Изучение вертикального переноса генов от биозащищенных растений к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам

Крутенко, Дмитрий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изучение вертикального переноса генов от биозащищенных растений к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение вертикального переноса генов от биозащищенных растений к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам"

На правах рукописи

КРУТЕНКО Дмитрий Викторович

ИЗУЧЕНИЕ ВЕРТИКАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА ГЕНОВ ОТ БИОЗАЩИЩЕННЫХ РАСТЕНИЙ К ИХ ДИКИМ СОРОДИЧАМ И ТРАДИЦИОННО ВОЗДЕЛЫВАЕМЫМ СОРТАМ

06.01.11.-защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар 2006

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБЗР РАСХН)

Научный руководитель: - кандидат сельскохозяйственных наук

Киль Владимир Ильич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Краснодарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства им. П.П.Лукьяненко

Защита состоится «24» мая 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.220.038.06 в Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, КубГАУ, факс (861) 221-38-85.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета. Автореферат разослан «.££.» 2006 г.

- профессор, доктор сельскохозяйственных наук Зеленский Григорий Леонидович

- кандидат биологических наук Мухина Жанна Михайловна

Ученый секретарь диссертационного сов доктор биологических наук, профессор

z.oo6^

302>2> 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Успехи современной биотехнологии привели к созданию генно-модифицированных (ГМ) растений и их широкому внедрению в практику сельскохозяйственного производства.

Перспективным направлением в биологической защите растений является использование генно-модифицированных биозащищенных от вредителей сортов, а также сортов, устойчивых к гербицидам. Это особенно важно, если учесть, что многие вредители сельскохозяйственных культур приобрели резистентность к большинству химических инсектицидов, следствием чего является увеличение объемов их внесения, загрязнение окружающей среды и в итоге потери урожая.

Значительный вред урожаю также наносит конкуренция со стороны сорных растений. В данной ситуации имеет большое значение использование раундап-защищенных сортов сои и кукурузы, так как Раундал широко применяемый гербицид, известный своей очень высокой эффективностью и имеющий высокие показатели безопасности. Широкое использование ГМ-растений в сельскохозяйственном производстве ставит на повестку дня вопросы их биобезопасности.

Одним из аспектов биобезопасности ГМ-культур является оценка вертикального переноса генов от ГМ-расгений к культурным сортам и диким сородичам. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению.

В этой связи актуальность наших исследований определяется необходимостью инструментального контроля ГМ-растений и получаемых на их основе продуктов и кормов для животноводства. Основным методом для быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений в настоящее время является ПЦР (полимеразная цепная реакция). Однако используемые в нашей стране методики ПЦР-детекции недостаточно эффективны и требуют доработки. До сих пор не разработаны рекомендации по безопасному выращиванию ГМ-культур, и, в частности, не исследованы вопросы переноса генов от трансгенных растений другим представителям биоценоза.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - оценить риск вертикального переноса генов от трансгенных биозащищенных растений кукурузы и картофеля к культурным сортам и диким сородичам. Для достижения поставленной цели в задачи исследований входило:

- модифицировать методику выделения препаратов ДНК из семян растений, для их анализа методом нолимеразной цепной реакции ИОН АЛЫ^АУ

- модифицировать методы ПЦР-детекции и иденИирлн^ВВКАгранфенных

СП----'—— 1

ЗЗЬ'.

растений;

разработать методы полуколичественной оценки генетически-модифилированных источников (ГМИ);

- разработать методику оценки риска вертикального переноса трансгенов на примере ГМ-кукурузы, устойчивой к гербициду Раундап, и ГМ-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку;

- определить степень риска и разработать меры по предотвращению вертикального переноса генов от раундап-защищенной кукурузы и Вг-защищенного картофеля к культурным сортам и диким сородичам.

Научная новизна. В настоящей работе:

- представлена модифицированная методика выделения ДНК по Дорохову и Клоке (1997) применительно к семенам растений, пригодная для проведения ПЦР;

- повышена эффективность методов детекции и идентификации трансгенных растений посредством оптимизации условий проведения ПЦР-реакции и подбора специфичных праймеров, а также использованием в реакции дополнительных положительных контролей;

разработана методика полуколичественной оценки генетически-модифицированных источников на основе амплификации участка целевого гена;

- оценен риск и разработаны меры по предотвращению вертикального переноса генов от генно-модифицированных биозащищенных растений к диким сородичам и другим культурным сортам.

Научно-практическая ценность работы. Результаты опытов по вертикальному переносу генов от генно-модифицированных биозащищенных растений к культурным сортам и диким сородичам позволяют оценить риски интродукции трансгенных растений в окружающую среду, определить особенности их выращивания, а также защиты от вредителей и сорняков. Внедрение в сельскохозяйственное производство генно-модифицированных биозащищенных от колорадского жука сортов картофеля и Раундап-защищенных сортов сои и кукурузы будет способствовать сокращению использования химических средств защиты, что приведет к уменьшению потерь урожая и к улучшению состояния окружающей среды. Для целей более эффективного мониторинга ГМ-растсний и продукции на их основе рекомендуется использовать модифицированные методы ПЦР-детекции и разработанные методы полуколичественной оценки ГМИ.

Основные положения, выносимые на защиту:

- ПЦР-детекцию необходимо проводить с дополнительным положительным контролем, для сои - амплификация участков генов актина (350 п.н.) и лектина (318 п.н.), для кукурузы - генов актина (350 п.н.) и зеина-19 (387 п.н.) и для

картофеля - пататина (216 п.н.), что позволяет проверить качество (чистоту) препарата выделенной ДНК, а также проверить другие химические компоненты П1 {Р-реакции во избежание ложно отрицательных результатов;

- разработанный нами метод полуколичественной оценки ГМИ позволяет эффективно проводить не только детекцию трансгенов в зерне и семенах, но и определять их количественное содержание без использования дорогостоящего оборудования;

- риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля можно считать минимальным, изоляция трансгенного картофеля от других сортов не требуется. Риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с грансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с традиционными сортами. При этом рекомендуется использовать защитные мероприятия, а частности, путем создания барьеров на пути движения пыльцы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи 22-26 сентября 2003), на Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва 12-14 ноября 2003), на 2-м Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,10-14 ноября 2003), на 5-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научная обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 18-19 декабря 2003 г.), на II региональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов Краснодарского края «Медицина и здравоохранение». -Анапа, 21-23 апреля 2004, на III ВОГиС) Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (Москва 6-12 июня 2004), на международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г), на 7-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса».- Краснодар, 8-9 декабря 2005 г.

Декларация личного участия автора. Диссертация содержит фактический материал, полученный лично автором в течение 2002-2005 гт. Полевые опыты но вертикальному переносу генов кукурузы и определению видового состава насекомых проводились совместно с лабораторией гербологии ГНУ ВНИИБЗР РАСХН. Личный вклад автора в получение результатов исследований составляет 80%.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, методики

проведения исследований, результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, приложений Содержит 8 таблиц и 30 рисунков. Список использованной литературы включает 17! источник, в том числе 156 на иностранном языке. Диссертация является самостоятельным завершенным научным трудом.

Автор считает своим долгом выразить глубокую благодарность и признательность научным сотрудникам ГНУ ВНИИБЗР РАСХН, содействовавшим выполнению настоящей работы и в особенности научному руководителю диссертационной работы к.с.-х.н. В.И. Килю; к.б.н. А.П. Савве; д.с.-х.н. В.Е. Болахоненкову; д.б.н. Е.П. Угрюмову; к.б.н. В.Я. Исмаилову и сотруднику КубГУ д.б.н. Ю.А. Волчкову.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В этой главе дан аналитический обзор литературных источников о распространении и использовании в сельскохозяйственном производстве генетически модифицированных культур. Анализируются сведения о биобезопасности Bt-защищенного картофеля (растение-инсектицид), а также раундап-защищенных сое и кукурузе. Рассматривается риск вертикального переноса трансгенов и факторы, определяющие степень такого риска. Обсуждается эффективность различных методов инструментального подхода к определению наличия трансгенов в пищевых продуктах и кормах. На основании анализа сформированы основные направления исследований.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Научно-исследовательская работа проводилась в 2002-2005 гг. в секторе биотехнологии ГНУ ВНИИБЗР РАСХН г. Краснодар в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001-2005 гг. раздел 05.02: «Изучить особенности защиты от вредителей, болезней и сорняков и безопасность для окружающей среды трансгенных сортов, гибридов и линий сельскохозяйственных культур».

Объектами исследования служили Раундап-устойчивая соя Stine 2254 RR и её исходный сорт (Монсанто, США), Bt-защищённый картофель Solanum tuberosum на основе сортов Невский, Луговской и Рлизавета, и их исходные линии (Модификации Центра «Биоинженерия» РАН), местные адаптивные сорта Дезире и Приор, дикие формы картофеля Solanum chacocnse subsp. Chacoense,

Раундап-устойчивая кукуруза NK 603 RR (Монсанто), а также нетрансгенные сорта кукурузы Краснодарский 408 АТВ и Краснодарский Белозерный 200.

