Изучение влияния ауксина и фузикокцина на электрохимическую регуляцию насосов растительных клеток

Магеррамов, Магомед Гамид-оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение влияния ауксина и фузикокцина на электрохимическую регуляцию насосов растительных клеток
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния ауксина и фузикокцина на электрохимическую регуляцию насосов растительных клеток"

АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БОТАНИКИ им. В. Л. КОМАРОВА

На правах рукописи

МАГЕРРАМОВ МАГОМЕД ГАМИД оглы

УДК 581,1:582,271:612,014.422

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АУКСИНА И ФУЗИКОКЦИНА

НА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКУЮ РЕГУЛЯЦИЮ ?Н+—НАСОСОВ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

03.00,12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

.диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Баку — 198»

Работа выполнена па кафедре биофизики Биологического! факультета МГУ им. Д1. В. «Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических паук, академик АН. Азерб.. ССР Д. А. Алиев

кандидат биологических наук, ст. н. сотр. Л.. Н. Воробьев.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Т. Г. Мамедов

доктор биологических наук X. М. Касумов

Ведущая организация: Институт Физиологии растений, им. К. А. Тимирязева АН СССР.

Защита состоится <¿2% » ^кргл 1989 г. _» часов

на заседании Специализированного, совета К. 004.12.01 по-присуждению ученой степени кандидата биологических, наук, в Институте ботаники им. В,1 Л. Комарова АН Азербайджанской ССР по адресу: 370073,1 Баку, Патамдартское шоссе, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ботаники им. В, Л. Комарова АН Азерб. ССР.

Автореферат разослан « >-__ 1989 г..

ета

'К

К- ДЖАВАДОВА!.

РБЩАЯ XAPAKTEFHCWHA РАБОТЫ Актуальность проблем». Санкционирование электрогвнншс насосов 8 сопряженное регулирование мембранной проницаемости а настоящее время составляет одну из центральных проблей электрофизиологии растений, направленную на pea»кие ркдд теоретически* и прикладных вопросов гормональной стимулядки иокного ойкена.

На ооновании изучения механизмов дейотвия индолилуксусной кислоты (Палевоб« -1969j Cleland, t973-1962 ) и фузикокцинв ÍWarre et el», 1974-t9ÖOj Pitman at el., 19?5 ) H& актишуа H*. секреции, a такке наследования К*/Н+- обмена в широком диапазоне концентрации К* (Cheoaeman et el., 1980t Егорова, 1903) были постулированы гипотезы пряного (химического) сопряжения обменных потоков через электрогекный Н*-насоо (Cleland¿ Ljbox, 197?|&ге, Churchill, 1981 ) и непрямого (электрического) сопряжения - электрически управляемый К+-приток (pitman et al,,1975t Млгг« et al., 1975tBailando et al.,1979)» Однако, обе гипотез» основывались на измерении мембранных потенциалов и иошглс noto-, ков К* и Н+ в клетках тканей-высших растений и не учитывали возможную роль потенциалозависимого регулироь&кил мембранной проводимости , прежде всего К*-кандлоа (Соколик, Юрий, 1981; Saith, Walker, 1967 ). Поэтому, в рамках проблемы электрохимической регудиция мембранного транспорта в растениях весьма актуальной стала задача комплексного изучения режимов функционирования електрогеннш Н+-наоооов и К^-канадов плазмалеммы при варьировании ионного состава среды и при дейстеии фитогормонов - ауксина и фуэикокцкна, как стимуляторов И+-насвсов (гипотезу Хаге-ра-Кяяланда-Пелевого и Mappe).

. Поскольку небольшие размеры клеток шшяас растений не позволяли провести адекватные измерен«» потенциала и сопротивления

ér^ML,

•„.у '.1,1 V.-.">',;tr'-

?'■■■. v.-!-; ■■■>■ J.

' ,, ■ * * -"V- ' -1" **

плазмалеммн, то представляло ките peo ввести для комплексных исследований объект о широким спектром электрогекной активности -крупные клетки таровой водоросли tri tel lépele obtuse (Воробьев и др., 197¡>{мitmrre «t ei., 1983 ),,которне все тдее входят.a практику элсггро^яэиолог*ичос|г(гс исслвдоват»я н'*'-насосра {Иуеаев, 1990; Tokeehie« et а1.,1Эб£ к Др.)« Л+-КаНвЛОВ {БервСТОВСКЯЙ я др., 1987).. г

Цель и задачи исследований. Основной цедъв работ« являлось * исследование калиевой и гормональной ре гуляния электрогеиной активности Н*-насосовплазмпломмн к л сток К, obtusa с учетом возможного вклада потенциалозаfkchw* К1-каналов.

В работе быяи лоетявленн следующие зддячн:

1. Для построеняя элвггрохихнчвской иоделя плаэгалемуы peo-тений, учнтнваюцей соотношение проводимоетеАактивных я пассивных каналов, исследовать влияние конов К* и Н* » широком диапазоне концентраций на биоэлектрические'параметры (потенциал и сопротивление плаэмалею/ы) клеток с различию» иасодчкм уровней мембранного потенциала.

2. Исследовать действие ауксина наэлектрохнмкчвсяута регуля-цио Н+-насосовна фоне изменения концентрация К* и рН, а, также учитывал его свойство как слабо? кясяоты в сравнении с гтротоно-форншлс раэобщитеяяии. ■

3. Провестк исследование концентрационно-зависимого действия нового сильного стимулятора Н+-насосов ^узккокцина на потенциал м сопротивление плазналеммн как 1л vivo, так и при перфузии клеток*.

