Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимосвязи накопления биомассы и токсина с динамикой физико-химических параметров глубинного периодического культивирования CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE PW 8

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимосвязи накопления биомассы и токсина с динамикой физико-химических параметров глубинного периодического культивирования CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE PW 8"

! На правах рукописи

РГБ ОД

2 5 НОЯ Ъ±о

РОЩУГЖИНА МАРИЯ НИКОЛАЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ И ТОКСИНА С ДИНАМИКОЙ ФИЗИКО - ХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ГЛУБИННОГО ПЕРИОДИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СОКУЫЕВАСТЕШиМ Э1РНТНЕШАЕ Р,№ 8

03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

-доктор медицинских наук Грубер И.М

- кандидат медицинских наук Свиридов В.В.

- доктор медицинских наук, профессор Н.Б.Егорова

- доктор медицинских наук, профессор H.H. Костюкова

- МНИ И Эпидемиологии и Микробиологии

им. Г.Н. Габричевского

Защита состоится 19 декабря 1996 г. в 14 — часов на заседании диссертационного совета Д 001. 36. 01. при НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Российской Академии медицинских наук по адресу: 103064, г.Москва, Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан 18 ноября 1996 г.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Увеличение в 1990-1993г. заболеваемости дифтерией, наряду с проблемой охвата населения иммунизацией (Зимина Л.Г., Зайцева О.Н., 1993; Маркина С.С.,1996; Farizo K.M. et |а1.,1993; Simoneon О., 1989), ставят вопрос и о качестве используемого для профилактики препарата -дифтерийного анатоксина (ДАТ).

Для решения этой задачи исследования проводятся в двух направлениях: во-первых, разрабатываются новые препараты вакцин для создания не только антитоксического, но и антибактериального иммунитета (Мац А.Н., Булк В.Ф., 1969; Шмелева Е.А., 1991) и, во-вторых, совершенствуется процесс получения дифтерийного токсина-анатоксина (Сиротинский A.B. с соавт., 1995).

В биотехнологической цепочке получения ДАТ, наряду с другими этапами, особо важными являются процесс культивирования C.diphtheriae и оценка накопления ДТ. Однако, действующая в настоящее время система контроля промышленных процессов биосинтеза ДТ включает только некоторые периодически измеряемые параметры (pH, t°) и величины, характеризующие состояние культуры (концентрация биомассы - OD/мл, накопление антигенного материала - Lf/мл и биологические свойства - DLM/мл).

В то же время данные о различной иммуногенности ДАТ при одинаковом содержании антигенного материала, определяемого в реакции флокуляции (РФ) (Валдохина И. Ф., 1972; Чеботарева C.B., Черткова Ф.Н, 1973 и др.) ставят вопрос о стандартизации ДТ, в том числе на основе выбора более чувствительных и специфических тестов его оценки. Имеющиеся сведения о взаимосвязи токсинообразования с активностью дыхания (Эссель Е.А. 1960; Наумов A.C.. 1967; Pappenheimer L., 1977; Машилова Г.М. с соавт., 1977) являются предпосылкой к расширению спектра используемых контрольных параметров, отличающихся

информативностью и оперативностью.

Поэтому целесообразно, говоря о подходах к стандартизации ДТ, обратить особое внимание на изучение различных физико-химических условий культивирования (окислительно-

восстановительного потенциала, состава отходящей из ферментера газовой смеси и др.) и оценку накопления ДТ, с использованием, наряду с традиционными таких современных методов, как тесты микроцитотоксичности на культурах клеток и ИФА с моноклональными антителами (МкАт) (к протективному С-концевому

участку ДТ) и поликлональными (ПкАт). Такой подход может способствовать разностороннему изучению процессов получения нативного токсина с постоянным фракционным составом и избежать значительной вариабельности иммунобиологических свойств серий

ДАТ.

ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ заключается в изучении физиолога - биохимических особенностей C.diphtheriae PW8 на основе использования различных физико-химических параметров процесса периодического глубинного культивирования и современных тестов оценки активности токсина in vitro.

Для осуществления поставленной цели предполагалось решение следующих конкретных задач:

1. Изучение влияния окислительно-восстановительного потенциала на биосинтетические свойства C.diphtheriae PW8 при глубинном периодическом культивировании.

