Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость между выделением протонов клетками корня и ростом

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Зависимость между выделением протонов клетками корня и ростом"

На правах рукописи

Месенко Михаил Михайлович

Зависимость между выделением протонов клетками корня и ростом

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в лаборатории физиологии корня Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН г. Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Иванов Виктор Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Обручева Наталья Владимировна

кандидат биологических наук Пилыцикова Наталия Владимировна Ведущая организация:

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " 2 " декабря 2003 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095)977-80-18, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «31» октября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

М. И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования. Изучение роста отдельного органа растения базируется на изучении роста его клеток. Для этой цели наилучшей моделью является рост клеток корня. Растущая часть корня состоит из меристемы и зоны растяжения. На границе меристемы относительная скорость роста резко возрастает на протяжении короткого участка корня (Иванов, 1974, Ivanov, 1997; Beemster and Baskin, 1998; Иванов и Максимов, 1999; van der Welle, 2003). Возрастание скорости роста связано с изменением характера роста клеток - образованием в клетках большой центральной вакуоли, активацией метаболизма клеток, изменением набора синтезируемых ферментов, повышением пластичности клеточных стенок. Переход клеток к растяжению не зависит от прекращения делений (Ivanov, 1997).

Механизм резкого возрастания скорости роста при переходе к растяжению и роль ИУК в нем до сих пор неясен. В частности, неясно, какую роль играют при этом ауксины. На колеоптилях было показано, что ИУК вызывает возрастание скорости роста через короткий промежуток времени, сопровождающееся усилением секреции протонов клетками и подкислением апопласта (Полевой, 1982). Низкие величины pH также ускоряют рост клеток, что и лежит в основе так называемого "кислого роста". Ускорение начала растяжения клеток под действием ИУК объясняют увеличением растяжимости клеточных стенок в результате подкисления апопласта (Rayle and Cleland, 1992).

Однако, неясно, в какой мере эти процессы характерны для роста клеток корня. Известно, что растягивающиеся клетки корней растут с гораздо большей относительной скоростью, чем растягивающиеся клетки других органов. Кроме того, ИУК только незначительно стимулирует рост корней и при гораздо меньших концентрациях, чем те, которые стимулируют рост колеоптилей и гипокотилей (Burström, 1969; Pilet and Saugy, 1987; Spiro et al., 2002).

Выделение протонов происходит в результате работы НГ-АТФазы (Briskin, 1990; Palmgren, 1998; Morsomme and Boutry, 2000). В происходящем под действием ИУК подкислении апопласта ключевая роль так же отводится повышению активности Н^АТФазы (Rayle and Cleland, 1970; Rayle and Cleland,

1992; Polevoi et al., 1996).

Данные иммуноцитохимии показывают равномерное распределение белка FT-АТФазы вдоль оси растущей части корня (Parets-Soler et al. 1990; Stenz et al., 1993; Jahn et al., 1998), хотя содержание его в разных тканях отличается. Однако показано усиление секреции протонов в растягивающихся клетках корней (Felle, 1998; Peters and Felle, 1999, Peters and Felle, 2001). Это позволяет предполагать существование механизмов активации работы НГ-АТФазы при переходе клеток к растяжению.

Один из механизмов активации работы Н^АТФазы связан с участием 14-33 белков - гидрофильных, консервативных регуляторных белков, широко распространённых в клетках животных и растений (Aitken, 1996). Белки 14-3-3 имеют специфический участок, ответственный за взаимодействие с С-концевым доменом ЬГ-АТФазы. При фосфорилировании ЬГ-АТФазы димер белка 14-3-3 взаимодействует с ферментом и активирует его (Jahn et al., 1997; Oecking and Hagemann, 1999; Svennelid et al., 1999; Jelich-Ottmann et al., 2001).

Несмотря на очевидную взаимосвязь между процессом роста корня и скоростью выделения протонов растущим корнем, до последнего времени не изучено, какую роль играет секреция протонов при росте клеток корней и как меняется содержание 14-3-3 белков, возможных регуляторов Н^-АТРазы, в растущих клетках корней.

Изучение этой проблемы актуально для понимания механизма ускорения роста при переходе клеток корней к растяжению.

Дели и задачи исследования. Основной целью работы было выяснить: каким образом процесс перехода клеток к растяжению и сам рост растяжением зависят от интенсивности выделения протонов, и в какой мере изменение интенсивности выделения прогонов в ходе роста клеток связано с акшвносшю Н^-АТФазы. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить скорости выделения протонов вдоль растущей части корня и при обработке стимулятором и ингибиторами ЬГ-АТФазы.

2. Изучить распределение 14-3-3 белков в кончике корня.

3. Выяснить возможную взаимосвязь между долей 14-3-3 белков во фракции плазматических мембран клеток вдоль растущей части корня и скоростью выделения протонов по длине корня.

Ш 4

4. Изучить влияние рН среды на скорость роста корня в целом и процессы, составляющие рост корня.

5. Изучить влияние обработки стимулятором и ингибиторами Н^-АТФазы на скорость роста корня в целом и процессы, составляющие рост корня.

Научная новизна работы. Впервые был проведён клеточный анализ роста корней кукурузы при инкубации интактных проростков в буферных растворах с диапазоном рН (3,5-8,3) и при обработке веществами, изменяющими активность Н^-АТФазы (ингибиторов - диэтилстильбестрола (ДЭС) и ортованадата натрия и стимулятора - фузикокцина (ФК)). Было показано, что стимуляция и ингибирование выделения протонов не влияют на резкое повышение относительной скорости роста клеток при переходе к растяжению, хотя дальнейшее растяжение клеток в корнях происходит по типу "кислого роста". Впервые было изучено распределение 14-3-3 белков по длине корня, и показано, что ускорение роста во время растяжения сопровождается повышением скорости выделения протонов, совпадающим с увеличением доли 14-3-3 белков в плазмалеммной фракции клеток растущей части корня, что указывает на возможное участие 14-3-3 белков в регуляции активности Н*-АТФазы. Впервые показано, что ингибиторы ЬГ^-АТФазы и щелочные значения рН удлиняли время жизни клеток в меристеме. В ранее проводившихся исследованиях не были найдены соединения среди цитостатиков, ингибиторов синтеза белка и нуклеиновых кислот, соединений с общетоксичным механизмом действия, которые удлиняли бы время жизни клеток в меристеме. Впервые на интактных корнях изучено, как зависит рост растяжением от выделения протонов корнями. Доказана роль Н^-АТФазы в выделении протонов растущими клетками корней и впервые установлена на корнях роль 14-3-3 белков в регуляции этого фермента в ходе роста клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные имеют значение для понимания регуляции роста корня и установлении общих и частных закономерностей организации роста разных органов растения. Разработанные методики и подходы могут использоваться для анализа действия разных факторов на рост корней и скрининге новых физиологически активных веществ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, (Санкт-Петербург, 15-19 мая, 2000), на Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке", (Сыктывкар, 1-6 октября, 2001), на международном симпозиуме "Растение в условиях экологического стресса" (Москва, 23-28 октября, 2001), на Международной научной конференции "Биологические ресурсы и устойчивое развитие" (Пущино, 29 октября-2 ноября, 2001), на V Съезде ОФР, (Пенза, 15-21 сентября, 2003) и на семинарах лаборатории физиологии корня ИФР РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 128 источников, из них 85 на иностранных языках.

Проведенные в диссертации исследования были поддержаны Российским Фондом Фундаментальных Исследований (проекты № 00-04-48434 и 03-04-48578).

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ: ДЭС - диэтилстильбестрол, ИУК — индолилуксусная кислота, ФК — фузикокции.

краст. / кмер_- соотношение относительных скоростей роста клеток после перехода к растяжению и в меристеме.

Объекты и методы исследования. Работа была выполнена на двухдневных проростках кукурузы Z. mays L., сорта Mieszko. Семена проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой в темноте при 26 °С. Двухдневные проростки переносили в пластмассовые чашки Петри диаметром 140 мм или в сосуды, объемом 250 мл в смесь 0,5 мМ MES + ВТР (рН=6,2) или растворы ФК (10'6 -10"7 М) или ДЭС (10"4 - 10"5 М) в этом буфере. В опытах с орто-ванадатом (10° -10"4 М) тот же буфер доводили до рН=7,2, контрольные корни так же росли при

рН=7,2. В специальных опытах было показано, что в пределах рН 3,9-6,5 не влиял на рост корней (Меэепсо, 2001). При изучении влияния рН на рост корни выращивали в смеси 0,5 мМ МЕ8 +ВТР на основе дистиллированной воды, при значениях рН равных 3,9; 4,3; 6,5 и 8,3. Готовая буферная смесь разливалась в сосуды, объёмом по 250 мл. Сверху сосуды накрывались алюминиевой фольгой с отверстиями для размещения проростков кукурузы. При инкубации проростков кукурузы в сосудах проводилось постоянное перемешивание и аэрация растворов.

Корни измеряли линейкой перед началом опыта и через 4, 8, 12, 24 и 48 часов после начала опыта. Каждый раз, после измерения длины главного корня небольшую часть корней разрезали. На продольных срезах корней измеряли длины последовательно расположенных клеток в рядах метаксилемы для определения места перехода клеток к растяжению и верхней границы зоны растяжения. На графиках зависимости длины клеток метаксилемы от номера можно было выделить две прямых линии, описывающих рост после окончания делений до скачка относительной скорости роста клеток на границе меристемы и после перехода клеток к растяжению. Соотношение углов наклона этих линий показывает, во сколько раз увеличивается относительная скорость роста клеток после перехода к растяжению. Ниже эта величина обозначается как соотношение относительных скоростей роста клеток после перехода к растяжению и в меристеме. После 24 и 48 часов инкубации измеряли длину закончивших рост клеток 3-4 внутреннего слоя коры.

Использование индикаторов для оценки рН вдоль корня. Для

Зех

-дневные этиолированные проростки кукурузы с длиной главного корня 3,5-4 см. Среда для заплавки корней имела следующий состав: ага-агар (0,6%), Са304 (0,5 мМ), бромкрезоловый-пурпурный (0,71 мМ), рН=6,0-6,5 (Магесйпег ег а1., 1982; г^йап е1 а1., 1990). Через 30-60 минут после заплавления корней в среду результаты опыта фотографировались.