Выделение ДНК из семян проводили по методу Дорохова и Клоке (1997), в нашей модификации, Wizard-методом (Promega) и двумя вариантами СТАВ. Концентрацию ДНК измеряли на двух лучевом спектрофотометре «Perkin-Elmer Model 124» (Hitachi).

Амплификацию ДНК проводили в 25 мкл реакционной смеси. Все компоненты кроме ДНК входят в набор для амплификации фирмы «Диалат Ltd» (Москва).

Приготавливали реакционную смесь, путем последовательного добавления в одну из пробирок компонентов (на 1 пробу): 18,625мкл НгО; 2,5мкл реакционного буфера без MgCb (ЮХ); 0,75мкл MgCl2; 0,5мкл смеси dNTP's; по 0,25мкл праймеров; 0,125мкл Taq-полимеразы; 2мкл ДНК.

В работе были использованы следующие праймеры: SA и SS (35S-промотор); NA и NS (NOS-терминатор); L1 и L2 (лектин); RPss и FPss (пататин); RR01 и RR04 (СР4 EPSPS); СгуША 01-5' и CryIHA 01-3' (Ciy HI А) -синтезированы фирмой «Диалат Ltd». PZ 19L и PZ 19R (зеин-19кДа) - любезно предоставленные нам Д. Сметаниным (КНИИСХ, Краснодар).

Далее пробирки помещали в амгошфикатор «Терцик» («ДНК-Технология») и запускали одну из следующих программ:

- режимы амплификации для 358-промотора и NOS-терминатора: 3 минуты 30 секунд при 94°С - предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 20 секунд денатурация при 940С, 40 секунд отжиг праймеров при - 54°С, 60 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72"С.

- режимы амплификации для гена СР4 EPSPS: 3 минуты при 94°С -предварительная денатурация, следующих 50 циклов: 45 секунд денатурация при 94°С, 45 секунд отжиг праймеров при - 60°С, 25 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 10 минут при 72°С.

- режимы амплификации для гена Cry III А: 10 минут при 94°С -предварительная денатурация, следующих 50 циклов: 30 секунд денатурация при 94°С, 30 секунд отжиг праймеров при - 60"С, 30 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 7 минут при 72"С.

Электрофорез продуктов амплификации осуществляли в 2% агарозиом геле при напряженности -электрического поля 5В/см, и в 3% агарозном геле при идентификации Bt-картофеля.

Статистическая обработка данных была выполнена с помощью программы Microsoft Office Excel 2003.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 ПЦР-ДЕТЕКЦИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ.

В задачу нашего исследования входила сравнительная оценка эффективности и оптимизация методов ПЦР детекции ГМ-сои, кукурузы и картофеля.

Несомненно, что для быстрого скрининга ГМ-зерна и кормов неизвестной природы необходим универсальный подход. Таковым может являться ПЦР-анализ с одновременным использованием двух пар праймеров: к промотору -Р355 и терминатору N08-3, так как подавляющее большинство ГМ-сортов различных сельскохозяйственных культур (включая ВЪ-картофель и ЯЯ-кукурузу и сою) содержат в своей генетической конструкции хотя бы один из указанных генетических элементов.

В то же время, при проведении реакции амплификации с целью детекции трансгенов очень важным является использование нескольких контролен. В реакции используют два отрицательных контроля: в первом случае в реакционную смесь не добавляется ДНК, а во втором - добавляется не ГМ-содержащая ДНК. Наличие продуктов амплификации в данном случае будет свидетельствовать о загрязнении препаратов ДНК во время выделения, компонентов ПЦР или о некорректности выполнения самой процедуры ГПДР Такие ложно положительные результаты, получаемые в результате загрязнения образцов или реагентов, часто представляют проблему при массовой ГЩР-диагностике. При этом ложно положительные результаты более редки и вызваны высокой чувствительностью метода ПЦР.

В качестве положительного контроля, прежде всего, берут ДНК известного стандартного ГМ-содержащего образца В дополнение к этому мы предлагаем использовать амплификацию участка гена, который в любом случае будет находиться в данном образце Это делается для проверки качества (чистоты) препарата выделенной ДНК, а также для проверки других химических компонентов ПЦР-реакции во избежание ложно отрицательных результатов

Методика выделения ДНК по Д Б Дорохову и Э. Клоке (1997) была нами модифицирована следующим образом:

После заключительной стадии растворения осадка в 100 мкл Т1г-буфера в каждую пробирку добавляли 14 мкл рабочего раствора РНКазы и инкубироврли в течение одного часа в суховоздушном термостате при 37°С. Затем добавляли 100 мкл смеси хлороформ/фенол (1:1) и 2 мкл изоамилового спирта, перемешивали и центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин. Супериатант огбирали в чиоые пробирки. К супернатанту добавляли 0,1 объёма 3 М ацетата натрия и 2,5 объёма охлажденного при -20°С 96% этанола, перемешивали и оставляли на ночь при -20°С

(либо на 2 часа при -70°С). Далее центрифугировали 10 мин при 8 ООО об/мин, осадок промывали дважды 70% этанолом, а затем растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера Концентрацию ДНК измеряли на двухлучевом спектрофотометре Perkin-Elmer Model 124 (Hitachi) или в 0,8% агарозе электрофорезом.

Кроме того, выделение ДНК из растительных тканей проводили также Wizard-методом (Promega) и двумя вариантами СТАВ. Выделенная ДНК одинаково хорошо рестрицировалась (рестриктазой Pstl) и амплифицировалась в ПЦР, с использованием различных пар праймеров, направленных на регуляторные области генома (358-промотор и NOS-терминатор). Максимально высоким выходом и приемлемой чистотой (Г>2«Д>280 = 1,8 — 2,0) отличались препараты ДНК, выделенные из семян Wizard-методом и по Дорохову и Клоке, в нашей модификации. Препараты ДНК, выделенные из листьев по Дорохову и Клоке, содержали большие примеси полифенолов, вследствие чего амплификация была затруднена. При этом важно отметить, что Wizard-экстракция являлась наиболее простым, быстрым и эффективным методом выделения ДНК из растительных тканей, но в то же время - и самым дорогостоящим. Поэтому в дальнейшем в работе выделение ДНК из семян проводили по Дорохову и Клоке, в нашей модификации, а из листьев - СТАВ-методом.

Сравнительный анализ детекции трансгенов по регуляторным областям генома выявил, что в одинаковых условиях амплификации наиболее четкая картина электрофоретических фрагментов наблюдается при использовании пары праймеров, направленных на 358-лромотор. Синтезируемый фрагмент (195 п.н.) был более интенсивным, нежели для NOS-терминатора (180 п.н.) (рис. 1).

Рисунок 1 - ПЦР-детекция ГИМР (на примере Ю1-сои) по наличию в геноме 35Я промотора (195 п.н.) и Ыов-терминатора (180 п.н.); М - маркер молекулярной массы

В качестве контроля при детекции сои мы использовали амплификацию участка I сна актина (350 п.н.) (рис. 2) и лекжна(318 п.н.) (рис. 3),

1 2 3 М

§1

зДэ

^ш350п.н.

195 п и

{в 350 л.н.

195 л н

Рисунок 2 - ПЦР-детекция ЯК-сои. ! - не ГМ соя; Рисунок 3 - ПЦР-детекция 2-3 - ГМ-соя; М - маркер молекулярной массы. ЯЯ-сои. 1 - не ГМ соя; 2,

3,4- ГМ-соя; М - маркер молекулярной массы, в случае картофеля - амплификацию участка гена пататина (216 п.н.) (рис. 4) и для кукурузы - использовали амплификацию участка гена зеин-19 (387 п.н.) (рис. 5).

^ 387 п н

195 пн

Рисунок 4 - ПЦР-детекция Ек-картофеля. 1 - не ГМ-картофель, 2, 3, 4 - ГМ-картофель; М - маркер молекулярной массы.

Рисунок 5 - ПЦР-детекция ЯИ-кукурузы. 1,2— ГМ-кукуруза; «К1 +» -ДНК ЯК-сои.; «К2+» - семена не ГМ-кукурузы; «М» - маркер молекулярной массы.

В результате исследований подобрана оптимальная система ПЦР-детекции В^картофеля, ЯК-сои и кукурузы, что позволяет проводить эффективный мониторинг этих ГМ-культур как в агроценозах, так и в сельскохозяйственной продукции на их основе.

3.2 ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИЯ RR-СОИ, ВТ-КАРТОФЕЛЯ И RR-КУКУРУЗЫ.

ПЦР-идентификацию трансгенов проводили по нуклеотидным последовательностям, кодирующим участки целевых генов: СР4 EPSPS - 356 п.н. и Cry III А - 117 п.н., ответственных за устойчивость к гербициду Раундал и колорадскому жуку, соответственно.

В качестве дополнительного положительного контроля при идентификации сои мы использовали амплификацию участка гена лектина (318 п.н.) (рис. 6), в случае картофеля - амплификацию участка гена пататина (216 п.н.) (рис. 7) и для кукурузы - использовали амплификацию участка гена актина (350 п.н.) (рис. 8) и гена зеин-19 (387 п.н.) (рис. 9).

