Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологически активные метаболиты Verticillium leganii Zimm. (Viegas): спектр действия и критерии отбора штаммов-продуцентов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологически активные метаболиты Verticillium leganii Zimm. (Viegas): спектр действия и критерии отбора штаммов-продуцентов"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного

РГ Б

На правах рукописи

х г г и 1г>г'.,1 'О - ¡1 • , , ;

РУССОВА Елена Николаевна

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ УЕЩ1С1ШиМ ЬЕСАМ1 гШМ. (УШСАБ): СПЕКТР ДЕЙСТВИЯ И КРИТЕРИИ ОТБОРА ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

03.00.07 — микробиология

А в тореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель; доктор биологических наук А. М. ЗАЙЧЕНКО

Киев —1994

Работа выполнена в отделе физиологии и систематики микро-мицетов Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. За-болотного HAH Украины и в отделе микробиометода Института биометодов защиты растений АН Молдовы.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А. М. Зайченко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Э. 3. Коваль

кандидат биологических наук JI. М. Яковлева

Ведущая организация:

Киевский государственный университет им. Т. Г. Шевченко

Защита диссертации состоится «21» сентября 1994 г. в 10.00 часов на заседании специализированного совета Д 016.06.01 при Институте микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболот-ного HAH Украины по адресу: 252143, Киев-143, ул. Заболотно-го, 154.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного АН Украины.

Автореферат разослан «1» августа 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

JI. М. Пуриш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интенсивное применение средств химической защиты растений в последнее десятилетия сопровождалось рядок побочных эффектов, которые поставили под угрозу ие только чистоту окружающей среды и здоровье человека, но и само выживание человечества. Кроне того, появление устойчивых к этим веществен форм вредителей сделало нногие из них неэффективными. В связи с этим в контроле урожая все большее значение приобретают биологические нетоды, основанные на использовании антагонистических отношений в агроцеиозах, Знтонопатогенный гриб V. iecanií Zimmermann СViegas) был успешно применен в Советском Союзе Евла-ховой в 1938-1941 гг. против червецов на цитрусовых культурах. Дальнейшее изучение его позволило выяснить, что наряду со иитов-капи и червецами он поражает некоторые виды тлей, а также представителей отрядов чешуекрылых и жесткокрылых.

Однако, наибольший интерес гриб представляет как патоген вредителей овошных культур закрытого грунта. Успехи s этой области достигнуты благодаря усилия« многих исследователей и связаны главным образом с работами Соловей (19803, Беглярова (1S85), Пав-люшина (1986), Гораля (198?). Hall (1976), Drummond et al. (198?). Hirte et al. (198S).

Способность V.lecanii подавлять вредных насекомых послужила основой разработки ряда биопрепаратов. В настоящее время в СНГ производят две препаративные Формы! "Вертициллин зерновой" и "Вертициллин-К". В Великобритании с 1981 г. выпускается препараты "Верталек" и "Ликотал", которые применяют против тлей и оранжерейной белокрнлки. Достигнуты определенные успехи по искусственному заражению личинок и цист ч>итопатогенных нематод конидиями гриба tHanssler, 1981. 1990). Кроме того. V. 1есал11 обнаружен в качестве гиперпар*зита на иучнисторосяных tleeiain?, 1980; Price. 1S88) и* ржавчинных грибах (Hasssbraitk, 193б< Bouriquet. 1939: Pfromer. Hendgeru 1978t Spencer, 1880> Sundhein, 1986: He Uwe gen I688r Shau, 1988).

Однако, несмотря на столь длительную историю изучения и применения V. leranií сведений о биологически активных веществах этого гриба и механизмах их действия крайне недостаточно яля того, чтобы достоверно судить об зтоп. Здесь можно лишь указать на обнаружение инсектнцктлных кетакоактов контактного типе (Гиндина

и др.. 1990), на способность V.lecanii синтезировать гельволевую (Arima, 1978) и дипиколиновую кислоты CClayüon, 19В2). а также бассианолид (Suzuki. 1977; Kanaoka. 1978; fturakoshi. 1976). с другой стороны, в литературе отсутствуют сведения о влиянии токсичных вешэств V. lecanii ьа Фитопатогенныэ грибы и бактерии, за исключение« гельволевой кислоты, активной в отношении грамположк-тельных бактерий. Большинство авторов считает, что метаболиты V. lecanii не обладают фитотоксической активностью. Лишь отдельные исследователи отмечали вредное влияние гриба на растения при использовании его для борьбы с насекомыми и фитопатогенами CSchans. 1982; HiJuegen, 1988). Однако, эти данные не были подтверждены в последующих экспериментах.

В связи с этим представляется крайне интересным и практически важным изучить влияние -биологически активных вешств V. lecanii на компоненты системы растение - насекомое ~ Фитопатоген.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было выделение биологически активных метаболитов V.lecanii. изучение их свойств и активности в отношении некоторых Фитопатогенных грибов к бактерий. нематод, насекомых, растений.

Достижение поставленной цели предусматривало решение ряда конкретных задач:

- выделить и идентифицировать культуры V.lecanii;

- на основании сравнительного изучения некоторых морфодого -культуральных. Физиологе - биохимических и токсигенных свойств выделенных штаммов провести их группирование, а также выявить возможные корреляционные сряэи;

- отобрать наиболее активные штаммы, изучить у них способность к синтезу кикотоксинов;

- отработать способы выделения и очистки биологически активных веществ V.lecanii. оценить спектр ик действия.

Наряду с этим был проведен ряд исследований, постановка которых диктовалась ходом выполнения настоящей работы, как-то:

- отработка условий биосинтеза активных метаболитов; изучение некоторых аспектов биохимического механизма их действия.

Основные положения, которые выносятся на защиту.

В результате выполнения поставленных задач был отработан psu положений, основные из которых выносятся на защиту:

1. Существует корреляционная зависимость между антибиотической активность», морфолого-культуральными свойствами и активное

тью гидролитических Ферментов штаммов ü. lecanii.

2. Метаболиты V.lecanii обладают наряду с инсектицидным антибиотическим, фитотоксическин и нематицидным действием.

3. Для исследованных штаммов характерен идентичный качественный состав активных метаболитов. Отмеченные различия носят количественный характер.

4. Метаболиты V.lecanii обладают способностью ингибировать синтез белка и нуклеиновых кислот, что определяет широкий спектр их биологического действия.