2. Анализ динамики потребления кислорода и выделения диоксида углерода в отходящей • из ферментера газовой смеси в сравнении с накоплением биомассы и антигенного материала.

3. Определение влияния содержания углеводного субстрата (глюкозы) на рост и накопление антигенного материала в динамике глубинного периодического выращивания C.diphtheriae PW8.

4. Сравнительное изучение динамики накопления антигенного материала в РФ и токсина в ИФА с использованием МкАт и ПкАт в процессе глубинного периодического культивирования C.diphtheriae

PW8.

5. Изучение взаимосвязи биологической (токсической) активности ДТ, определяемой in vivo (по DLM на морских свинках) и in vitro (по МЦТД в культуре клеток СНО.

i

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Доказана информативность и целесообразность включения в систему контроля процессов культивирования C.diphtheriae PW8\ таких параметров, как окислительно-восстановительный потенциал, концентрации кислорода и диоксида углерода в отходящей из ферментера газовой смеси, и тестов оценки накопления ДТ по, данным ИФА с МкАт и микроцитотоксичности в культуре клеток СНО.

Отмечено, что увеличение ¡ окислительно - восстановительного потенциала исходной питательной среды сказывается на биосинтетических свойствах микроорганизмов, в частности, на увеличении скорости накопления антигенного материала.

На основании профиля : изменений окислительно восстановительного потенциала и концентраций кислорода и диоксида углерода можно судить о фазах роста и дать ориентировочную оценку накопления антигенного материала.

Отмечено, что стабилизация уровня высокой интенсивности дыхания C.diphtheríae совпадает с периодом высокой удельной скорости накопления антигенного материала.

В процессе глубинного периодического культивирования C.diphtheriae изучено накопление токсина в ИФА с МкАт и ПкАт и его токсичности по МЦТД в культуре клеток СНО и показана большая информативность этих тестов по сравнению с реакцией флокуляции, как методов контроля за процессом получения стандартных препаратов. Выявлена прямая корреляция (г=0,98) при сравнительном изучении токсической активности ДТ in vivo на морских свинках и in vitro в культуре клеток СНО. При этом показано, что динамика накопления токсина в вышеуказанных тестах совпадает с данными, полученными в ИФА с МкАт.

На основании литературных и экспериментальных данных составлена комплексная система оценки процесса культивирования C.diphtheriae и накопления ДТ, расширяющая спектр общепринятых показателей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые показана целесообразность включения в систему обязательных критериев характеристики питательных сред их окислительно-восстановительного потенциала, влияющего на качество целевого продукта микробного синтеза.

Дано научное обоснование расширения существующей схемы оценки ДТ в условиях производства, заключающееся в возможности быстрой и точной биологической активности препаратов in vitro в культуре клеток СНО (по МЦТД) и ИФА с МкАт.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Определение взаимосвязи накопления биомассы и антигенного материала с такими физико-химическими параметрами процесса культивирования С.сИрИЖепае, как окислительно восстановительный потенциал, состав отходящей из ферментера газовой смеси, рН и концентрация углеводного субстрата, может способствовать прогнозированию периода максимального накопления антигенного материала.

2. Использование ИФА с МкАт и ПкАт и теста микроцитотоксичности в культуре клеток СНО позволяет быстрее определить иммунобиологические свойства нативного токсина в динамике процесса культивирования С.(Ир1йЬепае и существенно дополнить общепринятые методы его контроля - определение накопления антигенного материала - в реакции флокуляции и токсических свойств по ОЬМ на морских свинках.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), главы "Материалы и методы" и собственных исследований (3 главы), заключения, выводов и указателя литературы, включающего 130 отечественных и 112 зарубежных источников. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 10 рисунками.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИВС им., И.И.Мечникова (Москва, 1994); международной научно-технической конференции "Автоматизация биотехнических систем в условиях рыночной экономики (Москва, 1994); конференции "Процессы и оборудование химических производств" МИХМ (Москва, 1994).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела условно патогенных бактерий НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (12.09.1996).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использованы микробиологические, физико-химические, иммунохимические, серологические, статистические методы. !

В качестве объекта исследования избран высокотоксигенный производственный штамм С.&рЬ&епае РХУ8 варианта МазвасАив^я, переданный с предприятия "Биомед" им. И.И.Мечникова.