Научная новизна работу« Впервте обнадужено два типа действия фуэияохпнка в зависимости or его кошдентрации: гкнерполяря-ааяия ллазмялеммы клеток H.obtuaa при низких концентрациях

(пороговая Ю-" полунасыиение при Ю-11 II) и резкое увеличение сопротивления плаэмадемш при переходе к васвдЬющим концентрациям фуэикокцина II, Установлено различие в регудя-торных эффектах изучаемых; фитогормонов, ауксина и Фуэихокцина, при использовании рабочих концзнтрвдой Ю"® и нз электрические параметры плаэыалемиы: влияние ауксина направлено на перевод состояния плаэмалеммы на гиперпсляриэованного в К*-равновесноа путем шунтирования Н+-насосов, & ^уэикокцин, напротив, иццуци-рует переход в гшерполяризованное состояние с одновременным увеличением сопротивления пассивных каналов шшэмалокыы. Получен *электрохимический Портрет* влазмалешш клеток Н.оМияа- , который отражает характеров потенциалозавнснмость мембранной проводимости и «ожег быть использован для диагностики режима функционирования транспортной системы еле ктро генных Н+~насосов к ¡С-каналов.

Практическое и теоретикеское значение работы. Рассмотрение электрохимической модели ллазмалеммы а учетом вклада проводимое* тей активных и пассивных каналов позволяет анализировать первичные механизмы ионной и гормональной стимуляции электрогенных Н+-насосов с вцделением переходов от химического к электрическому сопряжению К'/Н+-обиена, что важно для выяснения принципов регулирования минерального питания и ростовых процессов, а также для разработки методов диагностики фибиологически активных сое-' динений - стимуляторов и ингибиторов мембранного транспорта.

Апробарпг ра$отц. Материалы диссертации докладывались на конференции "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1985, 1937)( на Х1У и ХУ Всессюэиых вко-лах "Биологические мембраны* (Звекигоррд, 1966, 1987); на секции биофиаики Ыосковског* общества испытателей природы (1966)} на

УН. УШ к IX Всвсоиэньас Сабининских свмкнарвк (Посева, 1966, 1987, I9C3).

Публиийши. По результатам исследований опубликовано 5 работ.

Структура и объем раЛотн. Диссертация изложена на "(59 страницах к состоит иа введен я, обзора литературы, методики, результатов и их ойсуждения, выводов, списка литературу, включающего 2.24 наименований, на которт« -Л? иа иностранных языках. Работа * содержит 39 рисунков и 3 таблиц.

МЕТОДИКА ИССЕВДОВАЮЙ

. Объектом исследований служили зеленееiинтернодаяьнне клетк* îfiteilopal» obtuia (Désir) J. С готе в семейство M it ell ope Масел» (Голлербах,Красавина, 1983). Водоросли собирали осекыа 1904-86 гг; иа озере Дружи» (Лит,ССР) и культивировали в лабораторных уолоаиях в аквариум** объемом 10 л, содертадих 1/3 природной озерной веди, 1/3 воды Москвы-реки и 1/3 искусственной пудовой вод» ОШВ) следуювдго состава (Л): КН2Р04 - 0,1, CaCIg - 0,4, МаНС03 - 1,0, Ms(ff03)2 - 0,1, Mg304,- 0,1, jtt.7,0-7,5. За^ сутки до нашла экспериментов хлетки (2-я или 3-я от верхушки) отделяли от таллома и выдерживали в ИПВ в чагосе Петри при рассеянном освещении. Длина к диаметр исследованные клеток составляли 2,56 ом и 0,3-0,6 ми соответственно.

Измерения потенциала и сопротивления ляазмалеммм проводил» стандартным йивроэлектродным методом. Измерительными и токовыми микроэлектродами служили иикропипатки, изготовленные из капилляров (стекло"пирекс") в специальной установке для втягивания микропипеток (ИЭ-4) и заполненные раствором 3 M KCI, Диаметр кончика микроэлектродоа не превышая I мкм. Электродом сравнения

служили пипетки из те* же капилляров с диаметром копчика.около 100 мкм (сопротивление Ю кОм> см2) н заполненные гелем

агар-агара, прмгетовленкым на раствора ЗЫКС1. В качеств« токового электрода использовали серебряную проволоку, хдорирдваннуи по методика (1*гтв, 1983),

Для измерения сопротивления плааммеммы ш постоянной ток* использовали упрооуэнный двухэлектродный метод Хогга-Вллкоаа (Hogg »tel., 1968{ Vcflko», 197460« параметры регистрировали одним внутриклеточным иикроэлектродои. Чтобы уменышстъ вклад вненнего раствора на значение сопротивления плазм&яемш кончик •електрода сравнения расположили в непосредственной близости от измерительного ыикроэлвктрода.

Поступаете от измерительного микроэяектрода сигналы [потенциал плазмалеымы и электротонический потенциал (падение напряжения на плаэмалемме, создаваемое тестирующим током)^ усиливали о t> на предварительном усилителе (коэффициент усиления 10), собранном на двух операционных усилителях, един из которых имел, высоко* входное сопротивление (10^ Ом), а другой ниэкоомный вход» Вводной сигнал с предварительного усилителя через дифференциальный усилитель поступал на самописец. Величина токового сигнала контролировалась с помощью усилителя-конвертера. Расчет сопротивления плаамалеммы (Ри) проводили по следующей формуле:

Jep

где 1ф - фиксированное значение пропускаемого через середину клетки тока, - падение напряжения на ллазмалемме при пропускании тока величиной 1ф, 4 и Ь - диаметр и длина клетки, соответственно.

