Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние катана, ЭОК и К-12 - новых бесхлорфенольных антисептиков на энергетический обмен растительных клеток

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние катана, ЭОК и К-12 - новых бесхлорфенольных антисептиков на энергетический обмен растительных клеток"

КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

на правах рукоптси УДК БГ '..121

КОСТИНА Елена Геннадьевна

ВЛИЯНИЕ КАТАНА, ЭОК И К-12 - ж-ОВЫХ БЕСХЛОРФЕНОЛЬНЫХ АНТИСЕПТ ¿КОВ - НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН РАСТИТЕЛЬ НЫХ КЛЕТОК

03.00.12-физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-1995 г.

КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

на правах рукописи УДК 581.121

КОСТИНА Елена Геннадьевна

ВЛИЯНИЕ КАТАНА, ЭОК И К-12 - НОВЫХ БЕСХЛОРФЕНОЛЬНЫХ АНТИСЕПТИКОВ - НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

03.00.12-физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-1995 г.

Работа выполнена в Казанском институте биологии Казанского научного центра РАН

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор

Л.Х.Гордон

кандидат технических наук Ю.А.Варфоломеев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук Ф.Г.Каримова

кандидат биологических наук В.Г.Яргунов

Ведущая организация - Марийский государственный университет

Защита состоится " 13 " сыл^/л^-^_1995 г. в " /С час.

на заседании специализированного совета К 002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (специальность - физиология растений) при Казанском институте биологии КНЦ РАН (420503, г.Казань, а/я 30).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ РАН.

Автореферат разослан " .Ж " (Ю-Ш^и^ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Н.Л.Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Известно, что леса являются на Земле основным продуцентом фитомассы, кислорода, Источником лекарственного сырья, топлива, местом обитания и размножения животных, объектом деятельности человека. Статистические данные последних лет по развитию отечественного лесопромышленного комплекса свидетельствуют, что при наличии в нашей стране огромных запасов леса и крупных объемов его заготовок ежегодный дефицит древесины в стране оценивается более чем в 25 млн. м3. Это объясняется неэкономным и нерациональным использованием лесосырьевых ресурсов.

Существенный резерв экономии лесоматериалов - повышение долговечности изделий из древесины (Попова, Харук, 1991). В решении этой проблемы особая роль принадлежит антисептированию -обработке древесины антисептиками с целью защиты от плесневых, деревоокрашивающих и дереворазрушающих грибов. Известно, что благодаря защитной обработке древесины антисептирующими препаратами, срок ее службы возрастает в 3-8 раз. В состав ранее использовавшихся средств защиты древесины входили такие высокотоксичные вещества как хлорфенольные, этилртутные соединения, мышьяк, хром, фтор и др.

Защитная химическая обработка древесины, как и любой другой технологический процесс, не лишена негативного воздействия на окружающую среду и сопряжена с широким кругом экологических проблем, которые сводятся, в основном, к следующим:

- образование при приготовлении пропиточных растворов защитных средств аэрозолей, вредных для организма человека;

- проникновение в почву вредных компонентов антисептиков в процессе пропитки древесины, обусловленное несовершенством технологического оборудования и систем сбора и очистки сточных вод;

- вымывание и выделение токсичных соединений в окружающую среду при эксплуатации антисептированной древесины и ее утилизации.

В процессе утилизации антисептированной древесины происходит как выделение ядовитых газов и токсичных соединений (углеводороды, оксиды серы, азота и др.), так и попадание в почву, воздух и воду тяжелых металлов, экологически опасных для биосферы. Наибольшую опасность для гидросферы представляют

загрязнения маслами и органорастворимыми антисептиками Например, окисление двухатомных фенолов при попадании их ] водоемы сопровождается потреблением большого количеств! кислорода, что приводит к нарушению его баланса в воде и, кш следствие, к гибели обитателей водоемов.

За рубежом в течение многих лет проводится планомерна! ограничительная политика в отношении токсичных защитны} средств. В Германии, Англии и Франции прекращен выпуа антисептиков, содержащих мышьяк. Германия, Голландия, Дания Швеция и др. страны отказались от импорта пиломатериалов обработанных хлорфенольными препаратами. В Финляндиз снижается применение оловоорганических соединений. Поэтому з последние годы исследования в России и за рубежом направлены т разработку и внедрение новых препаратов - эффективных, н< малотоксичных антисептиков (Варфоломеев, 1992), что позволи' снизить затраты на охрану окружающей среды. Так, в лабораторш защиты древесины ЦНИИМОДа синтезированы и внедрены ] производство новые бесхлорфенольные антисептики.

Цель и задачи. Основная цель исследований - изучение влияние новых бесхлорфенольных антисептиков (катана, ЭОК, К-12) н, растительные клетки.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния различных концентраци] антисептиков катана, ЭОК и К-12 на рост надземной части и корней 6 дневных проростков пшеницы.

