Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия антиген-антитело с использованием ферментативных и электохимически активных меток

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия антиген-антитело с использованием ферментативных и электохимически активных меток"

р г ь о л г і мір 'пс-7

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут молекулярної біології та генетики

На правах рукопису

СЕРГЕЄВА Тетяна Анатоліївна

ВИВЧЕННЯ ВЗАЄМОДІЇ АНТИ ГЕН-АНТИТІЛ О З ВИКОРИСТАННЯМ ФЕРМЕНТАТИВНИХ ТА ЕЛЕКТРОХІМІЧНО-АКТИВНИХ МІТОК

03.00.03 - молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ- 1997

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник:

Провідна установа:

Київський Університет, ім. Тараса Шевченка, кафедра мікробіології та загальної імунології

і.

засіданні спеціалізованої ради Д 01.86.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ-143, вул.

Заболотного, 150.

доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Г.В.Єльська

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, С.І.Черних

кандидат біологічних наук, М.В.Скок

Захист дисертації відбудеться________________1997 р. о ________год. на

Автореферат дисертації розіслано _ __1997 р.

Вчений секретар Спеціалізованої Ради кандидат біологічних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми Потреби сучасної молекулярної біології, медицини та біотехнології вимагають створення нових аналітичних систем, що мають високу специфічність, чутливість і разом з тим є дешевими, простими в використанні, та компактними. Створення таких систем дасть змогу успішно вирішувати як теоретичні проблеми, так і проблеми діагностики та лікування хворіб, регуляції біотехнологічних процесів та контролю стану довкілля. Насьогадні з цією метою використовують як традиційні методи молекулярної біології та біохімії, так і імунохімічні методи: в першу чергу радіоімунний [Yalow, Berson, 1959] та твердофазний імуноферментний аналіз [Engvall, Perlmann, 1971, Van Weemen, Schuurs, 1971]. Це зумовлено винятковою специфічністю та чутливістю цих методів, що забезпечується завдяки унікальним властивостям антитіл та можливості їх отримання практично проти необмеженої кількості антигенів. Однак, ці методи характеризуються довготривапістю аналізу, складністю, працемісткістю, а також високою вартістю обладнання, що застосовується. З метою подолання цих недоліків розробляються нові аналітичні пристрої - імуносенсори, в яких фізичний перетворювач біологічного сигналу, що виникає в процесі розпізнавання певного аналіту, є в безпосередньому контакті з іммобілізованим високоспецифічним рецептором (антигеном або антитілом в залежності від мети аналізу та його схеми).

Зважаючи на те, що взаємодія антитіла з відповідним антигеном викликає лише незначні зміни його фізико-хімічних властивосгивостей, пряма детекція взаємодії антиген-антитіло без додаткового підсилення сигналу зустрічається з рядом ускладнень, що пов'язані зі значним рівнем неспецифічного зв'язування [Severs, et al., 1993, Aizawa, 1994, Bier et al., 1994] і вузьким лінійним динамічним діапазоном розроблюваних пристроїв [Knichel et al., 1995]. Одним із шляхів подолання ускладнень безпосереднього імуносенсорного тестування є підхід, який грунтується на кон'югуванні ферментативних та електрохімічно-активних міток з антитілами та використанні електрохімічних перетворювачів для оцінки реакції

антиген-антитіло. Цей метод імуноаналізу створюється з метою об'єднання чутливості електрохімічного детектора зі специфічністю, що властива реакції взаємодії антиген-антитіло.

Беручи до уваги вищенаведене, актуальним є вивчення можливості створення високоселективних імуносенсорних пристроїв, що давали б змогу швидкої реєстрації взаємодії антиген-антитіло, шляхом введення ферментативних або електрохімічно-активних міток до молекули одного з компонентів імунохімічної реакції, із застосуванням рН-чутливих польових транзисторів та гребінчастих планарних електродів як фізичних перетворювачів.

Мета та завдання дослідження Метою даної роботи є створення аналітичних пристроїв для вивчення взаємодії антиген-антитіло, що грунтуються на явищі підсилення біологічного сигналу за рахунок використання ферментативних та електрохімічно-активних міток, які кон'юговано з одним із компонентів імунохімічної реакції. Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Розробити методи ефективної іммобілізації антитіл на металокерамічних поверхнях.

2. Вибрати та дослідити ефективність використання ферментативних та неферментативних електроактивних міток у імуносенсорному аналізі.

3. Створити зразки імуносенсорів на основі рН-чутливих польових транзисторів та планарних електродів

4. Вивчити робочі параметри сконструйованих сенсорних систем з використанням ферментативних та неферментативних електроактивних міток при реєстрації взаємодії антиген-антитіло.

Наукова новизна роботи В роботі вперше показано можливість реєстрації взаємодії антиген-антитіло з використанням (і-лактамази як мітки при створенні електрохімічного імуносенсора. Розроблено та апробовано лабораторний прототип- потенціометричного імуноензимного сенсора для визначення

з

концентрації рекомбінантного а2-інтерферону в культуральному середовищі з використанням як мітки р-лакгамази.