Научная новизна работы характеризуется следующим*

- Впервые обнаружена способность метаболитов V. lecanii ингибировать рост <?итопатогенных бактерий и грибов; для большого числа штаммов (189) в сравнительном разрезе представлены данные о норФолого - культуральных, физиологе - биохимических и тохсигек-ных свойствах. Установлена корреляционная связь антибиотической активности с иорфолого-культуральными свойствами и активностью гидролитических Ферментов цгганммов V. lecanii.

- Отработаны способы выделения и очистки биологически активных вешеств V. lecanii; из Фильтратов культуральной жидкости и нииелия 15-ти штаммов V. lecanii выделены ранее не известные токсические метаболиты, активные s отношении насекомых, нематод, Фи-топатогеннкх грибов и бактерий.

- Выявлены различия в количественном содержании активных компонентов в экстрактах из Фильтратов культуралькой жидкости и мицелия Р 28, 9/9Т и 168 этаммов при их качественной однородности. Установлено, что антибиотическая активность определяется преобладанием компонентов с антифунгальным CRf 0,60; 0.56; 0,50 в системе растворителей толуол - диэтиловый з<?ир - ацетон (5;81 ¡14) либо антибактериальным CRf 0.65; 0,53; 0.44) действием.

- Показано, что метаболиты v/. lecanii обладают фитотоксичес-кин действием, которое проявляется в ингибировании синтеза хлоро-фидлоз a. b и каротиноиаов Chlorella vulgaris 62 токсином в концентрации 0,25 якг/мл при культивировании хлореллы на свету и 2,0 мкг/мл - в темновом режиме.

- Изучено действие токсинов V. lecanii на синтез белка а нуклеиновых кислот а клетках Chi. vulgaris 82, Fusarium solan). 2/315 и Clavit>acter raichiganense 13. Установлены р&зличия в концентрациях токсина, вызывавших сходный ннгабиторнкй эффект а кс-следовакннх системах.

Практическое значение,

1. Изучение токсигенного потенциала V.iocanii расширяет воз-яожиостк его практического использования в защите растений от вредителей и болезной путей создания препаратов на основе штампов. обладаюоах конплексный действиен в отношении насекомых, нематод и фитопатогенных микроорганизмов. а также исключает припе-HSHK8 штамнов. обладающих Фитотоксической активностью.

2. Критерии отбора штаммов-продуцентов биологически активных веирств. разработанные на основе анализа корреляционных связей токсигенных свойств с яорфолого - культуральныш и Физиолого - биохипическини ногут быть использованы в скриннинге активных пгганиов,

3. Оптимизация синтеза активных кетаболитов, а также разработка нетодов выделения и очистки направлены на получение новых Фора биопрапарата на основе У. lecanii.

Несто проведения исследований н личный вклад автора. Работа выполнена в отделе Физиологии и систенатики иикроницетов Института микробиологии и вирусологии ии. Д. К. Заболотного АН Украины и в отделе микробионетодав Института биазашты растений АН Молдовы.

Экспериментальные материалы, изложенные в диссертации, получаны лично автора». Непатицидну» активность изучали совиестно со ст. научи. сотрудники отдела ненатодогии Института зашиты растений АН Украины Тиячэико Л. С. Математическую обработку данных, представленных в 3-ей глава, проводили при участии Садовникова Ю. С. по програнне TAI. разработанной в вычислительном центрэ Института никробиологки и вирусологии АН Украины.

Апробация работы. Натерналы диссертационной работы был» прваставаакы на I1-ан симпозиуме стран - членов СЗВ /Протвино. 1890 /. на I1-ой республиканской конференции "Микробиология в сельском хозяйства" /Ккшинеа. 1991/. на 1-ом Украинской никробио-логичесхон сьездэ /Одесса. 1893/.

Публикация рэзу«ьтатоп исследований. По натериалаи диссертационной работы опубликование 6 печатных работ.

Структура и обгак работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части. вхлвчахдай 3 главы, выводов в списка цитированной литературы.

Работа изложена на203 страницах яашнопкского текста, вклю-• чает 22 таблица,31 рис л га а. а тахга библиографический указатель из 292 источников. в тон числе 24? работ иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

• Глава 1. Vertfcillium lepanii Zimmermann (Viegas). история открытия, таксономическое положение, биология к применение в защите растений /Обзор литературы/.

В данной главе, представленной 9 разделами, приведена сведения по истории открытия исследуемого энтомопатогена, таксономическому положению, морфологии, распространению в природе, требованиям к условиям среды и потребностям в источниках питания. Рассмотрены механизмы патогенеза насекомых и гиперпаразитизма. Дано описание биопрепаратов. Подчеркивается недостаточность сведений относительно биологически активных веществ и их участия в патологическом процессе.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

Объекты исследования. Всего изучено 189 игаммов У. lecanii. Выделение и идентификация подавляющей части культур проводилась в Институте биометодов зашиты растений АН Молдовы ст. научн. сотрудником Е. Ф. Соловей при нашем участии. Отдельные штаммы были предоставлены в каше распоряжение из коллекций культур Англии, Польши, Румынии. Венгрии. Исследуемые штаммы выделены из личинок оранжерейной белокрылки. • бахчевой тли. червеца и шитовки в различных регионах (Кишинез. Ужгооод. Сочи. Владивосток). В качестве тест-объектов при изучении антибиотической активности иико-токсинов использовали «ритопагогенные грибы и бактерии. сапрФитккь дрожжи, список которых представлен в таблице 1. Эти микроорганизмы были предоставлены в наше распоряжение из музея отдела Фитопатогенных бактерий "ст. научк. сотрудниками В. А. Мурас к А.П. Коробко. из музея отдела физиологии и систематики микромице-тов - ст, научн. сотрудником И. А. Элланской. О Фитотоксической активности судили на основании способности метаболитов подавлять рост Chlorslla vulgaris 62. Нематицидное действие изучали на личинках Heloidogyna incognita и сапробионтах. Инсектицидную активность исследовали на личинках персиковой тли tlyzus persicae и оранжерейной белоксылки Trialeurodes vaporariorun.