2. Исследование генерации активных форм кислорода корням] на фоне действия антисептиков.

3. Изучение механизма действия указанных препаратов: а исследование влияния на потребление кислорода корнями проростко пшеницы:

- выращенных на растворах антисептиков;

- при добавлении антисептиков непосредственно пере, определением дыхания;

- после 5-ти часов инкубации корней корней в воде;

б) определение проницаемости корневых клеток для ионов калия; I выявление действия антисептиков непосредственно н митохондриальное дыхание; г) выявление возможного участия АТ<Ё азных систем плазмалеммы (в частности Н+-АТФ-азы) в ответны реакциях на действие антисептиков.

4. Изучение влияния антисептиков на термогенез корней проростков пшеницы.

Научная новизна. Установлено, что бесхлорфенольные антисептики в разной степени влияют на рост корней и надземной части проростков пшеницы: катан в концентрации 0.001% ингибирует рост надземной части, ЭОК в концентрации 0.01% не оказывает влияния на рост проростков пшеницы, а К-12 в концентрации 0.001% подавляет рост корней и не влияет на рост надземной части. Антисептики катан и ЭОК способствуют увеличению оводненности корней и снижению содержания воды в надземной части проростков пшеницы. Это объясняется увеличением проницаемости плазмалеммы для воды и связыванием ее клеточной стенкой, а также торможением транспорта воды из корней в надземную часть. Наименьшую токсичность в отношении проростков пхпеницы показал ЭОК.

Впервые получены данные об активации антисептиками генерации супероксидного радикала корнями проростков пшеницы. Генерация супероксидного радикала наиболее ярко выражена на фоне самого токсичного препарата К-12.

Впервые показано, что вновь синтезированные антисептики катан и К-12 (0.001%) снижают потребление кислорода корнями проростков пшеницы. Снижение интенсивности дыхания корней катаном может быть связано с действием на первый сегмент дыхательной цепи митохондрий и блокированием калиевой проницаемости плазмалеммы. Подавление интенсивности дыхания препаратом К-12 обусловлено, по-видимому, блокированием гликолитической системы. Обнаружено, что ЭОК (0.01%) стимулирует дыхание корней проростков пшеницы. Установлено, что стимуляция дыхания предотвращается ингибитором АТФ-азных систем плазмалеммы - ионами серебра, что свидетельствует об (изменении этим антисептиком пассивной проводимости для ионов.

Впервые получены данные о действии антисептиков на термогенез корней проростков пшеницы. Обнаружена коррелятивная зависимость между изменениями дыхания и термогенеза.

Практическая значимость. Результаты исследований показали, что антисептик ЭОК является наименее токсичным для растений из трех испытанных препаратов.

Обнаруженная коррелятивная зависимость между токсичностью антисептиков и генерацией активных форм кислорода позволяет использовать регистрацию интенсивности генерации супероксидного

радикала в качестве теста при выявлении степени токсичности различных препаратов.

Результаты исследований использованы:

- НПО "Научдревпром" при составлении экологических паспортов на антисептики. Проведенные исследования позволили оценить токсичность антисептиков по отношению к окружающей среде и разработать природоохранные мероприятия для промплощадок лесопильно-деревообрабатывающих предприятий;

- АО "Северолесоэкспорт" при экологической оценке отечественных и зарубежных антисептиков, предназначенных для защитной обработки экспортных сырых пиломатериалов из хвойных пород древесины.

Апробапия работы. Результаты исследований были доложены в лаборатории повышения эксплуатационной надежности и защиты древесины ЦНИИ механической обработки древесины (Архангельск, 1992 г., 1994 г.); на англо-русском совещании по проблемам защитной обработки древесины ЦНИИМОДа и Шотландского институте технологии древесины (Scottish Institute for Wood Technology] (Архангельск, 15 марта 1994 г.); на совместном заседании отделе энергетики и адаптации и отдела эндогенных регуляторов Казанскогс института биологии РАН (Казань, 1994 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано с работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит и: введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на /-ЛЙ стр. машинописного текста, включает 2] рис., 11 таблиц. Список литературы включает 188 наименований, и: них 135 - на русском языке.

Глава П. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили 6-дневные проростки пшениць сорта Люба. Семена замачивали в водопроводной воде, а затег высевали на стекло, покрытое смоченной марлей. Проростш выращивали на дистиллированной воде или растворах антисептико: катана (0.001%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% ), ЭОК (0.001%, 0.01% 0.1%, 0.25%, 0.5%) и К-12 (0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.025%).

Катан относится к поверхностно-активным веществам (ПАВ). О] содержит алкилдиметилбензиламмонийхлорид, где R - смес прямоцепных алкильных остатков Cio-Cis*.

ЭОК синтезирован на основе натриевых солей синтетических жирных кислот фракции С5-С9 в пересчете на энантовую кислоту СНз-(СН2)5-СООН.