Управляемое глубинное периодическое культивирование С.сИрАЖегше проводили в общепринятой среде Лингуда в экспериментальном ферментере АНКУМ-2М (с рабочим объемом 8л.). Ферментер имеет систему автоматического контроля и управления 1°, рН, р02, регистрации еН, состава отходящей из ферментера газовой смеси, подачи воздуха в ферментер и числа оборотов перемешивающего устройства. Все измеряемые параметры непрерывно регистрируются на многоканальном самопишущем приборе. _

При проведении управляемого глубинного культивирования С-сИрИЖепае использован подход, определенный на основе литературных данных, заключающийся в:

1 - использовании шуттелированной посевной культуры в фазе экспоненциального роста;

2 - поддержании оптимального уровня р02 для синтеза токсина в пределах 20-30% от полного насыщения, которое осуществляли путем регулирования подачи воздуха в ферментер (0,08-1,7л/мин.) и числа оборотов мешалки (140-360 об/мин.).

Всего проведено 18 процессов культивирования.

Для анализа процессов культивирования использовали следующие показатели;

оптическая плотность культуры-ОО (Е0, измеренная на ФЭК-56М при длине волны 560 нм;

длительность фаз роста по методу Лоджа и Хиншельвуда, (Перт С.Дж., 1978);

концентрация субстрата (Sgl) по Дюбуа (1984);

окислительно-восстановительный потенциал (гН2) расчитывали на основе еН0 и рН, определенных с помощью соответствующих электродов непосредственно в процессе культивирования (Смирнов С.Г., 1978);

анализ отходящей из ферментера газовой смеси по концентрациям кислорода и диоксида углерода с использованием пульта газового анализа (ПГА) системы "Респикон" (Бабурин A.A.,

1978).

В фильтрате культу ральной жидкости изучали: накопление антигенного материала в соответствии с общепринятым методом Рамона в РФ по Lf/мл (Аксенова Т.А. с соавт., 1978);

накопление ДТ в ИФА с МкАт с использованием моноклонального диагностикума "Дифтерия - Монозим" и ПкАт (Зайцев Е.М., 1985; Свиридов В.В., 1986);

биологическую активность Д Г in vivo на морских свинках по DLM/мл (Аксенова Т.А. с соавт., 1978) и in virio в тесте микроцитотоксичности в культуре клеток яичника китайского хомячка (СНО) по МЦТД/мл (по методике Miyamura К. et al., 1984; Свиридова B.B. с соавт., 1995).

На основе приведенных параметров и показателей расчитывали абсолютные и удельные скорости роста, потребления кислорода и выделения диоксида углерода, накопления антигенного материала и токсина (Бабурин A.A., 1987; Демидович Б.П., Марон И.А., 1966; Перт С.Дж., 1978), а также продуктивности процесса по выходу биомассы и токсина (Волкова Н.В., 1973) и экономические коэффициенты выхода биомассы и токсина по утилизированному субстрату (Мельникова В.А., Баснакьян И.А., 1984).

Математическую обработку данных проводили по программе, специально разработанной для этой цели Поляченко Д.В. При статистической обработке результатов использованы общепринятые методы, включая непараметрические (Ашмарин И.П, Воробьев A.A., 1962; Гублер Е.В., Генкин A.A., 197}; Плохинский H.A., 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В задачу исследования входило изучение влияния различных физико-химических факторов и тех их пределов, которые способствуют накоплению биомассы и ДТ. Это относится к таким физико-химическим параметрам, как окислительно-восстановительный потенциал, рН, потребление кислорода и выделение диоксида углерода, режим углеводного питания, т.е. к факторам, которыми можно контролировать и регулировать процесс культивирования. Эти параметры, как было показано на примере других микроорганизмов, могут влиять на конечные продукты микробного синтеза (Грубер И.М. с соавт., 1986; Зорин Н.А. с соавт., 1984; АкавЫ К. е! а1., 1979; Магоапес М. е1 а!.. 1984).

При анализе процесса глубинного периодического культивирования, проведенного с соблюдением условий , описанных в разделе "Материалы и методы", установлено закономерное накопление биомассы и антигенного материала в культу ральной жидкости до 27 ч.к. (Рис.1), что происходит быстрее, чем в производственных условиях - до 36ч. выращивания (Ильницкая И.Ю., Баснакьян И.А., 1986; Лобанова А.Н. с соавт., 1973).