Способы культивирования. Испытуемые штампы микромииетов. в зависимости от поставленной цели, культивировали поверхностный

Таблица 1

Список исследуемых шгаимов тест-кикроорганизмов

NN ВИД Ш Т А И И ПП_' -----

1 Clavibacter michiganense subsp. michiganense

Davis. Gillaspie, Vidaver, Harris 1984 13

2 C. michiganense subsp. sepedonicum Davis.

Gillaspie. Vidaver, Harris 1984 ■ 7755

3 Xanthomonas campestris pv. campestris

(Pamasel 1895) Dowson 1939 820

4 X. carapestris pv. malvacearum (Smith 1901) Dye 1978 8838

5 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

С Burkholder 1926) Young et al. 1978 8633

8 P. syringae pv. Iachrymans (Smith and Bryan 1915)

Young et al. 1978 40

7 Eruinia carotovora subsp. atroseptica (Jones 1901)

Dye 1969 9068

8 E. carotovora subsp. carotovora (Jones 1901)

Dye 1969 8982

3 E. toHica Korobko 1973 8418 Ш Agrobacteriuia tumefaciens (Smith et Tounsand 1907) Conn 1942

11 Bacillus sp.

12 Candida kefyr .44 L3 Myrothec iun roridun Tode BKHf 832

14 Drechslera teres (Sacc.) Shoem. Ito 109828

15 Fusarium sporotrichiella ßilai 53115

16 F. raoniliforne Sheld 54262

17 F. graninearum Sctiwaba 873

18 F. solani (Hart.) App. et Ur. 2/315

19 F. macroceras Уг. et Rg. 579A

20 F. oxysporuB (Schlecht.) Snyd. et Hans 55715

21 Botrytis cinerea Pers. 109815

либо глубинный способом. Грибы вырастали на среде с кукурузный sucTpasTon (Ph 4.5>. В-качества источняхсв углерода использовали счхагозу (30 г/л) к крахмал (20г/л). Засев, проводили стандартной суспеазнай конидий 2-к недельного возраста.

- h

Густота засева 5*1О4 клеток/ид. Температура 24-26° С, Для изучения корфолого-культуральных особенностей штаммов грибы выращивали поверхностный способом как на жилкой, так и на плотных питательных средах:' сусло-агаре и агаризовакной среде Чапека. Культуры описывали согласно рекомендаций Андреюк с сотр. (1980).

Изучение биологической активности. Исследовали антибиотическое действие Фильтратов культур&льной жидкости СШ 189 штаммоь tf. lacanii, антибиотическое и Фитотоксические действие метаболитов. выделенных из 15 штаммов, проявивших наибольшую активность t зткошении различных фитопатогенов. Б последующих эксперимента:: использовались токсичные экстракты 2-х штаммов - Р 26 и 9/9Т. Испытывали их действие на нематоды и насекомые. Отмечали угнетак-иээ действие на листья томатов. Для оценки антибиотической и фи-готоксической активности применяли методы лунок и дисков (Методы экспериментальной микологии, 1982). Ненатицидное действие эк-;трактов изучали вороночным методом (Тимченко, 19S2). Было испытано 4 концентрации токсина, из Фильтрата К* штамма 9/9Т Ш: 3.2; 0,3; 0.4: 0,8. Изучение инсектицидной активности проводили ю методу Гиндиной с соавт. (1990). Использовали IX водные растворы экстрактов из фильтратов КХ и мицелия штаммов Р 26 и 9/9Т.

Биохимические методы анализа. Наряду с изучением морФоло-го-культуральных свойств штаммов исследовали некоторые их Физио-¡¡ого-биохикические характеристики, а именно, активность таких гидролитических Ферментов, как целлюлаза, ксиланаза, пектиназа. *итиназа, протеаза. Кроме того изучали действие токсичных метабо-5итов на фотосинтетические пигменты хлореллы, а также на синтез ИНК. РНК и белка Фмтопатогенных микроорганизмов и хлорелла.

Активность ксиланазы, образуемой в культуре грибов, исследо-*али методом агаровых блоков (Dingle J. et al., 1953J. Для об-тружения активности пектино- и хитинолитических ферментов гриб!; зысевали в чашки Петри на агаризованные питательные среды, со-зержаше в качестве единственного источника углерода пектин либо штик. Активность целлюлозолитических Ферментов оценивали г,о {арактеру роста гриба в пробирках с жидкой средой Чапека без уг-TeBQSOB с полоской фильтровальной бумаги (Методы экспериментальной микологии, '1982). Для изучения протеолитической активности использовали желатину. В качестве субстратов для обнаружения «стивности ферментов использовали:

1) Ксилан из овса, 0,5/. в фосфатной буфере, агар - 27., рН

7.1 - для выявления ксиланазной активности.

2) Цитрусовый пектин ("Serva"), 0,5/. в минеральной среде Чапека - для выявления пектиназной активности.

3) Коллоидный хитин, (Кузнецов, Янгулова, 1970) в агаризо-ванной среде для грибов (Hankin, Anagnostakiy, 1975) без добавления дрожжевого экстракта. Хитин готовили по методу Reynolds et ai. (1954) в модификаци Института органической химии РАН (1961).

4) Фильтровальная бумага в голодной среде Чапека (Методы зксп. кикол.,1982)

5) Желатина pH 7,0 (Методы эксп. микол., 1982).

Для изучения действия токсических метаболитов на Фотосинтетические пигменты хлореллу выращивали глубинным способом на качалке (160 об/мин) при температуре 24° С и освещенности 4000 лк (Zalchenko et al., 1989) в колбах Эрленмейера емкостью 100 мл, содержащих 40 мл среды без источника углерода. В случае культи-зирования хлореллы в темновом режиме в среду добавляли пептон и глюкозу. Густота засева - 1.2*107 клеток/мл. Конечная концентрация спирта в исследуемых системах не превышала 0,05/.. Испытывали пять концентраций токсина, выделенного из мицелия штамма 9/9Т (мкг/нл)» 0.125; 0,25; 0,5; 1,0: 2.0; 5,0. Исследуемые пигменты (хлороФилли а и Ь. каротиноиды) экстрагировали абсолютным ацетоном, а их содержание в клетках хлореллы расчитывали по уравнениям. составленным на основании экспериментально' полученных удельных коэффициентов Хольма - Веттштейна (Методы биохимического анализа растений. 1978) с использованием спектрофотометра "Bsckman" DU - 8В (Австрия).

Об йнГибиравании синтеза белка и нуклеиновых кислот токсинами U. lecahil судили по включению меченых предшественников -'Н-дейцина (40 MBq. 1080 ji£i ) "Изотоп", С-Петербург) и 2- *С-аде-нина (40.63 KBq, 1037 jnCi f МТА ISOTOP INTE2ETE. Budapast) в макромолекулы (Рязанова и др., 1952).

