впервые показали отсутствие полового диморфизма по количеству нуклеотидных последовательностей курица, гомологичных гену zfy человека. На основа этих данных ааторы выдвинули гипотезу о происхождении половых хромосом млокопитащих от пары гомологичных хромосом общего предка млокогитащих и птиц. При этом предполагалось, что у птиц эти хромосомы не дифференцировалась в половые. Ранее Оно « oimo, 1966 > предположил общность пропсхсадения х-хро?жзсомы млекопитающих и z-хромосомы птиц. Однако, в ряде исследований показано, что некоторые гены, х-сцепленше у млекопитающих ( фосфоглицераткиназы, глюкозо-6-фосфат-дэгидрогеиазы, дистрофгаа ), является аутосомшми

У ПТИЦ < Bbatnagar, 1969; Can, Cooper, 1978; DoreihQuaz-Steglich at

ai., 1990 >. о другой стороны ряд генов, локализованных в 2-хромосоме птиц ( аконитазн, креатин гагаазы ) являются аутосомными у млекопитающих < Bovarstocfc et ai., 1982 >. в то »а время ген орнитинтранекзрбамилазы картирован в х-хромосомэ нескольких видов млокопитащих И В z-ХрОМОСОМЭ курицы < Doainoues-Steglich, Schnid, 1991 >. Полученные нами данные позволяют по-новому взглянуть на эту проблему. Возможно, v-хромосома млекопитающих имеет общее происхождение с одной из хромосом птиц, имеодзй общий район локализации генов семейств snv и zfy. Наиболзе вероятным является район zpc. В v-хромосоме человека гены suv и zfy такка являются тесно сцепленными и находятся Бблизи центромера < iwdon et ai.,

1989 цщ, Ш Zwingman et al., 1993; Sinclair ot el., 1990 ).

Следовательно, кокко считать районы их локализации участками гомологии хромосом человека и курицы. Поиск других обидах локусов y-хромосош млекопитающих и z-хромосомы птиц позволит проварить эту гипотезу.

Таблица I. Суммарный данные по эффективности гибридизации in situ в проведенных экспериментах.

ДНК-зонд вариант гибридизации N N a Е С£> b биологический еид, из генома которого получен ДНН-зовд

fl-ql И 168 64 38,1 2 Gallus domettleu«

И 133 50 37,8 2 Gallus dornasticus

e-gl Н I3S 40 29,4 г Gallus dornestleus

сТН Н 373 91 24,4 i Gallun donostlcu^

v-fos Н 250 63 25,2 2 вирус FBJ-rtSVI

paly<Тв1 Н 2174 1916 88,1 20 Qos taiirus

ZHY Н 1058 598 56,5 15 Ilona saplan»

SRV н 1047 506 48,3 13 Homo sapiens

Условные обозначения:

И - изотопный вариант гибридизации in »itu Н - неизотопный вариант гибридизации m attu n - общее число меток в эксперименте n - число меток над районами достоверной гибридизации к - число районов достоверной гибридизации ДНК-зонда

Перспективы___карти2ова1гая___хромосом___курицы___о__помдщью_

одной из задач нашего исследования была оценка эффективности неизотопного варианта гибридизации m situ в сравнении с более традиционным изотопным. Как следует из таблицы I, несмотря на насколько большее значение этого показателя при использовании изотопного варианта ( 37,8% и 38,155 ) ( таблица I ), достигнутая нами эффективность гибридизации биотикилированного ДНК-зовда, вклтащего последовательность гена

í-глоохнв, составила соизмеримую величину - 29,4% < р > о,оз ».

Известно, что эффективность гибридизации зависит также от степзни гомологии молекул ДНК-зонда выявляе*:ым с их помощью геномным нуклеотидным последовательностям и от числа сайтов специфической гибридизации. Согласно полученккм нами данным, не обнаруживается существенных различий в эффзктавности гибридизации при использовгшш в качестве зондов геномных последовательностей курицы и фрагментов вирусного генома ( 24,42 и 25,2% соответственно ). Хотя, в данном случае, могло оказать влияние и число сайтов специфической гибридизации ( соответственно I и 2 ). Выявление двух районов локализации кластера ^-подобных глобиноЕкх генов - 2qb и йчо ( рисунок I J - связано скорее с техникой статистической обработки, чем с существованием дополнительных копий этой последовательности и, поэтому, существенного влияния числа сайтов на эффективность гибридизации в данном случав не наблвдается. Следует отметить, что некоторые уникальные гены человека такха были картированы в двух близко расположена районах < например, воысось,

Наибольсая вф£ектквшсть гибридизации < 83,1% ) была отмечена при использовании в качестве ДНК-зонда бкотинилкровашгай плазмиды p6U72f., содержащей последовательность ТГ-Согатого минисателлита воз taurus. Слэдует отметить .высокую степень повторяемости Енугри кластеров таких последовательностей < Moran et л., гчп > и наличие большого числа районов достоверной гибридизации этого ДНК-зозда ( 20 ) ( таблица I ). В целом, для умеренных повторов, какими являются и мннисаталлиты, характерна повшзошшя по сравнении с уникальными последовательностями способность к связывании молекул ДНК-зонда < LícJltnr et al., 1991 ).