К-12 представляет собой кремнефтористый аммоний (NH4)2SiF6.

На шестой день определяли длину корней и надземной части, сырой вес корней и надземной части , сухой вес корней и надземной части этих же растений после трехдневного высушивания на воздухе. Общее содержание воды в корнях и надземной части рассчитывали по формуле:

ЮО(а-Ь) а

где X — общее количество воды, %, а — вес сырой навески, мг, b — вес сухой навески, мг.

В дальнейших экспериментах катан и К-12 использовали в концентрации 0.001%, а ЭОК - в концентрации 0.01%. Эти концентрации выбраны на основании литературных данных (Рудзит Э.А. и цр., 1981; Isomaa, 1979) и результатов наших экспериментов по влиянию антисептиков на рост и вес проростков пшеницы.

Для определения генерации супероксидного радикала корни проростков пшеницы, выращенные на дистиллированной воде, помещали в бюксы с тремя мл дистиллированной воды и инкубировали в течение часа или пяти часов. Затем добавляли 50 мкл Э.06%-ных катана и К-12 (0.001% в растворе) и 0.6%-ного ЭОК (0.01% в растворе) и через час добавляли 500 мкл 10"3 М адреналина. Генерацию супероксидного радикала оценивали по превращению адреналина в адренохром, который учитывали спектрофото-иетрически при длине волны 490 нм.

Интенсивность потребления кислорода и выделения углекис-иого газа корнями определяли манометрическим методом в аппарате Варбурга (Семихатова, 1965): навеску (150 мг) помещали в сосудики с гремя мл дистиллированной воды (контроль) и катана, К-12 (0.001%), ЭОК (0.01%), 10"5 М тетраэтиламмония (ТЭА). В

контрольном варианте навеску помещали в дистиллированную воду. После 10-15-минутного термостатирования измеряли интенсивность дыхания в течение шести часов (показания снимали каждый час).

Для доказательства специфичности действия катана в области первого сегмента электрон-транспортной цепи митохондрий использовали 5-10"3 М викасола. Отсеченные корни помещали в раствор катана, викасола, а также в смесь равных объемов этих веществ. В контроле навеску помещали в дистиллированную воду. После термостатирования измеряли интенсивность дыхания за один час.

Для доказательства активации протонных АТФ-аз при действии ЭОК использовали 10"5 М AgN03, так как ионы серебра являются высокоспецифичными блокаторами протонных АТФ-аз. К корням, преинкубированным пять часов в дистиллированной воде, добавляли ЭОК, AgN03, а также смесь равных объемов этих веществ. В контроле навеску помещали в дистиллированную воду. После термостатирования измеряли интенсивность дыхания за один час.

Проницаемость корневых клеток для ионов калия оценивали пс содержанию его в инкубационном растворе в сосудиках Варбургг сразу после определения интенсивности дыхания. Измеренш проводили на пламенном фотометре ПФМ.

Скорость тепловыделения фиксировали с помощьн дифференциального микрокалориметра LKB 2277 Bioactivity Monitor Навеску корней (30 мг) проростков пшеницы погружали в 0.6 mj жидкости (в контроле - дистиллированная вода, в опыте - 0.001% -ньи катан или К-12, 0.01%-ный ЭОК). Стеклянные ампулы помещали з калориметр в режим термостатирования, в котором выдерживали 10 15 минут, после чего опускали в измерительное положение i включали режим регистрирования.

Результаты экспериментов обработаны статистически.

Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Влияние антисептиков на рост и вес проростков пшеницы

Рост является интегральным показателем многих процессоь протекающих в растении. Данные исследований роста проростко пшеницы, выращенных при различных концентрациях антисептикох представлены на рис. 1. Подавление роста корней на 50°/ наблюдалось при концентрации К-12 0.004%, катана 0.022%

ЭОК 0.105%, а надземной части 0.006%, 0.025%, 0.150% соответственно.

Интересными представляются данные об увеличении сырого веса корней на фоне катана (0.001%) (рис. 2) при отсутствии влияния на их длину. При этом оказалось, что изменения касаются только сырого веса, а сухая масса не изменялась (рис. 3). Таким образом, можно сделать вывод, что катан в концентрации 0.001% не вызывает деструктивных процессов в клетке ( что согласуется с данными по термогенезу ), а увеливает оводненность корневых клеток. Действительно, оказалось, что в клетках корней пшеницы на фоне катана (0.001%) общее содержание воды увеличено (87.1% в контроле, 89.7% в опыте).

Содержание воды может возрасти из-за увеличения проницаемости плазмалеммы для воды при действии катана и связывания ее в отдельных компартментах клеток. В связи с этим отметим, что обработка катамином АБ, который является основным токсическим ингредиентом антисептика, приводит к утолщению и разрыхлению клеточной стенки (Пронин и др., 1991). В такой ситуации вполне вероятно и увеличение связывания воды клеточной стенкой, являющейся одной из причин большей оводненности корней в целом.