Измерение скорости выделения протонов. Главные корни длиной 27-33 мм промывали дистиллированной водой и с помощью специально сконструированного устройства разрезали на сегменты по 0,8 мм. Вырезанные

сегменты барботировались в буфере состава 0,5 мМ MES + 5 мМ K2SO4 + ВТР с рН=6,2 в течение 30 мин. Далее сегменты корней помещали в термостатируемую ячейку (25 °С), содержащую свежий буфер, и с помощью рН-метра определяли изменение pH буфера в течение 1-1,5 ч.

В опытах со стимулятором и ингибитором Н^-АТФазы корни предынкубировали в том же буфере с добавлением ФК (10"6 М) или ДЭС (10"4 -10"5 М), в течение 3,5 часов, после чего разрезали на сегменты, которые переносили в свежий буфер с добавлением ФК или ДЭС и барботировали в течение 30 минут. Во время измерения скорости выделения протонов сегменты из предобработанных корней инкубировались в порции свежего буфера, содержащего необходимые концентрации ФК или ДЭС. Для определения количества выделенных во внешнюю среду протонов раствор в ячейке титровали 1мМ КОН. По полученным кривым графически вычисляли скорость выделения протонов. Для того, что бы выяснить, влияет ли разрезание корня на сегменты на секрецию протонов, измеряли скорости выделения протонов апикальным участком корня размером 4,8 мм и аналогичным участком корня, разрезанным на сегменты по 0,8 мм.

Выделение фракции плазматических мембран, электрофорез и иммунодетекция 14-3-3 белков. Корни 10 растений разрезали на 10 частей по 0,8 мм от апекса. Вырезанные участки помещали в пробирки, содержащие 100 мл. буфера 50мМ Mes/Tris (pH 6.2), 0,4М сахарозы, 10% (в/о) глицина, ЮмМ NaF, ЗОмМ ß-глицерофосфата, ЮмМ EDTA, 5мМ EGTA, 2мМ DTT, 1мМ PMSF, 10% поливинилполипирролидона (от массы растительного материала). Образцы растирали тефлоновым пестиком с последующим озвучиванием 3 раза по 10 с. на средней мощности погруженным зондом ультразвукового дезинтегратора MSE во льду. Микросомальную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования: первое центрифугирование проводили при 10.000 g, 10 мин при 4 °С на центрифуге Sigma 15К, второе -при 4 °С 50.000 об/мин в течение 30 мин на ультрацентрифуге Beckmann TL-•100 ротор TLA-100.3. Полученный осадок микросомальной фракции ресуспендировали в буфере 0,33 М сахарозы, ЗмМ KCl, 5мМ КН2Р04. Выделение плазматических мембран проводили методом распределения

мембран в жидкой двухфазной полимерной системе (Larson et al., 1994). Осадок плазматических мембран ресуспендировапи в 20мкл буфера для ДСН-ПААГ электрофореза. Электрофорез белков проводили в 12.5% ДСН-ПААГ в соответствии с методом Laemmli на установке Bio-Rad Modular Mini Electrophoresis. На каждую дорожку геля предназначенного для окраски Кумасси R-250 наносили 5 мкл образца, несколько дорожек оставляли пустыми, остальные 15 мкл каждого образца наносили на гель для последующего иммуноблотинга на белки 14-3-3. После прохождения электрофореза гель разрезали на две части, одну часть (с образцами по 5 мкл) окрашивали Кумасси R-250, другую (с образцами по 15 мкл) использовали для дальнейшего иммуноблотинга. Электроблоттинг белков проводили по методу Towbin с системой визуализации ECL (Amerscham, UK). Иммунодетекцию проводили, используя в качестве первых антител кроличьи антитела, полученные к белку 14-3-3 (в разведении 1:50000). Количественные определение тотального белка на электрофореграмме и белков 14-3-3 на иммуноблоте проводили путем сканирования геля и фотоплёнки планшетным сканнером с последующей обработкой изображения программным пакетом ONE-Dscan ver. 1.3 (Scananalitics Inc.). Опыты проведены в не менее чем трёхкратной повторности, результаты обработаны статистически, и представляют собой среднее значение и стандартную ошибку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Положение зон роста в корне. Для определения границ зоны растяжения на продольных срезах живых корней измеряли последовательно длину клеток в рядах метаксилемы. В них деления заканчиваются на расстоянии 400 - 500 мкм от кончика корня. Далее до перехода к растяжению размер клеток метаксилемы увеличивается, тогда как длина клеток других тканей мало меняется из-за продолжающихся митозов. С началом растяжения длина клеток метаксилемы начинает возрастать значительно сильнее с удалением от кончика корня. Этот перелом был четко выражен на кривых зависимости длины клетки от ее номера и был принят за апикальную границу зоны растяжения. На базальной границе зоны растяжения длина клеток переставала увеличиваться с удалением от

кончика корня. В контрольных корнях зона растяжения была между 1,6-1,8 и 6,5 - 8 мм от кончика корня. Аналогичные результаты были получены на корнях кукурузы другими авторами (Erickson and Sax, 1956, Иванов, 1974, Иванов и Максимов, 1999, и др.). При действии ингибиторов размеры зон роста изменялись, о чем пойдет речь ниже. Относительная скорость роста клеток при переходе к растяжению увеличивалась 4-5 раз на небольшом участке корня, что было определено по методу, предложенному Ивановым и Максимовым (1999).

Использование индикаторов для оценки pH вдоль корня. При заплавлении интактых корней в агар-агар, содержащий бромкрезоловый-пурпурный, характерное изменение окраски вдоль корня наблюдалось уже через 20-25 минут после заплавления корня и воспроизводилось в большинстве опытов. На самом кончике корня наблюдалась зона подщелачивания размером 1,5-2 мм. Однако внутри этой зоны подщелачивания наблюдалась небольшая зона подкисления, расположенная напротив вершины корневого чехлика. За зоной подщелачивания, образуемой корневым чехликом и меристемой выявлялась зона подкисления размером 3-4,5 мм. Дальше была короткая зона подщелачивания. Причём, начало подщелачивания окружающей среды поверхностью корней совпадало с местом, где на поверхности корня можно было различить появляющиеся корневые волоски. После этого наблюдалась слабо выраженная зона подкисления вплоть до основания корня. После появления зон с изменённой окраской вдоль корня измеряли их положение и сравнивали с размерами зон роста, определенными как указано выше. Полученные данные хорошо совпадают с результатами других аналогичных исследований (Mulkey and Evans, 1981; Marschner et al., 1982). С использованием индикаторов наличие узкой области подкисления напротив вершины чехлика отмечалось лишь Mulkey и Evans (1981). Однако с помощью микроэлектродной техники аналогичная область описана в работе (Peters and Felle, 1999) как в интактных корнях, так и даже после мягкого удаления корневого чехлика.

Изменение скорости выделения протонов по длине корня. Изменение pH на поверхности корня определяется не только процессом выделения протонов, но и некоторыми другими процессами. Для измерения скорости

выделения протонов растущую часть корня разрезали на сегменты по 0,8 мм и измеряли скорость выделения протонов этими сегментами, как было указано выше. Скорости выделения протонов шестью последовательными сегментами по 0,8 мм и соответствующим цельным участком корня, длиной 4,8 мм, не различались (11,5 + 3 и 11,3 + 0,6 нмоль /г*мин, соответственно). Следовательно, раневой эффект не влиял на скорость выделения протонов сегментами корней. Этот факт определил возможность использования вырезанных сегментов корня в дальнейших исследованиях. Корневой чехлик и меристема подщелачивали окружающую среду, а зона растяжения подкисляла (Рис.1). Наибольшая скорость выделения протонов была на расстоянии 16003200 мкм от кончика корня, что соответствовало области самого быстрого растяжения. Снижение скорости выделения протонов наблюдалось между 4000 и 5600 мкм от кончика корня, где начиналось замедление растяжения. Апикальная зона подщелачивания включает в себя корневой чехлик и апикальную часть меристемы. Для определения вклада каждой из этих частей в процесс подщелачивания окружающей среды измерялись скорости выделения протонов изолированными корневыми чехликами и последовательными участками корня, вырезанными из корней без корневых чехликов.

Изолированные корневые чехлики (апикальная часть корня размером 400 - 450 мкм) подщелачивали среду инкубации заметно сильнее, чем первые сегменты корня

(0-800 мкм),

Рис. 1. Скорость выделения протонов вдоль

„ г включающие в

растущей части кооня.

себя корневые чехлики и апикальные части меристемы (Рис.1). Два последовательных сегмента корня, полученных с корней с удаленными

Скорость выделения ^.протонов (нмоль/г.*мин)

япп 1200 ifiQO gnnn gano ?япп з?по asno аооо алпп лава Расстояние от кончика корня (мкм)

- контроль

■без корневого чехлика « корневой чехлик

корневыми чехликами (ГыИ - 400-1200 мкм, а 2ой - 1200-2000 мкм от кончика интактного корня) интенсивно подкисляли среду инкубации (Рис.1), а не подщелачивали её, подобно изолированным корневым чехликам. Наши результаты согласуются с данными (Felle, 1998; Peters and Felle, 1999; Peters and Felle, 2001;) полученными с помощью микроэлектродов на интактных корнях. Это показывает, что разная скорость выделения протонов вдоль корней приводит к образованию на поверхности и вокруг корней участков с изменёнными значениями pH, обнаруживаемых в опытах с индикаторами. Во время растяжения происходит интенсивное подкисление апопласта, причём, максимальная скорость растяжения клеток совпадает с максимальной интенсивностью выделения протонов. Падение скорости растяжения клеток совпадает со снижением скорости выделения протонов. Возможно, процесс выделения протонов в клеточную стенку (подкисление апопласта), является одним из необходимых условий, для роста клеток корней растяжением. Это следует из многочисленных данных полученных при изучении роста колеоптилей и гипокотилей (Rayle and Cleland, 1970; Edwards and Scott, 1974; Schopfer, 1989; Luthen et al., 1990) и при прорастании семян (Обручева и Антипова, 1994).

Действие ФК и ДЭС на секрецию протонов корнями. Секреция протонов в основном происходит при участии Н^-АТФазы (Morsomme and Boutry, 2000;

Palmgren, 1998; Briskin, 1990). Для проверки этого было исследовано влияние стимулятора Н+-АТФазы фузикокцина (ФК) и ее ингибитора диэгалстильбестрола (ДЭС) на секрецию протонов отрезками корней. Скорость

Рис. 2. Влияние ФК и ДЭС на скорость выделения протонов отрезками корня по 0,8 мм.