Створено та апробовано варіант кондуктометричного імуносенсорного пристрою з використанням як мітки пероксидази хріну для визначення концентрації IgG в сироватці крові. Для реєстрації реакції взаємодії IgG зі специфічними антитілами, що мічені пероксидазою, створено високоселективний кондуктометричний перетворювач на основі тонких плівок тетратертбутил-фталоціаніну міді. Показано, що газопроникна гідрофобна мембрана, яку було застосовано при створенні цього перетворювача, дає змогу значно зменшити вплив на величину відгуку біосенсора факторіз середовища (буферна ємність, іонна сила).

Вперше продемонстровано можливість використання електропровідного полімера - поліаніліну як елекгроактивної мітки в імуносенсорному аналізі. Досліджено вплив ступеня окислення та молекулярної маси застосованого як мітки полімера на величину сенсорного відгуку.

Практична цінність роботи Розроблені в роботі лабораторні моделі імуносенсорних пристроїв для визначення інтерферону та IgG можуть бути використані при створенні серійних зразків імуносенсорів для визначення концентрації різноманітних антигенів та антитіл для досліджень як у галузях молекулярної біології, біохімії, імунології, так і в медичній практиці та контролі біотехнологічних процесів. Створені імуносенсорні пристрої було успішно апробовано для визначення концентрацій інтерферону в культуральній рідині та IgG в сироватці крові.

Структура та обсяг роботи Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів та їх обговорення, висновків та списку літератури, який включає 203 найменування. Робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту й містить 29 малюнків та 3 таблиці.

Апробація роботи Матеріали дисертації доповідались на Vll-ій міжнародній конференції Євросенсори VII (Будапешт, Угорщина, 1993), спільній

робочій нараді "Німеччина-СНД" (Мюнстер, ФРН, 1993), симпозіумі "Євросенсори IX” (Стокгольм, Швеція, 1995), IV світовому конгресі з біосенсорів (Бангкок, Таїланд, 1996).

Публікації За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт у вітчизняних та закордонних журналах.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

У роботі використовувалась генноінженерна 3-лактамаза ТЕМ-1 з E.coli (ЕС 3.5.2.6), з активністю 3x103 од/мг, генноінженерний лейкоцитарний а2-інтерферон людини, кролячі поліклональні антитіла проти генноінженерного лейкоцитарного а2-інтерферону (igG-фракція, отримана очисткою на ДЕАЕ-целюлозі (Whatman, Великобританія), сироватковий альбумін бика (БСА) та імуноглобулін G кроля (IgG) (ДІАМ Лтд., Москва, Росія), антитіла кози проти імуноглобуліну G кроля (Sigma, США), пероксидаза з хріну (ЕС 1.11.1.7), з активністю 350-500 од/мг (Reonal, Угорщина), тетратертбутил-фталоціанін міді та каліксарен (Інститут Органічних Барвників, Москва, Росія).

Ферменти іммобілізували на поверхні pH-чутливих польових транзисторів (рп-ПТ) або золотих пленарних електродів (ПЕ) у матриці БСА [Snui'ga et ai., 1993], антитіла іммобілізували на поверхні pH-ПТ та ПЕ шляхом ковалентної пришивки або сорбції в поперечно-зшитій матриці БСА за розробленими нами методиками. Для оцінки ефективності іммобілізації імуноглобулінів на металокерамічних поверхнях використовували метод прямого твердофазного імуноферментного аналізу з використанням пластин з кремнію, покритих шаром Si3N4, як твердої фази. Кон'югацію антитіл з р-лактамазою та поліаніліном провадили за допомогою глутаральдегідного методу [Сергеева и др., 1996, Sergeyeva et al., 1996]. Водорозчинний поліанілін синтезували за методом [Rachkov et al., 1994]. '

Дослідження провадили на чіпах виробництва інноваційного центру "Емокон" (Київ). Особливості конструкції та функціональні параметри обох типів

перетворювачів описано детально у роботах [Korpan et at., 1994, Sergeyeva et al., 1996].

Для визначення концентрації інтерферону/lgG застосовували конкурентний варіант електрохімічного імуноанапізу за запропонованою нами методикою. Всі виміри провадили у диференційному режим/, при кімнатній температурі та за інтенсивного перемішування. Максимальний відгук сенсора слугував мірою концентрації аналізованої речовини.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Іммобілізація антитіл на поверхні фізичних перетворювачів. Ковалентна іммобілізація на металокерамічних поверхнях.

Ковалентну іммобілізацію одного з компонентів імунохімічної реакції на металокерамічних поверхнях провадили шляхом послідовної обробки поверхонь насиченими парами у-амінопропілтриметоксісилану та глутарового альдегіду. Така обробка забезпечує ковалентну пришивку білка до активованої поверхні завдяки утворенню основ Шиффа між вільними аміногрупами залишків лізину в молекулі білка та альдегідними групами молекул глутарового альдегіду. У порівнянні з традиційним методом обробки поверхонь розчинами вказаних компонентів, метод активації поверхонь в парах забезпечує утворення на поверхні шарів реагентів, що гомогенні за товщиною. Це в свою чергу зменшує ймовірність похибок, що призводять до недостатньої відтворюваності аналізу.