Испытанные концентрации был» различники в 3-х модельных системах; в системе Chi. vulgaris 62 - 0.25; O.Si 1.0; 2.0 лкг/nx; в системе F. solanl - 5; 10; 25; 60 ихг/mÍ и. наконйй. в системе a. ¡nichiganense 13 - 50; 100: 200; 500 мы/ид. Радиоактивность ■ измеряли при попоет жидкостного сшштиллашюнкого спохтрокетра С'Баскшп". Австрия).

Глава 3. Сравнительная характеристика портолого-культуралькых, Физиолого-биохимических и токсигенных свойств штаммов.

Изучение антибиотических свойств нетаболитов V, lecanii яо настоящего времени не было предметом специального исследования. В литературе отсутствуют сведения относительно роли токсинов в процессе заражения грибов, на которых паразитирует V. lecanii. Тек не менее, активность V. lecanii в отношении грибов и бактерий вызывает особый интерес. Включенный в сложную систену взаимоотношений: растение-касекомое-фитопатоген, зктомопатоген, являвшийся одновременно гкперпаразитон, может играть важную роль в заките растения-хозяина, как от вредителей, так и от болезней. В исследованиях такого рода важно выявить возможные корреляционные связи антибиотической активности с морфолого-культуральными и Физио-лого-биохимическими свойствами.

В условиях стационарного культивирования на жидкой питательной среде у 189 итакмов грибов изучали изменение pH среды к концу Ферментации (12 суток), выход биомассы, проводили оценку их антибиотически?; свойств в отношении фктопатогенных микроорганизмов. Показано, что фильтраты Ш 116-ти штаммов V. lecanii подавляют рост изученных Фитопатогенов, за исключением Agrobacteriura tumafaciens и Fusarium sporotrichiella 53115. Наиболее восприимчивыми к метаболитам У. lecanii из Фитопатогенных бактерий оказались: Clavibacter sepedonicara 7755 - возбудитель кольцевой гнили картофеля, Erwinia carotovorasubsp. atroseptica 9068 - возбудитель гнилей овощных культур и Pseudomonas lachryraans 40. вызывавши угловатую пятнистость огурцов. Среди фитопатогенных грибов наибольшая чувствительность проявили; Fusarium solani 2/315. вызывающий гнили бобовых и овоиных культур, а также F. шасгоceras 579А и F. moniliforme 54282 - возбудители розовой плесени злаковых. Заслуживает внимания тот факт, что изоляты V. lecanii из оранжерейной белокрылки. паразитирующей на огурцах и томатах, способны подавлять рост бактериальных и грибных патогенов этих растений (Р. iachrymans 40. Cl. raichiganense 13, F. solani 2/315).

Ras по морфолого-культуральнкм, так и по физиолого-биохимическим свойствам изученная популяция грибов оказалась весьма гетерогенной.

, Для математической обработки экспериментальных данных ис-. пользовались иетоди числовой таксономии (Бейли. 1970). Признаки, полученные зксперинеитально, были разбиты на 8 групп:

1-ая группа объединяла количественные признаки, характеризующие антибиотическую активность в отношении Фитопатогенных грибов и бактерий;

2-ая группа объединяла количественные признаки, характеризующие интенсивность спороношения. биопассу. разнеры коллоний, длину конидии и pH среды культивирования;

3-я группа объединяла качественные морфолого-культуральные признаки V. lecanii при росте на жидкой питательной среде;

4-ая группа представляла качественные порфолого-культуральныв приэкахи шташов на авизированной среде Чапека;

5-ая группа представляла качественные норфологические признаки. характеризующие строение и пространственное расположение репродуктивных органов;

6-ая группа объединяла количественные признаки, характеризующие активность гидролитических Ферментов.

Сходство нажду иггаянами оценивали методой показателей расстояний. Каждоиу штамму был поставлен в соответствие вектор в п-нернрн эвклидово« пространстве, где п - количество признаков штампов, Такин образок, сходство нежду штаяпани определяли как расстояние нежду векторами.

Результаты обработки на ЭВМ представлены в виде таблиц уровней связи, по который были построены дендрограмиы. давшие наглядное представление об иерархической структуре.

При анализе дендрограин оказалось, что штаммы, проявляющие' антибактериальную и антифунгальную активности образовали разные кластеры во всех 6-ти группах признаков. Причем, из 9-ти штаммов CA 1Г, А 1, С 71, Р 26. 1У 57, 11. 13. 12/7. Р 61). наиболее активных в отнокании бактерий, 5 попали в один кластер во 2-ой (С 71. 1И 57, 11. 13. 12/7). 4-ой (С 71. 1« 57. П. 13. 12/7). 5-ой CP 26. 1Н 57. 13, 12/7, Р 61) и 6-ой (С 71. Р 26. 19 57. 13. 12/7) группах к 6 (С 71, Р 26. 1У 57. 13. 12/7. Р 61) - в 3-ей группе прзнаков. Из 18-ти Егганное с антифунгальной активность» (81. 1/5. 2/7. 3/3. 3/13. 1/1Т. 3/1Т. 4/2Т, 5/ЗТ. 5/4Т. В/ЗТ, 8/4Т. 9/ЗТ» 8/5Т, S/ST. 10/5Т) в один кластер попала 8 вганноа в 3-ей группе СЗ/З, 1/11. 3/1Т. 5/4Т. 8/4Т, 9/ЗТ. 9/9Т. 10/5Т). 7 -в 4-ой С 5/ЗТ. S/3T. 6/4Т. 9/ЗТ. S/5T. 9/9Г. 10/5Т). 10 - в 6-ой

- и -

С1/1Т. 3/П. 4/2T. 5/ЗТ, 5/4T, 6/ЗТ, 8/4Т. О/ЗТ. 9/5Т, 9/9Т) и 9 - S 6-ой.(3/3. 1/1Т. 3/1Т. 5/ЗТ. 5/4Т, 6/ЗТ. 8/4Т. 8/ЗТ. 8/5Т). Уровень связи, на которой формировались кластеры, во веек случаях вышв 68 /., за исключением 6-ой группа (56 /Л для штаммов с антибактериальной активностью. На рисунке 1 представлены фрагменты дендрогранмы, построенной на основе сходства между штаммами по 5-ой группе признаков.