Наблюдения за изменением направления кривой окислительно-восстановительного потенциала в динамике процесса культивирования С.&рЫЬепае позволяет определить окончание фазы экспоненциального роста. Так, перегиб кривой еН„ от снижения к его увеличению свидетельствует об окончании экспоненциальной фазы роста (Рис.1). Сопоставляя динамику окислительно - восстановительного потенциала с другими параметрами процесса выращивания С.сИрЬЖепае (Табл.1) отмечено, что максимальная абсолютная скорость накопления антигенного материала наблюдается при более высоких значениях гН2 и рН, чем максимальная абсолютная скорость роста, что подтверждено статистически при использовании непараметрического парного критерия "Т" Внлкоксона. С другой стороны анализ гН2 и рН различных серий исходной питательной среды (Табл.2) позволил заключить, что даже при небольших отличиях гН2 (10,20-12,67), правомочно разделение серий сред на две группы, поскольку при использовании непараметрического критерия "и" Вилкоксона между ними выявлены статистически значимые различия. При этом отмечено увеличение максимальных скоростей накопления антигенного материала и биомассы во II группе с более высоким уровнем гН2 исходной питательной среды. В то же время различия по рН между группами не выявлены. Этот факт позволяет рекомендовать

использование гН2 исходных питательных сред, как информативный дополнительный фактор, наряду с определением рН, для характеристики питательных сред.

Таблица 1.

Окислительно-восстановительный потенциал (гН2) и рН, определяемые в разных процессах культивирования C.diphtheriae PW8 при максимальных значениях абсолютных скоростей роста (dOD/dt max) и накопления антигенного материала (dLf/dt шах)

№ гН„ ранго- РН ранго-

при при раз- вый при при раз- вый

dLf/dt dOD/dt ность номер dLf/dt dOD/d ность номер

шах max шах t шах

1 7,43 5,77 1,66 6 7,75 6,60 1,15 9

2 6,40 4,57 1,83 7 7,90 7,80 0,10 3.5

3 4,20 4,53 -0,33 3,5 7,80 6,80 1,00 8

4 5,27 5,55 -0,28 2 8,25 8,31 -0,06 2

5 4,27 4,27 0 1 8,25 8,25 0 1

6 6,76 6,43 0,33 3,5 7,50 7,80 -0,30 5

7 5,59 5,10 0,49 5 8,27 7,50 0,77 7

8 4,57 2,33 2,24 8 8,70 8,05 0,65 6

9 8,11 3,21 4,93 9 8,20 8,10 0,10 3,5

и=9 Т=5,5 Т=7

Pj<0,05 при Т=8 РТ<0,05 при Т=8

Примечание: разности с отрицательным знаком (т.е. увеличение рН или гН2 при &ОЫdt шах по сравнению с dLf/dt шах) имели ранговые номера для гН2=3,5+2=5,5 и рН=2+5=7. Эти величины Т, равные 5,5 и 7, меньше 8 - критической величины Т при п=9 (при Рт=0,05).

Ccz

э • i о ti и л » п » 12 2 2

Ca02 '

р-о¿Ä

* ' л.

b—о-о * * * ♦.

♦ <■*■ 1--

• и ti U 21 2« 27 10

pH еНо

А^С"**

1.3 2.3

• 12 К 1» 21 24 2 Г 20

Рис.2

ta •но .1(0 200

12 U 1» 21 2« 27 »0

1.4

Рис. 1-2. Характеристика процес« глубинного периодическо!

культивирования С.сИр1пЬепае по абсолютным значениям (Рис.1) удельным скоростям (Рис.2) использованием различнь

показателей: Рис.1

1.1-накопление биомассы (OD), концентрация углеводного субстрата (Sgl);

1.2-накопление антигенного материала (Lf);

1.3-концентрации кислорода (Сог) и диоксида углерода (Ссог) в отходящей из ферментера газовой смеси;

1.4-рН и окислительно-восстановительный потенциал (еН„). 2.1.-удельная скорость роста (ц);

2.2-уд. скорость накопления антигенного материала

(dLf/dt/OD);

2.3-интенсивность потребления кислорода (яог) и выделение диоксида углерода (ясог)-

По оси абсцисс - время от начала культивирования (t,4).