Було оптимізовано умови іммобілізації імуноглобулінів на металокерамічних поверхнях. Показано, що інкубація поверхні перетворювача протягом 24 годин у насичених парах у-амінопропілтриметоксісилану та 4 годин в насичених парах глутарового альдегіду забезпечує іммобілізацію найбільшої кількості IgG на поверхні перетворювача. Оптимальна концентрація розчину IgG, що використовувся для ¡мобілізації - 20 мкг/мл, що забезпечує формування моношару білка, ковалентно пришитого до активованої поверхні.

Іммобілізація імуноглобулінів у поперечно-зшитій БСА-матриці.

Для іммобілізації біоматеріалу на поверхнях, які не містять активних груп, що можуть бути використані для ковалентної ¡мобілізації, було застосовано метод іммобілізації в матриці. Як матрицю для включення молекул антитіл нами було обрано БСА, оскільки він не передбачає застосування токсичних органічних розчинників, має стабілізуючий вплив на включені в його струюуру білкові молекули [Я.Р.ТауІог еі аі., 1991] і забезпечує зниження рівня неспецифічного зв'язування [Н.Сао еі аі., 1995,1996]. Як біфункціональний зшиваючий агент було застосовано глутаровий альдегід як найменш токсичну з усіх використовуваних для цієї мети сполук. Результати експериментів по оптимізації умов ¡мобілізації ІдЄ в матриці БСА, що поперечно зшита в парах глутарового альдегіду, представлено на Рис.1. Мірою активності іммобілізованих ІдЄ служила їх здатність до подальшої взаємодії зі специфічними антитілами, яка визначалась за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу. Як видно з рисунка, мембрани, що формувались у насичених парах глутарового альдегіду протягом 1 години, демонстрували найвищу активність іммобілізованих у їх складі ІдО. Як збільшення (більше 1 години), так і зменшення (менше 1 години) часу інкубації біомсмбран в насичених парах глутарового альдегіду призводило до падіння активності іммобілізованого Ідй більш як на 50%.

Рис. 1. Залежність активності іммобілізованого Ідв в поперечно-зшитій матриці БСА від часу інкубації мембран у насичених парах глутарового альдегіду для співвідношень ІдО:БСА в мембрані: 1 - 1:4, 2 -1:1, З - 4:1.

Це може бути пов'язано з одного боку (довгий час інкубації) з утворенням великої кількості поперечних зшивок в антиген-зв'язуючих ділянках IgG, що впливає на їх здатність до подальшої взаємодії зі специфічними антитілами. З іншого боку (при короткому часі інкубації) можливе утворення недостатньої кількості поперечних зшивок між молекулами IgG та БСА, і як результат -вимивання значної кількості IgG з біомембрани протягом аналізу. Мембрани з вмістом IgG 50%, що інкубувались в насичених парах глутарового альдегіду протягом 1 години було використано в подальших експериментах зі створення імуносенсорних пристроїв на їх основі.

Регенерація антитіл, що іммобілізовані на поверхні перетворювача.

Як правило, при ¡мукосенсорному аналізі використовують один сенсорний чіп для одного виміру. Це є одним з недоліків даного методу, оскільки зумовлює зростання вартості аналізу, а також недостатньо високу відтворюваність методу при кількісному аналізі, що є особливо важливим [Bier et аі., 1994, Wijesuriya, 1994, Chatelier et al., 1995]. Регенерація поверхні покритого антигеном сенсора шляхом дисоціації комплексу антиген-антитіло - один з підходів, що дає можливість вирішити ці проблеми. Для дисоціації комплексу антиген-антитіло використовували буферні розчини з низьким та високим значеннями pH, хаотропні агенти та поверхнево-активні речовини. Результати, що віддзеркалюють ефективність використання різних розчинів елюентів наведено в Таблиці 1. Показано, що найбільш ефективними розчинами елюентів є буфери з низькими значеннями pH.

Таблиця 1. Ефективність дії розчинів елюентів при регенерації антигена (IgG), що ковалентно іммобілізований на поверхні пластин Si^N^

Буфер, що застосовується для елюції Кількість елюйованих анти-IgG Кількість регенерова-ного IgG, що здатен до подальшої взаємодії з анти-IgG

20 мМ Тріс-НСІ, pH 10 76%

10% діметилформамід 79% 100 %

10% формамід 81 % 100%

1М оцтова кислота 58% 63 %

0,1М гліцин-НС/, pH 2,2 09 % 97%

0,1 М КІа-цитратний буфер, pH 2,2 98% 92%

0,03М КІа-цитратний буфер, pH 2,6 95% 95%

0,1 М Ыа-цитратний буфер, pH 2,2, що містить 2% Тууееп-20 92% 100%

20мМ Тріс-НСІ, pH 10, що містить 2% Тіл/ееп-20 10 % 85%

ЗМ КЗСЫ 99 % 100 %

6М сечовина 5% 85%

2М КЭСЫ 87% 67%

Після регенерації іммобілізованого IgG провадили тестування його здатності до подальшої взаємодії зі специфічними антитілами в імуноферментному аналізі. Слід зазначити, що обробка іммобілізованого IgG буферними розчинами з низькими значеннями pH, з одного боку, призводить до його повної регенерації, а з іншого - практично не впливає на його функціональну активність. Іммобілізований IgG зберігав 90% початкової активності після 15 циклів зв'язування з кон'югатом. Ці результати дозволяють розраховувати на

багаторазове використання імуносенсора. Зважаючи на це, надалі використовували 0.1М НСІ-гліциновий буфер pH 2,2.