В отноаегеш нуклеотидных последовательностей семейств вйу и zfv необходимо отметить высокий эволюционный консерватизм их первичной структуры и наличие в составе их продуктов доменов связывания с ДНК, присутствующих во МНОГИХ Транскрипционных факторах < Zwingman

et al., 19V3; GoodfeHoM, Lowall-Bodge, 1993 ). СраВНИТвЛЬНО

высокая эффективность гибридизации при использовании в качества ДНК-зондов биотинилированных последовательностей генов s»y и zfv человека ( 48,32 и 56,556 ) момзт быть объяснена как больной степенью гомологии этих генов с геномными последовательностями

КУрЩЫ < Oil-olla ot al-, lWtj Griffiths, 1991 ),TBK И

наличием больного числа районов их локализации ( соответственно 13 И 15 ).

Разрешающая способность современных методик гибридизации in situ на митотических хромосомах млекопитающих достигает 3 - 15 *

I03 Т.П.Н. ' HcNoil at al., 1991; Trask, 19-71 >. ПрИМЗНЯвМЫЙ Н8МЙ

способ разделения хромосом на условные единицы позволяет достичь разрешение до 14 » I0"3 т.п.н. при анализе результатов гибридизации in situ во внутренних районах плеч хромосом и до 4 * IQ3 т.п.н. в цэнтромаршх и теломерных районах.

Таким образом, модифицированный нами подход практически не уступает классическому способу совмещения дайеренциальных окрасок с гибридизацией in situ по разрешающей способности и мокет быть применен для дальнейших исследований по внутрихромосомной локализации нуклеотидкых последовательностей курицы.

ВНВО.Ш.

1) Осуществлена хромосомная привязка и определена Енутрихромосомная локализация шости молекулярных маркеров.

2) Кластер ^-подобных глсбиновых генов картирован в хромосоме 2. Сайтом локализации кластера является район 2ч5-6. Впервые для локализации кластера использованы последовательности ДНК двух геноэ - гена эмбрионального е-глобина и гена взрослого л-глобина.

3) Ген трансферршового рецептора курицы < стя > картирован в хромосоме I. Сайтом локализации этого гана является район Iql. Это позволяет установить соответствие комзтоновской группы сцепления 10, в которую входит ген стя, и хромосомы I.

4) Последовательности ДНК курица, гомологичные вирусному онкогену v-fos, картированы з хромосоме Зав группе хромосом 8-12,и. В хромосоме 3 такая последовательность находится в районе Зч1.

5) Выявлено распределение ТГ-богатой минисателлитной ДНК преимущественно в теломерных районах хромосом курицы. Это свидетельствует об ограниченности применения этих последовательностей для маркирования генов количественных признаков.

6) Выявлена многдаственная хромосомная локализация нуклеотидных

последовательностей семейств zfy и sky. обнаружено пять общих сайтов локализации последовательностей ДНК этих семейств, два. из которых находятся в z-хромосоме.

7) Показана возможность внутрихромосомной локализации повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК на хромосомах курицы с помощью неизотонного зарианта гибридизации tu situ.

8} Предложен кодифицированный способ разделения хромосом курицы на условные единицы, позволяпдй определять внутрихромосомную локализации с точностью, принятой при картировании хромосом млекопитающих.

СПИСОК РАБОТ, ОПШШКОВАИШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сазанов A.A., Дукельская A.B., Алексеевич Л.А. Выявление кластера р-глобиновых генов в длинном шюча хромосомы 2 домашней КУРИЦЫ С ПОМОЩЬЮ ГИбрИДИЗаЦИИ ДНК/ДНК in situ // Цитология - 1992.т. 34. - 0. 35-40.

2. Алексеевич Л.Л., Сазанов A.A. Исследования по частной гена иже курицы // Генетика. - 19Э4. - Т. 30. - С. III3-II22.

3. Дукельская A.B., Сазанов A.A., Алексеевич Л.А. Локализация кластера р-глобиновых генов и онкогена v-fos методом гибридизации in situ на митотических хромосомах курицы // Материалы vi съезда ВОГиО им. Н.И.ВзЕШЮва. - 1ЭЭ2. - Минск. - ч. 2. - С. 52.

4. Оазанов A.A., Алексеевич Л.А., Сазанова А.Л., Дукельская A.B., Смирнов А.Ф. Физическое картирование хромосом курицы // Тезисы докладов i Международной конференции по молвкулярно-генетическим маркерам животных. 27-29 января 1994. -Киев.: Агрария Наука. - С. 62-63.

5. Duclctalskaya A.v., Sazanov A.A., Alexnyovich L.A., Gazanova A. L_, Smirnov A.F. Happing chicken chromosomes // Abstracts of XVII International Congress of Gnnatxca. - 1993- - Birmingham. — P. 13Q.

6. Sazarioy rt.ft., Duck&lokaya A.V., Alexeyevich L.A.T Sazanova Й.L., Nidenfur A.V. , Smirnov O.F. Chromosomal localization of бвувгл1 DNA-probos // Proceedings of 9th European Poultry Confaronco, Ayr. 1994.- v. 2 - P. 371-372.