Увеличение концентрации катана до 0.01% вызывало снижение сырого веса корней и надземной части, однако, сухая масса надземной части возрастала. Общее содержание воды в надземной части снижалось более резко, чем в корнях. Сравнительная характеристика общего содержания воды в корнях и надземной части свидетельствуют о том, что на фоне катана корни не только могут "связать" большее количество воды, но и, вероятно, обладать меньшей способностью "подавать" воду в надземную часть растений.

При действии ЭОК в концентрации 0.001% и 0.01% длина корней и сухая масса не изменялись (рис. 3), тогда как сырая масса увеличивалась на 30-60% (рис. 2). Таким образом, можно сделать вывод, что ЭОК не вызывает деструктивных процессов в клетке (что согласуется с данными по термогенезу), а увеличивает оводненность корневых клеток. Действительно, оказалось, что в клетках корней пшеницы на фоне ЭОК общее содержание воды увеличено (87.9% в контроле, 91.4% и 92.9% при концентрации антисептика 0.001% и 0.01% соответственно).

ЭОК в концентрации 0.001% не оказал влияния на рост, сырую и сухую массу надземной части (рис. 2 и 3). Увеличение концентрации до 0.01% привело к некоторому снижению роста

А

5 К

о

СО У

>5

0 X

аз

1

1 <

СО I 5

100

о; Ц

0 о. )-

1

о

150

>5 ф

х о.

о ^

я х

100

к ^

о о. н

X

о

V

I-

о

К-12 Катан

эок

50 75 100 125 15С

концентрация антисептика, 10*3 °А

Рис. 1. Зависимость длины надземной части (А) и корней (Б проростков пшеницы от концентраций антисептиков

0.001 %

0.01 %

а

о

га

Я г

в °

£ х

ПЗ 5

§ §

о й

100

50

94

93

100 102

га о

0 га

1 -5 о. га о о. * л

о

50

100

150

• 1

63

89

100 100

131 124

1234 1234

Рис. 2. Влияние антисептиков на сырой вес проростков пшеницы: 1-контроль, 2-ЭОК, 3-катан, 4-К-12

0.001 %

0.01 %

« ь

с ?

2 «

г о

о; I

я 5 а)

¿г а

150

100

50

100 99 95 97 100 < *

51

га о

га >5

5 §

к а

га о

Г

0

ОС I 50 ■ * V ■ 5С *

X о ^ ■ Л 63

£ юо о * 150

100 104 100 108 100 104

1 2 3 4 1 2 3 4

1 -контроль, 2-ЭОК, 3-катан, 4-К-12

надземной части, тогда как сырая масса не изменилась, а сухая масс£ значительно возросла. Это может свидетельствовать о снижение оводненности клеток надземной части при действии ЭОК Действительно, на фоне ЭОК общее количество воды снижено (85.3% в контроле, 80.8% в опыте ).

При действии К-12 в концентрации 0.001% длина корне! уменьшилась на 30%, а длина надземной части не изменилась; npi этом сырая и сухая массы как корней, так и надземной част1 остались на уровне контроля (рис. 2 и 3). При увеличенш концентрации антисептика до 0.01% происходило значительно« снижение сырой и сухой массы как корней, так и надземной части, i также снижение общего количества воды в надземной части (81.5% : контроле, 72.3% в опыте). Подавление роста проростков ншениць антисептиком К-12, возможно, является следствием его действия m энергетический обмен.

На основании полученных данных можно сделать вывод, чт< ЭОК является наименее токсичным антисептиком для растений.

3.2 Изменение физиологического состояния клеток корней пшеницы i процессе адаптивного старения

Исследование динамики потребления кислорода отсеченным] корнями показало фазность этого процесса (рис. 5). Можно отметит! что через 2-3 часа после отсечения корней интенсивность дыхани корневых клеток сначала возрастает, а затем постепенно снижается.

Ряд авторов выделяют две фазы в процессе адаптивног старения (промывания) растительных клеток - индуктивную развития (Leonard, Hanson, 1972; Gronewald et al., 1979). индуктивной фазе (1-2 часа) происходит изменение и последующе восстановление ионных потоков, мембранного потенциала, снижени уровня АТФ и адениновых нуклеотидов. Отмечается, что изменение происходящие в этой фазе, в значительной степени связаны восстановлением после повреждения.

Во второй фазе (развития) наблюдается гиперполяризаци мембраны (Gronewald et al., 1979; Lin, Hanson, 1976), усиление АТС азной активности, увеличение скорости поглощения различны веществ, восстановление уровня АТФ и адениновых нуклеотидс (Gronewald, Hanson, 1982). Большинство исследователей приходят выводу, что основные взаимосвязанные ответные реакци

растительных тканей в процессе промывания определяются активированием Н+-помпы плазмалеммы (Leonard, Hanson, 1972).