Розробка електрохімічного методу реєстрації взаємодії антиген-антитіло з використанням р-гактамази як мітки.

Завдяки наявності ряду суттєвих переваг у порівнянні з іншими ферментами, (5-лактамазу було застосовано як мітку для створення електрохімічного імуносенсора. Цей фермент має односубодиничну структуру; малу молекулярну масу - близько 28 кДа; високу стабільність як самого фермента, так і його кон'югатів з антитілами; високу активність у широкому діапазоні pH. Реакція ферментативного гідролізу пеніциліну, що каталізується р-лактамазою, призводить до значної зміни концентрації протонів у середовищі;

Це дає змогу легко реєструвати реакцію зв'язування антигена з міченими р-лактамазою антитілами за допомогою рН-чугливих польових транзисторів.

Важливим при створенні імуносенсорного пристрою є те, щоб оптимальні умови функціонування фермента, що застосовується як мітка, були близькими до оптимальних умов проведення імунохімічної реакції. Тому на основі р-лактамази було створено ензимосенсор та детально досліджено оптимальні умови його роботи. Вивчення залежності максимального відгуку ензимосенсора від концентрації субстрату (Ыа - солі бензилпеніциліну) показало, що мінімальна концентрація субстрату, котру можна визначати, складає 0,1 мМ, а лінійний діапазон цієї залежності знаходиться в межах 0,1-0,75 мМ аналіту. Важливим є те, що сконструйований ензимосенсор може бути використаний для визначення вмісту основної речовини в препараті пеніциліну. На відміну від традиційних методів цей метод не є складним, працемістким, не вимагає великої кількості

реактивів і може бути успішно використаний для визначення бензилпеніциліну в препараті антибіотика, а також для контролю біотехнологічного процесу його виробництва. Час відгуку сконструйованого датчика складає лише 3-4 хвилини.

Було детально вивчено оптимальні умови роботи (З-лактамазного ензимосенсора: вплив концентрації буфера, pH середовища та іонної сили розчину. Показано, що амплітуда сигналу біосенсора надзвичайно сильно зменшується при збільшенні буферної ємності аналізованого розчину. Сенс цього явища полягає в тому, що компоненти буфера, дифундуючи в мембрану яка містить фермент, зменшують концентрацію вільних протонів, що генеруються як сенсорний відгук. Збільшення концентрації ЫаС1 у середовищі від 0 до 50 мМ призводило до значного (вдвічі) збільшення сенсорного відгуку. Подальше зростання концентрації N30 (до 300 мМ) практично не впливало на величину відгуку. Цей досить незвичний результат можна пояснити тим, що позитивно заряджені іони N3+ можуть екранувати заряд негативно зарядженої в таких умовах БСА-мембрани і таким чином уповільнювати дифузію протонів, що утворюються в процесі роботи фермента, з мембрани в розчин. Крива рН-залежності ферментного датчика мала куполоподібний вигляд з максимумом при pH 7,5. Таким чином, оптимальні умови роботи ензимссенсора (2,5 мМ фосфатнии буфер, pH 7,5, що містить 150 мМ №аСІ) близкі до оптимальних умов проведення імунохімічної реакції. Оптимізовані умови було застосовано в подальших експериментах при створенні електрохімічного імуносенсора з використанням як мітки р-лактамази.

Як модельну пару при створенні імуноферментного сенсора було обрано генноінженерний а2-інтерферон та антитіла до нього. Диференційна пара польових транзисторів з ¡мобілізованим біоматеріалом (інтерфероном на одному транзисторі та БСА на іншому - контрольному) являє собою біодатчик. Сконструйований імуносенсор демонстрував можливість визначення концентрації кон'югату антиінтерферонових антитіл з р-лактамазою в межах 1-1000 мкг/мл. Мінімільнмй рівень мічених р-лактамазою антиінтерферонових антитіл, що може

бути визначений за допомогою цього датчика, складав 1 мкг/мл, а лінійний діапазон цієї залежності знаходився в межах 1-300 мкг/мл (Рис.2). Варто зазначити, що спосіб іммобілізації інтерферону на затворному діелектрику польового транзистора не впливав на величину сенсорного відгуку, однак при іммобілізації шляхом ковалентної пришивки час сенсорного відгуку зменшувався вдвічі. Це видається цілком закономірним, оскільки дифузія субстрату та продукту (Ма-солі бензилпеніциліну та протонів) до поверхні польового транзистора крізь матрицю БСА потребує більше часу, ніж у випадку ковалентно пришитого до поверхні інтерферону.

