Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энтомоцидные токсины гриба Verticillium lecanii (Zimm. ) - продуцента биопрепарата вертициллин

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Энтомоцидные токсины гриба Verticillium lecanii (Zimm. ) - продуцента биопрепарата вертициллин"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

МИТИНА

Галина Вадимовна

ЭНТОМОЦИДНЫЕ ТОКСИНЫ ГРИБА УЕ1ШС1ЫЛиМ ЬЕСА1\!11 (ХШМ.) — ПРОДУЦЕНТА БИОПРЕПАРАТА ВЕРТИЦИЛЛИН

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений (г. Санкт-Петербург).

Научный руководитель — кандидат биологических наук В. А. Пав-люшин.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор Н. В. Кандыбии; кандидат биологических наук С. Л. Тютерев.

Ведущее учреждение — Научно-производственное объединение «Био-маш» (г. Москва).

Защита состоится «"/3» 1993 г. в /О час. на

заседании Специализированного совета К..020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических паук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, г. Санкт-Петербург—Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3, ВНИИСХМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « А» ¿ри^гы 1992 г

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Внедрение экологически безопасных технологий возделывания сельскохозяйственных культур требует расширения использования микробиологических средств зашиты растений, разработки новых препаративных форм микробиологический препаратов. В последние годы в ряде стран мира нашли широкое применение инсектицидные биопрепараты, получаемые" биотехноло-, гическим путем на основе метаболитов микроорганизмов (токсинов и антибиотиков) для подавления интенсивно размножающихся популяций белокрылок и тлей, проявляющих повышенную устойчивость к пестицидам. В качестве продуцентов токсинов значительный интерес представляют, энтомопатогенные грибы как экологически безопасные естественные патогены насекомых.

Исследования, проведенные в ВИЗР показали, что в биомассе и культуральной жидкости энтомопатогенногО гриба Vert lei Шит lecanti С Zimmerman) - продуцента биопрепарата вертициллина, накапливаются токсические метаболиты, вызывающие гибель тлей и личинок белокрылок при контактной обработке. (Гиндина и др., 1992). Высокая эффективность липидного-экстракта из биомассы гриба в отношении сосущих вредных насекомых, устойчивость при хранении показали перспективность разработки нового биопрепарата на дснове токсинов V. lecani 1. Аналоги такого препарата в отечественной л зарубежной практике отсутствуют. С другой стороны, важным моментом в проблеме вирулентности энтомопатоген-ных грибов является роль эктомоцидных метаболитов, синтезируемых грибом V. lecani i, в процессе патогенеза. Изучение этого вопроса имеет.большое значение в познаний механизма патогенеза микозов.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было исследование процесса токсийообразовакия грибом V.lecani1 и обоснование возможности создания биопрепарата на основе его знтомоцидного комплекса. В связи с этим в задачи исследования . входило: 1) изучить токсигенность природных изолятов V. lecanii и роль токсинов в патогенезе вертициллеза; отобрать токсиген-ные штаммы-продуценты препарата вертициллина; 2)разработать методы выделения инсектицидных метаболитов V. lecaMi, определяющих контактную активность в отношении сосущих вредителей, и идентифицировать зги метаболиты в целях контроля активности штаммов и образцов препаратов; 3) провести оптимизацию процес-

еа культивирования гриба V. 1есап11 по признаку токсинообразо-вания-,'4) обосновать возможность создания новой формы биопрепарата на основе токсинов V. 1есапи, получить опытные образцы и провести оценку их биологической эффективности в лабораторных и вегетационных опытах.

Научная новизна. Получены новые сведения о роли энтомоцид-ных токсинов гриба V. 1есапп и механизмов действия токсигенных и низкотоксигенных штаммов на насекомое - хозяина. Показано, что все изученные природные изоляты, независимо от источника выделения продуцируют инсектицидные метаболиты, обладающие контактной активностью в отношении сосущих вредителей. Впервые показано, что. штаммы, различающиеся по признаку токсигенносги

■ прк росте- на питательных средах,, различаются таете и по типу патогенеза. Наличие штаммов 2-х типов экспериментально подт-

■ вервдено при изучении динамики накопления биомассы гриба в теле насекомого-хозяина, симптоматики заболевания, динамики гибели тест-насекомых после заражения.

В результате данной работы впервые установлена природа действующего вещества токсического комплекса гриба V. 1есаш 1, отвечающего за контактную активность (триглицеридный фосфо-эфир). Изучено влияние состава питательной среды на биосинтез токсинов, показано, что на сбалансированной среде переход гриба к массовому спорообразованию совпадает с максимальным выходом токсинов. Испытания лабораторных образцов препарата на основе токсинов обнаружили выраженную специфичность действия против тлей,' оранжерейной и хлопковой белокрылок. •

Практическая ценность. Данная работа выполнена в ходе реализации проекта ГНТП "Высокоэффективные процессы производства продовольствия"(подпроект "Виопестициды" - 0.12.02,2003М). •

Результаты проведенных исследований рекомендованы для составления Лабораторного регламента получения биопрепарата на основе токсинов гриба V. 1есапП.

Апробация работа . Основные материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых "Экологические проблемы зашиты растений" (Ленинград, ВИЗР, 1990), на Всесоюзном совещании по экологически чистым технологиям (Ленинград,

,„ 1950), на Всесоюзной конференции "Современные методы выделения, очистки и идентификации микробных метаболитов" . (Лущино, 1991), а также на 1У Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве (Пущиио, 15)92).

Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. • Диссертация изложена на ПЦ страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 35 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, трех глав, посвященных ,экспериментальной работе, 'выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография содержит 189. названий, в том числе 100 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении показана актуальность темы диссертации и сформулированы основные задачи исследований.

Обзор литературы состоит из четырех разделов, в которых рассматриваются биологические особенности, Факторы вирулентности энтомопатогенных грибов. . Особое внимание уделено токсинам и другим метаболитам энтомопатогенных грибов, проявляющим инсектицидную активность. Приводятся данные- литературы по влиянию условий культивирования на процессы токсинообразозания.

Материалы и методы исследований. Природные изоляты гриба V.lecani1, различающиеся по вирулентности, были получены из коллекции энтомопатогенных микроорганизмов лаборатории- микробиологической защиты растений ВИЗР. В работе было использовано 20 штаммов, выделенных- из нескольких видов белокрылок (12 штаммов),- из тлей (3 штамма); из паутинного клеща, цикад, лож-нощитовок, уредопустул ржавчины ежевики. Штамм 51 имел мутант-ное происхождение.

Природные изоляты гриба V. lecani1 выравдвали поверхностным и глубинным способами на среде Чапека с сахарозой (2%). Конидии были получены поверхностным способом на чашках Петри ', бластоспоры в. глубинных условиях в колбах на качалке при 26°С, 270 об/мин.

При изучении динамики токсинообразования гриб, штамм 21 (Р-81) выращивали в течение 16 суток в глубинных условиях.

Пробы отбирали через 8, 12 часов после начала культивирования и затем на каждые сутки. В пробах определяли: титр блас- . тоспор методом прямого подсчета в камере Горяева (Примак, 1983), массу сухого мицелия и уровень эндо- и экзотоксинов. Токсинообразование оценивали по выходу экстрагированного неочищенного токсина (экстракцию липидов из биомассы проводили по методу Фолча (Folch et al, 1957) и инсектицидной активности этого экстракта методом биооценки на гороховой тле (Воронина и др., 1988)) .и оранжерейной белокрылке. .

. - 4

При изучении морфодого-культуральных особенностей природных изолятов в глубинных условиях дополнительно к этим показа-тёлям определяли содержание токсинов в культуральной жидкости и их инсектицидную активность. Экстракцию токсинов проводили в подобранных нами условиях: хлороформом из 300 мл нативного раствора (М 1:3), трижды. Биомассу предварительно отделяли центрифугированием при БООО об/мин, 30 мин, при t=4eC.

При выращивании, природных изолятов на твердой питательной среде регистрировали интенсивность конидиеобразования методом.. смыва с растущего газона; степень развития воздушного мицелия. Морщинистость и пигментацию колоний оценивали визуально в. баллах. Анализ взаимного влияния признаков штаммов проводили методами корреляционного анализа (с. предварительной симметризацией переменных) с помощью пакета прикладных программ . "Microstat" для IBM-компьютеров И Stat для ЭВМ СМ-4, разработанном в ВИЗР (Сергеев, 1991).

При изучении влияния состава питательной среды, на токсино-образование в культуральной жидкости определяли содержание-аминного азота - методом с нингидрином (Фаворская, Кононова, 1962) и содержание углеводов - методом Бертрана (Плешков, 1976). При подборе исходной питательной среды были использованы среды, обеспечивающие хороший рост гр:;5а и спорообразование: среда на основе неохмеленного пивного сусла и среда полная 'С пептоном (Бегляров и др. ,1838). Планирование экспериментов по оптимизации состава питательной среды проводили на основе симплексного метода (Грачев, 1978). •

Для изучения роли токсинов гриба V. lecanii в' патогенезе вертициллеза проводили экспериментальное заражение личинок гороховой тли штамма?®, различающимися по признаку токсигеннос-ти. Личинок гороховой тли 2-3 возраста обрабатывали суспензией конидий гриба (титр 50 млн спор/мл с добавкой Твина-80 (0(025%г -ный раствор) на проростках гороха, выращенного гидропонно (Воронина, Ч/макова, 1984). Учеты вели в течение 5 суток. В каждой повторнссти использовали по 100 насекомых, повторность опытов 4-х кратная. Накопление биомассы гриба в теле насекомо-ro-хоаяина определяли в камере Горяева по количеству спор и их | проростков, выделенных иа погибших и парализованных тлей, обобранных на 20, 40, 60 и 80 часов после заражения. .

. Для тестирования штаммов V. lecami на оранжерейной Оело-крылка получали популяцию дичинок младших возрастов (1-2 в) на

растениях огурцов (сорт ТСХА-77) в вавонах. Рассаду огурцов заселяли белокрылкой после раскрытия второго настоящего листа (60-80 особей на растение), оставляли на 2-е суток, после чего имаго удаляли. Перед заражением личинок листья отщипывали, помещали в раствор Кнопла и учитывали количество личинок в опыте. Учеты проводили на 3-й и 5-е сутки, температура опытов • 24-26 °С, относительная влажность около 100%.