выделения протонов заметно повышалась ФК (10"6 М) и снижалась ДЭС (10"4 М) (Рис. 2). ДЭС (10"5 М) снижал скорость выделения протонов самыми быстрорастущими участками корней примерно на 20% от контроля. Наблюдаемое под действием ДЭС очевидное снижение скорости выделения протонов, а так же повышение скорости выделения протонов во всех корневых сегментах при обработке ФК подтверждают предположение о ключевой роли lf-АТФазы в данном процессе. Следовательно, происходящее во время быстрого роста клеток корней подкисление окружающей среды в первую очередь связано с интенсивной работой Н^АТФазы по выделению протонов.

Влияние стимуляторов и ингибиторов ЕГ-АТФазы на рост корней. ФК (10"7 М) не влиял на рост корней. Максимальная стимуляция роста коней ФК (Ю-6 М) наблюдалась в первые часы обработки, затем эффект снижался. Незначительная стимуляция роста корней, быстрота проявления и последующее снижение стимулирующего эффекта ФК во времени подтверждает более ранние данные о быстром проявлении и непродолжительности действия ФК на рост корней кукурузы (Miller and Gow,1989), льна (McBridge and Evans, 1977) и колеоптилей овса (Cleland, 1976). Таблица 1. Анализ действия ФК на рост корней._

контроль 10-7 м ФК 10-6 м ФК

Прирост корня (мм) за 24 ч. 33,2 ±1,2 35,8 ±0,6 40 ± 1,3

Длина закончивших рост клеток коры (мкм) после 24 ч. 183 ± 3,2 199 ±3,1 216 ±1,7

Число клеток коры, закончивших рост в ряду за 24 ч. 182 ±7 180 ±5 185 ±5

Длина меристемы (мкм) после 24 ч 1712 ±82 1647 ±73 1659 ±52

Длина зоны растяжения (мкм) после 24 ч 6412 ± 351 5994 ±519 7184 ±271

Цист. / кМер. (24 ч.) 3,8 ± 0,3 3,8 ±0,2 3,4 ± 0,2

ФК (10 М) повышал скорости роста корней за счёт увеличения длины закончивших рост клеток, и не влиял на число закончивших рост клеток в ряду, следовательно, не влиял на переход клеток к растяжению (Табл. № 1). Кроме этого, ФК (10"6 М) не влиял на длину зоны растяжения и длину меристемы. После действия ФК скачок относительной скорости роста (переход клеток к растяжению) был на том же расстоянии от кончика корня, как и в контроле. Соотношение относительных скоростей роста клеток после перехода к

растяжению и меристеме не изменялось под действием ФК (Табл. № 1). Таким образом, впервые проведённый клеточный анализ действия ФК на рост корней показал, что ФК не влиял на скорость растяжения клеток в корнях. Стимулирующее действие ФК на рост корня объясняется только повышением длины закончивших рост клеток.

Опыты по изучению влияния ДЭС на рост корней были поставлены в чашках и сосудах. ДЭС (10'5 М) не влиял достоверно на скорости роста корней в обоих вариантах опытов. В чашках Петри ингибирующий эффект ДЭС (10"4 М) на скорость роста корней проявлялся с первых моментов инкубации, и снижался со временем. После 4 часов обработки ДЭС (10"4 М) ингибировал скорость роста корней на 29%, а после 24 часов только 16% относительно контроля. В чашках, на вторые сутки инкубации (24-48 ч) ДЭС не влиял на скорости роста корней. При одинаковых концентрациях ДЭС, ингибирование роста корней при выращивании растений в сосудах было значительно большим, по сравнению с таковым, наблюдаемым в чашках Петри. Вероятно, это связанно с более интенсивным поступлением ингибитора в ткани корня при выращивании растений в сосудах. Снижение скорости роста корней в сосудах с ДЭС (10"4 М) проявлялось с первых моментов инкубации. Максимальный эффект ДЭС на рост корней был в первые часы и затем незначительно снижался. После 24 часов инкубации ДЭС (10"4 М) не оказывал достоверного влияния на рост корней.

В чашках ДЭС (10"4 М) приводил к снижению скорости роста корней за счёт уменьшения длины закончивших рост клеток на 16% и не влиял на число закончивших рост клеток в ряду по сравнению с контролем. Следует отметить некоторое снижение длины зоны растяжения корней в среде с 10"4 М ДЭС. Изменение числа закончивших рост клеток в ряду за первые сутки инкубации обычно рассматривается как влияние на переход клеток к растяжению. Даже значительное подавление процессов деления в меристеме не приводит к снижению скорости роста корня в первые сутки инкубации. Подавление процессов размножения клеток в меристеме обычно снижает скорость роста корней на вторые-третьи сутки, так как к растяжению начинает переходить меньше клеток.. Однако на вторые сутки инкубации (24-48 ч) в чашках, ДЭС не

влиял на скорость роста корней, длину закончивших рост клеток и число закончивших рост клеток в ряду. Отсутствие ингибирующего эффекта 10"4 М ДЭС на рост корней в чашках на вторые сутки инкубации (24-48 ч) означает, что ДЭС не оказывает достоверного влияния на процессы деления клеток в меристеме и переход клеток к растяжению и на вторые сутки не влияет на длину заканчивающих растяжение клеток..

В сосудах ДЭС (1СГ4 М) снижал скорость роста корней за счет уменьшения длины закончивших рост клеток и снижения числа закончивших рост клеток в ряду (Табл. № 2). ДЭС (10"4 М) вызывал снижение размеров растущей части корней. В сосудах усиления во времени ингибирующего действия ДЭС на скорость роста корней, длину закончивших рост клеток, число закончивших рост клеток в ряду не происходило. На вторые сутки инкубации (24 - 48 ч.) ДЭС (10"4 М) не имел достоверного влияния на длину меристем корней (Табл. № 2).

Таблица № 2 Анализ действия ДЕС на рост корней в сосудах.

контроль 10-5 М ДЭС 10-4 М ДЭС

Прирост корня (мм) за 24 ч 32,0 ± 1,3 34,5 ± 2,3 10,4 ± 0,9

Длина закончивших рост клеток коры (мкм) после 24 ч 177 ± 2,4 181 ± 10,0 118 ±4,0

Число клеток коры, закончивших рост в ряду за 24 ч. 181 ±5 191 ±11 88 ± 5

Длина меристемы (мкм) после 24 ч 1518±44 - 1219 ±86

Длина зоны растяжения (мкм) после 24 ч 5642 ±457 - 3611 ±354

краст. / кмер. (после 24 ч). 5,4 ± 0,8 - 4,0 ±0,5

Прирост (мм) за 24 - 48 ч 49,2 ±3,6 43,9 ± 0,6 15,1 ±2,3

Длина закончивших рост клеток коры (мкм) в приросте за 24-48 ч 202 ± 8,5 208 ± 5,7 130 ±2,0

Число клеток коры, закончивших рост в ряду за 24 -48 ч. 242 ±9 211 ± 3 117 ± 19

Длина меристемы (мкм) после 24 -48 ч 1372 ± 64 - 1077 ± 42

Длина зоны растяжения (мкм) после 24-48 ч. 6400 ±442 - 4070 ±272

Уменьшение числа закончивших рост клеток под влиянием ДЭС при

незначительном уменьшении числа клеток в меристеме и незначительном изменении числа растягивающихся клеток свидетельствует о том, что ДЭС тормозит переход клеток корня к растяжению, удлиняя время жизни клеток в меристеме. При действии различных цитостатиков, избирательно подавляющих деление клеток (Иванов 1979; 1уапоу, 1994), было показано, что все они

15

уменьшают число клеток в меристеме и это приводит к сокращению размеров меристемы. В отличие от этих ингибиторов, избирательно действующих на деление, ДЭС ингибирует деление клеток, почти не вызывая сокращения меристемы. Следовательно, ДЭС удлинял время жизни клеток в меристеме. Надо отметить, что это первый описанный в литературе случай, когда вещество обладает таким действием. Однако интересно, что замедляя переход клеток к растяжению, ДЭС не влиял на то, на сколько увеличивается относительная скорость роста при переходе клеток к растяжению (Табл. № 2).

Снижение скорости роста корней в средах с №3У04 (10"4 - 10"3 М) происходило с первых часов инкубации. Ингибирование незначительно изменялось во времени, как и в опытах с ДЭС. Ка3У04 (Ю-4 М) снижал скорость роста корней за счет влияния на длину закончивших рост клеток. ЫазУ04 (10"3 М) влиял на длину закончивших рост клеток и число закончивших рост клеток в ряду (Табл. № 3).

Таблица № 3 Анализ действия ортованадата на рост корней.

контроль 10"4 М N33V04 10-3 м Na3V04

Прирост корня (мм) за 24 ч. 35,1 ±2,0 30,8 ±1,9 21,7 ±1,4

Длина закончивших рост клеток коры (мкм) после 24 ч. 191 ±7,7 170 ±7,0 156 ±7,3

Число клеток коры, закончивших рост в ряду за 24 ч. 184 ±7 181 ± 4 138 ±4

Длина меристемы (мкм) после 24 ч. 1496 ± 102 - 1948 ±112

Длина зоны растяжения (мкм) после 24 ч. 5231 ±209 - 4077±180

краст.! ''мер. (24 ч.) 4,0 ± 0,28 - 5,15 ±1,37

Снижение числа закончивших рост клеток в ряду и отсутствие изменений в

длине меристемы, означает, что ЫазУ04 (10"3 М) не только подавлял деление клеток, но и замедлял переход клеток к растяжению за счет увеличения времени жизни клеток в меристеме. Механизмы действия ДЭС и Ма3У04 на рост корней очень похожи, оба вещества кроме подавления делений клеток ещё и увеличивают время жизни клеток в меристеме. Так же следует отметить, что орто-ванадат не влиял на скачок относительной скорости роста клеток при переходе к растяжению (Табл. № 3). И в обработанных и в контрольных корнях

резкое повышение относительной скорости роста происходило на одинаковом расстоянии от кончика.