После 4-5 часов потребление кислорода корнями снижается и йожет быть ниже, чем в первый час инкубации (рис. 5). [[редполагают (Пахомова, Гордон, 1984), что в этот период ¡аканчиваются метаболические перестройки и клетки переходят на зовый уровень функционирования. По-видимому, затормаживаются зроцессы ионного транспорта. Последнее может быть связано с 5акрыванием ионных каналов, уменьшением пассивной утечки ионов, з частности для калия, протонов.

3.3 Генерация супероксидного радикала клетками корней при действии антисептиков

Известно (Островская, 1993), что многие патологические зроцессы в клетке (действие гербицидов, инфекционные заболевания, неблагоприятные экологические факторы) сопровождаются эбразованием супероксиданионрадикалоз ("02") и др. кислородных радикалов. Не исключено, что одной из ранних ответных реакций на воздействие антисептиков является генерация 'О2", поэтому в задачу исследования входило выявление его образования в клетках корня при действии антисептиков сразу после отсечения и в клетках, ааходящихся в состоянии "относительного покоя". Это состояние достигается пятичасовой инкубацией корней в воде, когда заканчиваются метаболические перестройки, вызванные отсечением, и клетки выходят на новый уровень функционирования.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о гом, что антисептики приводили к стимуляции образования 'О2" в корнях (рис. 4), особенно она значительна в состоянии "относительного покоя". Генерация супероксидного радикала, по-зидимому, связана с тем, что антисептики обладают поверхностно-активным действием, в связи с чем и оказывают мембранотропное влияние. Низкие концентрации катионных ПАВ, к которым относится катан, не проникая в клетку, обладают литической активностью, поскольку они изменяют структурное состояние гсипидов (Isomaa, 1979).

Антисептик ЭОК является производным синтетических жирных кислот. Сами жирные кислоты также обладают мембранотропным эффектом, изменяя проницаемость мембранных образований клеток. Следует отметить, что существует тесная взаимосвязь между

изменениями физического состояния мембран и генерацией "Ог* на фоне линолевой кислоты, этанола и холестерина (Кивпег, 1991). Линолевая кислота вызывала сильное снижение упорядоченности липидов и увеличение латеральной подвижности с одновременным увеличением образования "Ог". Этанол обладал сходным эффектом, однако не увеличивал латеральную подвижность липидов. Холестерин приводил к увеличению упорядоченности и снижению латеральной подвижности липидов. Это сопровождалось падением генерации 'Ог". Причем, чем в большей степени липиды мембран находятся в разупорядоченном состоянии, тем больше генерируется "Ог".

Поверхностно-активное действие К-12 обусловлено входящим в его состав фтором. Известно (Саубенова, 1989), что фтор увеличивает проницаемость клеток для ионов, в частности для калия и натрия (Лев, 1975).

В результате проведенных исследований обнаружена корреляция между влиянием антисептиков на рост проростков пшеницы и генерацией 'Ог" корневыми клетками через пять часов преинкубации их в воде. Так, наиболее токсичный антисептик К-12 приводил к увеличению продукции 'О2" в 4 раза по сравнению с контролем, а наименее токсичный ЭОК - в 2 раза. Коррелятивная зависимость между токсичностью антисептиков и генерацией активных форм кислорода позволяет использовать определение интенсивносте генерации 'О2" в качестве теста при выявлении степени токсичности различных препаратов.

| 0,6 с г

Конт ЭОК Ката К-12

роль н

ВН За 1 час

ЦЩЗа 1 час после 5-часовой преинкубации в воде Рис. 4. Генерация супероксидного радикала корневыми клетками

3.4 Влияние катана на потребление кислорода корневыми клетками и проницаемость для ионов калия

Дальнейшие исследования были направлены на .изучение механизмов действия антисептиков, которые лежат в основе изменения роста и веса проростков пшеницы. Мы исследовали влияние антисептиков на дыхательный газообмен, поскольку дыхание поставляет энергию для ростовых процессов.

При действии катана в концентрации 0.001% на отсеченные корни происходит значительное снижение потребления кислорода (рис. 5а). Известно, что ряд фунгицидов таких как витавакс, плантвакс и байлетон, в первые 2-3 часа ингибируют дыхание корней на 30-40% (Сафина-Осташевская, Гордон, 1984). По аналогии с этими данными можно предполагать, что и катан оказывает влияние непосредственно на митохондриальное дыхание, особенно на первый сегмент дыхательной цепи митохондрий. Известно (Скулачев, 1989), что начальный участок сопряженной дыхательной цепи - самый медленный и наиболее уязвимый. Широкий круг гидрофобных ксенобиотиков блокируют дыхание именно в этом пункте цепи. Так было показано, что аналог катана катамин АБ (1.2-10"2%) ингибирует НАД-Н-оксидазу на 60% (Рудзит, и др., 1981).