Для выделения и первичной идентификации токсинов гриба нарабатывали партию биомассы гриба V.leoanil (шт. Р-81). . Штамм культивировали 10 суток в бутылях емкостью 5 литров (1 л среды Чапека на 1 бутыль).,' В качестве инокулюма использовали 3-хдневную культуру гриба, выращенного в колбах (100 мл иноку-1 люма на 1 л среды). Отфильтрованную биомассу промывали, высушивали при 35-36°С, размалывали и экстрагировали из нее токсины. Для подбора подходящего эстрагента взвешенные количества воздушно-сухой биомассы экстрагировали 3 раза 1:10 растворителями (ацетоном, метанолом, хлороформом, петролейным эфиром и т. д.), встряхивали в течение 1 часа и отфильтровывали. Полученные экстракты анализировали методом ТСХ на пластинах "Sllufol" в различных системах растворителей с использованием характеристических проявителей (Кейтс, 1975). Препаративное выделение, токсинов проводили на пластинах с незакрепленным слоем силикагеля (Шгаль, 1965) и методом колоночной хроматографии. Способ приготовления колонок и условий злюирования подбирали согласно методике Бергстема (Гордс«,Рорд, 1976). Собранные фракции упаривали при 40°С и проверяли на инсектицидную активность. Индивидуальность активных фракций проверяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЗйК) на хро-. матографе Хром-5. Молекулярный вес действующего вещества определяли с помощью масс-спектрометра МАТ-Ш фирмы "Varían"- с. источником электронного удара.

Изучение структуры токсинов Y. lecanii проводили на базе ЛИЯФ РАН следующими методами:

- оптические спектры регистрировали на двухлучевом спектрофотометре "Specord" М40 (ГДР);

- инфракрасные спектры регистрировали на двухлучевом спектрофотометре "Specord" М80;

- спектры протонного магнитного резонанса регистрировали на спектрометре ЯМР BS-467 "Tesla" (Чехо-Словакия);

- ВЭЖХ проводили на хроматографе L1QUICHR0M-2010 (Венгрия);

- анализ элементного состава проводили методом резерфордовс-■ кого обратного рассеяния (POP) дейтонов на электростатичес-' ком ускорителе ЛИЯФ РАН.

Оценку биологической эффективности лабораторных образцов биопрепарата'на основе токсинов V. lecani t (условное название вертициллин М) определяли по снижению численности вредителя на модельных растениях в производственных условиях. Вертициллин М получали путем культивирования штамма Р-81 в бутылях (Б л) на оптимизированной нами питательной среде и последующей экстрак- . цией токсинов хлороформом. По данным первичной токсикологической экспертизы на острую токсичность образцы вертициллина М отнесены к веществам 3 класса опасности (LD50-2820 мг/кг).

Токсигенные свойства природнда ийолятов У. lecani 1. Роль токсинов в патогенезе. Предварительное изучение активности .токсинов гриба V. iecanii, выделенных из биомассы трех высоковирулентных штаммов, показало, что гибель тест-насекомых (персиковой тли и оранжерейной белокрылки) от контактных токсинов наступала быстро и возрастала с увеличением концентрации активной фракции. Симптомы токсикоза тлей, помещаемых на фильтр, смоченный в водной эмульсии экстракта: нарушения / координации движения, вялость, необратимый паралич конечностей. Смерть наступала через, 1-2 часа и сопровождалась пожелтением кутику- . лы. Гибель тлей составила 60-90% (в 0,1-1%-ной концентрации экстракта). Гибель личинок белокрылки составляла до 80%. Визу- ■ ально гибель диагносцировали, начиная с 4-5 суток, когда высохшие личинки покрывались твердой светло-коричневой чешуйкой.

Было установлено, что преимущественное накопление токсинов идет в биомассе гриба. Свежий неконцентрированный нативный раствор не обладал биологической активностью по отношению к тест-насекомым, но- в лиофильно-высушенном йаде (1-5%) вызывал гибель 26% гороховой тли. Более высокую активность (54%) пока--, вала 0,5%-ная водная эмульсия экстракта, полученного из свежего нативного раствора жидкостной экстракцией хлороформом. Изучение процесса токсияообрааовакия и его связи с физиологическими характеристиками роста гриба проведено в глубинных условиях на штамме Р-81. Показано, что синтез метаболитов, прояв-дящих инсектицидную активность, начинался со 2-х суток куль-'тнрования на среде Чапека. Максимальный выход токсинсодержа-шэй фракции составил 17,IX (на 7-е сутки); ее наибольшая активность - ; 91,32 смертности гороховой тли (на 9-е сутки). В

тот период было отмечено массовое спорообразование культуры.

В культуральную жидкость выделялось незначительное коли-ество токсинов и к 8-м суткам 'активность лиофилизированного ативного раствора- составила 51Z.

■' Для изучения уровня токсигенности природных изолятов . lecanii и связи этого признака с морфологическими и культу-альными показателями штаммы выращивали в стандартных условиях лубинно (в течение 7 сутоф и йоверхностно (в течение 10 суок). Основные характеристики штаммов приведены в таблице 1.'