Для визначення концентрації інтерферону використовували варіант аналізу, що базується на конкуренції іммобілізованого на поверхні рН-ПТ та вільного (в досліджуваному зразку) інтерферону за зв'язування з обмеженою кількістю антиінтерфаронових антитіл, мічених ферментом. Як результат присутності в пробі вільного інтерферону спостерігали зниження відгуку сенсора, що пропорційне концентрації інтерферону в межах 10-200 мкг/мл (Рис. 3).

Рис. 2. Залежність величини імуносенсорного відгуку від концентрації кон'югату анти-інтерферонових антитіл з р-лактамазою. На поверхні перетворювача іммобілізовано інтєр-ферон. Виміри провадили в 2,5 мМ Na-фосфзтному буфері pH 7,5, що містить 150 мМ Nad.

Рис. 3. Калібрувальна крива для визначення концентрації інтерферону в досліджуваному зразку в конкурентному варіанті аналізу. Виміри провадились в 2,5 мМ №-фосфатному буфері, що містить 150 мМ МаСІ.

Продемонстровано можливість визначення концентрації інтерферону за допомогою сконструйованого нами імуноферментного сенсора в культуральному середовищі. Отримані результати знаходились у відповідності з результатами імуноферментного аналізу (похибка в межах 10%). Запропонований метод забезпечує чутливість, що достатня для визначення рекомбінантного а2-інтерферону в культуральному середовищі при значному (на порядок) скороченні часу аналізу порівняно з традиційними методиками імуноферментного аналізу.

Розробка електрохімічного методу реєстрації взаємодії антиген-антитіло з використанням пероксидази хріну як мітки.

З метою отримання електрохімічного імуносенсора, що мав би вищу чутливість, як мітку для одного з імунокомпонентів нами було застосовано пероксидазу хріну та кондуктометричний метод детекції її активності. Цей метод базується на реакції окислення іонів йоду, що відбувається за участю пероксидази, і призводить до зміни концентрації цих іонів в середовищі:

пероксид аза

Н202 + 2У + 2Н+ -----2ШО + 12

Кондуктометричний метод детекції грунтується на вимірюванні зміни

провідності аналізованого розчину. Оскільки провідність розчину визначається міграцією всіх іонів, присутніх у зразку, цей метод є відносно малоспецифічним і тому має досить обмежене застосування. Для створення нового типу кондуктометричного перетворювача, що є специфічним, нами було використано унікальну здатність тетратертбугил-фтапоціаніну міді збільшувати на кілька порядків свою електропровідність у присутності молекулярного йоду в середовищі. Перетворювач було створено на основі гребінчастих планарних електродів, оскільки вони не вимагають наявності електроду порівняння, прості та дешеві при масовому виробництві.

До теперішнього часу властивості хеморезисторів (в тому числі фталоціаніну міді) вивчались лише в газовому середовищі [Lesnoff, 1989, ЫаЬок еі аі., 1995]. Це зумовлено тим, що висока електропровідність водного середовища перешкоджає створенню біосенсоріз на основі хеморезисторів. Для мінімізації впливу водного середовища йод-чутливий перетворювач, що являє собою тонкоплівкові планарні електроди з нанесеними тонкими плівками фталоціаніну міді, було покрито гідрофобною газопроникною мембраною. Було досліджено два типи газопроникних мембран: з термонапиленого капіксарену та полімеризованого в плазмі гєксаметилдісилоксану. Струїстури з різними мембранами рівної товщини (100 нм) мали схожі характеристики, але як оптимальний матеріал для газопроникної мембрани було обрано гексаметилдісилоксан завдяки кращій адгезії до поверхні та кращим механічним властивостям. Для визначення оптимальних параметрів створюваних структур було проаналізовано дані імпедансної спектроскопії. Вимірювались імпедансні спектри для перетворювачів з різним типом нанесення тонких плівок тетратертбутил-фталоціаніну міді: для плівок, що нанесені крапельним методом та методом Ленгмгара-Блоджетт. Показано, що обидва типи структур мають властивість збільшувати свою електропровідність в присутності молекулярного йоду в середовищі. Однак, структури з плівками фталоціаніну, що нанесені крапельним методом, в присутності 20 мкМ ^ збільшують свою електропровідність лише в 1,5-2 рази, в

той час як структури з упорядкованими плівками фталоціаніну, що нанесені методом Ленгмюра-Блоджетт, - в 10-12 разів. Показано, що оптимальним для проведення вимірів є частотний діапазон 1-10 Гц. В подальшому виміри провадили при частоті 1 Гц.

Для визначення оптимальних умов функціонування ферменту, використаного як мітки, на основі розробленого нами йод-чутливого перетворювача та пероксидази хріну було створено ензимосенсорний пристрій та досліджено його робочі характеристики. Аналізуючи залежність величини максимального відгуку пероксидазного ензимосенсору від концентрації субстрату (перекису водню), встановлено, що вона мала лінійний характер у межах 5-300 мкМ. Мінімальна концентрація перекису водню, яку можна визначати за допомогою цього сенсора, складала 5 мкМ. Залежність величини сенсорного відгуку пероксидазного ензимосенсора від pH середовища мала типовий куполоподібний характер з максимумом, що дорівнює pH 6,0. Було досліджено залежності відгуку ензимосенсора від концентрації буфера та концентрації №СІ в середовищі. Показано, що збільшення як концентрації буфера, так і концентрації №СІ практично не впливало на величину сенсорного відгуку (Рис.4-5).