Непосредственным доказательством специфичности действия ингибиторов в области первого сегмента служит снятие торможения дыхания витамином Кз (Смирнова и др., 1972; Ernster et al., 1962), который шунтирует дыхание на участке НАДН-цитохром b (Скулачев, 1989). В настоящее время витамин Кз используют для этих целей не только на изолированных митохондриях, но и на уровне клетки, ткани (Гордон, 1976). В настоящей работе был использован синтетический аналог витамина Кз -• викасол, хорошо растворимый в воде и обладающий теми же свойствами (Аничков, 1969; Гольд, 1975; Гольд и др., 1972; Гольд и др., 1973). В проведенных опытах викасол снимал ингибирующее действие катана (рис.6 ), что подтверждает предположение о действии катана в области первого сегмента электрон-транспортной цепи митохондрий.

Известно (Сафина-Осташевская, Гордон, 1984), что ингибиторы первого сегмента увеличивают выход ионов калия из клеток. Можно предположить, что и катан, как ингибитор первого сегмента, будет обладать сходным эффектом. С другой стороны химически катан является структурно-функциональным аналогом тетраэтиламмония (ТЭА). ТЭА и его алкилпроизводные блокируют калиевые каналы

мкл С>2/(г*ч)

А

§

о а о с;

1000

800

600

400

200

я Ч о а. о

ю ш а.

1000

800

600

400

200

В

I

а о

<и с ю <1)

1000

800

600

время, часы

Контроль Антисептик

Рис. 5. Влияние антисептиков на потребление кислорода корневым; клетками: А - 0.001 % катан, Б - 0.01 % ЭОК, В - 0.001 %, В 12

хб

а>

£ * £

\0 я 400

" Ч

О О. О С О

о а

600

200

® >

? I

щ 5

Ю <£

ш ч:

I »

§ §

800 600 400 200 0

|ЭЬ

1

3

Рис. 6. Влияние катана на потребление кислорода корневыми _ клетками в присутствии викасола: 1 - контроль, 2 - 0.001 % катан, 3 - 0.001 % катан+5-10"3 М викасол, 4 - 5-10"3 М викасол

Рис. 7. Влияние ЭОК на потребление кислорода корневыми клетками,

преинкубированными в воде в течение 5-ти часов, в присутствии ионов серебра: 1 - контроль, 2 -0.01 % ЭОК, 3 - 0.01 % ЭОК+Ю"5 М АдЖ)з, 4 - 10" 5 М А^Шз

глазмалеммы (Ходоров, 1975; Воробьев, 1988). Поэтому мы 1сследоваля влияние катана на выход ионов калия из клеток. >езультаты показали уменьшение в два раза выхода ионов калия на [юне катана (4.9 мкэкв/г против 8.8 мкэкв/г в контроле за 2 часа), [то свидетельствует о блокаде пассивных калиевых каналов глазмалеммы. Это могло быть одной из причин снижения |нергетических затрат на основной транспорт (снижение гнтенсивности дыхания).

К 5-6 часу инкубации дыхание на фоне катана выходило на ровень контроля (рис. 5а). Можно также отметить, что истинный локатор калиевых каналов - ТЭА к 5 часу инкубации в нем корней :ызывает стимуляцию дыхания. Таким образом, прослеживается [екоторое сходство в действии катана и ТЭА на потребление :ислорода во времени.

Не исключено двойственное влияние катана на дыхание корней: [нгибирование потребления кислорода через блокаду калиевых :аналов и непосредственное действие на первый сегмент электрон-ранспортной цепи митохондрий.

3.5 Влияние ЭОК на потребление кислорода корневыми клетками и проницаемость для ионов калия

При действии ЭОК на отсеченные корни происходит снижение потребления кислорода (рис. 56) за первый час инкубации, затем дыхание возрастает и к 3-му часу наблюдается значительная стимуляция дыхания на 40%. Причем рН среды инкубации на фоне ЭОК в течение опыта закислялась от 6.9 до 5.8, а концентрация ионов калия в среде инкубации оставалась на уровне контроля (0.33 мкэкв/г в контроле и 0.27 мкэкв/г в опыте).

Возрастание потребления кислорода к 3-му часу на фоне ЭОК и закисление среды инкубации связаны, на наш взгляд, с активацией ионтранспортирующих систем плазмалеммы. Известно (Лев, 1971), что энергетические затраты, связанные с активным транспортом, оказываются зависящими от факторов, определяющих величины утечек и, в частности, от проницаемости мембран. Проницаемость мембран увеличивают жирные кислоты ( "УУо^огак, 1974). Поскольку ЭОК представляет собой смесь синтетических жирных кислот, мы предположили, что он увеличивает проницаемость плазмалеммы для ионов.