Таблица 1

Характеристика штаммов V. lecanii при поверхностном и глубинном культивировании

ол- Название Диаметр Титр кони- Титр бласто- Биомасса,

екц. штамма колоний дий на 1 см2 . спор в мл, мг/мл N ' на 7 сут- П'107 п»108

ки, мм

РБ1-Кш82 * 16,5*6,5 4,2*0,3 1,2*0,1 4,96*0,31

АСп-ПрЛ-85* 17,0±1,0 8,1*1,0 • 4,2*0,1 4,6*0,4

Ц-См-85 * 16,7*4,9. 9,6*0,7 2,2*0,1 5,5*0,2

б TU-К2-82 * 21,3*0,9 13,0*2,0 2,4*0,1 5,9*0,2

7 РЕ-3-84 * 15,2±б,0 3,5*0,7 0,5*0,1 7,3*0,7

В TV1-P85 * 17,3*3,3 7,4*0,9 4, 0*0,2 4,5*0,4

0 Л-81 * 16,5*1,2 8,4±1,0 3,6+0,2 6,8*0,1

1 Р-81 * 16,5*5,0 2,6*0,5 2,1*0,1 7,1*0,3

г AS1-P85 * 18,8*0,5 16,0*2,0 2,1*0,1 4,4*0,2

7 А1-ПрЛ-83 * 18,5±0,5 8,5*0,6 4,0*0,3 4,5*0,3

в Иепси : к* 19,0t6,3 7,2*1,4 2,5*0,1 5,5*0,3

D AG-P-82 * 17,3*6,1 8,1*0,2 1,7*0,1 5,9*0,2

1 Cj-Ag-84 , * 9,3*0,7 1,3*0,3 0,3*0,1 2,9*0,2

5 ГТ-Хн-85 * 22,7*4,9 1,6+0,1 3,0*0,1 5,9*0,9

В ТУ1-ВИЛР84* 19,5*0,3 5,1*1,3 1,6*0,5 6,0*0,3

Э БВЛ-81 * 19,8*4,0 9,2*0,9 2,6*0,1 5,910,1

4 Е>С1-Ад84 * 17,Oil,0 ' 0,9*0,2 0,17*0,05 2,8*0,1

5 Мик-1 *** 19,8*0,8 9,5±1,8 2,8*0,1 5,9*0,3

Э Й-0-4Б * 18,2+4,8 4,9*2,0 3,7*0,2 " 5,5*0,2

1 29 М **** 15,0*6,2 3, Oil.0 40,Oil,0 5,8*0,1

римечание: * штаммы выделены Б. А. Борисовым (АО "Биоиндустрия*'); ** выделен Лазаревской опытной станцией ВИЗР;

*а* выделен из препарата микотал; **** мутант, полученный Д. И. Котляревским Изученные штаммы значительно различались по скорости радиаль- ' ного роста,' степени развития воздушного мицелия, морщинистости колоний, а также по пигментообразованию. Несколько штаммов не синтезировали пигмент, цвет реверзума других варьировал' от светло-розовых и желтых тонов до коричневых. Поверхность штаммов в основном была гладкой или слабоморщинистой.

Наиболее высокий титр конидий отмечался для штамма 16 (130 млн сиор/см2) и штамма 22 (160 млн спор/см2-). В целом уровень биомассы и бластоепор на среде Чапека был невысоким, но тем не менее выделились низко- и высокопродуктивные штаммы (7, 16, 18, "20, 21, 27,- 28, 35, 39, 46, 61)..

Изучение токсинообразования штаммов показало, что все 20' изолятов образовывали инсектицидные метаболиты,^обладающие активностью при контакте с насекомыми, однако они существенно различались по уровню выделения и инсектицидной активности эк-Э£>- и эндотоксинов (табл.2). . На основе полученных показателей по продуктивности, спорообразованию и токсигенности мы отобрали штаммы 7, 18, 21,' 35, перспективные для разработки на их основе биопрепарата контактного типа действия.

Таблица 2

Токсигенность природных штаммов V. 1есаш 1

Содержание токсической Инсектицидная активность,

Кол-лекц. N

Название штамма'

фракции (X) в

% смертности гороховой тли

мицелии натив. р-ре

0,5% экстр.

3

0,5% экстр.