М ! : • 4 5 6 7 К

ш»

«г* ♦ Ж

I I'Sl'S

m ** т ш

Ш «"*■• *т Ш

Ш t

356 п.н. фв 318 п.н.

Рисунок 6 - ПЦР-идентификация RR-сои.1-7 - ГМ-соя, К - не ГМ-соя,- М -маркер молекулярной массы.

4 S 6 ГЧ

Пататин

¿¿¿ль. ij^Mft. яШЁЬ- Лм^

д^^Р"

If» 216 и ч.

Л&ие- ¡Ш "Ш «Ш 1

Cry III А

117 п н

Рисунок 7 - ПЦР-идентификация Bt-картофеля. 1, 2 - не ГМ-картофель, 3-6 - ГМ-картофель; М - маркер молекулярной массы

Ьш 356 II н 387 п н

Рисунок 8 - ПЦР-идентификация ИЛ- Рисунок 9 - ПЦР-идентификация 1*11-кукурузы. 1-5 - ГМ-кукуруза; ММ - кукурузы. 1-8 - ГМ-кукуруза; М -мастермикс; М - маркер маркер молекулярной массы, молекулярной массы.

Таким образом, подобрана оптимальная система ПЦР-идентификации Вь картофеля, ИИ-сои и кукурузы, что позволяет проводить специфический анализ при мониторинге этих ГМ-культур как в агроценозах, так и в сельскохозяйственной продукции на их основе.

3.3 ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ НА СПЕЦИФИЧНОСТЬ И (ИЛИ)

В случае малой концентрации ГМИ в пище или кормах скрининг может быть затруднён. Это может быть связано с недостаточной оптимизацией параметров ПЦР-реакции, что в свою очередь приводит к уменьшению выхода реакции и к появлению неспецифичных полос при гель-электрофорезе. Появление неспецифичных полос мы наблюдали при концентрациях ГМИ в образцах от 0,1% до 0,5%. Поэтому в задачу нашего исследования входило тестирование ряда веществ, влияющих на специфичность и (или) выход ПЦР-реакции.

Установлено, что при добавлении диметилсульфоксида (ОМЗО) в концентрации 1,4 М реакция не проходит. Добавление формамида (1 М) приводило к снижению выхода реакции амплификации, т.е. к уменьшению интенсивности 1Ш-полосы по сравнению с контролем. Добавление бычьего

ВЫХОД ПЦР-РЕАКЦИИ.

сывороточного альбумина (BSA) (0,1 мкг/мл) незначительно повышало выход ГЩР-реакции, но не влияло на специфичность. Увеличение выхода реакции (больше, чем при добавлении BSA) и отсутствие неспецифических полос в нашем эксперименте наблюдалось при добавлении хлорида аммония в концентрации 15 мкМ [Kovarova, 2000] (рис 10).

К 1 2 3 VI

+1 350 il а

Рисунок 10 - Влияние различных веществ на специфичность и (или) выход ПЦР-реакции на примере амплификации участка гена СР4 ЕРБР8 ЯЯ-сои. М- маркер молекулярной массы, 1- Хлорид аммония (15 мкМ), 2-ВвА (0,1 мкг/мл), 3-Формамид (1М), К - контроль (без добавочных веществ).

Таким образом, добавление в реакцию хлорида аммония в указанной концентрации позволяет проводить ПЦР-идентификацию даже при концентрациях ГМИ в образце ниже 0,5%.

3.3 ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКИ-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ В настоящее время для целей количественного анализа ГМ-компонента в пище и кормах используют метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Однако этот метод вследствие своей дороговизны широко не используется. Поэтому в нашу задачу входила разработка более простого и относительно недорогого метода полуколичественной оценки ГМ-компонента («semi-quantitative method») на примере RR-сои, который позволил бы проводить не только детекцию и идентификацию трансгенов в пище и кормах, но и определять их количественное содержание.

Подготовка образцов. Семена исходной и трансгенной сои измельчали с помощью зерновой мельницы. Из полученной муки готовили смеси со следующим массовым содержанием ГМ-компонента: 0,01%; 0,1%; 0,5%; 1%; 3%; 5%; 10%

Затем брали навески по 200 мг и добавляли 400 мкл экстракционного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 7.5; 250 мМ NaCl; 25мМ EDTA; 0,5 % SDS) (Дорохов и Клоке, 1997). Далее выделение проводили согласно протоколу в нашей модификации Амплификацию ДНК осуществляли с использованием следующих праймеров: RR01 и RR04 (участок гена СР4 EPSPS) — синтезированы фирмой «Диалат Ltd». Визуализацию продуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле.

Предварительные исследования электрофореграмм продуктов амплификации выявили, что нижняя граница чувствительности данного метода полуколичественной оценки составила около 0,1%. Поэтому в дальнейшем в опытах мы не использовали образцы с содержанием ГМ-компонента ниже 0,1%. На рисунке 11 представлена электрофореграмма продуктов амплификации образцов ДНК сои, выделенных из навесок соевой муки с массовым содержанием ГМ-компонента 0,1%; 0,5%; 1%; 3%; 5%; 10%.

.4 м

f ш

1М"/.> О.?'/,, г:. з% 5% «г/., за

___. ,__>____ ( > г-'--, __)__ 4MB

•> • ■ " »» т» ни*

-4*

Рисунок 11 - Полуколичественная оценка ГМ-компонента в соевой муке на примере амплификации участка целевого гена ЕР8Р8 (356 п.н.).

Как видно из рисунка, интенсивность полос падает с уменьшением содержания ГМ-компонента в образце. Полученные нами смеси соевой муки с массовым содержанием ГМ-компонента 0,1%; 0,5%; 1%; 3%; 5%; 10% можно использовать в качестве стандартов для полуколичественной оценки пищевых продуктов и кормов на предмет содержания ЯЯ-сои. Для этого:

1. Выделяют ДНК согласно описанному выше протоколу из испытуемого образца (как минимум в двух повторностях) и из стандартов (с содержанием ГМ-компонента: 0,1%; 0,5%; Г/о; 3%; 5% или 10%);

2. Проводят амплификацию выделенных образцов ДНК одновременно в одинаковых условиях;

3. Далее на электрофореграмме сравнивают интенсивность полос стандартных и испытуемых образцов

Данный метод при подборе определенных условий, вероятно, можно использовать не только для полуколичественной оценки RR-сои, а также RR-кукурузы и других Раундап-защищённых культур.

3.4 ВЕРТИКАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ КАРТОФЕЛЯ. Опыт проводили в течение 2003-2005 гг. на закрытых сертифицированных участках опытных полей ГНУ ВНИИБЗР РАСХН на трансгенных линиях и исходных сортах картофеля. В качестве донора пыльцы использовали генно-модифицированные линии отечественных сортов картофеля Solamim tuberosum. Невский, Луговской и Елизавета. Ловушками пыльцы служили нетрансгенные растения картофеля. Помимо исходных сортов картофеля Елизавета, Невский и Луговской в опыте использовали местные адаптивные сорта Дезире и Приор, а также дикие формы картофеля Solanum chacoense suhsp Chacoense (линии PI 472816, PI 472813, PI 458316, PI 472818, PI 472809).

Цель работы - оценка возможности получения ботанических семян -гибридов от скрещивания трансгенных линий картофеля и исходных сортов.

Цветение отдельных исходных растений всех сортов отмечалось во второй половине июня при отсутствии цветения у ГМ-растений этого сорта. Одновременное цветение трансгенных и исходных растений наблюдали у всех сортов в начале июля.Растения картофеля сорта Елизавета отличались плохой всхожестью и отсутствием цветения. Их гибель была отмечена в начале июля. Помимо естественного ветроопыления, использовали принудительное. Всего было произведено 35 скрещиваний' у исходного растения удалялись пыльники при использовании пинцета (в каждом случая использовался стерильный инструмент). Пыльцу трансгенного растения брали непосредственно из пыльников. Рыльце исходного растения опыляли пыльцой трансгенного. Количество опыленных цветков в соцветии ограничивали 3-4-мя, лишние незрелые цветки удалялись (было замечено до 8 цветков в соцветии). После чего на каждое опыленное соцветие исходного растения ставили изолятор. Завязь семян наблюдали только у диких форм картофеля (собрано две ягоды). I В качестве опылителей на трансгенном и исходном картофеле были

* замечены следующие насекомые: шмели, мухи-сирфиды, жуки-бронзовки и в

редких случаях пчелы. На исходные сортах картофеля в качестве целевого объекта был отмечен колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say, однако на трансгенных сортах картофеля наблюдалась его 100% гибель. На трансгенном и исходном картофеле в качестве нецелевых объектов были отмечены следующие насекомые: озимая совка (Agrolis segetum Schiß, медведка (Gryllotalpa gtyllotalpa

/-.), жук-щелкун (Agriotes tauricus Heyden), семиточечная божья коровка (Coccinella septempunctata L.), двухточечная божья коровка (Adalia bipunctata L.).