Незначительные концентрации ДЭС, Ыа3У04, ФК, не влияющие на другие параметры роста, вызывали изменения в длине закончивших рост клеток, совпадающие с изменениями в скоростях роста корней Обработка ДЭС, ЫазУ04, ФК почти не влияла на длину меристемы и зоны растяжения в корнях. Только высокие концентрации ингибиторов (10"3 М Ма3\Ю4 и 10"4 М ДЭС в сосудах) приводили к значительному достоверному уменьшению длин зон растяжения корней и снижению числа закончивших рост клеток в ряду за счёт замедления перехода клеток к растяжению. Таким образом, в корнях ингибиторы Н^-АТФазы не только подавляли деление клеток, но также увеличивали время жизни клеток в меристеме.

Следует отметить, что скачок относительной скорости роста при переходе клеток к растяжению не изменялся под действием стимулятора или ингибиторов Н^-АТФазы, следовательно, не зависел от процесса выделения протонов. Даже почти при полном прекращении выделения протонов (10ч М ДЭС) и значительном снижении скорости роста корней, подавлении делений и замедлении выхода клеток из меристемы, снижении длины закончивших рост клеток, переход клеток к росту растяжением сопровождался резким повышением относительной скорости роста клеток.

С другой стороны, между скоростью роста корня и скоростью выделения протонов наиболее быстрорастущим участком корня (1600 -2400 мкм от кончика) существует высокая положительная корреляция (г = 0.98). Высокая корреляция между скоростью роста корня и скоростью выделения протонов, а так же совпадение самого быстрорастущего участка корня с областью наибольшей скорости выделения протонов означают, что растяжение клеток в корне происходит по типу "кислого роста" и подкисление клеточных стенок является одним из необходимых условий для роста клеток растяжением.

Изменение доли 14-3-3 белков во фракции плазматических мембран клеток растущей части корня. Наши опыты показали, что в зоне растяжения резко активируется выделение протонов корнями и это связано с работой Н^-АТФазы. Однако иммуногистохимические данные (Раге1Б-8о1ег е1 а1., 1990;

Stenz et al., 1993) показывают, что увеличения содержания этого фермента

области быстрого растяжения не наблюдается. Следовательно, усиление

активности выделения протонов определяется не увеличением количества

фермента, а его активацией. Один из возможных механизмов регуляции

активности Н*-АТФазы происходит с участием 14-3-3 белков (Jahn et al., 1997;

Oecking and Hagemann, 1999; Svennelid et al., 1999; Jelich-Ottmann et al., 2001).

Чтобы выяснить наличие такой регуляции в корне, в работе было исследовано

изменение содержания этих белков вдоль корня. Определение 14-3-3 белков в

выделенной фракции плазматических мембран проводили методом

иммунохимии. В предварительных опытюс было показано, что полученные

антитела к 14-3-3 белкам обладают высокой специфичностью к последним.

При иммуноблотинге они присоединялись к белкам с предполагаемой

молекулярной массой, равной 29-31 кДа, которой обладают 14-3-3 белки (De

Boer, 1997). Вдоль корня доля 14-3-3 белков во фракции плазматических

растяжению. Во 20М

и Зем участках

корня по 800 мкм,

доля 14-3-3 белков

увеличилась

соответственно в

4 и 10 раз, по

сравнению с 1™

участком (Рис. 3).

В дальнейшем,

увеличение доли

14-3-3 белков

происходило в

быстрорастущем Рис. 3. Доля 14-3-белков во фракции плазмалеммы

клеток вдоль растущей части корня. регионе корня

(область зоны растяжения, соответствующая - 5"®' " участкам).

Максимальная доля 14-3-3 белков наблюдалась в области корня, соответствующей 3200-4800 мкм от кончика (5ЫЙ-60Й участки), например, доля

мембран постепенно увеличивалась при переходе клеток к Доля 14-3-3 белков

60 Судл- вдО

0-800 800- 1600- 2400- 3200- 4000- 4800- 56001600 2400 3200 4000 4800 5600 6400 Расстояние от кончика корня (мкм)

14-3-3 белков в 6™ участке корней (4000-4800 мкм) в 50 раз больше относительно доли 14-3-3 белков в самом апикальном участке корня. В следующих, более базальных участках корня наблюдалось снижение доли 14-33 белков во фракции мембран плазмалеммы (Рис. 3). Участки корня, отличающиеся высокой долей 14-3-3 белков в обычных условиях демонстрируют высокую скорость выделения протонов (Рис. 4). Так, участок корня, включающий в себя корневой чехлик и апикальную часть меристемы обычно подщелачивает окружающую среду и отличается наименьшей долей 14-3-3 белков. Последующие участки корней показали высокие скорости выделения протонов и характеризуются высокой долей 14-3-3 белков по сравнению с первым апикальным участком корня (Рис. 4). Наблюдаемое в базальных участках снижение доли 14-3-3 белков, совпадает с уменьшением скорости выделения протонов и замедлением роста клеток растяжением (Рис. 4). Таким образом, при переходе клеток к растяжению содержание 14-3-3 белков во фракции плазматических мембран увеличивается, и это коррелирует

с повышением скорости секреции протонов, хотя максимумы содержания 143-3 белков и скорости выделения протонов достигаются на разном расстоянии от

Рис. 4. Доля 14-3-3 белков и скорость выделения кончика корня, протонов вдоль растущей части корня. Это позволяет

предположить, что в корнях, как и в других объектах (De Boer, 1997; Jahn et al.,

1997; Olivan et al., 2000) регуляция работы НГ-АТФазы происходит при

помощи 14-3-3 белков.

Скорость выделения протонов (нмоль/г.*мин) 25

Доля 14-3-3 белков (усл. ед.) ео

Расстояние от кончика корня (мкм)

50 40 30 20 10

0-800 800- 1600- 2400- 3200- 4000- 4800- 56001600 2400 3200 4000 4800 5600 6400 - скорость выделения протонов —♦— количество 14-3-3 белков

Влияние рН среды на рост корней. Был изучен рост корней при рН 3,9; 4,3; 6,5 и 8,3. Предварительно было установлено наименьшее значение рН, равное 3,5, при котором полностью останавливается рост корней кукурузы. Корни, инкубированные при рН=3,2 - 3,5 прекращали рост и уже через 4 часа размягчались. После 12-24 часов инкубации в среде с рН=3,5 зона растяжения корней кукурузы становилась тоньше, приобретала бурую окраску и появлялись некрозы, выявляемые по окрашиваемости нефиксированных корней проционовым ярко-голубым RS, который не окрашивает живые корни.

Скорость роста корней в буферных растворах изменялась с первых часов инкубации. При рН 3,9 и 4,3 наблюдалась незначительная стимуляция скорости роста корней, тогда как при рН=8,3 скорость роста корней заметно снижалась относительно контроля (корни, растущие в среде с рН=6,5) (Табл. № 4). Аналогичные результаты были описаны в литературе для корней кукурузы (Marschner et al., 1966, Moloney et al., 1981 Yan et al., 1992; Yan et al., 1998, Walter et al., 2000). Ингибирование роста корней кукурузы при рН=8,3 вообще не описывалось в литературе.

Наибольшее влияние рН среды оказывает на число закончивших рост клеток в ряду (Табл. № 4). Ингибирование роста при рН 8,3 объясняется снижением числа закончивших рост клеток в ряду относительно контроля. Наблюдалось очень слабое влияние значений рН среды на длину закончивших рост клеток, причём размер завершивших растяжение клеток не уменьшается с повышением рН среды, не смотря на значительное подавление роста корней при рН=8,3 (Табл. № 4).

Длина меристем корней при рН=8,3 почти не менялась, по сравнению с рН=6,5. При рН 8,3 после 12-24 часов инкубации происходит уменьшение длины зоны растяжения. Замедление роста корней в среде с рН=8,3 объясняется снижением числа закончивших рост клеток в ряду относительно контроля (рН=6,5). Усиления во времени (по результатам инкубации за первые и вторые сутки) ингибирующего действия рН=8,3 на скорость роста корней и число закончивших рост клеток в ряду не происходило. Следовательно, уменьшение числа закончивших рост клеток в ряду при рН=8,3 это результат замедления перехода клеток к растяжению, и подавления размножения клеток

в меристеме. Данное замедление перехода клеток к растяжению в основном вызвано увеличением времени жизни клеток в меристеме, так как при рН 8,3 длина меристемы почти не меняется. При рН 3,9; 4,2; 6,5 и 8,3 отношение скоростей роста клеток после перехода клеток к растяжению и в меристеме не изменялось (Табл. 4). Следовательно, скачок относительной скорости роста клеток оставался без изменений и происходил примерно на одинаковом расстоянии от кончика корня во всех изученных вариантах.

рН=3,9 рН=4,3 рН=6,5 рН=8,3

Прирост корня (мм) за 24 ч. 28,9 ± 2,5 31,9± 1,4 26,1 ±2,5 13,7 ±2,2

Длина закончивших рост клеток (мкм) коры после 24 ч. 171 ±9 177 ±5 178 ±8 186 ±10

Число клеток коры, закончивших рост в ряду за 24 ч. 167 ±8 180 ±4 147 ± 13 75 ±15

Длина меристемы (мкм) после 24 ч. 1829±107 1794 ±86 1773 ± 84 1511± 103

Длина зоны растяжения (мкм) после 24 ч. 6283 ± 526 - 5916 ±306 4975± 184

краст.! ^мео. (24 ч.) 4,4 ±0,7 4,8 ±0,6 6,2 ± 0,8 4,4 ± 1,0

Прирост (мм) за 24 - 48 ч. - - 42,7 ± 7,2 46,5 ± 0,35

Длина закончивших рост клеток (мкм) коры в приросте за 24-48 ч. - - 196 ±3 212±3

Число клеток коры, закончивших рост в ряду за 24 -48 ч. - - 218 ± 10 219 ±13

Обычно стимуляция скорости роста растительных тканей при инкубации в средах с низкими значениями pH "эффект кислого роста" имеет небольшую продолжительность (до 3 часов) (Edwards and Scott, 1974; Winch and Pritchard, 1999), причем большая часть данных о проявлении "эффекта кислого роста" получена на сегментах надземных органов растений. Диапазон значений pH, используемых в работе предполагает существование эффекта кислого роста, так как пороговые значения pH для промотирования скорости роста сегментов корней кукурузы равны рН=6,4 в цитрат-фосфатном буфере и рН=5,2 в небуферном растворе (Edwards and Scott, 1974). Незначительные различия в величине прироста корней, инкубируемых при разных значениях pH выявлялись уже через 4 часа. Возможным подтверждением существования эффекта кислого роста в корнях, растущих при рН=3,9-4,3 является отмеченное