9

I 2

Влияние гН2 различных серий максимальные скорости накопления шах) и биомассы (dOD/dt max) C.diphtheriae.

Таблица 2. исходной питательной среды на антигенного материала (сН_1/ в процессах культивирования

гН0 рН dLf/dt шах dOD/dt max

I II число I II число I II число I II число

ннвер инве инвер инве

сии рсии сии рсий

10,20 7,8 0,50 0,90

10.20 8,0 1,11 1,08

10,60 8,0 1,94 1,66

10,93 8,02 2,17 1 1,88

11,49 8,10 2,39 1,90

11,57 8,10 3,22 2 1.95

11,63 8,15 4,05 2,27

11,67 8,15 4.06 2,88 4

11,67 8,20 4,83 3,05

11,93 8,2 8,20 6 5,78 3,07

12,17 8,20 7,44 3,15

12,67 3,33

ni=4 П7=8 0 п1=4 п?=8 6 п1=4 «7=8 3 ni=4 n?~8 4

Р,,=0,001 Рц>0,05 Рц<0,05 Р„<0,05

Примечание: Процессы культивирования сгруппированы в зависимости от гНг: I -10,20-10,93;

II -11,49-12,67.

Анализируя концентрации кислорода (Со2) и диоксида углерода (Ссо2) в отходящей из ферментера газовой смеси (Рис.1), обращает на себя внимание перегиб кривых (концентраций указанных газов) -"перекрест", который наблюдается за 1,0 - 1,5 часа до конца экспоненциальной фазы роста. При этом показана тенденция к снижению Ссс>2 и увеличению Со2 при переходе от экспоненциальной фазы к фазе замедления скорости роста. Следует подчеркнуть, что стабилизация интенсивности дыхания (6-12ч.) совпадает с периодом высокой удельной скорости накопления антигенного материала, которая снижается до минимальных значений к 21 часу роста (Рис.2), в то время как абсолютные значения накопления антигенного материала нарастают до конца процесса культивирования (27-30ч.к.) (Рис.1).

Таким образом, приведенные данные по динамике окислительно-восстановительного потенциала и состава отходящей из ферментера газовой смеси позволили впервые представить в процессе глубинного периодического культивирования С.ЖрИ&епае их взаимосвязь между собой, с фазами роста и дать ориентировочную оценку накопления антигенного материала.

Анализ процессов культивирования С-сИрИЖепае, различающихся между собой по количеству утилизированного углеводного субстрата в широких приделах (1,26-10,29 г/л) показал корреляцию сильной степени (г=0,99) между экономическими коэффициентами выхода биомассы и антигенного материала по утилизированному субстрату (Табл.3). При этом во всех этих процессах экономический коэффициент накопления антигенного материала по биомассе практически не различается. Отмечено также, что концентрация в среде углеводного субстрата (1,0 - 3,0 г/л), сказывается в большей степени на максимальной скорости накопления антигенного материала по сравнению со скоростью роста.

Таблица 3.

Экономические коэффициенты накопления биомассы и антигенного материала по утилизированному субстрату (у00/5 и Уу/5) и антигенного материала по биомассе (Уу/оп^ в процессах культивирования С.ЛрЫАеше, различающихся по количеству утилизированного субстрата (с^^)).

№ Уоп/з У] и* У] 1/ОГ>

1 3,30 7,77 2,50 10,29

2 3,88 8,14 2,19 8,60

3 3,99 7,51 2,07 5,86

4 4,91 13,47 2,77 6,68

5 6,84 19,55 2,86 3,58

6 14,98 39,68 2,65 1,26

1=0,99 при п=6 гтш 95%=0,811 гт;„ <К%=0.917

На примере различных микроорганизмов показана не всегда прямая взаимосвязь продуктивности процесса по выходу биомассы и целевого продукта (Грубер И.М. с соавт., 1986, 1989; Волкова Н.В., 1973).

Представлялось целесообразным изучить возможность существования такой взаимосвязи у С. (ИрЫЬепае. В связи с этим

процессы культивирования в зависимости от продуктивности по выходу биомассы были разделены на две группы (Табл.4). Показано, что при более высокой продуктивности процесса по выходу биомассы отмечается статистически значимое двукратное увеличение продуктивности процесса и максимальной скорости накопления антигенного материала, и следовательно, показана прямая зависимость между изучаемыми показателями.