• мицелия натив. р-ра

б Р31-КШ82 12,7*1,2 6,5-Ю-3. 41 ,б±10,0 ' 60,0±7,Б

7 АСп-ПрЛ-85 14.4*0,6 2,3'10 91,2±1,7 50,1 ±3,5

8 Ц-См-85 12,3*0,4 0,3-10"5 41,1+4,7 -

16 ти-кг-вЕ 10,2*0,6 3,0-Ю'3 49,6*7,7 50. 7±5,2

17 РЕ- 3-84 ' 11,3±1,0 3,0'Ю"' 80,7*8,1 49,3*5,2

ГУ1-Р85 0,0*0,7 1В,2'10 100 • 52,2*9,1

20 Л-81 13,6*0,2 г.з-кГ 37,5*6|7 ■ 0

>81 16,2*1,0 25,0*10 89,0+10,0 54,2*2,5

гг Л51-Р85 14,3*0,6 16,1-Ю"3 98,7*0,2 2,0*0,2

Продолжение таблицы 2

27 А1-ПрЛ-83 14,410,4 0, б ю'3 100 0

28 Шзпси 13,4*0,7 10, 0 10"3 48,6+3,5 48,812,7

30 АВ-Р-82 12,510,5 1, 7 10" * 86,112,0 82,911,1

31 С]-Аг-84 8,510,03 3, 4 ю-3 86,513,0 81,0±2,1

35 ГТ-ХН~85 13,010,3 ■'о, 8 ю'3 100 - 51,412,0

38 ТМ-ВИЛР-84 13,010,7 2, 3 ю-3 67,110,5 6,011,0

39 БВЛ-81 17, ОЮ, 5 6, 3 10* 100 26,1+9,1

44 Ю1-АД84 4,811,5 3, 5 103 20,114,0 85,012,1

46 Мик-1 16, 411,6 17, 4 10* 70,716,8 12,013,3

49 Й-0-4Б 11,310,2 11, 9 ю-3 96,612,2 10,714,7

51' 29 М 51,111,5 31, 0 10"3 96,412,2 4,010,5

Контроль - 4,111,2 5,3+0,2

Следовало выяснить какую роль играют токсины в патогенезе, при их преимущественном накоплении в биомассе гриба. Гибель оранжерейной белокрылки, наблюдаемая нами после экспериментального заражения штаммами V. 1есапп, наступала как от микоза, так и от токсикоза. Личинки, погибшие от токсикоза, .отличались визуально на 3-й сутки от микозных личинок, покрытых белым налетом гриба. Гриб на таких личинках не развивался даже после помещения их во влажную камеру. Смертность личинок, учитываемая на 5-е сутки, являлась результатом суммарного эффекта токсина и гриба в отношении личинок оранжерейной белокрылки. Вирулентность штаммов варьировала от 22 до 86% (штамм 5) (табл. 3).

Токсигенность штаммов (3-й сутки) также варьировала в широких пределах от б% (штамм 51) до 322 (штамм 46).

Таким образом, в результате сравнения штаммов по вирулентности, с учетом гибели от токсикоза, выделились штаммы с отчетливыми вирулентными свойствами, значительный вклад в реализацию которых осуществляли токсины (5, 17, 21). Симптомы гибели личинок оранжерейной белокрылки от токсикоза совпадали с симптомами, характерными для токсикоза от действия экстрагированного из мицелия токсина. Это позволило нам предположить наличие связи между способностью V. 1есапН к образованию токсинов и их участием в инфекционном процессе.

Таблица 3

Сравнительная вирулентность, штаммов в отношении личинок оранжерейной белокрылки

. Смертность личинок, X

Кол- Название 3 сутки ' 5 сутки

лекц. штамма —-

N от токсикоза от токсикоза от токсикозе

и микоза и микоза

5 Р31-КШ-82 19,2+4,9 21,814,7 86,0±4,9

17 РЕ-3-84 28,4±5,5 .30,8^5,6 85,71-5,9

21 Р-81 16,5+3,3 20,8+3,2 81,3+4,9

51 29Ы 6,0+2,4 9,2+2,2 70,516,7

39 БВЛ-81 17,2±6,1 21,2±б,0 ■ 70,2±7,8

16 Ти-К2-82 , 1б,1±4,2 17,7±4,1 67,5±4,5

49 о Й-0-4Б 10,9+2,1 20,714,5 66,6+2,8

44 0С1-Ад84 14,б±3,2 16^ 0+3,1 63,5+3,1

8 Ц-См-85 14,4+3,4 17,313,3 '55,5+6,5

46 Мик-1 32,0±2,2 38,5+2,1 54,411,8

22 А31-Р85 . 13,8±3,1 18,7+3,0 52,8+4,8

28 Шзпси 10,9±3,1 13,3+3,0 , 51,4±7,7

33 • ТУ1-ВИЛР-84 12,9+2,2 15,2+2,1 . 51,3+4,8

27 А1-ПрЛ-83 10,3+3,4 21,8+3,5 46,1+2,4

20 Л-81 15,713,8 18,713,6 41,9+6,6

7 АСп-ПрЛ-85 12,6+1,6 14,51-1,5 35,2+4,1

31 С}-ЛЕГ~84 6,5+1,5 • 6.8+1,4 22,8110,5

Контроль 3,0 3,0 5,0

Статистический анализ взаимного влияния признаков штаммо выявил невысокие значения коэффициентов парных' корреляций. Од нако, множественный регрессионный анализ влияния прианако: штаммов на вирулентность и токсигешссть позволил выявить наибо лее существенные признаки штаммов. Так, выход экзотоксинов бы связан с продуктивностью штамма по конидиям, бластоспорам. Си омасса и морщинистостью колоний (коэффициент множественно: корреляции 0,Бб). Получено уравнение прогноза вирулентност: атаммов в отношении личинок оранжерейной белокрылки, В неп вошли такие признаки как продуктивность штамма по биомассе

и

бластосиорам, содержанию токсичееюйфракции в биомассе и куль-туральной жидкости и морщинистость.колоний (коэфициент множественной корреляции 0,703). Для удобства расчета вирулентности построена номограмма.

На основании полученных данных мы выделили две группы штаммов, различающихся по типу патогенеза: I. Штаммы с высоким уровнем токсигенности и опережающим токсикозом в патогенезе (5, 7, 8, 16, 17, 20, 21, 22, 27, 38, 39, 44. 46). II. Шгаммы С низким уровнем токсигенности (28, 31, 49, 51). Важно отметить, что токсины могут влиять не только на скорость протекания инфекционного процесса, но и отражать характер накопления биомассы гриба в теле насекомого-хозяина, изменять симптоматику заболевания. Это наиболее подробно изучено для Kfetarrhizium amsopleae (Samuels, 1988). Различия в симптоматике поражения насекомых токеигенными и низкотоксигенными штаммами выявились при экспериментальном заражении гороховой тли. Смертность тлей при заражении 5 токеигенными штаммами была несколько выше на первые сутки после инокуляции (до 15%). Микроскопирование трупов показало, что в этом случае в тлях содержалось значительно большее количество элементов гриба и проростков спор (до 13 тыс. для штамма 21 и 15 тыс. для штамма 27). Симптоматика поражения низкотоксигенными штаммами характеризовалась низким начальным содержанием биомассы гриба в теле насекомого, последовательным прохождением грибом всех стадий (до образования мицелия) и более медленной гибелью тлей.