в работе уже через 4 часа инкубации увеличение мягкости и гибкости растущей части корней. Подходящим объяснением этого явления может бьггь размягчение и набухание материалов клеточных стенок в кислой среде с низким значением pH. В работе первое измерение прироста корней проводилось через 4 часа после начала после инкубации в буферных растворах. За это время повышение скорости роста корней в результате "эффекта кислого роста" может прекратиться, так как продолжительность предполагаемого повышения скорости роста значительно меньше 4 часов (Edwards and Scott, 1974; Winch and Pritchard, 1999). Измерение прироста главных корней через более короткие периоды экспозиции в буферных растворах не позволяет выбранным способом получить достоверные результаты. Результаты клеточного анализа роста корней в средах с различными значениями pH показывают высокую зависимость роста корней в данных условиях от числа закончивших рост клеток в ряду и слабую взаимосвязь между скоростью роста корня и длиной закончивших рост клеток. Значительной снижение скорости роста корней при рН=8,3 является результатом резкого уменьшения числа закончивших рост клеток в ряду, в основном за счёт замедления перехода клеток к растяжению и увеличения времени жизни клеток в меристеме. Повышение скорости роста корней при рН=3,9 и 4,2 объясняется за счёт большого числа растягивающихся клеток. Повышение скорости растяжения клеток при рН=3,9-4,3 вероятно связано с размягчением материала клеточных и увеличения способности клеточных стенок к пластическому и эластическому растяжению (Rayle and Cleland, 1970). Если придерживаться общепринятой схемы, то в щелочной среде (рН=8.3) способность клеточных стенок к растяжению меньше и растяжение клеток происходит со значительно меньшей скоростью по сравнению с кислыми средами. Данной схемы придерживается большинство исследователей, кроме немногих считающих, что пластичность и эластичность клеточных стенок при высоких концентрациях протонов снижаются (Ктиторова и Скобелева, 1999). Возможно, инкубация корней в буферных растворах может приводить к незначительному изменению значений pH апопласта (Felle, 1998; Peters and Felle 1999) и к изменению свойств клеточных стенок (Rayle and Cleland, 1970; Rayle and Cleland, 1992; Ктиторова

I

I

и Скобелева, 1999). Предполагаемые изменения не оказывают влияния на резкий скачок относительной скорости роста клеток при переходе к растяжению. Вероятно, происходящее при переходе клеток к растяжению повышение относительной скорости роста отличается повышенной устойчивостью к внешним факторам и регулируется независимо от других процессов, составляющих рост корня.

ВЫВОДЫ.

и 1. Во время роста клеток растяжением происходит подкйсление их

клеточных стенок за счёт выделения протонов. Между процессом выделения протонов клетками растущей части корня и скоростью роста корня показана

' высокая положительная корреляция.

2. Подкисление окружающей среды во время быстрого роста клеток происходит за счет интенсивной работы КГ-АТФазы по выделению протонов, что было показано при действии фузикокцина и диэтилстильбестрола на скорости выделения протонов растущей частью корня.

3. Повышение скорости выделения протонов после перехода клеток к растяжению совпадает с увеличением доли 14-3-3 белков во фракции плазмалеммы клеток в растущей части корня, что подтверждает участие 14-3-3

. белков в регуляции активности НГ-АТФазы.

4. При инкубации корней в буферных растворах при рН 3,9; 4,3, 6,5 и 8,3 скачок относительной скорости роста клеток при переходе к растяжению не менялся и происходил на одном и том же расстоянии от кончика корня.

5. Стимуляция секреции протонов фузикокцином приводила к повышению скорости роста корней за счёт увеличения длины закончивших рост клеток, не влияя на наличие и положение скачка относительной скорости роста клеток, а так же на число закончивших рост клеток в ряду, переход клеток к растяжению, длину растущей части корня.

6. Подавление секреции протонов орто-ванадатом и диэтилстильбестролом замедляло скорость роста корней за счёт снижения числа закончивших рост клеток в ряду и уменьшения длины закончивших рост клеток, а так же, удлинения времени жизни клеток в меристеме и замедления перехода клеток к

растяжению. Диэтилстильбестрол и орто-ванадат не влияли на степень ускорения роста клеток при переходе их к растяжению.

7. Выдвинуто предположение, что скачок относительной скорости роста при переходе клеток к растяжению не зависит от скорости выделения протонов, тогда как дальнейшее растяжение клеток происходит по типу "кислого роста" и обусловлено выделением протонов. Повышение скорости выделения протонов после перехода клеток к растяжению является результатом активации Н^-АТФазы, в регуляции активности которой принимают участие 14-3-3 белки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Месенко М.М. Роль кислого роста в регуляции растяжения клеток корня. // Материалы VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, Санкт-Петербург, 2000, с. 135.

2. Месенко М.М. Механизм влияния pH на рост корней кукурузы. // Материалы Международной конференции "АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ В XXI ВЕКЕ", Сыктывкар, 2001, с. 282-283.

3. Mesenco М.М. THE SPECIFIC "ACID GROWTH" IN ROOTS AND ROOT REACTION ON SOME STRESS FACTORS. // International Symposium "PLANT UNDER ENVIRONMENTAL STRESS", abstracts, Moscow, 2001, P.189.

4. Месенко М.М. Влияние некоторых стрессовых условий на процессы, составляющие рост корней. // Материалы Международной научной конференции "Биологические ресурсы и устойчивое развитие", Пушино, 2001, с. 157.

5. Месенко М.М. РОЛЬ Н^-АТФазы В РЕГУЛЯЦИИ РОСТА КЛЕТОК КОРНЯ. Материалы V Съезда ОФРР, Пенза, 2003, с. 413-414.

6. Шанько A.B., Месенко М.М., Клычников О.И., Носов A.B., Иванов В.Б. Активность протонной помпы в растущей части корня кукурузы: корреляция с 14-3-3 белками и изменения при осмотическом стрессе. // Биохимия. 2003. т. 68. № 12:1639-1647.

í

»

f

Гарнитура Times. Формат 60V90/16. Бумага офсетная 80 г. Печать офсетная. Уч .-изд. л 1,0 Усл.печ.л 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового Оригинал-макета в ООО "Знаменка".

p 17 283

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Месенко, Михаил Михайлович

I. Список принятых сокращений.

И. Общая характеристика работы.

III. Обзор литературы:

1. Особенности роста растительных клеток.

2. Строение растущей части корня.

3. Переход клеток корней к растяжению

4. Теория "кислогороста".

5. Значение ИУК для роста корней.

6. Возможная взаимосвязь между тургорным давлением и процессом растяжения клеток.

7. Изменение свойств клеточных стенок и процесс растяжения клеток.

8. Влияние рН среды на скорость роста растительной ткани

9. Влияние растущих корней на значения рН среды.

10. Значение выделения протонов для роста клеток растяжением.

11. Влияние стимуляторов и ингибиторов Н+-АТФазы на рост корней.

12. Распределение фермента Н -АТФазы в растущей части корней.

13. Характеристика Н+-АТФазы. Регуляция Н+-АТФазы с помощью 14-3-3 белков.

IV. Объекты и методы исследования.

V. Результаты.

VI. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Зависимость между выделением протонов клетками корня и ростом"