Такин образом, установлена положительная корреляция между антибиотической активность» штампов, йорфолого-хультуральными и физйолого-биохимическими их свойствами. Обобщая вышесказанное, мы пришли к заключении, - чto поиск штаммов. обладающих антифун-гальной активностью, следует проводить среди изолятов. выделенных из тли, обладающих следующими.свойствами. Штаммы не проявляют активности гидролитических Ферментов или проявляют еэ в слабой степени. На твердой среде формируют врастающие в субстрат колонии белого и сероватого цвета со слабо развитым пицелиёи, бархатистой текстурой, складчатой поверхностью, реснитчатым краем. Реверзум палевый радиально исчерченный. На жидкой среде образуют тонку» складчатую поверхностную ницелиальную пленку с бархатистой текстурой. Реверзум возможен винно-красный. В световой микроскопе различимы прямостоящие мокопоидально разветвленные конияиеносца, фиалидк, большей часть»,, собраны в мутовки. Встречается также супротивное и одиночное расположение, междоузлия больше или равны длине Фиалид. Споры цилиндрические средние (5,4 - 6.1 мкм) и крупные (6,3 -7,6 мкм), спороношение обильное.

Для выявления антибактериальной активности, напротив, следует использовать штаммы, выделенные из белокрылки, с высокой степенью Ферментативной активности. На твердых средах эти итаммы Формируют белые пушистые колонии с хорошо развитым мицелиек, ровной поверхностью и ветвистым краем. Реверзум радиально исчерченный палевого или охристого цвета. На жидкой среде штаммы образует складчатую толстую пушистую ницелиальную пленку. Конидиеносць? стелющееся. большей частьв. не разветвленные, Фиалида. в основном, одиночные и супротивно расположенные. Нутовки встречаются редко. Споры цилиндрической Формы мелкие (3,4 - 4.6 мки). Спороношение обильное при культивировании на агаризованной среде Чапека не менее 2-х недель. Эти критерии можно использовать при отборе активных штаммов.

•

3 *>

сс ча и

-о

о

о

• ^

915919т фЗ/{$абА 9/3

4»

Л-

ТУ

XV а нтиВных

ю

I

Рис. I. Дэидрограмма сходства по морфологическим признакан

штампов, активных в отношении грибов (а) и бактерий Св)

Глава 4. Биологически активные метаболиты Verticillium lecanii и их свойства.

Динамика токсинообразования. В связи с изучением биологически активных вешеств V.lecanii. прежде всего встал вопрос о выборе. препарата для исследования. Учитывая это. изучали содержание токсичных метаболитов в фильтратах Ш и мицелии У. lecanii Р 26 в различные периоды роста в условиях поверхностной ферментации на двух средах: среда Н 1 с кукурузным экстрактом и основная полусинтетическая среда К 2 с аспарагином в качестве источника азота. Максимальный выход токсинов отмечается на 10 и 16 сутки культивирования на среде N 1 и на 6, 10 и 16 сутки на среде N 2. Максимум продуктивности токсинообразования, которая представляет собой отношение выхода образуемого токсина к биомассе за время культивирования, приходился на 8 - 10 сутки на среде N 1 и на 6 и 10 - на среде fl 2. Наибольшей биологической активностью в отношении Clavlbacter michiganense 13 обладали внеклеточные метаболиты на 14 сутки культивирования на среде N 1 и с 10 по 14 сутки - на среде N 2. Пики активности мицелиальных экстрактов на среде N 2 приходятся на 6 и 10 сутки культивирования. На среде N 1 их активность с 6 по 16 сутки изменяется незначительно, от 23 до 25 мм (максимальные значения на 8 и 12 сутки). В связи с этим дальнейшие исследования проводили с препаратами, полученными на 12 сут-тск культивирования на среде N 1. учитывая, что эта среда обеспечивает значительно бодьиий выход токсина по сравнении с альтернативной.

■ Выделение биологически активных ветств.

Для этой цели использовали культуральные фильтраты и яицелнй 15 агаммов V. lecanii. Ниже приведена общая схема выделения:

Фильтрат КЯ. мицелий

•I

Экстракция хлороформом Cli5. трижды)

I

Упаривание (аваууа) |

2кякостг> - ГКДК0С7К09 пороргспродззеяи® • Сгцетонитрнл.- гехсаи)

Нпаривание С вакуум) i

Растворение в хлороформе

1

Дегидратация^Сбезв. йа2Бф Упаривание Свакуум)

I

Препарат-сырец

Действие на фитопатогеккые бактерии и грибы. В главе 3 нами описана способность Фильтратов Ю£ ряда штаммов V. lecanii с определенной избирательностью подэелять рост грибных и бактериальных Фитопатогенов. Так, некоторые из них подавляли рост значительного числа изученных фитопатогеноЕ, другие - лишь отдельных или даже единичных. В одних случаях-.для них была характерной как анти-фунгальная, так и антибактериальная активность, в других - либо та, либо другая. Это могло быть связано как с качественными, так и с количественными различиями активных метаболитов. С целью подучить ответ на этот и другие вопросы и была предпринята постановка настоящего исследования, включающего сравнительное изучение накопления биомассы, выхода токсина и продуктивности токси-нообразования. а также биологической активности экстрактов из фильтратов КХ и иицелия наиболее активных штаммов. В работе использовали 15 штаммов U. lecanii выделенных из тепличной бе-локрылки Сизоляты Р 26, 11, 112, 116, 124, 153. 162. 16В, 182. 183. 195. 196) и бахчевой тли Сизоляты А 1, 5/ЗТ, 9/9Т). Из хлороформных экстрактов фильтратов КХ и мицелия получали ацето-нитрильну» и гексавовую Фракции к использовали их для биологических и хроиатографических исследований. Компонентный состав токсических велиств изучали, используя метод тонкослойной хроматографии в системах растворителей толуол - яиэтиловый эфир (5:6) для веществ ацетонатрильной Фракции и петролейный эфир - диэтиловый эфир C?í3) - для гексаковой.

Биомасса исследуемых штаммов отличалась незначительно и колебалась в пределах от 14.5 до 16,в г/л. Минимальный выход токсина был характерен для штампа 153 С50.5 яг/л). Продуктивность ток-синообразования за исследуемый период, представляющая отношение выхода образуемых токсических метаболитов к биомассе, находилась

в пределам от 3,3 иг/г у шт 153 до 10.7 иг/г - у шт 168. Характерно, что у штаммов с большими значениями биомассы наблюдался и больший выход токсина.