Таблица 4.

Накопление антигенного материала по продуктивности (Чи) и максимальной абсолютной скорости (сИЛ/ск шах) в разных процессах культивирования С.сИрЫЬепае в зависимости от продуктивности по выходу биомассы (яоп)

<Ъо Чи ¿и/& шах

1<1 И>1 I II I 11

0,78 0,67 2,28

0,83 0,92 2,28

0,86 1,27 — 2,94

0,95 1,33 3,56

0.97 1,67 4,33

1,18 2,30 4,33

1,29 2,52 4,83

1,34 2,59 5,78

1,56 3,26 7,44

»1=5 ПН=4 п =5 п„=4 "1=5 п„=4

Рп=0,001 Р„=0,001 Р„=0,001

Примечание: Процессы культивирования сгруппированы в зависимости от я0,): 1-меньше 1,0;

Н-больше 1,0.

Таким образом, на основании анализа проведенных процессов управляемого глубинного периодического культивирования С.(Ир1иЬепае получены новые данные о взаимосвязи окислительно -восстановительного потенциала, рН, состава отходящей из ферментера газовой смеси, утилизации углеводного субстрата с накоплением биомассы и антигенного материала.

Общепринятыми методами оценки накопления ДТ в динамике производственного процесса культивирования C.diphtheriae являются in vitro РФ и in vivo определение DLM. При этом, как известно, оценка по флокулирующим единицам и минимальной смертельной дозе не дают полной характеристики ДТ (Валдохина И.Ф ,1972; Чеботарева C.B. с соавт., 1973 и др.).

Сравнительное изучение накопления ДТ, наряду с традиционными методами, проводили с использованием современных тестов in vitro - микроцитотоксичности в культуре клеток С НО и ИФА с МкАт и ПкАТ.

В результате изучения токсических свойств по DLM на морских свинках и МЦТД в культуре широко используемых клеток СНО впервые между ними определена корреляция сильной степени (г=0,98) (Табл.5). Наши наблюдения согласуются с данными Кырчикова Б.А. с соавт. (1965), определявших токсичность нативных ДТ на других культурах клеток, однако, статистически достоверная разница между тестами была отмечена лишь в конце выращивания. В наших экспериментах одинаковый коэффициент вариации определен на протяжении всего процесса культивирования (Табл.5), что говорит в пользу культуры клеток СНО, которая является адекватной биологической системой, более чувствительной, чем использованные другими авторами. К тому же следует принять во внимание, что в наших исследованиях оценку токсической активности осуществляли не по ЦТД (на ++), как другие авторы, а по минимальному цитотоксическому действию МЦТД токсина, что, возможно, дает меньшую ошибку теста.

Изучение микроцитотоксичности в динамике процесса культивирования показало,, что максимальные абсолютные значения МЦТД отмечаются на 21ч. роста и дальнейшее увеличение накопления биомассы до конца выращивания не влияет на величину МЦТД в то время как антигенная активность (по РФ) увеличивается до конца процесса (Рис.3).

Таблица 5.

Определение взаимосвязи токсических свойств нативного ДТ, определенных in vivo (по DLM на морских свинках) и in vitro (по МЦТД в культуре СНО)

№ t,4 DLM/мл МЦТД/мл DLM/мл : МЦТД/мл

18 769231 160000 4,81

I 21 1492537 320000 4,66

27 1754386 320000 5,48

15 2000000 320000 6,25

11 18 3448276 640000 5,39

21 4000000 640000 6,25

27 4160700 640000 5,50

r=0,98

при n=7 rmin95<yo=0,755 V=13%

rmin99%=0'874

Таким образом, показано I несоответствие между тестами определения токсической и антигенной активностей, что согласуются с данными Кырчикова Б.А. с соавт., обнаруживших максимальную активность ДТ по ОЬМ и ЦТД через ЗОч.к., а его флокулирующую способность через 42ч.к. Это, вероятно, связано со сложной природой накапливаемого токсического продукта, состоящего из цельного ДТ, его фрагментов с различной молекулярной массой, бактериальных антигенов, компонентов питательной среды и т.д. (Далин М.В. с соавт., 1973, 1980; Езепчук Ю.В., 1977; Кушнарев В.М.,1974; Перепечкина Н.П., ,1973; Хлебникова Н.И., 1970; ЫЬогре А., 1962). .