Актуальность темы исследования Изучение роста отдельного органа растения базируется на изучении роста его клеток. Для этой цели наилучшей моделью является рост корня. Растущая часть корня состоит из меристемы и зоны растяжения. На границе меристемы относительная скорость роста резко возрастает на протяжении короткого участка корня (Иванов, 1974, Ivanov, 1997; Beemster and Baskin, 1998; Иванов и Максимов, 1999; van der Welle, 2003). Возрастание скорости роста связано с изменением характера роста клеток - образованием в клетках большой центральной вакуоли, активацией метаболизма клеток, изменением набора синтезируемых ферментов, повышением пластичности клеточных стенок. Переход клеток к растяжению не зависит от прекращения делений (Ivanov, 1997).Механизм резкого возрастания скорости роста при переходе к растяжению до сих пор неясен. В частности, неясно, какую роль играют при этом ауксины. На колеоптилях было показано, что ИУК через короткий промежуток времени вызывает возрастание скорости роста, сопровождающееся усилением секреции протонов клетками и подкислением апопласта (Полевой, 1982). Низкие величины рН также ускоряют рост клеток, что и лежит в основе так называемого "кислого роста". Ускорение начала растяжения клеток под действием ИУК объясняют увеличением растяжимости клеточных стенок в результате подкисления апопласта (Rayle and Cleland, 1992).Однако, неясно, в какой мере эти процессы характерны для роста клеток корня.Известно, что растягивающиеся клетки корней растут с гораздо большей относительной скоростью, чем растягивающиеся клетки других органов. Кроме того, ИУК только незначительно стимулирует рост корней и при гораздо меньших концентрациях, чем те, которые стимулируют рост колеоптилей и гипокотилей (Burstrom, 1969; Pilet and Saugy, 1987; Spiroetal., 2002), Выделение протонов происходит в результате работы Н'-АТФазы (Briskin, 1990; Palmgren, 1998; Morsomme and Boutry, 2000). В происходящем под действием ИУК подкислении апопласта ключевая роль так же отводится повышению активности Н АТФазы (Rayle and Cleland, 1970; Rayle and Cleland, 1992; Polevoi et al., 1996).Данные иммуноцитохимии показывают равномерное распределение белка Н АТФазы вдоль оси растущей части корня (Parets-Soler et al. 1990; Stenz et al., 1993, Jahn et al., 1998), хотя содержание его в разных тканях отличается. Однако показано усиление секреции протонов в растягивающихся клетках корней (Felle, 1998; Peters and Felle, 1999, 2001;). Это позволяет предполагать существование механизмов активации работы Н^АТФазы при переходе клеток к растяжению.Один из механизмов активации работы Н^-АТФазы связан с участием 14-3-3 белков гидрофильных, консервативных регуляторных белков, широко распространённых в клетках животных и растений (Aitken, 1996). Белки 14-3-3 имеют специфический участок, ответственный за взаимодействие с С-концевым доменом Н^-АТФазы. При фосфорилировании Н"-АТФазы димер белка 14-3-3 взаимодействует с ферментом и активирует его (Oecking and Hagemann, 1999; Jahn et al., 1997, Svennelid et al., 1999; JelichOttmannet al., 2001).Несмотря на очевидную взаимосвязь между процессом роста корня и скоростью выделения протонов растущим корнем, до последнего времени не изучено, какую роль играет секреция протонов при росте клеток корней и как меняется содержание 14-3-3 белков, возможных регуляторов Н^-АТРазы, в растущих клетках корней.Изучение этой проблемы актуально для понимания механизма ускорения роста при переходе клеток корней к растяжению.Цели и задачи исследования. Основной целью работы было выяснить: каким образом процесс перехода клеток к растяжению и сам рост растяжением зависят от интенсивности вьщеления прогонов, и в какой мере изменение интенсивности вьщеления прсггонов в ходе роста клеток связано с активностью 1Т-АТФазы.Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи исследования: 1. Изучить скорости выделения протонов вдоль растущей части корня и при обработке стимулятором и ингибиторами Н^-АТФазы.2. Изучить распределение 14-3-3 белков в кончике корня.3. Выяснить возможную взаимосвязь между долей 14-3-3 белков во фракции плазматических мембран клеток вдоль растущей части корня и скоростью выделения протонов по длине корня.4. Изучить влияние обработки стимулятором и ингибиторами Н^-АТФазы на скорость роста корня в целом и процессы, составляющие рост корня.5. Изучить влияние рН среды на скорость роста корня в целом и процессы, составляющие рост корня.Научная новизна работы. Впервые был проведён клеточный анализ роста корней кукурузы при инкубации интактных проростков в буферных растворах с диапазоном рН (3,5-8,3) и при обработке веществами, изменяющими активность Н^-АТФазы (ингибиторов - диэтилстильбестрола (ДЭС) и орто-ванадата натрия и стимулятора фузикокцина (ФК)). Было показано, что стимуляция и ингибирование выделения протонов не влияют на резкое повышение относительной скорости роста клеток при переходе к растяжению, хотя дальнейшее растяжение клеток в корнях происходит по типу "кислого роста". Впервые было изучено распределение 14-3-3 белков по длине корня, и показано, что ускорение роста во время растяжения сопровождается повышением скорости выделения протонов, совпадающим с увеличением доли 14-3-3 белков в плазмалеммной фракции клеток растущей части корня, что указывает на возможное участие 14-3-3 белков в регуляции активности Н^-АТФазы. Впервые показано, что ингибиторы Н^-АТФазы и щелочные значения рН удлиняли время жизни клеток в меристеме В ранее проводившихся исследованиях не были найдены соединения среди цитостатиков, ингибиторов синтеза белка и нуклеиновых кислот, соединений с общетоксичным механизмом действия, которые удлиняли бы время жизни клеток в меристеме. Впервые на интактных корнях изучено, как зависит рост растяжением от выделения протонов корнями. Доказана роль Н^-АТФазы в выделении протонов растущими клетками корней и впервые установлена на корнях роль 14-3-3 белков в регуляции этого фермента в ходе роста клеток.Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные имеют значение для понимания регуляции роста корня и установлении общих и частных закономерностей организации роста разных органов растения. Разработанные методики и подходы могут использоваться для анализа действия разных факторов на рост корней и скрининге новых физиологически активных веществ.Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, (Санкт-Петербург, 15-19 мая, 2000), на Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке", (Сыктывкар, 1-6 октября, 2001), на международном симпозиуме "Растение в условиях экологического стресса" (Москва, 23-28 октября, 2001), на Международной научной конференции "Биологические ресурсы и устойчивое развитие" (Пущино, 29 октября-2 ноября, 2001), на V Съезде ОФР, (Пенза, 15-21 сентября, 2003) и на семинарах лаборатории физиологии корня ИФР РАН. Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.Структура и объём диссертации. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 128 источника, из них 76 на иностранных языках.Проведенные в диссертации исследования были поддержаны Российским Фондом Фундаментальных Исследований (проекты № 00-04-48434 и 03-04-48578).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Месенко, Михаил Михайлович

Результаты проведенной работы подтвердили существование вдоль растущей части корня участков с разной скоростью секреции протонов. Результаты измерения скорости выделения протонов кончиками корней после обработки ФК и ДЭС (стимулятором и ингибитором Н^-АТФазы ) позволяют утверждать, что Н^-АТФаза играет ключевую роль в секреции протонов клетками растущей части корня.Изучение доли 14-3-3 белков во фракции плазматических мембран клеток вдоль растущей части корня показало увеличение количества 14-3-3 белков в месте перехода клеток к растяжению и их высокое содержание в наиболее быстрорастущем участке зоны растяжения. Полученные данные подтверждают возможность регуляции активности Н"^ -

АТФазы с помощью 14-3-3 белков, на корнях данный результат получен впервые.Изучение влияния стимулятора и ингибиторов Н^-АТФазы на скорость роста корней и на скорость выделения протонов наиболее быстрорастущими участками зоны растяжения показало высокую положительную корреляцию между скоростью роста корней и скоростью выделения протонов. Несмотря на очевидную взаимосвязь между скоростью выделения протонов растущей частью корня и скоростью роста корня, резкое повышение относительной скорости роста клеток при переходе к растяжению не зависело от процесса секреции протонов. На границе меристемы и зоны растяжения относительная скорость роста клеток увеличивалась в 3,5-4,5 раз, независимо от скорости выделения протонов и скорости роста корня.Снижение скорости роста корней при рН=8,3, а так же после обработки корней орто ванадатом и ДЭС происходило за счет увеличения времени жизни клеток в меристеме и замедления перехода клеток к растяжению.В целом, результаты представленной работы показывают независимость резкого повышения относительной скорости роста при переходе клеток к растяжению от секреции протонов, необходимость подкисления клеточных стенок во время быстрого роста клеток растяжением, ключевую роль Н^-АТФазы в процессе подкисления клеточных стенок растягивающихся клеток и участие 14-3-3 белков в регуляции активности Н^-АТФазы в растущей части корня.VIII. выводы.1. Во время роста клеток растяжением происходит подкисление их клеточных стенок за счёт выделения протонов. Между процессом выделения протонов клетками растущей части корня и скоростью роста корня показана высокая положительная корреляция.2. Подкисление окружающей среды во время быстрого роста клеток происходит за счет интенсивной работы Н^-АТФазы по выделению протонов, что было показано при действии фузикокцина и диэтилстильбестрола на скорости выделения протонов растущей частью корня.3. Повышение скорости выделения протонов после перехода клеток к растяжению совпадает с увеличением доли 14-3-3 белков во фракции плазмалеммы клеток в растущей части корня, что подтверждает участие 14-3-3 белков в регуляции активности НГ-АТФазы.4. При инкубации корней в буферных растворах при рН 3,9; 4,3, 6,5 и 8,3 скачок относительной скорости роста клеток при переходе к растяжению не менялся и происходил на одном и том же расстоянии от кончика корня.5. Стимуляция секреции протонов фузикокцином приводила к повышению скорости роста корней за счёт увеличения длины закончивших рост клеток, не влияя на наличие и положение скачка относительной скорости роста клеток, а так же на число закончивших рост клеток в ряду, переход клеток к растяжению, длину растущей части корня.6. Подавление секреции протонов орто-ванадатом и диэтилстильбестролом замедляло скорость роста корней за счёт снижения числа закончивших рост клеток в ряду и уменьшения длины закончивших рост клеток, а так же, удлинения времени жизни клеток в меристеме и замедления перехода клеток к растяжению. Диэтилстильбестрол и орто ванадат не влияли на степень ускорения роста клеток при переходе их к растяжению.7. Выдвинуто предположение, что скачок относительной скорости роста при переходе клеток к растяжению не зависит от скорости выделения протонов, тогда как дальнейшее растяжение клеток происходит по типу "кислого роста" и обусловлено выделением протонов. Повышение скорости выделения протонов после перехода клеток к растяжению является результатом активации Н^-АТФазы, в регуляции активности которой принимают участие 14-3-3 белки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Месенко, Михаил Михайлович, Москва

1. Балодис В.А. Некоторые закономерности распределения митозов в кончике корня. // Цитология. 1968. Т. 10. 1374.

2. Балодис В.А., Иванов В.Б. Изучение размножения клеток в корнях при переходе от меристемы к зоне размножениея. //Цитология. 1970. Т. 12. 983-992.

3. Вахмистров Д.Б. "Пространственная организация ионного транспорта в корне. XLIX Тимирязевское чтение". М., "Наука ", 1991, 48 с.

4. Вахмистров Д.Б., О Эн До. Переходный процесс при индукции протонного насоса корневых клеток. //Физиология растений. 1993. Т. 40. № 1. 100-105.

5. Воробьев Л.Н., Магеррамов М.Г., Бабаков А.В., Муромцев Г.С. Действие фузикокцина на проводимость и мембранный потенциал клеток Nitellopsis obtusa // Физиология растений. 1987. Т. 34, вып.2. 342-349.

6. Демченко Н.П. Последовательность перехода к митозу сестринских клеток в корне пшеницы и различие их по продолжительности митотических циклов. // Ботанический журнал. 1975. Т. 60. № 2. 188-198.

7. Иванов В.Б. Клеточный анализ кривых роста корней при различных воздействиях. // Физиология растений. 1970. Т. 17. № 9. 348-357.

8. Иванов В.Б. "Рост и размножение клеток в корне " в " Физиология растений ", Т. 1, "Физиология корня ", Итоги науки и техники ВРШИТИ АН СССР, М., 1973. 216 с.

9. Иванов В.Б. "Клеточные основы роста растений"; М., "Наука ", 1974, 222 с.

10. Иванов В.Б. Проблема стволовых клеток у растений. Онтогенез. 2003. Т. 34. № 4. 253-261.

11. Иванов В.Б. "Пролиферация клеток в растениях"; М., ВИНИТИ, 1987, 221 с.

12. Иванов В.Б., Максимов В.Н. Изменение относительной скорости роста клеток корня на протяжении меристемы и начала зоны растяжения. // Физиология растений. 1999. Т. 46. № I .e . 87-97.