Ботанические семена, собранные на диком картофеле, были подвергнуты дальнейшему анализу. Семена ягоды образовавшейся на диком картофеле PI 458316 оказались нежизнеспособными. Из ягоды картофеля PI 472813 было собрано и положено на проращивание 32 семени. Адаптацию в полевых условиях прошли 10 растений, от которых были взяты листовые экспланты и выделены образцы ДНК. ПЦР-анализ не выявил наличия трансгенной вставки (участок гена Cry III А 117п.н.) в данных образцах (рис. 12).

К- К+ 1 2 3 Д Пататин BR

(216п.н.) Ä

4 5 6 7 8 9 10

луш ^иШЮг^

ЗДЯг ЩШШ ЧИРР1

Cry III А « (117 п.н.)

Рисунок 12 - ПЦР-анализ растений картофеля на наличие трансгенной вставки.1-10 -образцы растений картофеля.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что перенос генетической конструкции осуществлен не был. Необходимо отметить, что, несмотря на то, что картофель является самоопылителем, перекрестное опыление может составлять у него от 0 до 20 % [РЫвЮё, 1980]. Если учесть, что в качестве посадочного материала в нашей стране служат клубни картофеля, а не семена, можно заключить, что риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля можно считать минимальным. К тому же дикие родственники картофеля на территории Российской Федерации не произрастают, а если бы и произрастали - гибридные семена не образовывались бы, что подтверждается результатами наших опытов.

3.5 ВЕРТИКАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ КУКУРУЗЫ.

На закрытых сертифицированных участках опытных полей ГНУ ВНИИБЗР РАСХН в течение 2003-2005 гг проводили опыт по изучению возможности вертикальной передачи генов от Раундап-защишённой кукурузы к традиционно возделываемым сортам, В задачу исследований входило" изучение возможности переноса пыльцы; дистанция рассеивания пыльцы; определение зоны

культуры кукурузы, а также определение видового состава и относительной численности насекомых, как потенциальных переносчиков пыльцы (энтомохорный перенос).

В качестве донора пыльцы использовали растения RR-кукурузы линии NK 603 (желтозёрные). Ловушками пыльцы служили нетранменные растения кукурузы гибрида Краснодарский 408 АТВ и сорта «Краснодарский Белозерный 200» (белозёрные). Делянки с растениями-ловушками располагались от источника на расстоянии 5, 10, 20, 50, 100, 200 и 250 м в восьми направлениях: северном (С), северо-восточном (С-В), северо-западном (С-3), южном (Ю), юго-восточном (Ю-В) и юго-западном (10-3), восточном (В), западном (3) согласно схеме на рисунке 13.

В полевых опытах, начиная с фазы цветения кукурузы и до созревания зерна, на всех вариатах опыта проводили регулярные (2 раза в неделю) учеш видового состава и относительной численности насекомых. На каждой опытной делянке анализировали rio 5 растений в 4 точках. Существенных различий в видовом составе насекомых и их численности на опытных делянках не отмечено. В фазу цветения на листьях кукурузы практически на каждом растении были обнаружены трипсы, клопы родов Lygus, Anthocoris, Orius, Nabis, 7-точечная и 13-точечная божьи коровки, яйцекладки клопов, единично зараженные теленоминами. Кроме того, на растениях отмечены цикадки Macrosteles laevis Rib., Psammotettix striatus t., Kuboasca bipunctata Osh. Ha растениях и метелках кукурузы отмечались Coccinella septempunctata L., Cocinulla quatuordecimpustulata L., тли Shizaphis graminum Rond, Aphis mayáis Fitch., клопы рода Anthocoris, бабочки хлопковой совки Heliothis armígera Hb. и кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis НЬп.,ъ початках гусеницы всех возрастов хлопковой совки (20 % початков), гусеницы младшего и среднего возрастов кукурузного мотылька (80 % початков). В фазу созревания зерна (начало первой декады сентября) видовой состав насекомых и их численность заметно сократились и до уборки уже практически не изменялись. В початках кукурузы встречались гусеницы старших возрастов хлопковой совки и кукурузного мотылька. На початках отмечены клопы родов Anthocoris, Nabis, реже тли, Coccinella septempunctata L и божьи коровки Cocinulla quatuordecimpustulata. Потенциальными переносчиками пыльцы ГМ-кукурузы в первую очередь могут быть бабочки хлопковой совки и кукурузного мотылька, откладывающие яйца на метелки и початки кукурузы и совершающие большие перелеты (до 2 км), в меньшей степени имаго тлей, клопов, цикадок и кокцинеллид.

с-з

250 м

140 м

200 м

250 м

с-в

100 м

20 м

10 м

200 м

100 м

Мм

20 м

ШШ 0ЫЫ ж

ДОНОР

|5м|

| 5м |

ЖМИ

20 м

50 м

100 м

20Ф М

ю-з

140 м

- делянки с трансгенными растениями

ю-в

Рисунок 13 - Схема проведения опыта по вертикальному переносу генов кукурузы.

Было отмечено, что на метелках первыми появлялись пчелы В дальнейших учетах в период массового цветения на каждой делянке находилось по 1-3 пчелы, и, как правило, их пыльцевые сумки были полными. Кожнантными вредителями изучаемой культуры во время наблюдений были полевой клоп Lygus pratensis L., полосатая хлебная блоха Phyllotreta vittula Redt., стеблевая хлебная блоха Chaetochema hortensis Geoffrклоп-щитник эйзакорис неприглядный Eysarcoris inconspicnus H-S., гусеницы хлопковой совки Heliothis armígera Hb., несколько видов цикад.

Из энтомофагов постоянно встречались Coccinella septempunetata L., Aphidius picipus Nees., Nabis pseudoferus Rem., Nabis férus L., клопы рода Orius, златоглазки Chrysopa vulgaris Sehrt., Ch. carnea L., Ch. fvifrons Br.

После сбора урожая зерно было подвергнуто тщательному анализу, были пересчитаны зерна кукурузы, которые приобрели окраску донора (желтый цвет), т.е. ксении.

Количество ксений разнообразно по направлениям и удаленности от участка-донора, но стоит отметить, что на делянках, удаленностью 50, 100, 200 м количество желтых зерен было намного меньше, чем на делянках-реципиентах, удаленностью на 5 - 20 м от донора. Кукуруза в основном ветроопыляемая культура, хотя наблюдения, в том числе и наши, показали, что многие насекомые собирают пыльцу с кукурузы. В то же время, насекомые играют незначительную роль в перекрестном опылении кукурузы, т.к. их не привлекают женские цветки в связи с отсутствием химических механизмов привлечения и анатомических особенностей строения женского цветка [Bateman, 1947; Emberlin, 1999] Следовательно, на распространение пыльцы влияли в основном скорость и направленность ветра.

Для построения зависимости между количеством ксений и удаленностью участка-реципиента от донора мы использовали линию тренда.

Линия тренда позволяет графически отображать тенденции данных и прогнозировать их дальнейшие изменения (рис. 14). Значение R2 отражает близость значений линии тренда к фактическим данным. Линия тренда наиболее соответствует действительности, когда значение R в квадрате близко к 1.

Между количеством ксений и удаленностью участка-реципиента от донора существует зависимость, описанная следующей формулой:

у = 144,58e'°'1546к,где (1)

у — количество ксений на делянке-реципиенте, шт; х - расстояние от донора до участка-реципиента, м; 144,58 - коэффициент пропорциональности; е- основание натурального логарифма.

Таким образом, используя полученную зависимость можно рассчитать количество ксений при разном удалении от донора.

При анализе данных стало очевидно, что между количеством растений, выращенных из желтых семян и устойчивых к гербициду, и удаленностью учасгка-рсцшшснта от донора существует таисимость (рис. 14), описанная следующей формулой:

у= 10,546е"о<Мх, где (2)

у — количество гербицидоустойчивых рас гений, шт; х - расстояние от донора до участка-реципиента, м; 10,546 - коэффициент пропорциональности; е -основание натурального логарифма.

Зависимость между количеством ксений и удаленностью участка-реципиента от донора, описанная формулой 1, не совпадает с зависимостью между количеством растений, выращенных из желтых семян и устойчивых к гербициду, описанной формулой 2. Отсюда следует, что гены желтозерности и устойчивости к Раундапу не сцеплены между собой.

160 140 120 100 80 3 60 40 20 0

,-0,154вк

у = 144,58е" Я?2 = 0,7171

-0.94*

у = 10,546е' Н!2 = 0,8801

--1

10 20 50 100 140 200 250

Удаленность делянок-реципиентов от донора, м

иоиу

коеммйя

удаленностью учаелса-рецялиетэот локера

зависимость •ЮМУ копыеством гарбмамоусто

растений и удаленностью участка-реципиетаот донора - линии тренда

Рисунок 14 - Зависимости между количеством ксений и гербицидоустойчивых растений и удаленностью участка-реципиента от донора.

Зерна с признаками ксенийности, собранные с делянок-реципиентов на различном удалении от донора (гипотетически трансгенные) были проанализированы на предмет наличия трансгенной вставки (1->Ю8). ДНК выделяли двумя способами: из зерен по методу Дорохова и Клоке, в нашей модификации и из этиолированных проростков СТАВ-методом с последующей очисткой фенолом.