Для доказательства мембранотропного эффекта ЭОК и возможности активации в этих условиях ионтранспортирующих систем плазмалеммы (в частности Н+-помпы) были поставлены эксперименты по совместному действию ЭОК и ионов серебра. Известно, что ионы серебра являются высокоспецифичными блокаторами протонных АТФ-аз (Лялин и др., 1981). Результаты исследования показали, что стимуляция потребления кислорода ЭОК предотвращается ионами серебра (рис.7).

По-видимому, ЭОК способствует активации интенсивности дыхания клеток корня опосредованно через усиление активности транспортных систем плазмалеммы (возможно, протонных АТФ-аз).

3.6 Влияние К-12 на потребление кислорода корневыми клетками

При действии К-12 на отсеченные корни в первые три часа инкубации происходит снижение потребления кислорода на 40-60% (рис. 5в). Поскольку К-12 является фторсодержащим соединением, можно допустить, что ингибирование дыхания связано с подавлением активности гликолитической системы клеток ионами фтора (Гордон. Бичурина, 1968). При этом можно отметить, что на фоне К-12 ш

¡удет изменяться дыхательный коэффициент. Действительно, в [роведенных исследованиях дыхательный коэффициент был близким : единице (1.15), то есть субстратом дыхания является глюкоза.

В работах (Гордон, Бичурина, 1968) показано, что под влиянием >торида натрия дыхательный коэффициент был также равен единице. Гнтересно (lager, Crill, 1975), что при воздействии фторидов на летки в них уменьшается содержание аланина, что свидетельствует б ингибировании гликолиза, вследствие чего уменьшается бразование пирувата, который является основой для синтеза ланина.

Через 4 часа дыхание корней, обработанных К-12, выходит на ровень контроля, что может быть обусловлено включением пьтернативных путей окисления глюкозы.

По данным Хилла (Hill et al., 1959) действие иона фтора на ыхание не имеет простой связи с количеством этого иона в клетках: огут накапливаться большие количества фтора и не оказывать пияния на дыхание. Авторы считают, что действие ионов фтора 1висит от того, каким образом вводить его в клетки. При ногодневном медленном проникновении в клетки фторид не эйствует на дыхание или вызывает его стимуляцию, а при нфильтрации тканей раствором фторида дыхание подавляется. В аших экспериментах выращивание проростков пшеницы на этисептике К-12 приводило к подавлению дыхания на 20%.

.7 Влияние антисептиков на термогенез корневых клеток проростков

пшеницы

Для проверки предположения о механизмах действия 1тисептиков были проведены опыты по их влиянию на !ПЛовыделение корней пшеницы. Тепло выделяется при каждом уравнивании химических потенциалов клетки, при каждом акте I утренней работы организма и служит мерой этой работы ЕСолкевич, 1968).

Поскольку катан является блокатором калиевых каналов репятствует выравниванию калиевого градиента) и ингибитором ¡рвого сегмента электон-транспортной цепи митохондрий (снижает :ислительные процессы в митохондриях), можно предположить, что ш его действии термогенез будет снижен. Действительно, в опытах а наблюдали значительное подавление тепловыделения (рис. 8а).

Мы предположили, что под влиянием ЭОК возрастает проницаемост плазмалеммы для протонов и калия, переносчиками которы являются жирные кислоты, входящие в состав ЭОК. Выравнивани ионных градиентов сопровождается выделением тепла (Жолкевич 1968; Скулачев, 1989). В предыдущих опытах было показано, что ЭО] стимулирует дыхание опосредовано через активацию Н+-АТФ-азы работа которой может тоже сопровождаться выделением тепла. Н фоне ЭОК термогенез возрастал (рис. 86), что подтверждав предположение о механизме действия этого антисептика. Через 4 час инкубации отсеченных корней в растворе ЭОК и потреблени кислорода, и термогенез приближаются к контролю, чт свидетельствует о снижении энергетических затрат на транспор ионов калия и протонов. Можно полагать, что за этот период времен: произошла компенсация потерь клетками ионов калия (содержани ионов калия в среде инкубации в контроле - 0.33 мкэкв/г, в опыте 0.27 мкэкв/г). Одновременно имело место уменьшение пассивног поступления протонов в клетку, поскольку рН среды инкубаци: снизился на единицу (с 6.9 до 5.8). Подтверждением снижени, энергетических затрат на транспорт ионов является снижени тепловыделения на фоне ЭОК.

Мы предположили, что действие К-12 направлено в основном н ингибирование гликолитической системы, что обусловлено наличие] ионов фтора. В литературе практически нет данных о влияни: специфических ингибиторов дыхания на термогенез. Можн допустить, что ингибирование энергетического обмена в течение 2-часов будет сопровождаться именно снижением термогенеза, так ка: последний в значительной степени определяется активность! окислительных реакций. Действительно, в наших эксперимента: наблюдалось снижение выделения тепла в первые шесть часов. Пр: более длительной инкубации корней в растворе К-12 (7-12 часо! могут включаться альтернативные пути окисления глюкозы ил: других субстратов (жирные кислоты). При этом вполне возможно н подавление, а усиление термогенеза, что и наблюдалось экспериментах через 7-12 часов (рис. 6в).