13. Кларксон Д. "Транспорт ионов и структура растительной клетки"; М., "Мир", 1978, 368 с.

14. Колосов И.И. "Поглотительная деятельность корневых систем растений "; М., Изд-во Академии Наук СССР, 1962, 387 с.

15. Ктиторова И.Н., Скобелева О.В. Изменение упругих свойств клеточных стенок и некоторых параметров водного обмена растений при закислении среды, // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 2. 239-245.

16. Медведев С. "Электрофизиология растений ", СПб., Изд-во -Петербург, ун-та, 1998,184 с.

17. Медведев С, Батов А.Ю., Мошков А.В., Маркова ИВ. Роль ионных каналов в транчдукции ауксинового канала. // Физиология растений. 1999. Т.46. № 5. 711 -717.

18. Месенко М.М. Механизм влияния рН на рост корней кукурузы. // Материалы Международной конференции "АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ В XXI ВЕКЕ", Сыктывкар, 2001, С 282-283

19. Муромцев Г.С. Фузикокцин-новый фитогормон? // Физиология растений. 1996. Т.43. №3.0.478-492.

20. ОбручеваН.В. "Физиологиярастущих клеток корня", М,"Наука", 1965, 111с.

21. Обручева Н.В., Антипова О.В. Фузикокцин как вероятный эндогенный фактор прорастания семян// Доклады Академии наук, 1992. Т.325. № 2. 412-415.

22. Обручева Н.В., Антипова О.В. Запуск роста осевых органов и его подготовка при прорастании семян, находящихся в вынужденном покое. 2. Инициация "кислого роста" в осевых органах семян кормовых бобов.// Физиология растений. 1994. Т.41. № 3. С, 443-447.

23. Обручева Н.В., Антипова О.В. Физиология инициации прорастания семян.// Физиология растений. 1997. Т.44. № 2. 287-302,

24. Полевой В.В. " Фитогормоны", Л., Изд-во Ленингр. ун-та, 1982, 248 с.

25. Сабинин Д.А. "Физиологические основы питания растений", М., Изд-во АН СССР, 1955, 512 с,

26. Саламатова ТС. "Физиология растительной клетки ", Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1983, 232 с.

27. Трофимова М.С. Драбкин А.В., Клычников О.И., Зоринянц Э., Андолфи А., Эвиденте А., Бабаков А.В. Возможная роль фузикокцин-связывающих белков в адаптации растений к стрессу. // Физиология растений. 1997. Т.44. № 5. 652-657.

28. Трофимова М.С, Клычников О.И., Носов А.В., Бабаков А.В. Активация дополнительных сайтов связывания фузикокцина на плазматической мембране при осмотическом стрессе. //Физиология растений. 1999. Т.46. № 1. 9-15.

29. Хавкин Э. Е. " Обмен веществ растущих клеток корня "в " Физиология растений ", Т. 1, "Физиология корня ", Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР, М., 1973. 216 с.

30. Шишова М.Ф., Линдберг С, Полевой В.В. Активация ауксином транспорта Са^ ^ через плазмалемму растительных клеток. // Физиология растений. 1999. Т.46. № 5. 718 -727.

31. Aitken А. 14-3-3 and Its Possible Role in Co-ordinating Multiple Signaling Pathways // Trends Cell Biol. 1996. V.6. P. 341-347.

32. Babakov A.V., Chelysheva V.V., Klychnikov O, I., Zorinyanz S. E., Trofimova M.S., De Boer A.H. Involvement of 14-3-3 Proteins in the Osmotic Regulation of H*-ATPase in Plant Plasma Membranes // Planta. 2000. V. 211. P. 446-448.

33. Balke N.E., Hodges Т.К. Effect of Diethylstilbestrol on Ion Fluxes in Oat Roots. // Plant Physiol. 1979. V. 63. P. 42-47.

34. Balke N.E., Hodges Т.К. Inhibition of Adenosine Triphosphatase Activity of the Plasma Membrane Fraction of Oat Roots by Diethylstilbestrol. // Plant Physiol. 1979. V. 63. P. 48-52.

35. Baluska F., Barlow P.W., Kubica S. Importance of the post-mitotic isodiametric growth (PIG) region for growth and development of roots. In Structure and Function of Roots ( Eds. Baluska F. et. al.), Kluwer Acad. Publ., Netherland, 1995, pp 41-51.

36. Baluska F., Kubica S., Hauskrecht M. Postmitotic "Isodiametric" Cell Growth in theMaize Root Apex//Planta. 1990. V. 181. P. 269-274.

37. Baluska F., Volkmann D., Barlow P.W. Specialized Zones of Development in Roots: View from the Cellular Level. // Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 3-4.

38. Barlow P.W., Brain P., Parker J.S. Cellular growth in roots of a gibberellin-deficient mutant of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) and hs wild-tipe. // J. Exp. Bot. 1991, V. 42. P. 339-351.

39. Beemster G. T. S., Baskin T. I. Analysis of Cell Division and Elongation Underlying the Developmental Acceleration of Root Growth in Arabidopsis thaliana. II Plant Physiol. 1998. V.

41. Bert De Boer. Fusicoccin - a Key to Multipplle 14-3-3 Locks. // Trends Plant Sci. 1997. V.2. № 2. P. 60-66.

42. Briskin D.P. The plasma membrane H+-ATPase of higer plant cells; biochemistry and transport function. Biochimica et Biophysica Acta. 1990. 1019. P. 93-109.

43. Brumfield R.T. Cell growth and division in living root meristems. //. Am. J. Bot. 1942. V.

44. Buchaman B.B., Gruissem W., Jones R.L. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. 2000. American Society of Plant Physiologists.

45. Burstrom H.G. Influence of the tonic effect of gravitation and auxin on cell elongation and polarity in roots. // Amer. J. Bot. 1969. V. 56 № 7. P. 679-684.

46. Burstrom H.G. Studies on growth and metabolism of roots. IV. Cell elongation and dry matter content. //Physiol. Plantarum. 1951. V. 4. № 1. P. 199-208.

47. Burstrom H.G. On formative effects of carbohydrates on root growth. // Bot. Notiser. 1941. № 3 . P. 310-334.

48. Burstrom H.G. Temperature and root cell elongation. // Physiol. Plantarum, 1956. V. 9, № 4, P, 682-691.

49. Cleiand R. E. Fusicoccin-induced Growth and Hydrogen Ion Excretion of Avena Coleoptiies: Relation to Auxin Responses. // Planta. 1976, 128. 201-206.

50. Clowes F.A.L. Anatomical aspects of structure and development. In: Root growth, 3. Proc. Fifteen Easter School in Agricultural Sciences. Univ. Nottingham Press, 1969.

51. Dreyer S. A., Seymour V., Cleiand R. E. Low Proton Conductance of Plant Cuticles and Its Relevance to the Acid-Growth Theory. // Plant Physiol. 1981. V.68. P. 664-667.

52. Edwards K.L., Scott Т.К. Rapid-growth Responses of Corn Root Segments: Effect of pH on Elongation. //Planta. 1974. 119. P. 27-37.

53. Edwards K.L., Scott Т.К. Rapid-growth Responses of Corn Root Segments: Effect of Citrate-phosphate Buffer on Elongation. // Planta. 1976. 129. P. 229-233.

54. Emi Т., Kinoshita Т., Shimazaki K. Specific Binding of vfl4-3-3a Isoform to the Plasma Membrane H^-ATPase in Response to Blue Light and Fusicoccin in Guard Cells of Broad Bean //Plant Physiol. 2001. V. 125. P. 1115-1125.

55. Erickson R.O., Sax K.B. Elemental Growth Rate of the Primary Root of Zea mays. //Proc. Amer. Phil. Soc. 1956. V. 100. P. 499-514.

56. Felle H.H. The apoplastic pH of the Zea mays root cortex as measured with pH-sensitive microelectrodes: aspects of regulation. // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. № 323. P. 987-995.

57. Gabella M., Pilet P.-E. Effects of pH on Georeaction and Elongation of Maize Root Segments. //Physiol. Plant. 1978. 44. P. 157-160.

58. Green P. B. Cummins W. R. Growth Rate and Turgor Pressure. // Physiol. Plant. 1974. 54. P. 863-869.

59. Grif V.G., Ivanov V.B., Machs E.M. Cell cycle and its parameters in flowering plants. // Цитология. 2002. Т. 44. № 10. 936-973.

60. Hager A., Debus G., Edel H.-G, Stransky H., Serrano R. Auxin induces exocytosis and the rapid synthesis of a high-turnover pool of plasma-membrane H^-ATPase. // Planta. 1991. 185: P. 527-537.

61. Hasenstein K. H., Evans M.L. The influence of calcium and pH on growth in primary roots of Zeamays. //Physiol. Plant. 1988. 72. P. 466-470.

62. Hejnowiz Z. Growth and Cell Division in the Apical Meristem of Wheat Roots // Physiol. Plantarum. 1959. V 12. P. 124-138.

63. Hejnowiz Z., Brodzki V.Y. The growth of root cells as the function of the time and their position in the root. Acta Soc. Hot. Pol. 1960. V 29. P. 625-644.

64. Ishikawa H., Evans M.L. Specialized Zones of Development in Roots. // Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 725-727.

65. Ishikawa H., Evans M.L. The Role of the Distal Elongation Zone in the Response of Maize Roots to Auxin and Gravity. // Plant Physiol. 1993. V. 102. P. 1203-1210.

66. Islam A.K.M.S., Edwards D.G., Asher C.J. pH OPTIMA FOR CROP GROWTH. Resuhs of flowing solution culture experiment with six species. // Plant and Soil. 1980. V. 54. P. 339-357.

67. Ivanov V.B. Relationship between cell proliferation and transition to elongation in plant roots. //Int. J. Dev. Biol. 1997. 41: 907-915.

68. Jacobs M., Taiz L. Vanadate inhibition of auxin-enhanced H^ secretion and elongation in pea epicotyls and oat coleoptiles. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980. V. 77. № 12. P. 7242-7246.

69. Jehch-Ottmann С, Weiler E. W., Decking С Binding of Regulatory 14-3-3 Proteins to the С Terminus of the Plant Plasma Membrane H^-ATPase Involves Part of Its Autoinhibitory Region // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 39852-39857.