ПЦР выявила наличие трансгенной вставки у образцов, взятых по следующим направлениям: Юг -5, Юм; Юго-Восток - 5, 10м; Юго-запад - 10, 200м; Север - 5, 10м; Северо-Запад - 5м; Северо-Восток - 5, 10,20м; Восток - 5, 10, 20, 50м; Запад - 10, 50м. Всего было проанализировано по 2 образца с каждой делянки, данные ПЦР-анализов совпали.

Другую выборку зерен с признаками ксенийности, выращенных в теплице, обработали гербицидом Раундап в рабочих концентрациях с целью подтверждения их устойчивости к данному гербициду. ГЩР-анализ показал, что все растения, выжившие после обработки гербицидом, несут трансгенную вставку (г-ЫОв). Схематично делянки, на которых были обнаружены растения, имеющие трансгенную вставку, представлены на рисунке 13.

Опыт по выживаемости семян под действием гербицида Раундап также был заложен в полевых условиях. Высевались семена, имеющие желтую и белую окраску семян, собранных с делянок расположенных в разных направлениях и на разном удалении от источника. При этом следует отметить, что выживаемость растений, выращенных из семян имеющих белую окраску, составила 0%, а у растений имеющих желтую окраску в среднем 3,7%.

Гибель растений под действием Раундапа может быть вызвана отсутствием трансгенной вставки или снижением уровня экспрессии гена СР4 ЕРБРв. В связи с чем, были взяты листовые экспланты у растений выживших после обработки Раундапом, а также у погибших растений. ДНК выделяли СТАВ-методом с последующей очисткой фенолом. ПЦР-анализ выявил наличие трансгенной вставки (1-ЪЮ8) у всех выживших растений, и отсутствие таковой у всех погибших растений (оно, 13). _ _ _

Северо- Юго-восток,

восток. Юм Юг, 10м 5м

1 2 3 4 5 6

1-\ОМ !8и 11.11.)

Рисунок 15 - ПЦР-анализ на наличие траисгенной вставки у растений-реципиешов. 1,3,5- ДНК растений, погибших после обработки Раундапом в полевых условиях; 2,4,6-ДНК растений, выживших после обработки Раундапом.

На основании проведенных исследований можно заключим», что риск вертикального переноса генов ог ГМ-кукурузы к культурным сортам существует Степень перекрестного опыления между граисгенной кукуруюй и культурными сор|ами. находящимися поблизости, будет зависеть ог ряда факторов, таких как расстояние между ними, локальных барьеров на пу!и движения пыльцы, местного климата и гопофафии. Вследствие этого поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от нолей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на нуги движения пыльцы. В России дикие сородичи кукурузы не встречаются, поэтому, риск интрогрессии трансгенов к ее диким видам маловероятен.

Выводы

I. Модифицированный метод выделения ДНК по Дорохову и Клоке (1997) позволяет получить пригодные для проведения ПЦР препараты ДНК из семян сои, кукурузы и картофеля; 2 Во избежание ложно отрицательных результатов ПЦР-детекцию необходимо проводить с дополнительным положительным контролем, для сои -амплификация участков генов актина (350 п.н.) и лектина (318 п.н.), для кукурузы генов - актина (350 п.н.) и зеина-19 (387 п.н.) и для картофеля -пататина (216 п.н.), чю позволяет проверить качество (чистоту) препарата выделенной ДНК, а также проверить другие химические компоненты П1ДР-реакции;

3. ПЦР-идентификацию при концентрациях ГМ-компонента в образце ниже 0,5% проводят при добавлении в реакцию хлорида аммония в конечной концентрации 15мкМ, что приводит к увеличению выхода ПЦР-реакции, о1сугствик> неспецифических полос при гель-электрофорезе и повышению чувствительности данного метода;

4. Разработан метод полуколичественной оценки ГМ-компонента, основанный на амплификации участка целевого гена СР4 EPSPS с использованием пары цраймеров: RR01 и RR04, фланкирующих участок целевого гена размером 356 п.н;

5. У растений кукурузы линии NK 603 (Монсанто, США) гены желтозерности и ус гойчивос 1И кРаундапу не сцеплены между собой, так как ¡анисимос гь между количеством Ксений и удаленностью участка-реципиенга от донора не совпадает с зависимостью между количеством растений, выращенных из желтых семян и устойчивых к гербициду, и удаленностью участка-реципиента от донора;

6 Риск псршкалыюго персмюса генов oí Bt-картофеля к ею диким сородичам и культурным copiaM минимален, так как ботанические семена обра юны вались только на диких формах картофеля, и ПЦР-анали? не выявил наличия трансгенной вставки в данных образцах. Вследствие юю, чго картофель является в основном самоопылителем, а в качестве посадочного ма1ериала исполыуют клубни, изоляции полей с трансгенным картофелем не требуемся, 7. Риск вертикального переноса генов от RR-кукурузы к ее культурным copiaM существует Факт переноса генетической конструкции на расстояние до 200 м подтвержден результатами проведения ПЦР-реакции и обработки гербицидом Раундап. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны бьпь удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. В России дикие сородичи кукурузы не встречаются, поэтому риск вертикального переноса генов от RR-кукурузы к ее диким видам маловероятен.

Практические рекомендации

В целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов использовать модифицированный нами метод выделения ДНК по Дорохову и Клоке (1997) из различных растительных тканей, а также предлагаемые нами методы детекции и идентификации трансгенной вставки.

ПЦР необходимо проводить с использованием двух положительных и двух отрицательных контролей.

При предварительном определении количества ГМИ в образцах использовать предложенный нами метод полуколичественной оценки.

Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльны Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется.

Список работ, опубликованных по теме диссер1ации

I Киль, В.И. Мониторинг генно-инженерно-модифицированных растений: 111 IP-детекция RR - сои / В И. Киль, Д. В. Крутенко И Материалы Всероссийской научно-технич. конф. «Биотехнология 2003» (Сочи 22-26 сентября 2003 г). -Сочи, 2003 -С. 87-89.

2 Киль, В.И. Сравнительный анализ методов ПЦР-детекции семян RR-сои и полуколичесгвенная оценка их содержания в зерне и кормах / В.И. Киль, Д.В. Крутенко // Материалы VII Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» (Москва, 12-14 ноября 2003).-М., 2003.- С.235-236.

3 Киль, В.И. Идентификация и полуколичественная оценка содержания семян RR-сои в зерне / В.И. Киль, Д.В. Крутенко // Материалы 2-го Московского международного Конгресса: "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 10-14 ноября, 2003). -М.,2003. -Ч.1.-С.199-200.

4 Крутенко, Д.В. ПЦР-детекция трансгенных растений / Д.В. Крутенко // Материалы 5-й региональной научно-практич. конф. молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 18-19 дек.2003).-Краснодар, 2003.-С.101-102.

5 Крутенко, Д.В. Оценка влияния некоторых веществ на специфичность и выход реакции амплификации на примере ПЦР-идентификации RR-сои / Д.В. Крутенко, В.В. Гронин II Материалы II региональной научно-практич. конф. молодых ученых и студентов Краснодарского края «Медицина и здравоохранение» (Анапа, 21-23 апреля 2004 г). -Анапа. -2004. -С. 152-153.

6 Надыкта, В.Д. Биологическая эффективность и биоценотическая безопасность генно-инженерно-модифицированных сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, устойчивых к колорадскому жуку / В.Д. Надыкта, В.Я. Исмаилов, Ж.А. Ширинян, М.В. Пушня, Д.В. Крутенко, В.И. Киль // Материалы Ш съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 6-12 июня 2004).-М.,2004.-С. 477.

7 Киль, В.И. Резистентность вредителей к трансгенному картофелю и другим Bt-защищенным культурам / В.И. Киль, H.A. Головатенко, Д.В. Крутенко И Агрохимия.-№7.-2004.-С.77-91.

8 Крутенко, Д. В. Методы ПЦР-детекции трансгенных растений / Д. В Крутенко, В. И. Киль // «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем»: материалы докл. междун. научно-практ. конф. (Краснодар, 29 сент.-I окт. 2004). -Краснодар, 2004.- Вып.2,- С.ЗОЗ-313.

9 Крутенко, Д. В. Вертикальный перенос генов картофеля / Д. В. Крутенко // «Научное обеспечение агропромышленного комплекса»: материалы 7-й региональной научно-практич. Конф. Молодых ученых (Краснодар, 8-9 декабря 2005 г). -Краснодар. -С.33-34.

Подписано в печать 21 04.2006

Формат 60* 841/,в Заказ № 228

Объем 1,0 п. я Тираж -100 экз

Бумага офсетная Офсетная печать

Отпечатано в типографии ФГОУ ВПО "Кубанский государственный афарный университет" 350044, г. Краснодар, ул им Калинина , 13

Д.ОО& ft

9033

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крутенко, Дмитрий Викторович

Введение

Глава 1. 1.

1.2 1.2.

1.6.1 1.6.

Глава 2. 2.1. 2.2. 2.2.