Опыты с интактными клетками проводили я измерительной каме.

ре, изготовленной хз оргстекла. Для предотврашання поперечных переыбшвкий клеток при введении ьткроэдекгродоа пользовались специально иаготовлетнк фиксатором, на котором прикрепляли клетку* С методической точки зрения, главной вадачой наших исследований выла регистрация электрически* параметров плазиалеммьг, что требовала локализацию кончика измерительного микроэлектрода в цитоплазме* Жесткая фиксация клетки позволяла контролировать глубину введения микроэлектрода в клетку. Критериями локализация кончика микроэлектрода в цитоплазма служили следующие факты; Ирм введении микроэлектрода в вакуоль интактньи: клеток обычно наблюдается потенциал действия, сопровождаемый остановкой движения цитоплазмы t Beiiby, Blatt, 19S6 ) и медленный выход {» течения I ч) мембранного потенциала на стационарна уровень (Мотею-нена, Воробьев, 2977)* Наоборот, когда кончик микроэлектрода попадает в цитоплазму» мембранный потенциал достигает стационарного уровня мгновенно, потенциал действия не наблюдается и движение цитоплазмы не меняется ( Венъу, Blatt, 19öS ). Поскольку . в наших опытах эти условия соблюдались, то можно констатировать, что регистрировались биоэлектрические параметры плаэмалемми.

Токовый микроэлектрод вводили в середину клетки, а измерительный на расстоянии 0,4-^ от него. Скорость протона раствора в камере составляла 0,5 мл/мин. Параметры клеток определял» под микроскопом, освещая их через зеленый фильтр.

Эксперименты о перфузией клеток проводили по методике, описанной в работе (Борестовский к др., 1973). Клетку слегка под-сущивали, чтобы снизить тургор и укладывали в камере в пазы, предварительно заполненные вазелином. Затем заливали в рабочий отсек внешвма среду, Доадавцись почти полного падения тургора обрезали боковые концы клеток и по очереди заполняли соответст-

Вушциа отсеки перфуэионным реет во рои. Удаление тонопласта из клеток осуществляли путем ее выпивания перЗуэиоктд» ре створом, содержащим ЗСТА (3 UÍ), о пометь» которой уровень свободного

доводился до 10*"' U. Процесс удаления тонопласта считался законченным, когда из клетки переставали выходить мембранные ве-анкулы и основная масса гранул цитоплазмы. Регистра цмв мембранного потенциала N сопротивления проводили стандартной микроэлектродной техникой*

В экспериментах о фуэикокцином (препарат ВНИИ СХБ ВАСХНИЗ), ИУК (фирма Merk — ÍFT) и разобщителем карбонилиианад-m -хлор-фенилгидраэоном (фирма Serva - Щвейцарил) прмготовливали их концентрированные (10*^ И) спиртовые раствори. Нужную концентрации получали разведением в №В,

После каждого опыта определяли копчиковый потенциал измерительного микроэлеятрода в растворе IOO Ш KCl. Температура растворов во время экспериментов была 2I¿20C,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВВДОВАНИП И ИХ ОБСУВДНИЕ

I« Потенциал и сопротивление плаэмалеммы клеток H.o^tuaa. Биоэлектрические параметры плаэмалеммы (разность электрических потенциалов между цитоплазмой » внешней средой В^ и сопротивление плаэмалеммы К,,) клеток N.obtusa составляли -196+2,3 мВ и

кОм-оД соответственно (350 клеток). Значения Еи варьировали в очень широком диапазоне от -70 до -267 ыВ, а ^ - от 4 до 116 кОм-см®. Гистограмма потенциалозависимосто Кц от Ец (jmc.I) характеризовалась двумя максимумами в диапазонах -170 --160 мВ (66,26 кОм-ем2) н -230 - -240 мВ (57,5 кОм см2). Первый максимум сопротивления плазыалеымы осответствовал потенциалу •177 мВ, близким к К+ -равновесноког потенциалу Кц-»- (Мотеонене,

-гоа

-100

Рис.1. Гистограмма распределения значения сопротивления Ем и потенциала Еи плазмалеммы клеток N.obtuse (шаг поддиапазонов ЕМ«Ю wB). Приведены средние значения и Е^, дер* тикпльнме иjгоризонтальные линии■отражают стандартные отклонения соответственно для Рм и Еи.

Воробьев, 1931) и отделял 30£ клеток, для которых была характерна потенциалозависимость мембранного сопротивления Ry в диапазоне Ем -IOO - -175 мВ (изменение почти а Ю раз):

Еи = 1,2.5/?* - (04,3 , , коэффициент корреляции г »0,724 В этом диапазоне проводимость пяазкалеммы определяется проводимость» К^-каналов ( В©11Ъу, 1966{ Ohksna et al., 1987 )» а насосная проводимость, по-еидимому, минимальна. Тахое состояние плаэы&пеммн, характеризуемое значением потенциала EM<ER+, высокой проводимостью и чувствительностью к изменении концентрации К4" можно называть "К*-состоянием" ( ВеНЪу, Blatt, 1986s Smith «I »1., 1987).