Рис. 4. Залежність величини сенсорного відгуку пероксидазного ензимосенсора від концентрації іїа-фосфатного буфера. Виміри провадили в Иа-фосфатному буфері, що містить 10 мМ Кі, 50 мкМ НгОа 150 мМ ИаСІ

Рис. 5. Залежність величини відгуку пероксидазного єнзимо-сенсора від концентрації Nad в середовищі. Виміри провадили в 20 мМ Na-фосфатному буфері, що містить 10 мМ KJ та 50 мкМ Н2О2.

Ця особливість сконструйованого нами сенсора пояснюється тим, що газопроникна мембрана ефективно блокує проникнення іонів до поверхні фталоціанінової плівки. Завдяки цьому досить низький опір електроліту не має суттєвого впливу на опір фталоціанінової плівки і зміни в її опорі відбуваються лише при проникненні до ії поверхні молекулярного йоду, який є результатом специфічної ферментативної реакції. Ця особливість сконструйованого нами перетворювача є надзвичайно важливою, оскільки дозволяє уникнути основного недоліку кондуктометричного методу вимірювань - його низької специфічності. В подальших експериментах використовувався 20 мМ Ма-фосфатний буфер pH 6,0, що містить 150 мМ НаСІ, 10 мМ Ю та 50 мкМ перекису водню.

Для створення імуносенсора на основі даного перетворювача як пару антиген-антитіло нами було обрано ІдС кроля та антитіла кози до Ід<3 кроля. Оскільки плівка полїмеризованого в плазмі гексаметилдісилоксану не містить на своїй поверхні активних груп, які можуть бути використані для ковалентної іммобілізації білків, 1дЭ було іммобілізовано на поверхні перетворювача в поперечно-зшитій БСА-матриці. На контрольний перетворювач, що

використовувався для компенсації неспецифічних ефектів, було нанесено БСА-матрицю, яка не містила ІдЄ.

Рис. 6. Залежність імуносенсорного відгуку від концентрації' мічених пероксидазою анти - Ідв антитіл. На поверхні перетворювача

іммобілізовано Ідв. Виміри

провадили в 20 мМ №-фосфатному буфері, що містить 150 мМ №С/, 10 мМ К1 та 50 мкм Н2Ог.

Рис. 7. Калібрувальна крива для визначення концентрації IgG в досліджуваному зразку в конкурентному варіанті аналізу. Виміри провадили в 20 мМ Na-фосфатному буфері, що містить 150 мМ NaCI, 10 мМ KJ та 50 мкМ НгОг.

Сконструйований імуносенсор демонстрував можливість визначення концентрації мічених пероксидазою анти-ІдО в межах концентрацій 0,1-5 мкг/мл. Лінійний діапазон цієї залежності знаходився в межах 0,1-2 мкг/мл (Рис. 6). Для визначення концентрації (дС в досліджуваному зразку було застосовано

конкурентний варіант аналізу. Як результат присутності в досліджуваній пробі вільного ІдО спостерігалось зниження відгуку сенсора, що пропорційне його концентрації в межах 0,2-2 мкг/мл (Рис. 7).

Межа визначення Ідб за допомогою створеного імуносенсорного пристрою з використанням як мітки пероксидази складала 200 нг/мл. Продемонстровано можливість визначення концентрації ІдЄ у сироватці крові. Отримані результати є у відповідності з результатами імуноферменгного аналізу (похибка в межах 10%).

Використання електропровідного полімеру поліаніліну як мітки для розробки електрохімічного методу реєстрації імунохімічної реакції.

Властивості ферментативних міток є виключно цінними для імуноаналізу в лабораторних умовах, однак ферментам, як білкам, властива обмежена термостабільність та залежність ферментативної активності від факторів середовища. Спрощення аналізу та зменшення його часу (за рахунок елімінації стадії додавання ферментативного субстрату) можна досягнути, використовуючи електрохімічно-активні мітки неферментативного походження.

Як можлива мітка неферментатизного походження для реєстрації взаємодії антиген-антитіло нашу увагу привернув електропровідний полімер-поліанілін, оскільки він є одною з небагатьох електропровідних сполук, що стабільні в кисневій атмосфері, має в своєму складі функціональні групи, зручні для кон'югації з білками, а також може бути легко синтезований з дешевих та доступних матеріалів. Умови формування сенсорного відгуку оптимізували на парі антиген-антитіло: ІдЄ кроля та антитіла кози до ІдЄ кроля, використовуючи кондуктометричну схему вимірювань та тонкоплівкові золоті планарні електроди як детектор. В контрольних експериментах використовували кон'югат неспецифічних антигенів з поліаніліном. При взаємодії іммобілізованих на поверхні електроду антитіл зі специфічними антигенами, міченими поліаніліном, відбувається збільшення електропровідності системи за рахунок утворення на поверхні сенсора шару електропровідного полімеру.