Обзор литературы

Трансгенные культуры: распространение и использование в сельскохозяйственном производстве Вертикальный перенос генов

Факторы, определяющие степень риска переноса генов

Перенос генов к другим возделываемым сортам растений

Биобезопасность трансгенного картофеля

Биобезопасность трансгенной кукурузы

Биобезопасность трансгенной сои

Методические подходы к определению наличия трансгенов в пищевых продуктах и кормах

Методы оценки содержания генетическимодифицированных источников

Методы на основе полимеразной цепной реакции

ПЦР-идентификация трансгенов Неспецифическая ПЦР-детекция генетически-модифицированных источников Другие методы детекции модифицированных источников Апробация методов ГМ-детекции Материалы и методы исследований Объект исследования

Использованные материалы и оборудование Химические реактивы генетическиф 2.2.2 Оборудование

2.3 Использованные методы

2.3.1 Выделение ДНК из различных тканей растения

2.3.2 Амплификация геномной ДНК

2.3.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.3.4 Фотодокументирование продуктов амплификации

• Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 ПЦР-детекция трансгенных растений

3.2 ПЦР-идентификация трансгенных растений

3.3 Влияние различных веществ на специфичность и

• (или) выход ПЦР-реакции

3.4 Полуколичественная оценка генетическимодифицированных источников (ГМИ)

3.5 Оценка риска вертикального переноса генов от ГМкартофеля

3.6 Оценка риска вертикального переноса генов от ГМкукурузы

Выводы

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение вертикального переноса генов от биозащищенных растений к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам"

Значительный вред урожаю также наносит конкуренция со стороны сорных растений. В данной ситуации имеет большое значение использование раундап-защищенных сортов сои и кукурузы, так как Раундап широко применяемый гербицид, известный своей очень высокой эффективностью и имеющий высокие показатели безопасности. Широкое использование ГМ-растений в сельскохозяйственном производстве ставит на повестку дня вопросы их биобезопасности.

Одним из аспектов биобезопасности ГМ-культур является оценка вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и диким сородичам. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению.

В этой связи актуальность наших исследований определяется необходимостью инструментального контроля ГМ-растений и получаемых на их основе продуктов и кормов для животноводства. Основным методом для быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений в настоящее время является ПЦР (полимеразная цепная реакция). Однако используемые в нашей стране методики ПЦР-детекции не достаточно эффективны и требуют доработки. До сих пор не разработаны рекомендации по безопасному выращиванию ГМ-культур, и, в частности, не исследованы вопросы переноса генов от трансгенных растений другим представителям биоценоза.

- модифицировать методику выделения препаратов ДНК из семян растений, для их анализа методом полимеразной цепной реакции (ПНР);

- модифицировать методы ПЦР-детекции и идентификации трансгенных растений; разработать методы полуколичественной оценки генетически-модифицированных источников (ГМИ);

- определить степень риска и разработать меры по предотвращению вертикального переноса генов от раундап-защищенной кукурузы и ЕИ;-защищенного картофеля к культурным сортам и диким сородичам.

Научная новизна. В настоящей работе: представлена модифицированная методика выделения ДНК по Дорохову и Клоке (1997) применительно к семенам растений, пригодная для проведения ПЦР;

- разработана методика полуколичественной оценки генетическимодифицированных источников на основе амплификации участка целевого гена;

Научно-практическая ценность работы. Результаты опытов по вертикальному переносу генов от генно-модифицированных биозащищенных растений к культурным сортам и диким сородичам позволяют оценить риски интродукции трансгенных растений в окружающую среду, определить особенности их выращивания, а также защиты от вредителей и сорняков. Внедрение в сельскохозяйственное производство генно-модифицированных биозащищенных от колорадского жука сортов картофеля и Раундап-защищенных сортов сои и кукурузы будет способствовать сокращению использования химических средств защиты, что приведет к уменьшению потерь урожая и к улучшению состояния окружающей среды. Для целей более эффективного мониторинга ГМ-растений и продукции на их основе рекомендуется использовать модифицированные методы ПЦР-детекции, а также разработанные методы полуколичественной оценки ГМИ.

Основные положения, выносимые на защиту:

ПЦР-детекцию необходимо проводить с дополнительным положительным контролем, для сои - амплификация участков генов актина (350 п.н.) и лектина (318 п.н.), для кукурузы - генов актина (350 п.н.) и зеина-19 (387 п.н.) и для картофеля - пататина (216 п.н.), что позволяет проверить качество (чистоту) препарата выделенной ДНК, а также проверить другие химические компоненты ПЦР-реакции во избежание ложно отрицательных результатов;

- разработанный нами метод полуколичественной оценки ГМИ позволяет проводить не только детекцию трансгенов в зерне и семенах, но и определять их количественное содержание без использования дорогостоящего оборудования;

- риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля можно считать минимальным, изоляция трансгенного картофеля от других сортов не требуется. Риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с традиционными сортами. При этом рекомендуется использовать защитные мероприятия, а частности, путем создания барьеров на пути движения пыльцы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи 22-26 сентября 2003), на Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва 12-14 ноября 2003), на 2-м Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 10-14 ноября 2003), на 5-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научная обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 1819 декабря 2003 г.), на II региональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов Краснодарского края «Медицина и здравоохранение». - Анапа, 21-23 апреля 2004, на III ВОГиС) Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (Москва 6-12 июня 2004), на международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сентября - 1 октября 2004 г), на 7-й региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса».-Краснодар, 8-9 декабря 2005 г.

Декларация личного участия автора. Диссертация содержит фактический материал, полученный лично автором в течение 2002-2005 гг. Полевые опыты по вертикальному переносу генов кукурузы и определению видового состава насекомых проводились совместно с лабораторией гербологии ГНУ ВНИИБЗР РАСХН. Личный вклад автора в получение результатов исследований составляет 80%.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, методики проведения исследований, результатов исследования, выводов, практических рекомендаций, приложений. Содержит 8 таблиц и 30 рисунков. Список использованной литературы включает 171 источник, в том числе 157 на иностранном языке. Диссертация является самостоятельным завершенным научным трудом.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Крутенко, Дмитрий Викторович

ВЫВОДЫ

1. Модифицированный метод выделения ДНК по Дорохову и Клоке (1997) позволяет получить пригодные для проведения ПЦР препараты ДНК из семян сои, кукурузы и картофеля;

2. Во избежание ложно отрицательных результатов ПЦР-детекцию проводят с дополнительным положительным контролем, для сои - амплификация участков генов актина (350 п.н.) и лектина (318 п.н.), для кукурузы генов -актина (350 п.н.) и зеина-19 (387 п.н.) и для картофеля - пататина (216 п.н.), что позволяет проверить качество (чистоту) препарата выделенной ДНК, а также проверить другие химические компоненты ПЦР-реакции;

3. ПЦР-идентификацию при концентрациях ГМ-компонента в образце ниже 0,5% проводят при добавлении в реакцию хлорида аммония в конечной концентрации 15мкМ, что приводит к увеличению выхода ПЦР-реакции, отсутствию неспецифических полос при гель-электрофорезе и повышению чувствительности данного метода;

4. Разработан метод полуколичественной оценки ГМ-компонента, основанный на амплификации участка целевого гена СР4 ЕР8Р8 с использованием пары праймеров: Ю101 и ЯШМ, фланкирующих участок целевого гена размером 356 п.н.;

5. У растений кукурузы линии ЫК 603 (Монсанто, США) гены желтозерности и устойчивости к Раундапу не сцеплены между собой, так как зависимость между количеством ксений и удаленностью участка-реципиента от донора не совпадает с зависимостью между количеством растений, выращенных из желтых семян и устойчивых к гербициду, и удаленностью участка-реципиента от донора;

6. Риск вертикального переноса генов от В^картофеля к его диким сородичам и культурным сортам минимален, так как ботанические семена образовывались только на диких формах картофеля, и ПЦР-анализ не выявил наличия трансгенной вставки в данных образцах. Вследствие того, что картофель является в основном самоопылителем, а в качестве посадочного материала используют клубни, изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется;

7. Риск вертикального переноса генов от Ш1-кукурузы к ее культурным сортам существует. Факт переноса генетической конструкции на расстояние до 200 м подтвержден результатами проведения ПЦР-реакции и обработки гербицидом Раундап. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. В России дикие сородичи кукурузы не встречаются, поэтому риск вертикального переноса генов от ЯЯ-кукурузы к ее диким видам маловероятен.

Практические рекомендации

ПЦР необходимо проводить с использованием двух положительных и двух отрицательных контролей.

Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Крутенко, Дмитрий Викторович, Краснодар

1. Ала, А .Я. Использование спонтанного опыления у сои при межвидовой гибридизации Текст. / А.Я. Ала // Доклады ВАСХНИЛ. -1988. -Т.6. -С. 10-12.

2. Дорохов, Д.Б. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа растительных геномов Текст. / Д.Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. -1997. -Т. 33. -№4. -С.443-450.

3. Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников: методические указания

4. Минздрава Российской Федерации (МУК2.3.2.970-00) Текст. -М: Минздрав России, 2000. -С. 94.