Большее число клеток (—70%) имели потенциал плазмалемны,

правьюаеднй Ек+, т.е. в явным электрогенным компонентам, Так как, пр« Еы«-175 мВ достигает максимума, »о, вероятно, при этом значении Еи (^-каналы закрывается (Соколик, Срин, 1981, 1966) и будет доминировать проводимость насосов, которое, по-видимому, работают в режиме источника малряхекия ( Sponawiok, 19St), Это состояние, характеризуемое наличием электрогенного компонента, будем называть гилерполяриэованным.

Таким образом, в условиях постоянства внешней среды биоэлектрические параметры клеток H.obtuea характеризовались елок-, ной зависимостью сопротивления от потенциала плазмалеммы, и в послещчщюе вкспериментах о варьированием ионного состава среды (К* и (Ш и введением фитогормонов необходимо было установить положение максимума и соответствукцего e»v граничного потенциала, прм котором возможны переключения режимов работы Н+-на«о-оов,

Йт Влияние -ионов- К* и Н+ на потенциал и ^ог^ротивлеяиа плаа-маяеммн клеток H.ototuaa. По олектрореакциям на изменение содержания К4" (от искусственной прудовой воды, ВДВ, в 0,1 ыМ К*" до 50 Л К4, т.е. были перекрыты оба диапазона концентраций механизма I и II по ЭпотаВну) клетки в*оЪ*даа разделились на % типа.' У I типа клеток исходный потенциал плазмалеммы Ен"-175+6 мЗ ( п* 12) реагировал на Ю-краТиов и большее увеличение К4- как типичный К^-электрод по уравнению линейной регрессии 9

Ец * коэффициент корреляции г »0,96,

число экспериментальных значений а >41, Ок*- активность ионов 1С* в вреде (мМ). Расчетное значение К^-равковеского потенциала в ИПВ для этой группы клеток составило -168 мВ.

Для клеток II типа, о высокой мектрогеиной ыливноотьп,

Сгиперполлризованное состояние, Ем«-233*6 -26), был обнару-

Рио,2» Кинетика измаютмя потенциала!^ и сопротивления плязмалеммн клеток н.оМдша при ^еличения и последующем ук<еньшегом концентрации KCl во внешней среде. На вставке показано потенциалоэависимое избиение RH при обратном восстановлении параметров после "К^-пробоя". Потенциал.переключения F^—178 wB. Обозначения: Kj, Kg, ЭК^, 4Kg соответственно концентрации KCl в ИПВ 0,1, I, 10, 20, 30, 40 мМ.

ние кенцчнтрации К* до Г мМ индуцировало дальнейшую гиперполяри-зацяга на 17,4*2,6 »ß (n «Л7) « параллельным снижение« сопротивления пллзмалеммн на 8,1^3,1 кОм-см^. Эти ра зультатъ» являются одним из сильных доводов в пользу К+-ст инфляции Н*-насосов (Cleland, 197? >, выполняющих олектрогенный К*/Н+-обмен

(химическое сопрк*ение). Для остальных клеток этой группы была характерна индивидуальная нечувствительность к ионам К4" и переход в состояние К*-злоятрохнмячеслого равновесия со снижением

ь*„ и при достижении определенной концентрадаи К+ (7-50 iil). Переход из гкпе ^поляризованного в "К+-состояние" имея двукфаздый характер; медленная фаза деполяризации продолжалась до уровня потенциала «170 - -ISO uB и била обусловлена, по-видимому* уменьшекиек алоггрогенного компонента (Biaacn, 19В4 ) вследствие смешения Сай+ из плазмалеммы высокой концентрацией К* (tu-еея et el., 1976 ), а быстрая фаза, вероятно* отражала резкое открывание К+-канадов при достижении уровня потенциала около -175 jjD. Интересно отметить, что граничные потенциал между двумя фазами не зависел от концентрации if* и, вероятно, соответствовал пороговому значении открывания К+-каналов. Двухфаа-ность процессе наблюдалась и при обратном переходе из "^-состояния" в гипе рполяриэовакное при уменьшении содержания К4 до его уровня в ШВ (0,1 iMK Регистрируемая при отои гиперполяри-эация (рис.2) сопровождалась потенциалоэависнмым, почти 10-кратным увеличением сопротивления, при этом максимум его вновь достигался при Eu--I78 «В, Затем гиперполяриэация до уровня -220 мЕ} шла с уменьшением сопротивления плазмалеммы RM, что, по-видимому, связано о активацией электрогенных Н+-наеосов и доминированием насосной проводимости.

Таким образом, если пороговый потенциал активации К*-кана-лов находится в диапазоне калиевого электрохимического равновесия -170 —100 мВ, то клетки о исходным EU-~I75 ufc (I тип реакции) и должны иметь теоретическую каливсуп зависимость потенциала плазмалеммы о увеличением К+-провсдииости открытых К*-каналов (электрический «унт для Н+-насосов). В этом случае согласно гипотезе Марре-Питмана (1979) возможно осуществление непрямого сопряжения К+/И+ потоков: электрически управляемый К'-приток и стимуляция Н*-насосов вследствие К^-индуцирувмой деполярк-

эацин. В гилерооляриэованнои состояния (Ем превыишет К+-ревно-весный потендаал Ек+) К*-каналы закрыт« к электрический шум отсутствует» чем и обусловлена, вероятно» нечувствительность клеток к К*, и возможен механизм прямого сопряжения потоков К* и Н+ Ионы К* в этом состоянии, по-ридимоыу, выступает как стимулятор« Н+-нпсоса, а гиперооляриэация поддерживается за счет элвктрсгвн-ного К+/И+-обмена. Пороговое значение потенциала активация К^-ка налов (около -175 мВ) является и граничным потенциалом С"потен-"*цяалом переключения"» s»ith, 19S4 )» при котором осуществляется переключение между химическим и электрическим типами сопряжения потоков К* и Н*.