Эти данные подтвердили наше предположение о том, что биосинтез токсических метаболитов изменяет характер поражения хозяина, особенно на начальных этапах патогенеза. Как оказалось, активное участие токсинов в инфекционном процессе было характерно для целого ряда штаммов.

Инсектицидные метаболиты V. lecam 1. Выделение, очистка и идентификация действующего вещества. Для дальнейшего изучения механизма патогенеза и установления роли в нем контактных токсинов было проведено выделение и изучение природы действующих веществ. Обнаруженные соединения не относятся к метаболитам V. lecani i с известной структурой. Соединения типа дипиколино-вой кислоты и бассианолида токсичны для насекомых только при инъекциях или при скармливании (Claudon, Grove, 1992; Murakoshi et al, 1978). Подобным эфф?ктом обладают и С?.5-сое-динения (Grove,1984).

Как показали опыты, токсины содержатся в липидной фракции биомассы гриба, при этом наилучшим экстрагентом оказался хлороформ (выход экст-ракта 4,42, активность - 93%). Исходный ли-пидный экстракт длительно сохранял инсектицидную активность при комнатной температуре, а также был устойчив к кратковременному прогреванию при 94°С. Нами была подобрана хроматогра-фическая система для разделения липидов (толуол-этилацетат-муравьиная кислота 8: 1: 1). Эти условия были использованы для препаративной хроматографии ■ с закрепленным слоем силикагеля, что позволило выявить две активные фракции.

Гибель тлей от фракции с ЙМ),26-0,33 начиналась черер 15 минут после обработки, наблюдался паралич, обесцвечивание конечностей, пожелтение кутикулы. Гибель от второй фракции, остающейся на старте, происходила медленнее; тли становились вялыми, наблюдались судороги, цвет кутикулы не менялся.

Была разработана схема выделения этих двух фракций: схема включает в себя стадию предварительной очистки лцпидного экстракта на широкой короткой колонке с силикагелем и тонкую очистку (диаметр колонки 3 см, высота 40 см). Колонки элюиро-вали системой растворителей с повышением полярности (табл.4).

Активность очищенной от нейтральных липидов фракции составляла ври О,12-ной концентрации 80-90% смертности гороховой тли и для фракции, остающейся на старте - 902.

Таблица 4

.Схема деления обогащенного токсином экстракта на колонке с силикагелем

Растворитель

Объем растворителя, мл

Обозначение фракции

гексан

гексан-хлороформ 1:1 хлороформ

хлороформ + хлороформ + хлороформ +

5% этанола 102 этанола 12% этанола

500 1

2000 2 "

1000 с 3 по 10 - по 100-200 мл

2500 с 11 ПО 20 -- по 250 мл

1500 С 21 ПО 29 - по 120-250 МЛ 250 30, 31 250 32, 33 500 34, 35, 36, 37

В результате деления на тонкой колонке была получена фрак-

ция, содержащая 1 основной компонент (Rf=0,32 в системе толуол--этилацетат-муравьиная кислота 9:2:1). Индивидуальность этого соединения, названного токсин-1,. была подтверждена методом ВЭЖХ Его выход начинался после подачи- на колонку 2-х л хлороформа и составил около 4Z от исходного экстракта. При пропускании через колонку хлороформа, .содержащего 12% этанола, вышло другое активное соедитение (токсин-2), которое оказалось очень нестабильным (упаривание под азотом, хранение под аргоном) и вряд ли может отвечать ва контактную активность экстрактов.

С помощью предварительного качественного анализа, а также анализа элементного состава было показано, что в состав молекулы токсина-1 входит фосфор и сложноэфирные группы. Был установлен молекулярный вес соединения -.390 у. е. При изучении структуры токсина все физико-химические характеристики определялись параллельно для модельного вещества, в качестве которого использовали афидол (синтетический фосфоэфирный инсектицид - аналог природного токсина гриба Entomophthora thaxteriana). При снятии спектров ЯШИ моделями также служили простые и сложные алифатические зфиры, фосфотриэфиры. Было установлено наличие углеводородного скелета, метильных и метиленовых групп в молекуле токсина.

Полученные данные позволили представить, возможную структуру токсина-1, как триглицеридного фосфоэфира, содержащего две коротких и одну длинную углеводородные цепи. Количество атомов углерода в длинной цепи<12, в двух коротких<6.

Важно отметить, что подобный по строению . фосфолипид был обнаружен и у гриба.Entomophthora thaxteriana. Это указывает на неслучайный характер биосинтеза биологически активных фос-фолипидов и их возможную роль как факторов патогенеза.

Оптимизация питательной среды для культивирования V. lecanil (шт.Р-81) по признаку токсинообразования. При культивировании V. lecanli на среде Чапека, полной с пецтоцом и пивном сусле наилучший рост гриба происходил на среде о (тонки суслом, однако инсектицидная активность экстрактов было низкой. Близкие значения изучаемых параметров были получены на среде Чапека и модифицированной нами среде с пептоном (с пониженным содержанием азота). При изучении роста гриба на этих средах в динамике было установлено, что на модифицированной среде с пептоном гриб образует токсины более интенсивно. KfeK-симальная инсектицидная активность экстрактов на обеих средах

наблюдалась несколько раньше, чем максимальный выход липидов, что свидетельствует об изменении липидного состава гриба в процессе роста культуры.