5. Российская газета Текст. / Учредитель Правительство Российской Федерации. -Краснодар, 30 января 2002 год: отп. ОАО изд. Советская Кубань. -№ 18 (2886).

6. Уайтхед, Т. Картофель здоровый и больной Текст. / Т. Уайтхед, Т. МакИнтош, У. Финдлей; пер. с англ. под ред. Пушкарева И. И. М.: Иностранная литература, 1955. - 608 с.

7. Ahmad, Q.N. Inversion bridges and meiotic behavior in species hybrids of soybeans Текст. / Q.N. Ahmad, E.J. Britten, D.E. Byth // J Hered. -1977. -V.68. -P. 360-364.

8. Allmann, M. Polymerase chain reaction (PCR): a possible alternative to immunochemical methods ensuring Safety and quality of food Текст. / M. Allmann, U. Candrian, C. Hofelein, J. Luthy // Z.Lebensm.Unters.Forsch.-1993196.-P.248-251.

9. Anon. The Regulatory Directive Dir94-ll: The biology of Zea mays L. (Corn/Maize) Текст. / Anon // Plant Biotechnology Office, Plant Health and Production Division, Canadian Food Inspection Agency. -1994.

10. Arias, D.M. Gene Flow between cultivated and wild sunflower Текст. / D. M. Arias, L. H. Rieseberg // Theor. Appl. Genet. 1994. - V. 89. - P. 655-660.

11. Arnold, M.L. Natural hybridization and evolution Текст. / M. L. Arnold. -N. Y.: Oxford University Press. -1997.

12. Bateman, A. J. Contamination in seed crops — I. Insect pollination Текст. / A. J. Bateman II J. Genet. -1947. -48. -P. 257-275.

13. Bateman, A.J. Contamination of seed crops — II. Wind pollination / A. J. Bateman Текст. II Heredity. 1947. -1. -P. 235-246.

14. Blake, N.K. Polymerase chain reaction used for monitoring multiple gene integration in Agrobacterim-mediated transformation Текст. / N.K. Blake, R.L. Ditterline, R.G. Stout // Crop Science.-1991. -№31. -P. 1686-1688.

15. Bonnett, O.T. Development of the corn kernel Текст. / О. Т. Bonnett // In: Growth and development of the corn plant. American Seed Trade Association. -1947. -P. 32-36.

16. Burdon, J.J. Diseases and plant population biology Текст. / J. J. Burdon. -New York : Cambridge University Press, 1987.

17. Carpenter, J. E. Agricultural biotechnology: Updated benefit estimates Текст. / J. E. Carpenter, L. P. Gianessi // National Center for Food and Agricultural Policy. -2001. http://www.ncfap.org/pub/biotech/updatedbenefits.pdf.

18. Carpenter, J. E. Comparing Roundup Ready and conventional soybean yields: 1999 Текст. / J. E. Carpenter; National Center for Food and Agricultural Policy, Washington, D.C. 2001. www.ncfap.org.

19. Coble, H.D. Weed control investigations in corn, cotton, crop rotations, soybean, small grain Текст. / H. D. Coble, L. S. Warren // Annu Rep Dept Crop Sci NCSU. -1997. -28. -P.103-113

20. Comparison of the ABI 7700 system (TagMan) and competitive PCR for quantitation of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculesis Текст. //J.Clin.Microbiol. -1998. -№36. -P.1964-1968.

21. Conway, G. Crop Biotechnology: Benefits, Risks and Ownership Текст. / G. Conway // The Rockefeller Foundation. 8-30-2000. http://www.Rockfound.Org/News/03062000Cropbiotech.Html#Intro: 1 -7.

22. Cote, M.J. Identification of genetically modified potato (Solanum tuberosum) cultivars using event specific polymerase chain reaction Текст. / M.J. Cote, A.J. Meldrum, P. Raymond, C. Dollard // J Agric Food Chem. -2005 Aug 24. -№53(17). -P. 6691-6696.

23. Crawley, M. J. Transgenic crops in natural habitats Текст. / M. J. Crawley, S. L. Brown, R. S. Hails, D. D. Kohn, M. Rees // Nature. -2001. -№409. -P. 682-683.

24. Culpepper, A.S. Weed management in glufosinate- and glyphosate-resistant soybean (Glycine max) Текст. / A. S. Culpepper, A. C. York, R. B. Batts, K. M. Jennings // Weed Technol. -2000. -14.-P.77-88.

25. Daniell, H. Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome Текст. / H. Daniell, R. Datta, S. Varma // Nat. Biotechnol. 1998. - V. 16. - P. 345-348.

26. Dunwell IIJ Experiment Bot. 2000. -51. -P.487-496.

27. Ellstrand, N.C. Gene flow and introgression from domesticated plants into their wild relatives Текст. / N. С. Ellstrand, H. C. Prentice, J. F. Hancock // Ann. Rev. Ecol. Syst. 1999. - V. 30. - P. 539-563.

28. Ellstrand, N.C. Gene Flow by pollen: implications for plant conservationgenetics Текст. / N. С. Ellstrand // Oikos. 1992. - V. 63. - P. 77-86.

29. Ellstrand, N.C. Hybridization as an avenue for the escape of engineered genes Текст. / N. С. Ellstrand, С. A. Hoffman // Bioscience. 1990. - V. 40. - P. 438-442.

30. Ellstrand, N. С. Pollen as a vehicle for the escape of engineered genes? Текст. / N. С. Ellstrand // Trends in Ecology and Evolution. 1988. - № 3.ф P. 30-32.

31. Ellstrand, N.C. Population genetic consequences of small population size: Implications for plant conservation / N. C. Ellstrand, D. R. Elam // Annu. Rev.• Ecol. Syst. 1993. - V. 24. - P. 217-242.

32. Elmore, R.W. Glyphosate-resistant soybean cultivar yields compared with sister lines Текст. / R. W. Elmore, F. W. Roeth, L. A. Nelson, C. A. Shapiro, R. N. Klein, S. Z. Knezevic, A. Martin II Agron J.-2001.-V. 93.-P.408-412

33. Erickson, E.H. Soybean pollination and honey production—A research progress report Текст. / E. H. Erickson II Am Bee J. -1984. -124. -P. 775-779.

34. European Commission Official Journal L 006 Текст.; 13-14 (2000).

35. Fagan, L. Performance assessment under field conditions of a rapid IMMUNOLOGICAL TEST FOR TRANSGENIC SOYBEANS Текст. / L. Fagan, B. Schoel, A. N Haegert e.a. // Int.J.of Food Science and Technology.-2001.-№36. -P.357-367.

36. Fredshaven, J.R. Growth behavior and competitive ability of transgenic crops Текст. / J. R. Fredshaven, G. S. Poulsen // Field Crops Res. 1996. -54. -P. 11-18.

37. Frutos, R. Managing insect resistance to plants producing Bacillus thuringiensis toxins Текст. / R. Frutos, C. Rang, M. Royer // Crit Rev Biotechnol.- 1999.-V.19.-P.227-276.

38. Gasser, C. S. Genetically engineered plants for crop improvement Текст. / С. S. Gasser, N.H. Fraley // Science. 1989. - V. 244. - P. 1293-1299.

39. Goodman, M.M. Maize Zea mays (Gramineae — Maydeae) Текст. / M. M. Goodman // In: immonds, N. W. (Ed.). Evolution of crop plants. -Longman, London.-1976. -P. 128-136.

40. Gould, F.W. Grass systematics Текст. /F. W. Gould // McGraw Hill. -New York.-1968.-P. 381-382.

41. Grant, V. Plant speciation Текст. / V. Grant. -N. Y. : Columbia University Press, 1981.• 60 Gray, A. J. Environmental risks of herbicide-tolerant oilseed rape Текст. / A.

42. J. Gray, A. F. Raybould // DETR Research Report.-London. -1999. -№ 15.

43. Gray, P. J. The transfer of traits to wild relatives Текст. / P. J. Gray // BCPC Symp. Proc. Predicting field performance in crop protection. 2000. -No. 74. -P. 165-174.

44. Gressel, J. Tandem constructs: preventing the rise of superweeds Текст. / J.

45. Gressel // Trends Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 361-366.

46. Gresswel, J. E. Predicted pollen dispersal by honey-bees and three species of bumble bee foraging on oilseed rape: A comparison of three models Текст. / J. E. Gresswel, A. P. Bassom, S. A. Bell [et. all.] // Funct. Ecol. 1995. - V. 9. - P. 829-842.

47. Guretzky, J.A. Evidence for natural biological control: insects decreasesurvival and growth of native thistle Текст. / J. A. Guretzky, S. M. Louda // Ecol. Appl. 1997. - V. 7. - P. 1330-1340.

48. Hancock, J. The opportunity for escape of engineered genes from trans genie crops Текст. / J. Hancock, R. Grumet, S. Hokanson. // Hortsci. -1996. -31. -P. 1080-1085.

49. Handel, S.N. Pollination ecology, plant population structure, and gene flow Ф Текст. / S. N. Handel // Pollination biology (L. Real ed.) : Academic Press,

50. Orlando, FL.- 1983.-P. 163-211.

51. Harding, K. Risk assessment of the release of genetically modified plants % Текст. / К. Harding, P. S. Harris; A review. MAFF. -1994.