Изменение tH среды я диапазоне |Й 7-4 также вызвало 2 типа электрореакций клеток H.obtusa. I тип клеток реагировал на- уменъ шкие |П переходом плаэмалеммы в режим.К^-Н^-диНуэионного равновесия: коэффициент относительной проницаемости ионов Н4" по сравнению в К*" был равен; по нашим данным, 17, а не 10^, как у Китасато (1968). Создание противоградиента рй снижало вклад элект'рогенного компонента и вызывало увеличение сопротивления плазмалеммы (рис.3)» которое продолжалось до момента достижения "потенциала гореклачекия" режимов -ITS мВ, ниже которого резко возрастала мембранная проницаемость, по всей вероятности, вследствие активации К*-х8назов,

Появление К^-чувствителькостиклеток прослеживается и в тех опытах, когда в гиперполярязованном состоянии на фоне I }М К+ рН среды снижается от рН 7 до рН 6 (рио.4): "рИ-здвисимое ингибиро-вание Н+-нассгсов* (pool», 1978) также индуцирует снижение Ем и возрастание а в момент перехода через -180 мЗ - "потенциал переключения" режимов - возникает резкая активация К4-каналов и выход на соответствующий К^-ревновесныЙ потенциал.

Рмо.З, Кинетика изменения Ям» потенциала Е^ я сопротяв-*м плазиалекмы «леток V.obtuee прй снижения fH среды в диапазоне рН 7-5. На вставке показано потенцнавоваеисимое изт* меняв £м при двпоя крива- . ции. Потенциал . лврвклгаВ" nut &„—175 мВ.

Время, нш

Рис.4. Кинетика изменения потенциала Еу и сопротивления Кц плазмалекмы клеток Н.оМша при снижении рН среди на'фоне увеличенной концэнтрацик К* (1 кЫ) На вставке - потенциале-* зависимое изменение ^ при деполяризации. Потенциал переключения Е^-180 иВ.

20 60 бремя, ммм<

- 14 -

У II типа клеток о высокой злектрогекной активность»} (Ец-~214^9 мВ, R^-34,2^6 кОц.ем2) зависимость потенциала плазма-леммы от pH практически отсутствовала (рис. ?> н появлялась лит при {Н Э, Расчетное значение коэффициента относительной проницаеыости Не превышало 1,0, Видимо»уменьшенная Непроницаемость и буферные свойства клеточной стенки (протонная емкость апопласта, Егорова, 1963) обусловили pii-нечувствительность клеток. Применение буфера moïs (I мМ)в диапазоне pit 7-5 позволило продемонстрировать» что и у этого типа клеток возможен Пароход из гиперполяриаованного в режим К^-Н *-диффузионного равновесия, характерного для I типа клеток. При возвращении а исходному pH 7 потенциал плаэналеымы достигал уровня -247+3,3 мВ (п «6)..который соответствовал работе алектрогекного насоса харофитов со стехиометрией 2Я+/1 АТФ (Kawamura et al., 1900 ). Гиперлоляриэа-ционный эфрект последействия кислой среды (pH 4), обнаруженный нами у всех клеток,1 по-видимому, объясняется временным увеличением H ^-проницаемости и, как следствие, подкислекием грггоплаэиы и стимуляцией АТФаэной активности насосов плаэмалеммы (оптимум pli 6,6, Зав, 1965 ).

Santo отметить, что необходимым условием функционирования Н+_насосов в режиме електрогенного H -обмена и потенцкалозави» симого изменения сопротивления плаэмалеммы а Н+-К+_диффузиокном состоянии было присутствие Ca. в среде ИГШ. При обратном увеличении pH среды от tfî 4 до JÜ 7 в отсутствие Еи клеток обоих типов восстановливалоя только до К*-равновесного потенциала, а сопротивление плаэмалеммы оставалось на низком уровне и почти не зависело от Ем. *

р. Влияние аукрина Н протонофсаа на потенциал и сопругивлр-

«г

плазмалеымы идете*. * Действие 10 И ИУН на потен-

-16 - .

циал плазмалеми* Е^иук) зависело от его исходного уровня Е^Сист) и могло быть описано регрессионным уравнением

Ем(»</*)' 0,45 £м (»"> -34, г.0,65, п-15 ■

У большинства клеток (рис.5) ИУК вызывала деполяризаций* предел которой стремился к потенциалу -170 мВ, близкому к К*"-равно-

' ' ' ^ Рис.5. Корреляционная зависи-

мость меалу потенциалом плаэ-малеммы в ИПВ + Ю Н ИУК [Бм<иук}] к его исходным значением В^исх). Пунктирная линии - теоретическая зависимость, отражающая нечувствительность клеток к ИУК.