Не все исследуемые препараты проявляли бкодогическув активность. Так, к гексановым экстрактам оказался чувствительным лишь один из изученных штаммов (F. moniliforme 542823. И только гекса-новая фракция штамма Р 26 оказызала антибактериальное действие в отношении CI. michiganense 13, Cl. sepedónícuia 7755 a Bacillus sp. Данные относительно токсичности ацетонитрильнкх фракций представлена з таблице 2, из которой видно, что наибольшую активность проявляли экстракты аз мицелия и Фильтратов KJC вггамнов А 1. Р 26. 11, 9/9Т, 124, 168 и мицвлиальный экстракт штамма 5/ЗТ. При этом штамм Р 26 оказывал исключительно антибактериальное действие, штамп 9/9Т - как антибактериальное, так и антифунгальное. а аггам-нн А 1, 11. 124 и 168 - в основном антифунгальное и очень слабое антибактериальное действия. При этом антифунгальная активность сочеталась с фитотоксической. Слабо выраженная активность в отношении очень ограниченного числа Фитопатогенов отмечалась также у итамиов 112. 116, 162. 168 и 196. Штаммы 153, 182 к 195 оказались неактивными. Наш предположения относительно того, что действие на разные группы Фитопатогенов связаны с разными веществами были подтверждены данными хроматографических и биоавтографических исследований.

Изучение компонентного состава комплексных препаратов.

Препарат-сырец подвергали разделению при понега ступенчатой колоночной хроматографии. В качестве неподвижной фазы использовали селикагель (II степени активности. 100/160 мкн). Системы растворителей были следующими: н-гексан. н-гексан - диэтиловый эфир (1¡3). диэтиловый эфир. диэтиловый эфир - ацетон (9U), диэтило-зый эфир - ацетон (4:1). диэтиловый эфир - ацетон (1:1), ацетон. Выход ведаств из колонки контролировали г.о содержаний сухих ве-сэств во фракциях после их упаривания, при поноси тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластиках "Silufol" UV 254 (Kavalliar. Чехия). используя системы растворителей толуол - диэтиловый эфир (5:6) зс толуол - диэтиловый зФнр - ацетон (5:81:14) с псследто-сам биоактографическим проявлением, а также пря поногя бшзгестоз на аятифунгальнув. антибахтериальну© и фитотогсаческуз ахгтонос-та в стногязнии F. solani 2/315, Cl. aichíganeasa 13 a Chi. vulgaris 62. соответственно. .

Таблица 2

Антибиотическая и фитотоксическая активности С<1 стерильной зоны, им) ацетонитридьных фракций из Фильтратов культуральной жидкости и ницелия исследуемых штаммов УегисПИшп 1есапИ

NN ТЕСТ-КНЛЬТВРЫ штам _______________

Фильтраты культуральной жидкости

А 1 11 10 15 12 15 11 15 10

Р26 38 12 15 25 10

11 10 8 20 11 23 10 15 13

Б/ЗТ

8/8Т 21 8 8 20 7 15 14 23 12 10 18 13

112 12

116 10

124 10 10 7 20 15 22 13 8 18 13

153

162 8

168 10 15 12 20 11 13 10

162

193 8 8

185

186 8

Ницелий

А 1 10 10 15 12 15 12 14 14

Р26 20 15

11 8 8 7 8 17 11 25 13 10 20 10

5/ЗТ • 10 9 10 8 10

8/8Т 8 8 20 13 25 13 10 20 13

112

116

124 8 8 20 11 25 10 10 20 15

153

162 8

168 8 8 8 20 14 20 13 10 20 15

182

183 8 ?

185

1В6

06 активности Фракций сулили на основании измерения диаметра стерильных зон вокруг бумажных дисков, пропитанных . 17-ным спиртовым раствором исследуемого вешзства. Визуализацию пятен на ТСХ-пластинках осупествляли путей опрыскивания их 10Z раствором фосфорномолибденовой кислоты (ФШ в этаноле и выдерживания в течение 5 минут при 105° С. Осуществляли УФ-детекции компонентов.

Результаты хроматографического исследования активных Фракций представлены иа рисунке 2. Очевидно, что одиошенние фракции токсичных метаболитов штаммов Р 26 и 168 содержат одни и те же компоненты, за исключением трех высокополярння земств в нижней части хроматеграммы от 163 Несколько инуо картину представляет собой хроматограмма метаболитов штамма 9/8Т. теп не менее, я здесь мы обнаруживаем те же компоненты. Для выявления активных компонентов использовали метод биоазтограФяческого проявления хроматограмм. Результаты опыта показали, что антибактериальным действием обладают компоненты с Rf 0.65г 0,53 и 0,44, а антифун-гальным действием компоненты с Rf 0.60; 0,56 и 0,50. Ведэство с Rf 0,65 получено в кристалическом виде.

Препараты из Фильтратов RX и мицелия трех штаммов существенно отличались по количественному содержанию отдельных компонентов с различным биологическим действием.

Это позволяет нам утверждать, что актизкость птаипов з отношении грибов и бактерий связана с различными компонентами и зависит от их количественного содержания в комплексной препарате, что игаммоспецифично.

Действие на насекомых. Экстракты из Фильтратов КХ и яицелия. а также Фракции, полученные путем колоночной хроматографии, испытывали на инсектицидную активность в отношении персиковой тли а оранжерейной белокрылки . Фракции обладали антибактериальная (штамм Р 26) и антифухгальнын (пггамп 8/91) действиями. Гибель личинок тли наступала на вторые сутки, в то время, как а контроле-все насекомые оставались живыми. Фракция, сбладаяцая антяфуп-гальным действием, показала наибольшую инсектицидную активность -78.9Z. Токсины сггамма 9/9Т зазывали гибель больевго числа тест-насекомых по сравнению с токсинами птамма Р 23 Испытаиниз эк-страхта не оказали действия на личинок- оранжерейной бзлохралзи. однако вызывали хлороз листьев томатов. Учитывая особенности развитая тля и белокралки. ложно прзаполозятгх. что токскаи V. lee mil деастзуят персральяо.