Шинирование экспериментов по оптимизации состава среды модифицированной с пептоном по пяти параметрам (концентрация азота, углерода, КН^РО^, М^ЗОд, рН среды) проводили симплексным методом. В результате экспериментов была подобрана питательная среда следующего состава: глюкоза - 8,0%, пептон - • - 1.0%, КН2Р04- 0,2%, МгБ04- 0,112%, рН - 6,5.

Как оказалось, все три показателя на этом варианте среды были %чень высокими: биомасса - 15,1 мг/мл,липиды - 23,§ мг/мл, инсектицидная активность - 98%. Использование оптимизированной среды увеличило выход биомассы на 15%, инсектицидную активность экстрактов на 22%, выход токсинсодержащей фракции на 12% по сравнению с неоптимизированной средой.

Потребление сахара и аминного азота на подобранной среде шло наиболее полно (остаточное содержание сахара на 4-е сутки составило 0,8%, а аминного азота - 0.35%). На различных по составу средах кривые потребления сахара и азота носили сходный характер. Наиболе интенсивно углеводы потреблялись в первые трое суток роста культуры на 10-20% и на 30-40% в течение четвертых суток. Очевидно, в этот период происходили наибольшие энергетические затраты, связанные с переходом гриба к спорообразованию. Потребление азота наиболее интенсивно шло в течение-первых 24 часов роста (на 20-40%), затем скорость-' потребления азота снижалась и составила 5-10% в сутки. Анализ Кривых роста показал, что развитие гриба на оптимизированной среде происходило быстрее: длительность лаг-фазы составила несколько часов, а фаза экспоненциального роста - трое суток. Переход в стационарную фазу (на четвертые сутки) сопровождался началом спорообразования, что совпадало с максимальным выходом липидов. Благодаря оптимизации состава среды получили ускоренное и синхронное развитие культуры, срок культивирования сократили до трех суток.

Увеличение соотношения между содержанием сахара и азота в среде (при неизменном рН и концентрации солей) приводило к увеличению выхода биомассы, липидов и повышению их инсектицидной активности. При неизменном соотношении сахар/азот в среде наиболее существенное влияние на биосинтез токсических метаболитов оказывало содержание фосфора и. магния.

Биологическая эффективность образцов препарата вертицилли-на М на основе метаболитов V. 1есап11 в отношении сосущих членистоногих - вредителей сельскохозяйственных культур. Биологическая эффективность вертициллина М (в 0,1-0,5%-ной концентрации) в отношении персиковой, бахчевой и гороховой тлей по данным лабораторных опытов была высокой и составляла 59-100% смертности тлей. Аналогичные результаты были получены и в мелкоделяночных опытах на изолированных растениях в пленочных теплицах Лазаревской опытной станции (смертность персиковой тли на перце - 91%, бахчевой тли на огурцах - 97%).

Высокую эффективность образцы вертициллина М показали в отношении личинок оранжерейной белокрылки как в лабораторных,' так и в производственных условиях. Учеты в лабораторных опытах проводили до вылета имаго, который составил 4% (в контроле 50%). Смертность личинок оранжерейной белокрылки на растениях огурца в пленочных теплицах Лазаревской опытной станции составила 91-96% (концентрация вертициллина'М 0,1-0,5%).

Испытания, проведенные в открытом грунте в условиях Средней Азии, показали перспективность вертициллина М в борьбе • с хлопковой белокрылкой. Гибель хлопковой белокрылки от применения вертициллина М составила от 60,8 до, 96% при концентрации 0,7-1,0%.

Испытания вертициллина М против хризантемного трипса в лабораторных опытах показали некоторый токсический эффект против имаго'(гибель до 55% в-1%-ной концентрации). Против личинок препарат оказался неэффективным. При испытаниях на паутинном клеще концентрации 0,:1-1% были неэффективными; высокую гибель препарат вызывал в 2%-ной концентрации.

■ Полученные данные свидетельствовали о выраженной специфичности действия образцов вертициллина М, а именно: против тлей разных видов (гороховой, персиковой, бобовой и бахчевой), а Также против оранжерейной и хлопковой белокрылок.

ВЫВОДЫ:

1. У всех изученных нами 20 природных изолятов гриба V. 1есапп различного происхождения обнаружены энтомоцидные метаболиты с контактной активностью, вызывающие высокую смертность тест-насекомых. Основное количество инсектицидных метаболитов содержится в биомассе гриба и значительно меньшее - в культуралькой мццасти ( до 21% от веса сухой биомассы и до 31 мг% в культуральной жидкости).

2. Природные изоляты высоко изменчивы, существенно различаются по уровню накопления экзо- и эндотоксинов. Наиболее перспективные штаммы:, 5, 17, 21 характеризуются высоким уровнем токсинообразования и хорошими технологическими свойствами (выход токсической фракции до 16£ с активностью до 80%; титр бластоспор до 210 млн. спор/мл, биомасса 5-7 мг/мл).

3. Нами выявлены наиболее существенные признаки штаммов, коррелирующие с . вирулентностью и токсигенностью . гриба.. V. 1есал11. Коэффициент множественной корреляции 0,7 получен для следующих факторов: продуктивности штамма по биомассе и бластос^орам, содержание токсической фракции в биомассе и культуральной жидкости и фенотип колоний. Определение вирулентности по зтш факторам проводится с помощью номограммы.