ве сному в ИПВ, где калия-содержится 0*1 rfi. Переход плаэыалеммы в "К^-со стояние" сопровсящалсяувеличением ее сопротивлетш до . 64+S кОм'с№, т.е. на Z3% по сравнимо с исходным значением. Типичная величина Еи на фоне 10"^ И ИУК составляла -180*7 мВ, и, таким образом, на криеой потенциалозависимости сопротивления плазма-леммы оба параметра Ец и Е^ не отличались от нормы (рис.1). То ' . есть ИУК индуцирует изменения биоэлектрических параметров по стандартной кривой потенциалозависамости В некоторых '

клетках 10 Ji ИУК индуцировала деполяризации до уровня потенциала, ниже К+-равновесного, которая сопровождалась скачала увеличением сопротивления плазмалеммы, а затем «го переходом через максимум при потенциале -165 мВ (рис.6). Дальнейшее увеличение концентрации К*" до I мМ приводило к переходу Е^ на уровень Е

Гло.6. Кинетика изменения м, потенциала ^ и сопротивление«1 «ия Км пл&змалеммы клеток B.obtvwa вря введении в среду Ю"5 U ИУК и дальней, щам увеличении концентрации KCl до ГЛ. Потенциал переключения ЕП»-185 мВ,

1 г

.Время, v

Один на возможных механизмов деполяризующего действия ИУК - это ее протонофорное свойство как слабой кислоты (ifruatr, Bentrup, 1Э7в), которая создает протонный шунт Н^-наоооов. В атом случае деполяризующий эффект слабой кислоты должен усиливаться со стоке-кием рИ, что и наблюдалось при последовательном смещении pH опытного раствора от jH7 до рН5 на фоне 5*10. И протонофора карбо-нилцианид-tri-хлорфенилгидравока (КЦШ. Подобно ИУК, протонофор-ный разобщитель на фоне pH 7 также индуцировал переход плазмалем-ми из гипврполяризованного в "K+-cocromoie", причем деполяризация обычно сопровождалась переходом Рм через максимум при потенциале -177+2,6 ifi (п»17), а установившиеся значения Ем в отличие от ИУК находились на уровне, несколько ниже, чем К+-равновбсный (рис.7), Другим отличием действия этих слабых кислот было то, что КЦЙ действовал быстрее (лаг-фаза <1 мин, Ем снижался до уровня Еи+в Течении 5-10 müh), чем КУК (лаг-фал 5-20 мин, деполяризация до уровня ER. протекала в течении I ч)* Деполяризующий еффект ГОДО (константа дисооциацхи рК 6,0) по 0равнению «ИУК {рй 4,7) бш

сильнее вырежем при pH 6 к pH 6 (рмо.7). По-видимому, при атом

-100

Рис.7. Зависимость потен» циала плаз, .алеммы Еи от pH среды (ИПВ); Обозначения: о-о, ♦—•-клетки I и II типов; л—* на фоне 10 И • КУК; о-о - иа фоне Ь-Ю*^ карбснялцианчи-tfi -хлорфв-кил гид района, Вк+ - Неравновесный потенциал. Пряве-дены средние значения (количество измерений 6-10)» • Стандартные отклонения не пре вывали 65t,

суммировались два эффекта: и рН-эависиная инактивация Н^-насссов, о которой уы упоминали »tue, и н+чо>гггироеанив насосов. Но при pH 4 был обнаружен новы" эффект - отклонение потенциала пяаэма-леммы в сторону гкперполяркзвции' на 30 для раэобпргтеля и 15 «S для ПУК. Можно предположить, что протежированные форин обоих слабых кислот вызывают при диссоциации в цитоплазме (jH 7,3, xi-mura et al., 1985 ) eä подкйсленив и етцуляцив Н^-транспорти-руюцих АТФаэ пяазмахзмми

Таким образом, исследование регуляторного влияния ИУК на электрохимические параметры плаэыалеммы В, ob tue а свидетельствует о том, что типичной реакцией моток является сдвиг тибренного потенциала к К^-электрохимиче«я>«у равноDtsow, которое для пркроднш- экосистем (0,1 idl К*) локализовано около -175 кВ я характеризуется ещё закрытым состоянием К^-кдк&яов. Следует от--метить» что снижение потенциала плаэмалемхи сопровождается уве-. личсютем сопротивления й отражает, по-видимому, переход от влек-трогекного к элестронэйтральксцу К^/И^-обмену. При увеличении со-

держания К*- 8 среде (диапазон механизма It по Эпстайну) ИУК стимулирует переход на соответствующий уровень Неравновесного потенциала о активацией ^-каналов. Физиологическое значение перехода х "^-состоянию", которое индуцирует ИУК, состоит, по-видимому* в том, что в условиях годдерканнл постоянства протонодви-вущеВ сит ВДС-Ем+5вЛрН»соп^ (smith. Walker, 1976 ), деполяри-ведая плазмалешл» будет приводить и усилению о г тока к увеличении градиента рН, как это постулируется в теории кислого роста (Полевой* 1965). Можно предположить, что зтот адекгрофиэяологк-ческий аффект ИУК является общей реакцией растительных клеток, поскольку гиперполяризация клеток высших растений; индуцируемая ИУК и другими слабым кислотами (Полевой* 1985; Etberton* 1970» Marre «t «i., i974t Clelantt et al., 1976),также устанавливает

К*-раановесный потенциал.

» *

4. Действие <!(узико¡сцица на потенциал и сопротивление ¡щазма-лемиы клеток MTofrtmm. Изучение действия фуэюсокцина (СК), дитер-ненового глакозида, в широком диапазоне концентраций позволило обнаружить два типа биоэлектрических реакций;

I гилерлоляризация плазмалеммы при низких концентрациях (пороговая 1СГ1 11, полун&сыаюиие ¿Еи-19 иВ при ю-п М) и слабое изменение сопротивления (8,2 кОмсм2) в диапазоне 10"1Э-10~7 Н.