Изучение накопления ДТ в динамике процесса глубинного культивирования в ИФА с МкАт обосновано тем, что протективными являются антигенные детерминанты, расположенные на С-концевом участке В-фрагмента ДТ. При этом, главная роль принадлежит антителам, взаимодействующим с С-концевым участком ДТ, и препятствующим связыванию его рецепторами чувствительных к токсину клеток (Свиридов В.В., 1986; Зайцев Е.М., 1985). Параллельно с определением ДТ в ИФА с МкАт использовали ПкАт.

16000«

3.1 4.1 ^

ит

1400 1200 11ЮЙ <№0 ММ 400 НИ) (I

0 3 6 9 1} 15 II 21 и г? 30

0 Э

9 12 15 К И 24 17 3»

МЦГЛ/МА

350000 ^ 300000 250000 200000 150000 100000 50000

3.2 4.2 ,

лшдЦуЬо

и

1

мри

4500 4000 »00 3000 2500 2000 1500 1000 500 О

\

» 12 15 II 21 24 27 30

\ / в41ЩйМо ■ * . «

О 3 « 9 12 15 1* Я 24 2Т 30

3.3 4.3

Рис.3 Рис. 4

Рис. 3-4. Характеристика процесса глубинного периодического культивирования С.сИрЫЬепае РХ№8 по абсолютным значениям (Рис.3) и удельным скоростям (Рис.4) с использованием различных тестов:

3.1-накопление биомассы (СЮ) и антигенного материала (Ь0;

3.2-накопление токсина по ИФА с МкАт и ПкАг,

3.3-накопление токсической активности в тесте микроцитотоксичности на культуре клеток СНО по МЦТД.

4.1-уд. скорость роста (ц) и накопления антигенного материала

(сНЛ/Ж/СЮ);

4.2-уд. скорость накопления токсина в ИФА с МкАт и ПкАт;

4.3-уд. скорость накопления токсической активности в тесте микроцитотоксичности в культуре клеток СНО по МЦТД.

По оси абсцисс - время от начала культивирования (1,ч).

з

При изучении динамики накопления ДТ в процессе глубинного культивирования C.diphtheriae в ИФА с МкАт и ПкАт, а также по МЦТД, профили изменения абсолютных значений накопления ДТ и их скоростей повторяют друг друга (Рис. 3-4). Так, отмечаются два пика увеличения накопления токсина на 9ч. и 18ч. роста, соответственно, и отсутствие такой тенденции по антигенной активности (в РФ). Абсолютные значения накопления токсина в этих тестах с 21ч. культивирования остаются до конца культивирования на одном уровне, что дополняет данные исследователей, обнаруживших токсический фактор (гистотоксин) с коэффициентом седиментации 4-5S в наиболее активном состоянии в фильтрате культуральной жидкости в период после 20ч. выращивания и незначительное варьирование его до конца культивирования (Далин М.В., 1973; Хлебникова Н.И, 1968). Следует отметить, что в результате сравнительного анализа накопления ДТ более высокие показатели его содержания определяются при оценке в ИФА с МкАт, чем ПкАт. Вероятно, это можно объяснить различием эпитопов ДТ и аффинности антител.

Сравнительный анализ проведенных процессов глубинного периодического культивирования по временным характеристикам (Рис.5) позволяет заключить, что в каждом процессе выращивания совпадают периоды максимальной продуктивности и достижения максимального абсолютного значения накопления токсина, оцененного в ИФА с МкАт и ПкАт и его токсических свойств по МЦТД. При атом выявлен небольшой сдвиг максимальных значений удельных скоростей накопления биомассы и антигенного материала по РФ (Зч.) и накопления токсина в ИФА и МЦТД (6ч.), что подтверждает данные по разобщению процесса накопления и биомассы и синтеза

ДТ (Рис.4).

Таким образом, полученные данные по биологической активности ДТ в тестах микроцитотоксичности в культуре клеток СНО и DLM на морских свинках совпадают с оценкой накопления токсина в ИФА с МкАт и ПкАт и позволяют рассматривать их как достоверные, высокочувствительные методы определения активности ДТ в производстве препаратов ДАТ.