Шляхом полімеризації аніліну в присутності персульфату амонію було отримано ряд водорозчинних форм поліаніліну, що різнились за ступенем окислення, а також за молекулярною вагою. Кожен з синтезованих поліанілінів мав високомолекулярну (1 МДа) та низькомолекулярні (10-45 кДа) фракції. Отримані фракції концентрували та використовували для мічення антигенів. Проведення імунохімічної реакції, один з компонентів якої мічений поліаніліновою міткою, показало, що при додаванні кон'югату в інтервалі концентрацій від 100 нг/мл до 5 мкг/мл імуносенсорний сигнал на специфічний кон'югат значно перевищував відгук на кон'югат поліаніліну з неспецифічними антигенами. (Рис. 8).

Порівнюючи залежності величини імуносеисорного сигналу від ступеня окислення полімеру, який використовувався для мічення, встановлено, що при використанні як мітки препаратів поліанілінів з меншим ступенем окислення спостерігається значно більша величина сигналу, ніж при використанні препаратів

Рис. 8. Залежність величини сенсорного відгуку від концентрації кон'югату поліаніліну зі специфічними (1) або неспецифічними (2) антигенами. На поверхні детектора іммобілізовано анти-Ідв. Для мічення антигенів використовувалась фракція поліаніліну, що синтезований в присутності 0,2 мМ персульфату амонію, з ММ 45 кДа.

Вивчення залежності максимального відгуку імуносенсора від молекулярної маси поліаніліну, що використовується як мітка показало, що збільшення

з більшим ступенем окислення.

0 12 3 4 5

концентрація кон'югату, мкг/мл

молекулярної маси мітки призводило до пропорційного зростання імуносенсорного відгуку за виключенням мітки з масою 1 МДа. Незначне зниження сигналу при використанні цієї мітки виглядає цілком закономірним, оскільки вага мітки значно перевищує вагу самої молекули ІдС. Результатом цього може бути як зміна оптимальної конформації антигену, так і просторові труднощі при зв'язуванні молекул кон'югату з антитілами, іммобілізованими на поверхні детектора, що і виражається в зменшенні сенсорного відгуку. Для визначення концентрації ІдЗ в досліджуваному зразку використовували конкурентний варіант аналізу, який базується на конкуренції мічених та немічених {які присутні в пробі) антигенів за обмежену кількість антиген-зв'язуючих сайтів антитіл, що іммобілізовані на поверхні детектора. Як результат присутності в досліджуваній пробі неміченого компонента спостерігали зменшення сенсорного сигналу, що

Границя визначення Ідв за допомогою створеного імуносенсорного пристрою складала 500 нг/мл. Продемонстровано можливість визначення концентрації Ідв за допомогою сконструйованого сенсора в сироватці крові. Отримані результати є у відповідності з результатами імуноферментного аналізу

(похибка в межах 15%). У порівнянні з запропонованими в попередніх розділах, даний імуносенсорний пристрій забезпечує подібну чутливість при значному спрощенні процедури аналізу та скороченні його часу.

Таким чином, на основі рН-чутливих польових транзисторів та гребінчастих планарних електродів в роботі було створено 3 зразки електрохімічних сенсорів для швидкої реєстрації взаємодії антиген-антитіло. Для підсилення біологічного сигналу, який виникає б процесі взаємодії антиген-антитіло, один з компонентів імунохімічної реакції було кон'юговано з мітками різного походження, що генерували електрохімічний сигнал. Всі запропоновані зразки імуносенсорних пристроїв дозволяють на 1-2 порядки скоротити час аналізу та спростити його процедуру у порівнянні з традиційними методами імуноанапізу. За чутливістю зразки імуносенсорних пристроїв з використанням як міток пероксидази хріну та електропровідного полімеру поліаніліну наближаються до імуноферментного аналізу.

ВИСНОВКИ.

1. На моделі ідО кроля розроблено методи та оптимізовано умови іммобілізації антитіл шляхом ковалентної пришивки та шляхом включення в білкову мембрану на металокерамічні поверхні електрохімічних перетворювачів (польових транзисторів та тонкоплівкових планарних електродів).

2. Досліджено умови регенерації шару іммобілізованих антитіл після проведення імунохімічної реакції. Показано, що найбільш ефективними при регенерації є буферні розчини з низькими значеннями pH, які забезпечують регенерацію 97-99% іммобілізованих антитіл та збереження 90% їх початкової активності після 15 циклів регенерації.

3. Вперше створено та апробовано лабораторну модель потенціометричного імуносенсора з використанням р-лактамази як мітки та pH-

чутливих польових транзисторів як перетворювача біологічного сигналу для контролю концентрації інтерферону з межею визначення 10 мкг/мл.