II резкое увеличение на 32 кОм-ом2 при lÜ^-tO-5 Н 4К, когда реакция гиперяоляризации достигает насиивния'.ьЕ^-Зв (pic.8),

Концентрация ФК КГ5 Ut выбранная в настоящее время исследователя!« в качестве рабочей, ичодцировала необратимую гиперлоля-ризацт |^Ем(фк>] в зависимости от и ох одного уровня потенциала К (иох)|

" Ефк) ~ о, 5£h <«Ъ) - /¿0, г = 0,73, п- 31

ftto.8. Зависимость изменения потенциала Ем и сопротивления плазмалеммн клеток N.obtusа от концентрации фуэи-кокцина (ФК) в ИПВ. Кривые построены'методом скользящей средней. Приведены средние значения+етакдартная оцибка. Количество измерений т 4 до 29.

Предел гиперполяризации достигается при Ем«-240 ыВ, при больших , значениях Ем ffit вызывал деполяризации» но о неизменным увеличением Вм.

Низкая пороговая концентрация (1СГ1Э М) и низкая концентрация полунасыщения {Ю-^ Ц) подтверждают высказанное ранее предположение о рецепт орно» механизма действия ФК на электрогенныв Н+-насосы плазмалеммн (магге, 1980t Нашюп, Тгчwaves, 19s2 ), однако, по модели Mappe (1980) активация Н*-насосоа, индуцированная фузикокцином, должна, приводить х усилению К*-пригока (электрического шунта). Наши зксперименты не подтвердили етого положения: ia *1то ФК вызывал увеличение R^ во вое* случаях. Это наво-

-годило на мысль о том, что возможно влияние ФК но только на Н+-на-сосы, ко н на диффузионные каналы пя&змалемыы. Выключение Н+-«а-соса о помощь» ингибитора АТФааы плазмалешш диэти лети лбе строла - ДЭС (Ю-5 U) привадило к переходу R.,на деполяризованный уровеНь, 10 IIна фоне ингибитора Н+-насооов увеличивал в 5 pas и переводи* Вм на максимальный диффузионный уровень, близкий к К^-равновесмоцу. Еехк ДЭС снижал Бм только до К^-равновес-ного потенциала, то введение ФК увеличивало только Показательны вэтом отношения опыты с клетками, перфузкдоемыми раотво-ром без сопротивление шаэмалеммы на фоне 11{К

(как со стороны цитоплазмы, ток и с внешней стороны) возрастало В Ô раз (фактически без изменения Гиперподяриэация плаэма-леммм на 40-50' мВ наблюдаласьтолько при наличии в оерфузате Н^-АТФ (0,1-1 Л>. Таким образом, ФК, действительно, может 'оказывать непосредственное действие на проницаемость диффузионных каналов и его гнперполяриэуюций аффект может быть отражением вклада Н+-насосов как генераторов тока, создающих электрогенныЯ компонент и за счет увеличения мембранного сопротивления. Уменьшение сопротивления плазмалеммы не обнаружено и на клетках Ohara ooralllna (Нова et al. 1905)и на клетках aloapte alb* (pell«, 19&2), а на клетках устьичного аппарата так же, как в нашей работе, зарегистрировано увеличение в 2,6 раза (Blatt, 1988).

Дискуссионным оотается вопрос о прямой стимуляции фузикок-цином электрогенных И+-насосов АТФаэного ( Uarr«, 1960t нahaon, Tremava«,1982) или радоко типа (Нсвак и др., 1988). Тот факт, что при высоких потенциалах ( > -243 мВ) ФК мщуцирует деполяризации s одновременным увеличением ï^, а при внутриклеточной перфузии ÎK гнперполяризация сопровождалась уменьшением сопротивления плазмалеммы, может служить электрофмзиологическин доводом

в пользу х прямого действия ФК на Н+-насос. Активация гидролитической активности Н+-АТФаэн также обнаружена при подачи Ш со стороны цитоплазмы на вывернутых везикулах шгазмеяеммы ( Raai-Caldogno et al., 19e6).

Таким образом, изменение конного состава и jH о роды, а также введение, ингибиторов метаболизма и регуляторов роста - аукси-иа и фуэикокцина показало, что для функционирования транспортной системы Н+-насосов и К^-каналов гдаямалеммы характерно ре гуля-торное влияние мембранного потендедоа на соотношение проведимоо-тя Н+-насосов и К*-каналов. Лереклвчение из режима о лреобдадв-нхем насосной проводимости (Бм>-175 мВ, химическое сопряжете, механизм 1) в режим с потенциэлоэавяеимум управлением калиевой проводимости■ (диапазон -175 - -125 м£, электрическое сопряжение, механизм II) обусловлено, вероятно, уменьшением вклада электрогенного компоненте к отгрываниеы К*-каналов,

Двухфазный характер потенциалозависимостя сопротивления плазмзлеммы свойств«! не только для одиночных клеток при изменении факторов среда, но я для распределения биоэлектрических параметров популяции клеток, находящихся исходно в рлзтлс фонологических состояниях, что может использовано для экспресс-диагностики транспортных систем.

- шведа

I. Исследование електричеекях параметров плазмалемюг (мем-бранкуй потенциал Б^ я сопротивление 1^,) клеток S.obtuea при действии ионов К* в широком диапазона котацэвтрацнй (от механизма I ионного транспорта к механизму И по Эпстейну) позволяло обнаружить у 50Í клеток новый тип биоэлектрической реакция - гипер-поляризацип илазмалеммы с уменьшением сопротивления, отрвжаю$рто,

по-видимому , активацию электрогеннм* В+-насосов. Для остальных клеток о исходным потенциалом выше К+-равновесцого (ER+«-175 »В) была характерна индивидуальная нечу в ствительность к иоваы К+ и переход х состояние {(^-электрохимического равновесия, "(^-состояние о уменьшением Еи и ^ при достижении определенной концентрации К+ (7-50 мМ), индуцирующей открывание К*-каналов.