На основании проведенных исследований составлена комплексная система оценки накопления биомассы и токсина, базирующаяся на изучении физико-химических параметров процесса глубинного периодического культивирования C.diphtheriae и современных надежных и удобных экспресс - тестов in vitro.

12 3 4

1,час.

5.1

5.2

5.3

5.4

и

МкАт

ПкАт

Обозначения □ трап (1) вод.

Iщ 1 ■

■ (»)«

□■ран (О

МЦТД ^

Рис 5. Сравнительный анализ процессов глубинного периодического культивирования С.ЛрЫЬепае РХУ8 по временным характеристикам накопления антигенного материала в РФ по Ы (5.1), токсина в ИФА с МкАт (5.2) и ПкАт (5,3), и токсической активности в тесте микроцитотоксичности по МЦТД (5.4).

выводы

1. Выявлен характер взаимосвязи накопления биомассы и антигенного материала с некоторыми физико-химическими параметрами (окислительно-восстановительный потенциал, состав отходящей из ферментера газовой смеси, концентрация углеводного субстрата), позволяющий прогнозировать течение процесса глубинного периодического культивирования C.diphtheríae PW8, в частности период максимального накопления антигенного материала.

2. Установлено, что при более высоких значениях окислительно-восстановительного потенциала питательной среды (выше 11 мВ) увеличивается скорость накопления биомассы и антигенного материала. Полученные данные позволяют отметить целесообразность включения показателя гН2 в систему дополнительных критериев характеристики питательных сред.

3. При глубинном периодическом процессе культивирования C.diphtheríae PW8 показано, что начало стабилизации концентраций кислорода и диоксида углерода на 1,0-1,5 часа предшествует окончанию экспоненциальной фазы роста и совпадает с периодом высокой удельной скорости накопления антигенного материала.

4. Установлена прямая корреляционная связь (г=0,98) между величинами биологической активности ДТ, определяемыми in vivo на морских свинках и in vitro в тесте микроцитотоксичности в культуре клеток СНО, что позволяет использовать его как один из методов быстрой, воспроизводимой, экономичной оценки ДТ.

5. Качественная и количественная оценка ДТ в ИФА с использованием МкАт и в тесте микроцитотоксичности в культуре клеток СНО свидетельствует о существенном их преимуществе в специфичности и информативности этих тестов, как методов контроля за процессами культивированияв в сравнении с реакцией флокуляции.

6. Определена прямая взаимосвязь между продуктивностью процесса глубинного периодического культивирования C.diphtheríae по накоплению биомассы и антигенного материала, а также между экономическими коэффициентами накопления биомассы и антигенного материала по утилизованному субстрату.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. К вопросу оптимизации процесса культивирования дифтерийных бактерий /Горбачева Е.И., Рощупкина М.Н., Гаврилова И.А. Вячкилева О.В., Шмыгалева Т.П., Грубер И.М. //Тезисы докладов Междунар. Научно-технич. Конф. "Автоматизация биотехнических систем в условиях рыночной экономики и конверсии" .- М.- 1994,- с.147-148.

2. К оценке активности дифтерийного токсина /Рощупкина М.Н., Гаврилова H.A., Титова Н.Г., Свиридов В.В., Грубер И.М., Яковлева И.В. //Тезисы докладов V-Poc. Съезда специалистов по лабораторной диагностики. - М.- 1995.- ч.Н.- с.246-247.

3. Прогнозирование накопления дифтерийного и коклюшного токсинов в динамике культивирования продуцентов /Рошупкина М.Н., Гаврилова H.A., Грубер И.М. //Тезисы докладов VII Всерос. Съезда Общества Эпидемиол. Микробиол. и Паразитол.-М.- 1997. (в печати).

4. Использование новых методов для стандартизации и контроля получения дифтерийного токсина /Гаврилова H.A., Рощупкина М.Н., Грубер И.М., Титова Н.Г., Яковлева И.В., Свиридов В.В //Тезисы докладов VII Всерос. Съезда Общества Эпидемиол. Микробиол. и Паразитол.- М.- 1997. (в печати).

5. Влияние окислительно - восстановительного потенциала питательной среды на динамику процесса культивирования Bordetella pertussis /Грубер И.М., Николаева В.Б., Рощупкина М.Н. и Горбачев ИД. //Ж. Микробиол.- 1993.- № 6.- с.10-14.