Rf 0,61

ом-

0.2

шт /68

О О . ©к 0 § ©'2 © /3

д io и i£

ll системе:

штР26

О

О

9-Ю и

12

Ю

и

О

О

'2

Ъчспо.нир 6 системе. TO/IL/ОЛ - -Эфир - (5 /vV cppo*HU<s

' aro; 2 0,65; з-о/<о; А-о.56; 5-о,5ъ; в-о,50; r-o.4?; 8-o,W. 0-0.38; sc-0,35; K-0J5; fV. on; Рис. 2. Схепа хронатографического разделения биологически активных фракций 3-х штакнов V. lecanil

Ненатицияное действие. В условиях закрытого грунта Фитопато-генные галловые нематоды представляют большую опасность, повреждая корни растений, и препарат с ненатацилнын яействиен надоя бы применение в занята растений. С другой стороны, сапрофитные нена-тоды не представляют опасности, и действие на них токсина нежелательно. На личинхах Maloldogyna incognita и сапрофитных неиато-дах был испытан экстракт из фильтрата К2 штанна 9/9Т. ЮОК-нуго гибель паразитических нематод вызывал 0.8И раствор. Минимальная испытанная концентрация (О,2X3 вызывала гибель 25И личинок И. incognita и оказывала стшулируюше лэйствио на сапробионтов по сравнении с контролен.

Фитотоксическая активность. Влияние' токсинов U. lecanii на рост и синтез пигментов хлореллы изучали в разных условиях» на свету без источника углерода и в темноте с источником. Было показано. что все изученные концентрации ингибируят рост водоросли. При этом концентрация токсина 1,0 нкг/нл на свету ингибирует рост на 65'/.. а в темноте - лишь на 30'/.. Концентрация, «нгкбирушая рост на 30'/. в условиях освещенности составляла 0,6 нкг/мл, а концентрации, ингибируюше рост на 50/., составляли 4.0 якг/нл в темноте и 0,8 мкг/нл на свету. Изменения, наблюдаемые в биосинтезе пигментов, носят преинугаэственно количественный характер и не сопровождаются изменениями их качественного состава. Как видно из данных, представленных в таблице 3. при культивировании хлореллы а темноте токсины V. lecanii оказывают стииулирувпав действие на синтез пигментов при содержании их в среде от 0.125 до 1.0 икг/нл. Лишь концентрация 2.0 мкг/йл незначительно снижает количество пигнентов.

При культивирования хлорелла на свету без источника углерода наблюдали несколько инуя картину. Ниникальиая кояцэнтрацяя токсина стимулировала биосинтез пигнентов. а концентрации' 0,25» 0,5; 1.0; 2.0 оказывали ингибируюсзе воздействие. Так концентрация 2.0 нкг/мл снижала содержание хлорофилла а до i3,5X. хлорофилла b - до 3?.4'/. каротиноивоа - во-14,6/.. Вероятно, это связано с функциональными особенностей Фотосннтатачесаях пигкоктсз, которые организованы в язе пкгкеиткке систеяы (1С I и К1!) ц- s состава этих систем приникают участка в реакциях сзстзпсД *ми Фотосинтеза. Следует ответить, что синтез хлорофилла- Ь' оказался' наиболее устойчивым з-дзйстзх» тог.сияа. что связано .'с -хохалага-' цягй пнгяаата з хлоре пластая. Предполагает: (Goolbtia» ftwrer.

18863. что почти весь хлорофилл b и ксантофиллы у высших растений и зеленых водорослей содержатся не в ФС I и ФС II. а входят в состав другого светособираюшэго комплекса СССК). синтез которого происходит в значительно большей степени при низкой интенсивности света.

Центральной частью, "ядром". Фотосистем является хлорофилл-белковый "комплекс. Очевидно, ингибирование синтеза пигментов сопряжено с нарушением синтеза белка, в связи с этим нами была предпринята попытка изучить влияние токсина на синтез белка и нуклеиновых кислот ÍHK) хлореллы.

Таблица 3

Влияние токсинов Veгtic 111Iura lecanii 9/9T на синтез клороФиллов и каротиноидов у Chlorella vulgaris 62

: Содержание пигментов, иг/г

Концвнт :_; ........;_

оация. : хлорофилл a s хлорофилл b s каротннонды токсина

нкг/кл :_

г в тем- :на све-«в тем- ^на све-:в тем- г на све-«ноте »ту :ноте :ту «ноте :ту

О

0.125

0.25

0-5

1.0

2.0

3.383 3,553 3,93? 3,558 3.440 3.332

5,576 7.268 5,340 4,301 1.073 0,753

0.854 0.956 1.071 1,001 0,973 0.861

1,784 2.731 1.766 1.401 0.940 0,667

2,092 2.171 2,403 2,189 2.125 2.061

3,414 4,239 3.127 2,687 1.290 0,497

Некоторые аспекты механизма действия токсинов V. lecanii.

Изучали действие токсинов V. lecánii на синтез белка и нуклеиновых кислот в системах CI. michiganense 13 (шт. Р 26) Chi. vulgaris 62 и Т. solani 2/315 Сшт. 9/9Т). Показано Срис. 3). что во всех изученных модельных системах отмечается ингибирование синтеза белка, однако концентрации кикотоксинов. вызывающие 50/ ингибирование, сушзетвенно различаются. Так синтез белка в бактериальной системе низкими концентрациями подавляется £ незначительной степени, а 50/ ингибирование отмечается при концентрации

§

CMor&Ua

vodooris 62 0

1

V i

V

I

0.25

I j

Ш

0.5

%

's'y ii Hi

1

1

I

< l

£ 1

t

Щ

Fu s a riurn Sot an i 2/3iS

lil.L

10 ¿5

ill.

60

iM PHrt

CHoOiSooier гнейсуan&r>se f3

¡a

I

EsJ

SO 100 200 500 /бони^нтрация Токсина, г^Л'/>

Рвд. 3. Вклктниа пачапии прияшственникоа в балок, ДНК и PKK

клеток Chi. vulgaris 62, F. solani 2/315 и Cl, raichiganense 13

200 якг/пл, аналогичный эффект в системе F. solant 2/315 вызывается концентрацией 10 мкг/мл, а в системе Chi. vulgaris 62 - в диапазоне концентраций 1-2 мкг/мл. Вызывает значительный интерес способность метаболитов V. iecanil йкгибировать синтез белка как в системе прокариот, так и.эукариот. Различная степень ингибиро-вания синтеза НК так же была характерной для исследуемых метаболитов. Более чувствительным к такому действию оказался синтез ДНК и PKK Chi. vulgaris 62, в то время, как мигрирование синтеза бактериальных НК отмечается лиеь при использовании более высоких концентраций иикотоксинов. Чувствительность синтеза НК.F. solani 2/315 к яикотоксинаи У. lecanii занимает промежуточное положение. Различия действующих концентраций токсических метаболитов, вызы-вавиия сходный ингибиторный эффект, представляется нам весьма интересным s плане возможной их регуляторной роли в функционировании сложной системы растение - Фитопатоген - гиперпаразит, в значительной нерв» по—видимому, опр&лэляемой состоянием бэлок-синте-зирующик систем.