2. Спонтанный переходиэК^илдуцироеанного состояния в гиперлоляриэованное на фоне низкой концентрации К4, (естественные экосистемы) происходил с одновременным увеличением потенциала плалыалемны Ем и сопротивления J?u, которое достигало максимума (К*"-каналы эакрьпы) при потенциале, близком к К+-равно ne снопу , а затем К^ уменьшалось до стационарного уровня сопряженно о гиперпояяриаациейЕм до -220 мВ, связанной, по-видимому, с активацией электрогенных Н+-насооов и доминированием насосной проводимости, -

3. Создание противоградивнта ионов Н+ (1-2 ед, pH) для работы Н+-насосов также индуцировало переход иа гиперполяриэованного состояния в Неравновесное о увеличением сопротивления плазмалеммы. В состоянии Н+-К+-диффуэиокного равновесия ({tí 4) протонная проницаемость более чем на порядок превосходила калиевую, что, вероятно, вызывало закисдение цитоплазмы и активацию Н^-АТво-эы, поскольку, при обратном переходе к центральному pH усиливался гиперполяризационный ответ. Присутствие ионов Са2+

в среде было необходимым условием проявления рН-контроля электрогенной активности и потенциалозависимоети сопротивление плазмалеммы.

4. Действие ауксина (мндблилуксусной кислоты) было направлено на регуляцно електрогенного нсмпонеша мембранного потенциала N.obtueе. Типичной реакцией клеток не аукоин п прого-

- 23 - '*

нофорный разобщитель (сравнение аффекта слабых кислот) был переход из гиперполяризовшшого.в К4-равновесное состояние (на фона 0,1-10 К*) с начальным увеличение« сопротивления плаэ-ыалеммы, отрожегхцим, по-вздимоьдг» уменьшение проводимости Н+-насосов с последующей потёнциалоэавнсимой активацией К*-кака-лов в диапазоне -175 - -125 мб.

5, Фуэикокцин» наиболее сильный из известных стгаогляторов Н+-насосов, вызывал необратимую гиперполяризацию, обратно пропорциональную исходно^ уровню потенциала плазмалеммн. Низкая пороговая концентрация Ю"13 И и полунасышение реакции при jq-II к позволяет рассматривать эффект № кал актямцш Н+-на-сосов плазмалеммн по типу рецепторного механизма. Резкое увеличение обнаруженное при высоких коицгнтрацялх (ior^-io-5 К), по-видимому, связано о прямым влиянием ФК на проводимость диффузионных каналов, которое наблюдается как при депрессии влек* трогенной активности, так и на моделях клеток» перфзгэий7емых

без М3г*-АТФ.

6. Таким обрезом, гормон-иццупируеиые' биоэлектрические реакции клеток H.ottuea определяются специфичностью действии . регуляторов роста ва электрогенные Н*-насось»и мамбранную проводимость. При этом эффект ауксина связан в переводом состояния плазмалеммн из гиперюляркэоеаниаго а К^-рввновесное путей шунтирования Н*-масосов» а фузяхокцян, напротив, вызывает переход в гилерполярнзованное состояние о одновременным увеличением сопротивления пассивных каналов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Магерратов М.Г., Н&пгеадхшас Л.А. Влияние pfl тетей среды на биоэлектрические параметры клеток B.obtua* ... В кн,: Тези-

-- 24 -

сы докладов конференции молодых ученых "Изучение* охрена к рациональное использование природных ресурсов". Уфа, 1985, с.134,

2. Воробьев Д.П., Ыагеррамов И,Г,, Бабаков A.B., Муромцев Г,С. Действие фузикокцина на проводимость и мембранный потенциал клеток »Itellopala obtusa Физиол. растений, 198?, т.34, »2, «. 342-349.

3. Ыагеррамов М.Г, Влияние слабых кислот на {И-зависимоеть биоэлектрических параметров клеток К.obtusa В кн.: Тезисы докладов конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов". Уфа, 1987, о. Ив.

4. Воробьев Л.Н,, Кагерраыов Ы.Г, Влияние ионов К+ и Н+ на электрогенну» активность клеток К.obtusa В кн.: "Мембранный транспорт и биозлектрогенез у растений". Горький, 1987, о. 25-29.

5."Ыагеррамов М.Г.,»Воробьев Л.Н. Индукция Непроводимости в

■ г .

клетках Н.obtusa- В кн.: "Испольэ. раэл. методов в иэуч. биол. систем. Докл. ШИП, 1986, Общ. б иол," It., 1988, о Л 5-17,

Подписано к печати 06. 01. 89. ФГ 11505. Заказ 13, Тираж 100.

Типография АН Лзерб. ССР,

Бесплатно

АЗЭР6МЧАН ССР Е.ДМЛЭР АКАДЕМШАСЫ В. Л. КОМАРОВ адына БОТАНИКА ИНСТИТУГУ

дл}азмасы Ьугугунвя

МЭЬЭРРЭМОВ МЭЬЭММЭД ЬЭМИД оглу

УДК 581.1:582.271:612.014 422

АУКСИНИН ВЭ ФУЗИКОКСИНИН БИТКИ ьуче^элэринин н —насосларынын ЕЛЕКТРОКИШЭВИ РЕГУЛМСИМСЫНА

тэ сиринин елрэнилмэси