70. Kutschera U., Schopfer P. Evidence against the acid-growth theory of auxin action. // Planta. 1985, 163, P. 483-493.

71. Kutschera U., Schopfer P. Evidence for the acid-growth theory of fusicoccin action. // Planta. 1985. 163. P. 494-499.

72. Larsson C , Sommarin M., Widell S. Isolation of Highly Purified Plasma Membrane and the Separation of Inside Out and Right-Side Vesicles // Methods Enzymol. 1994. V. 226. P. 127-153.

73. Liithen H., Bigdon M., Bottger M. Reexamination of the Acid Growth Theory of Auxin Action. //Plant. Physiol. 1990. V.93. P.93 1-939.

74. Marschner H., Handley R., Overstreet R. Potassium Loss and Changes in the Fine Structure of Corn Root Tips Induced by H-ion. // Plant. Physiol. 1966. V.41. P. 1725-1735.

75. Marschner H., Romheld V., Ossenberg-Neuhaus H. Rapid Method for Measuring Changes in pH and Reducing Processes Along Roots of Intact Plants. // Z. Pflanzenphysiol. 1982. V. 105. P. 407-416.

76. Martin H.V., Elliott M.C., Wangermann E., Pilet P.E. Auxin Gradient along the Root of the Maize Seedling.//Planta. 1978. 141. P.179-181.

77. McBride R., Evans M.L. Auxin Inhibition of Acid- and Fusicocccin-induced Elongation in 1.entil Roots. // Planta. 1977. 136. P.97-102.

78. Mesenco MM. THE SPECIFIC "ACID GROWTH" IN ROOTS AND ROOT REACTION ON SOME STRESS FACTORS. // International Symposium "PLANT UNDER ENVIRONMENTAL STRESS", abstracts, Moscow, 2001, P. 189.

79. Meuwly P., Pilet P.E. Maize Root Growth and Localized Indolo у 1-Acetic Acid Treatment. // Plant. Physiol. 1987. V.84, P. 1265-1269.

80. Miller A.L., Gow N.A.R. Correlation between Root-Generated Ionic Currents, pH, Fusicoccin, Indoleacetic Acid, and Growth of the Primary root of Zea mays. // Plant. Physiol. 1989, V.89. P.1198-1206.

81. Moloney M. M., Elliott M.C., Cleland R. E. Acid growth effects in maize roots; Evidence for a link between auxin-economy and proton extrusion in the control of root growth. // Planta. 1981. 152. 285-291.

82. Morsomme P., Boutry M, The Plant Plasma Membrane H^-ATPase; Structure, Function and Regulation//Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P, 1-16,

83. Mulkey T,J,, Evans ML. Geotropism in Corn Roots: Evidence for Its Mediation by Diffrential Acid Efflux. // Science. 1981. V. 212, P. 70-71.

84. Nichol S.A., Silk W.K. Empirical evidence of a convection-diffusion model for pH patterns in the rhizospheres of root tips. // Plant, Cell and Environment. 2001, 24, 967-974.

85. Obroucheva N.V., Antipova O.V., Gorbova E.N., Kotova L.M. Relationship between initiation of cell elongation and cell division in radicles of germinating seeds. // Plant and Soil. 1995. 173: P. 311-316.

86. Decking C , Hagemann K. Association of 14-3-3 Proteins with C-terminal Autoinhibitory Domain of Plant Plasma-Membrane Ff^-ATPase Generates a Fusicoccin -Binding Complex // Planta, 1999, V. 207. P. 480-482.

87. Olivari C , Albini C , PugUarello M.C., De Michelis M.I. Phenilarsine Oxide Inhibits the Fusicoccin-Induced Activation Plasma Membrane H^-ATPase. // Plant. Phusiol. 2000. V. 122. P.463-470.

88. O^Neill R.A., Scott Т.К. Proton Flux and Elongation in Primary Roots of Barley {Hordeum vulgare L.).//Plant. Physiol. 1983. V. 73. P. 199-201.

89. Palmgren M.G. Proton Gradients and Plant Growth: Role of Plasma Membrame H^-ATPase // Adv. Bot. Res. 1998. V.28. P. 1-70.

90. Parets-Soler A., Pardo J.M., Serano R. Immunocytolocalization of Plasma Membrane H^- ATPase. // Plant. Physiol. 1990. V. 93. P. 1654-1658.

91. Peters W.S., Bernstein N. The Determination of Relative Elemental Growth Rate Profiles from Segmental Growth Rates // Plant. Physiol. 1997. V. 113. P. 1395-1404.

92. Peters W.S., Felle H.H. The correlation of Profiles of Surface pH and Elongation Growth in Maize Roots.//Plant. Physiol. 1999. V. 121. P. 905-912.

93. Peters W,S., Felle H.H. Dynamics of extracellular pH in cells traversing maize root elongation zones: Imphcations for expansin action. // The 6* Symposium of the International Society of Root Research, 11-15 November 2001. Nagoya, Japan. 56-57.

94. Peterson T.A., Swanson E.A., Hull R.J. Use of lanthanum to trace apoplastic solute transport in intact plants. // J. Exp. Bot. 1986, V. 37. № 179, P. 807-822.

95. Pilet P.E., Elliot M.C., Moloney M M . Endogenous and Exogenous Auxin in the Control of Root Growth. //Planta. 1979. 146. P. 405-408.

96. Pilet P.E., Saugy M. Effect on Root Growth of Endogenous and Applied lAA and ABA. //Plant. Pysiol. 1987. V. 83. 33-38.

97. Pilet P.E., Senn A. Root Growth Gradients: A Critical Analysis. // Z. Pflanzenphysiol. 1980. V. 99. P. 121-130.

98. Pilet P.E., Versel J.M., Mayor G. Growth distribution and surface pH patterns along maize roots. //Planta. 1983, 158. P. 398-402.

99. Pritchard J., Tomos A.D., Wyn Jones R.G. Control of Wheat Root Elongation Growth. 1. Effects of ions on growth rate, wall rheology and cell water relations. // J. Exp. Bot. 1987. V. 38. № 191. P. 948-959.

100. Rayle D.L., Cleland R. Enhancement of Wall Loosening and Elongation by Acid Solutions. // Plant. Physiol. 1970. V. 46. P. 250-253.

101. Rayle D.L., Cleland R. The Acid Growth Theory of Auxin-Induced Cell Elongation Is Alive and Well.// Plant. Physiol. 1992. V. 99, P. 1271-1274,

102. Reid R. J., Field L. D., Pitman M.G. Effects of external pH, Fusicoccin and butirate on the cytoplasmic pH in barley root tips measured by "''p-nuclear magnetic resonance spectroscopy.//Planta, 1985. 166.341-347.

103. Rost T.L., Jones T.J., Falk R.H. Distribution and relationship of cell division and maturation events in Pisum sativum (Fabaceae) seedling roots. // Am. J. Bot. 1988. 75. 1571-1583.

104. Rubinstein В., Cleland R. E. Responses o^Avena Coleoptiles to Suboptimal Fusicoccin: Kinetics and Comparisons with Indoleacetic Acid. // Plant. Physiol. 1981. V,68. P.543-547.

105. Samuels A.L., Fernando M., Glass A. D.M. Immunofluorescent Localisation of Plasma Membrane H+-ATPase in Barley Roots and Effects of К Nutrition. // Plant. Physiol, 1992. V,99. P. 1509-1514.

106. Sentenac H., Grignon С Effect of H^ Excretion on the Surface pH of Corn Root Cells Evaluated by Using Weak Acid Influx as a pH Probe, // Plant, Physiol. 1987, V,84, P,1367-1372.

107. Schopfer P, pH-Depedence of Extension Growth in Avena Coleoptiles and Its Implications for the Mechanism of Auxin Action. // Plant. Physiol. 1989, V, 90. P. 202-207.

108. Sharp R. E., Silk W. K., Hsiao T, С Growth of the Maize Primary Root at Low Water Potentials. //Plant. Physiol. 1988. V. 87. P. 50-57.

109. Spiro M.D., Bowers J.F., Cosgrowe D.J. A Comparison of Oligogalacturonide- and Auxin-Induced Extracellular Alkalinization and Growth Responses in Roots of Intact Cucumber Seedlings. // Plant. Physiol. 2002. V. 130. P. 895-903.

110. Stenz H.-G., Heumann H.-G., Weisenseel M. H. High Concentration of Plasma Membrane H^-ATPase in Root Caps of Lepidium sativum L. // Naturwissenschaften, 1993. V.80, P. 317-319.

111. Sze H., Li X., Palmgren M.G. Energization of Plant Cell Membranes by H"^-Pumping ATPases: Regulation and Biosynthesis // Plant Cell. 1999, V. 11. P. 677-689.

112. Tanimoto E., Scott T. K., Masuda Y. Inhibition of Acid-Enhanced Elongation of Zea mays Root Segments by Galactose. // Plant. Phys. 1989. V. 90. P. 440-444.

113. Tomos D., Pritchard J. Biophysical and biochemical control of cell expansion in roots and leaves. / /J. Exp. Bot. 1994. V. 45. P. 1721-1731.

114. Versel J.-M., Mayor G. Gradients in maize roots: local elongation and pH. // Planta. 1985. 164. P. 96-100.

115. Wagner N. Wachstum und Teilung der Meristemzellen in Wurzelspitzen. // Planta. 1937. V. 27. P. 550-582.

116. Walter A., Silk W.K., Schurr U. Effect of Soil pH on Growth and Cation Deposition in the Root Tip of Zea mays. L.// J. Plant Growth Regul. 2000. V. 19. P. 65-76.

117. Winch S., Pritchard J. Acid-induced wall loosening is confined to the accelerating region ofthegrowingzone.//J.Exp. Bot. 1999. V. 150. №338. P. 1481-1487.

118. Yan F., Feuerle R., Schaffer S., Fortmeier H., Schubert S. Adaptation of Active Proton Pumping and Plasmalemma ATPase Activity of Corn Roots to Low Root Medium pH. // Plant. Physiol. 1998. V. 117. P.311-319.

119. Yan P., Schubert S., Mengel K. Effect of Low Root Medium pH on Net Proton Release, Root Respiration, and Root Growth of Corn {Zea mays L.) and Broad Bean (Viciafaha L). II Plant. Physiol. 1992. V.99. P.415-421.