4. З використанням високоселективного кондуктометричного перетворювача на основі тонких плівок тетратертбутил-фталоціаніну міді та пероксидази хріну як мітки створено модель імуносенсорного пристрою та показано можливість ¡V використання для визначення IgG в сироватці крові з межею визначення 200 нг/мл. Показано, що газопроникна гідрофобна мембрана, яку було застосовано при створенні кондуктометричного перетворювача, дозволяє значно зменшити вплив на величину відгуку біосенсора факторів середовища (буферна ємність, іонна сила).

5. Розроблено лабораторний прототип кондуктометричного

імуносенсора на основі золотих тонкоплівкових планарних електродів з використанням як мітки електропровідного полімера - поліаніліну для визначення IgG кроля з межею визначення 500 нг/мл. Досліджено вплив ступеня окислення та молекулярної маси застосовуваної мітки на величину сенсорного сигналу. Показано, що величина сенсорного сигналу збільшується зі зменшенням ступеня окислення та зі збільшенням молекулярної маси полімеру.

6. Продемонстровано принципову можливість' використання розроблених варіантів імуносенсорних пристроїв для визначення концентрацій інтерферону та IgG у реальних рідинах, зокрема в культурапьному середовищі та сироватці крові.

СПИСОК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Rachkov А.Е., Piletsky S.A, Rozhko M.I., Sergeyeva T.A., El’skaya A.V. Electrochemical labels for conductometric immunosensor development // Abstr. of Cis-German Workshop Biosensors, Munster, Germany.-1993.-P.76.

2. Rachkov A.E., Rozhko M.I., Sergeyeva T.A, Piletsky S.A. Method and apparatus for the detection of the binding reaction of immunoglobulins // Sensors and Actuators

B.-1994.-18/19.-P.610-613.

3. Sergeyeva T.A., Piletsky S.A., Rachkov A.E., El'skaya A.V. Polyaniiine labelbased conductometric sensor for IgG detection // Digest of Technical Papers of the 8th International Conference Eurosensors !X, Stockholm, Sweden.- 1995.-2.-p.503.

4. Shirshov Yu.M., Chegel V.I., Subbota Yu.V., Matsas E.P., Rachkov A.E., Sergeyeva T.A. Determination of polarizability and surface concentration of biomolecules using surface plasmon resonance experiment II Proceedings of SPIE.-

1995.-2648.-P.118-123.

5. Сергеева T.A., Пилецкий C.A., Рачков А.Э., Ельская А.В. Синтез и изучение полианилинов как меток в иммуносенсорном анализе II Журнал Аналитической Химии.-1996.-51, №4.-С.427-430.

6. Сергеева Т.А., Солдаткин А.П., Рачков А.Э., Терещенко М.И., Пилецкий

С.А, Ельская А.В. Разработка потенциометрического иммуносенсора для определения интерферона // Биополимеры и клетка,-1996.-12, №4.-С.31-37.

7. Sergeyeva Т.А., Lavrik N.V., Rachkov АЕ., Piletsky S.A., El'skaya A.V. A novel conductometric immunosensor based on tetra-tertbutyl-copper phthalocyanine thin films II Abstracts of the 4th World Congress on Biosensors, Biosensors'96, Bangkok, Thailand.-1996.-P.143.

8. Sergeyeva T.A., Lavrik N.V., Piletsky S.A., Rachkov A.E., El'skaya A.V. Polyaniline label-based conductometric sensor for IgG detection // Sensors and Actuators В,-

1996.-34.-P.283-288.

АННОТАЦИЯ

Сергеева Т.А. Изучение взаимодействия антиген-антитело с использованием ферментативных и электрохимически-активных меток.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1997.

В диссертационной работе представлены результаты по использованию ферментативных и электрохимически-активных меток при разработке иммуносенсорных устройств для определения концентрации а2-интерферона и 1дС. Установлено, что линейная зависимость между откликом иммуносенсора и концентрацией аналита наблюдается в пределах концентраций аналита 10-200 мкг/мл при использовании в качестве метки р-лактамазы, 0,2-2 мкг/мл при использовании в качестве метки пероксидазы хрена и 0,5-10 мкг/мл при использовании в качестве метки полианилина. Исследованы зависимости величины сенсорного сигнала от буферной емкости раствора, pH, концентрации соли в среде, а также молекулярной массы и степени окисления полианилина, используемого в качестве элвктрохимически-акгивной мэтхи.

SUMMARY

Sergeyeva T.A. Investigation of antigen-antibody interactions using enzymatic and electrochemically-active labels.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D) in Biology, specialization

03.00.03 - Molecular Biology, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1997.

The thesis contains the results of using enzymatic and electrochemically-active labels for development of immunosensor devices for the detection of a2-interferon and IgG concentrations. It has been shown that the calibration curves for a2-interferon and IgG were linear within the range 10-200 ng/ml for [5-lactamase label-based immunosensor, 0,2-2 ¡ig/mi for peroxidase label-based immunosensor and 0,5-10 ng/ml for polyaniline label-based immunosensor. The dependence of the sensor response on pH, buffer and NaCI concentrations as well as dependence of the sensor response on oxidation value and molecular weight of the electroactive label used have been investigated.

Ключові слова: електрохімічний імуноаналіз, біосенсор, інтерферон, імуноглобулін в, рН-чутливі польові транзистори, планарні електроди