Можно отметить, что на фоне К-12 уже через 5-6 часо происходит ослабление ингибирующего действия этого антисептика н потребление кислорода (рис. 5в). Можно допустить, что имеет мест активация систем детоксикации яда. Известно, что процес детоксикации (особенно окислительной) сопровождается увеличение] потребления кислорода и особенно теплопродукции. Так, показан

:ал/(г*ч)

3 Б

Контроль ' Антисептик

6 7 8 время, часы

11

1С;

8. Термогенез корней проростков пшеницы при действии антисептиков: А - 0.001 % катан, Б - 0.01 % ЭОК, В - 0.001 % К-12

(Gordon et. al., 1994), что обезвреживание некоторых ксенобиотиков корневыми клетками сопровождается резким возрастанием термогенеза, потребления кислорода и генерацией 'Ог".

Таким образом, уровень термогенеза определяется спецификой действия того или иного антисептика. Непосредственное действие катана и К-12 на энергетический аппарат клетки сопровождается i начальный период времени ингибированием термогенеза. Поскольку антисептик ЭОК увеличивает мембранную проницаемость, то обнаруживается возрастание термогенеза корневыми клетками. Б большинстве случаев интенсивность термогенеза коррелирует с интенсивностью потребления кислорода.

ВЫВОДЫ

1. Бесхлорфенольные антисептики для защитной обработки древесины от фунгицидного воздействия в разной степени оказывают влияние на рост корней и надземной части проростков пшеницы:

а) катан, основным токсическим ингредиентом которого является соединение четвертичного аммония, в концентрации 0.001% ингибирует рост надземной части;

б) ЭОК, содержащий соли синтетических жирных кислот, i концентрации 0.01%, не оказывает влияния на рост проростков пшеницы;

в) К-12, содержащий соединение фтора, в концентрации 0.001% подавляет рост корней и не влияет на рост надземной части.

2. Антисептики катан и ЭОК способствуют увеличении оводненности корней и снижению содержания воды в надземной часта проростков пшеницы.

3. Наименее токсичным антисептиком из трех испытанных i отношении проростков пшеницы является ЭОК.

4. Вновь синтезированные антисептики катан и К-12 i концентрации 0.001% снижают потребление кислорода корням! проростков пшеницы. Снижение интенсивности дыхания корне! катаном может быть связано с действием на первый сегмент дыхательной цепи митохондрий и блокированием калиевой про ницаемости плазмалеммы. Подавление интенсивности дыхания К-12 обусловлено блокированием гликолитической системы.

5. ЭОК в концентрации 0.01% стимулирует дыхание корне! проростков пшеницы. Установлено, что стимуляция дыханш

1редотвращается ингибитором АТФ-азных систем плазмалеммы -гонами серебра, что свидетельствует об увеличении этим штисептиком пассивной проводимости для ионов.

6. Впервые получены данные о действии антисептиков на :ермогенез корней проростков пшеницы. Обнаружена коррелятивная )ависимость между изменениями дыхания и термогенеза.

7. Впервые получены данные об активации антисептиками генерации супероксидного радикала корнями проростков пшеницы. Генерация супероксидного радикала на фоне более токсичного 1репарата К-12 возрастает в четыре раза по сравнению с контролем.

8. Коррелятивная зависимость между токсичностью штисептиков и генерацией активных форм кислорода позволяет использовать определение интенсивности генерации супероксидного радикала в качестве теста при выявлении степени токсичности различных препаратов.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Варфоломеев Ю.А., Костина Е.Г. Влияние антисептиков на структуры жизнедеятельности клеток микроорганизмов// Деревообрабатывающая промышленность.-1992.-N.3.-0.4-5.

2. Варфоломеев Ю.А., Костина Е.Г. Влияние активных ингредиентов антисептиков на метаболизм и структуру клеток// Лесной журнал.-1993.-N.1.-0.82-84.

3. Варфоломеев Ю.А., Костина Е.Г. Воздействие антисептиков на рост растений и генерацию ими активных форм кислорода// Лесной журнал.-1994.-Ы.2.-С.69-73.

4. Варфоломеев Ю.А., Костина Е.Г. Воздействие антисептиков на дыхательный газообмен растений//Лесной журнал (в печати).

5. Костина Е.Г., Гордон Л.Х. Рост проростков пшеницы и генерация супероксидного радикала при обработке бесхлорфенольными антисептиками//Физиология и биохимия культурных растений (в печати).

6. Костина Е.Г., Гордон Л.Х. К вопросу о механизме действия бесхлорфенольных антисептиков на дыхательный газообмен корней шпеницы//Физиология и биохимия культурных растений (в печати).

Кос^и-и^-