ВЫВОДЫ

1. В результате изучений антибиотической активности фильтратов культурадьиой жидкости 183-ти итаниов V. lecanii установлено, что метаболиты 116-ти атаммов икгибируат рост Фитопатогенных бактерий. относящихся к родам Clavibacter, Xanthomonas, Pseudomonas Eruinla. Bacillus (неидентифицированный вид) и грибов рр Hyrothecium, Drechslers. Fusarium. Botrytis.

2. Изучены норфолого-культуральные свойства штаммов и актив кость гидролитических ферментов, установлена корреляция с анти биотической активностью. На основании анализа коррелятивных свя зей предложены критерии отбора, стаммов-продуцентов биодогическ активных вепестз. Штаммы с антифунгальным действием, не прояв лявт активности гидролитических ферментов или проявляют ее в слг бой степени, на твердой среде Формируют враставшие в субстрат кс локик со слабо развитым мицелием, бархатистой текстурой и скла; чатой поверхность»! конидкеносцы прямостоящие монопоидально ра: ветвленные. фкалиды собраны в мутовки, споры средней 'величи! <5.4 - 6.1 мкм) и крупные С8.3 - 7.6 ккм)г выделены из тли. örai ны с анткбэхтэри&льнье» действием проявляет высокую степе!

: Ферментативной активности. Формируют выпуклые колоний с хоро:

развитый мицелием, пушистой текстурой и ровной поверхностью! ко-нидиеносцы стелющиеся керазветвленные. Фналиды одиночные и супротивно расположенные, споры мелкие (3,4 - 4. 8 мкм); выделены из белокрылки. •

3. Изучена динамика накопления биомассы и токсинообразова-ния на примере V. lecanii Р 26. Максимальный выход токсина отмечен в конце экспоненциальной Фазы роста гриба, на 10-е сутки ■ культивирования. Наибольшую антибиотическую активность проявляли экстракты из фильтрата культуральной жидкости на 14-й, из мицелия - на 8-е и 12-е сутки культивирования;

4. Из Фильтратов культуральной жидкости и мицелия 15-ти штампов путем экстракции хлороформом выделены комплексные токсичные препараты. Очистка от ведаств липидной природы достигнута с помощью жидкость - жидкостного перераспределения в системе ацето-нитрил - гексан.

5. Методами колоночной и тонкослойной хроматографии достигнуто разделение комплексных препаратов на Фракции. Показано, что активные фракции штаммов Р 26, 9/8Т и 168 имеют идентичный компонентный состав. Активность комплексного препарата определяется количественным содержанием вещзств, обладающих антибактериальным (Ri 0,65; 0,53,- 0, 44 в системе растворителей толуол - диэтило-вый эфир - ацетон (5:81:14) либо антифунгальным CRf 0,60; 0,56î 0,50) действием.

6. Выделенные препараты обладают инсектицидной активностью в отношении личинок персиковой тли. 17. раствор экстракта из Фильтрата культуральной жидкости V. lecanii 9/9Т вызывает гибель 48,4/. личинок.

?. Установлена кенатицидная активность токсинов V. lecanii. Препарат из Фильтрата культуральной жидкости штамма 9/9Г в концентрации 0.8/. вызывает 100Z гибель личинок Heloidogyna incognita.

8. Токсины U. lecanii вызывают хлороз листьев томатов и обесцвечивание хлореллы. Фитотокснческая активность препаратор в отношении Chlorella vulgaris 62 сопровождается ингибироеаниек роста водоросли и изменением содержания Фотоскнтетическкх пигментов в клетках хлореллы. Концентрации токсина от 0.125 мкг/мл дэ 1.0 мкг/мл повышают содержание хлороФиллов a, b и каротмноидов в клетках хлореллы, а концентрация 2,0 ккг/кл кнгибирует синтез пигментов при культивировании хлореллы в темповом режиме. 3 световом режима концентрация 0,125 мкг/нл оказывает стимулируюцээ

действие, а 0.25 ккг/ил - ингибирувше.

9. Метаболиты V. lecanii ингибирувт синтез белка и нуклеиновых кислот в модельных систенах бактерий, грибов и хлореллы, что определяет широкий спектр их действия. Концентрации токсинов, вы-згеавщяе внгибнрование белка и нуклеиновых кислот, более, чей на 50/. в систене Chi. vulgaris 62-2 нкг/нл. в систене F. solani 2/315 - 25 нкг/нл (белок) и 60 нкг/пл (НЮ и в систене CI. raichiganense 13 - 600 икг/нл (белок). 200 нкг/ил (ДНК) и 100 нкг/нл (РНК).

Список работ, опубликованных по теке диссертации:

1. Соловей Е. Ф.. Кучеренко Е. Н. (Руссова). Технологические проблем« получения биопрепарата на основе Verticlllium lecanii// Тез. докл. И Сиипозиуна стран -членов СЭВ по иикробнык пестицидан / Протвино, Посква. 15

- 19 окт.. 1990 г./. _ с. 113.

2. Соловей Е. Ф.. Кучеренко Е. Н. (Руссова). Пробленн производства и применения биопрепарата на основе Вертициллиуи лекалии против белокрылки и тлей // Тез. сб. "Биологический иетод завиты растений" //Минск, 19S0./

3. Соловей Е. Ф.. Иучереико Е. Н. (Руссова). Биологическая активность гриба Verticilliim lecanii // Тез. докл. II Республиканской конференции "Никробиология в сельской хозяйстве" // Кикинев. 4 -5 июня, 199) г./ - с. 93.

4. Руссова Е. Н., Зайченко ß, М. Токсигенный потенциал Vartlcllliuo lecanii (Zimmermann) Viegas. // Тез. докл. I Украинского микробиологического съезда / Одесса, 13 - 16 окт.. 1883 г./

5. Руссова Е. Н.. Соловей Е. Ф.. Зайченкс А. К. Антибиотические свойства культуральных Фильтратов Verticilliurc lecanii Eiaaasrmann (Viegas) // Микробиол. журнал. - 1993.

- 55, К 5. с. 69-'/'¿.

6. Руссова £. Н.. Соловей Е. Ф. - Зайченко fi. Н. Сравнительная характеристика токсинообразования к биологического действия изолятов, Verticilliuia lecanii Ziroermann CViegas)// йихробиол. журнал. - 1993. - 55. К 5. с.?2-8о.