4. Изученные' нами штаммы V. 1есапп по признаку токсинообразования и симптоматике делятся на две группы:

- штаммы с высоким уровнем токсигенности и опережающим токсикозом в патогенезе (5, 7, 8, 16, 17, 20, 21, 22, 27, 38, 39, 44, 46);

- штаммы с низким уровнем токсигенности (28, 31, 49, 51). Первые характеризуются массовым образованием мицелиальных проростков в теле насекомого-хозяина и смертностью до 15% на первые сут^и после инокуляции. Вторые характеризуются повышенным образованием биомассы гриба в теле насекомого-хозяина и более низкой смертностью на первые сутки (до 47.)

5. Нами установлено, что токсический комплекс гриба V. 1ес:апП содержится в липидной фракции (до 4% от общих липи-дов) и состоит из двух активных компонентов, названных нами токсином-1 (относительно стабильное соединение, вызывающее гибель тест-насекомых в течение 15-20 минут) и токсином-2 (нестабильное соединение, приводящее к гибели тлей при контакте в течение нескольких часов).

6. Установлена химическая природа токсина-1 - основного действующего вещества токсического комплекса, которое определено нами как триглицеридный фосфоэфир (М вес=390 у. е.) и предложена его возможная структурная формула.

7. Наиболее высокий выход токсинов из биомассы гриба (до 23% с активностью до 98%) обеспечивается разработанной нами питательной средой, которая предложена' как основа для промышленной питательной среды при производстве биопрепарата вертициллина М. Сбалансированная' среда приводит к синхронному росту культу-

ры, при этом максимальный синтез токсинов происходит в стадию предспоруляции культуры (на 3-й сутки).

8. Полученные нами в лабораторных условиях образцы препарата вертициллина М обладали выраженной специфичностью действия: в отношении персиковой,, бобовой, гороховой и бахчевой тлей активность варьирует от 74 до 100% (при рабочей концентрации 0,5 %). В отношении оранжерейной и хлопковой белокрылок активность составляет около 95£ и 60-902, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основе проведенных исследований разработан способ получения биологического инсектицида на основе токсинов гриба V. ]есапп, который рекомендуется биотехнологическим научно-исследовательским учреждениям и опытно-промышленным производствам. Для наработки опытных образцов препарата рекомендуем проводить культивирование гриба V. 1есалН (штамм Р-81) в глубинных условиях на оптимизированной среде следующего состава: глюкоза -2Х, пептон-и,; КН2Р04-0,2%, (,£304-0,112% (рН-6,5).

2. Разработан способ экстракции токсинов из биомассы V. 1есалп. В качестве зкстрагента можно использовать хлороформ и смесь этанол-вода (1:1) для экстракции из сухой биомассы.

3. Разработан метод количественного определения токсинов. Для определения действующего вещества в пробе, практически не содержащей примесей, рекомендуем метод ВЭЖХ в градиенте во-да-ацётокигрил с оптическим детектированием на волне порядка 220 им. При оценке опытных образцов препарата следует совместить методы тонкослойной хроматографии, калориметрического определения .фосфата Н вэкх,

. 4. Материалы, полученные по методам экстракции и количественному методу определения токсина, а также рецептуру питательной среды ми рекомендуем включить в лабораторный регламент получения биопрепарата вертициллина М.

5. Разработанные наш подходы по методам выделения токсинов V. 1есапи мы рекомендуем для изучения токсинов других видов энтомопагогенных грибов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Новикова И. И., Митина Г. Б. Перспективы использования метаболитов гриба V. 1есап11 для борьбы с болезнями растений // Тезисы докладов' Всесоюзной научно-практической конференции

"Проблемы овощеводства в защищенном грунте". 29 октября-2 ноября 1990 г. г.Самарканд, Самарканд, 1990, с. 49-50.

2. Митина Г. Гиндина Г. М., Павлюшин В. А. Изучение токси-генности энтомопатогонного гриба Vertlcillium lecanil // Конференция молодых ученых "Экологические проблемн защиты растений" (21-24 ноября 1990 года) Тезисы докладов. Л , 1990, С. 242.

3. Гиндина Г. U , Митина Г. В., Павлюшин Е А. Токсигенность' природных изолятов VerticiIlium lecanii (ZimmerMan) Viegas // Микология и фитопатология, 1990, т. 24, вып. 6, с. 576-582.

4. Цитина Г. В., Павлюшин В. А. Изучение энтомоцидных токсинов знтомопатогенного гриба VerticiJllum lecanii // Всесоюзное совещание "Перспектива создания экологически чистых технологий возделывания сельскохозяйственных культур". Тезисы докладов. Л. , 1990, с. 88-90.

5. Митина Г. В., Павлюшин В. А., Новикова И. И. Связь токсиген-ности и вирулентности природных изолятов Vertic.illium lecanii// Микробиология в сельском хозяйстве. II Республиканская конференция 4-5 июня 1991 г. Тезисы докладов. Кишинев, 1991, с. 87.

6. Митина Г. Е , Новикова И. И., Павлюшин В. А. Оптимизация процесца культивирования гриба VerticiIlium lecanii по признаку токсинообразования // Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тезисы докладов IY Всесоюзной научной конференции. Пущиго, 2024 января 1992 г. Пущино, 1992, с. 137.