52. Hassan-Hauser, C. Detection of the starch modifying gbss-antisense construct in transgenic potatoes Текст. / С. Hassan-Hauser, W. Mayer, H. Hortner // Z.Lebensm.Unters.Forsch. -1998. -№206. -P.83-87.

53. Hemmer, W. Foods derived from genetically modified organisms and defection methods Текст. / W. Hemmer // BATS.-1997.

54. Hernandez, M. Interlaboratory transfer of a PCR multiplex method for simultaneous detection of four genetically modified maize lines: Btll, MQN810, T25, and GA21 Текст. / M. Hernandez, D. Rodriguez-Lazaro, D.

55. Hokanson, S.C. Effect of border rows and trap/donor ratios on pollenmediated gene movement Текст. / S. C. Hokanson, R. Grumet, J. F. Hancock // Ecol. Appl.- 1997.-V. 7.-P. 1075-1081.

56. Holt, J. Prevalence and management of herbicide-resistant weeds Текст. / J. Holt // Scientific Methods Workshop: Ecological and Agronomic Consequences of Gene Flow from Transgenic Crops to Wild Relatives

57. Ф (Meeting Proceedings, The Ohio State University, March 5, 6. 2002). - P.47.51.

58. Hood, M.J. Interspecific hybridization studies between cultivated soybean,• Glycine max and a perennial wild relative Текст. / M. J. Hood, F. L. Allen // G. falcata. Proc Am Soc Agron. -1980. -P. 58.

59. Hupfer, C. Detection of genetic modification in heat treated products of Bt-maize by polymerase chain reaction Текст. / С. Hupfer, H. Hotzel, K. Sachse, K.H. Engel // Z.Lebensm.Unters.Forsch. -1998. -№206. -P.203-207.

60. Johnson, W.G. Efficacy and economics of weed management in glyphosate-resistant corn (Zea mays) Текст. / W. G. Johnson, P. R. Bradley, S. E. Hart, M. L. Buesinger, R. E. Massey // Weed Technol. -2000. -V.14. -P. 57-65.

61. Johnston, S.A. The significance of genie balance to endosperm development in interspecific crosses Текст. / S. A. Johnston, Т. P. M. den Nijs., S. J. Peloquin, R. E. Hanneman, Jr. // Theoretical and Applied Genetics. 1980. -V. 57.-P. 5-9.

62. Jones, M.D. Effect of tree barriers on outcrossing in corn. Oklahoma

63. Agricultural Experimental Station Текст. / M. D. Jones, J. S. Brooks // Technical Bulletin.-\952. No T-45.

64. Jones, M.D. Effectiveness of distance and border rows in preventing outcrossing in corn Текст. / M. D. Jones, J. S. Brooks; Oklahoma Agricultural Experimental Station, Technical Bulletin. -1950. -No. T-38.

65. Kapteijns, A.J. Risk assessment of genetically modified crops. Potential of Ф four arable crops to hybribize with the wild flora Текст. / A. J. Kapteijns //

66. Euphytica. -1993. -66. -P. 145-149.

67. Kapusta, G. Yield response of soybeans (Glycine max) to injury from t postemergence broadleaf herbicides Текст. / G. Kapusta, L. A. Jackson, D. S.

68. Mason// WeedSci.- 1986.-34.-P.304-307.

69. Kareiva, P. Can we use experiments and models in predicting the invasiveness of genetically engineered organisms? Текст. / P. Kareiva, I. M. Parker, M. Pascual II Ecology. -1996. -№77. -P. 1670-1675.

70. Kleppe, K. Studies on polynucleotides. Repair replication, of short synthetic DNAs as catalysed by DNA polymerase Текст. / К. Kleppe, E. Ohtsuku, R. Kleppe [et.all.] //J.Mol.Biol.-1971.-V.56.-P.341-361.

71. Klinger, Т. Engineered genes in wild populations: fitness of weed-crop hybrids of Raphanus sativus Текст. / Т. Klinger, N. С. Ellstrand // Ecological Application. -1994. -V. 4.-P.117-120.

72. Kovarova, M. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reaction Текст. / M. Kovarova, P. Draber // Nucleic Acids Research. -2000.

73. Vol. 28.-No. 13.-P. 134-138.

74. Kuvshinov, V. Molecular control of transgene escape from genetically modified plants Текст. / V. Kuvshinov, K. Koivu, A. Kanerva, E. Pehu // Plant science. 2001. - V. 160. - P. 517-522.

75. Kwon, S. H. Studies on the diversity of seed weight in the Korean soybean land races and wild soybean Текст. / S. H. Kwon, К. H. Im, J. R. Kim. //ф Korean J Breed. -1972. -4. -P. 70-74.

76. Ladizinsky, G. Wild crosses in soybeans: Prospects and limitations Текст. / G. Ladizinsky, C. A. Newell, T. Hymowitz // Euphytica. -1979. -28. -P. 421423.

77. Langevin, S.A. The incidence and effects of hybridization between cultivated rice and its related weed red rice (Oryza sativa L.) Текст. / S.A. Langevin, K. Clay, J. Grace // Evolution. 1990. - V. 44. - P. 1000-1008.

78. Lee, D. Evaluating genetic containment strategies for transgenic plants Текст. / D. Lee, E. Natesan // Trends Biotechnol.-2006.-V. 24(3).-P. 109-114.

79. Lefol, E. Predicting hybridization between transgenic oilseed rape and wild• mustard Текст. / E. Lefol, V. Danielou, H. Darmency // Field Crops• Research.-1996.-V45.-P. 153-161.

80. Lopez-Perez, G.C. Dynamics of pesticides in potato crops Текст. / G.C. Lopez-Perez, M. Arias-Estevez, E. Lopez-Periago, B. Soto-Gonzalez, B. Cancho-Grande, J. Simal-Gandara // J Agrie Food Chem.-2006.-V.54(5).-P. 1797-1803.

81. Losey, J.E. Transgenic pollen harms monarch larvae Текст. / J. E. Losey, L. S. Rayor, M. E. Carter // Nature. 1999. -399. -P. 214.

82. Marshall, M.W. Weed community shifts associated with continuous glyphosate applications in corn and soybean rotation Текст. / M. W. Marshall, K. Al-Khatib, L. Maddux // Proc Western Soc Weed Sci.-2000.- 53.-P.22-25.

83. Messean, A. Impact du development des plantes transgeniques dans les systemes de culture: rapport final Текст. / A. Messean // Dossier. -B: Impact des plantes transgeniques-1999.-No. 96/15.

84. Meyer, R. Detection of genetically engineering plants the FLAVR SAVR tomato as an example Текст. / R. Meyer // Z.Lebensm.Unters.Forsch.-1995.-№201.-P.583-586 (German).

85. Meyer, R. Polimerase chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance * of food: detection of soya in processed meat products Текст. / R. Meyer, F.

86. Chardonnens, P. Hubner, J. Luthy // Z.Lebensm.Unters.Forsch.-1996.-203.-P.339-344.

87. Meyer, R. Tierartbestimmung und Soyanachweis in erhitzten Fleischprodukten mittels der Polymerase Kettenreaktion Текст. / R. Meyer, U. Candrian, J. Lüthy // Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg. -№199384. -P. 112-121.

88. Mikkelsen, T.R. The risk of crop transgene spread Текст. / T. R. Mikkelsen, B. Andersen, R. B. Jorgensen // Nature. 1996. - V. 380. - P. 31.

89. Mooney, S. Environmental concerns and risks of genetically modified crops: Economic contributions to the debate Текст. / S. Mooney, К. К. Klein // Canadian JAgric Econ. -2000. -47. -P.437-444.

90. Moschini, G. "Roundup Ready Soybeans and Welfare Effects in the Soybean Complex" Текст. / Moschini, G., H. Lapan and A. Sobolevsky // Agribusiness.-2000. -Vol. 16. -no.l. -P. 33-55.

91. Moyes, C. L. Gene flow from oilseed rape to Sinapis arvensis : variation at the population level Текст. / С. L. Moyes, J. Lilley, C. Casais, P. J. Dale // British Crop Protection Council. BCPC Symposium Proceedings. -1999. -№ 72. -P. 143-148.

92. Murray, M.G. Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA Текст. / M.G. Murray, W.F. Thompson // Nucl. Acids Res. -1980. -№8. -P. 4321-4325.

93. NAS (National Academy of Sciences). Genetically Modified Pest-Protected Plants: Science and Regulation Текст. -Washington, D.C. : Nat.Acad.Press.-2000.-V.1.

94. National Research Council. Genetically modified pest-protected plants: Science and regulation Текст. -Washington. DC: National Academy Press.2000.-V. 1-P. 81-93.

95. Owen, M.D.K. Current use of transgenic herbicide-resistant soybean and corn in the USA Текст. / M. D. К. Owen // CropProtection.- 2000.-19.-P.765-771.

96. Owen, M.D.K. World maize/soybean and herbicide resistance Текст. / M. D. К. Owen // In S. В. Powles and D. L. Shaner (eds.). Herbicide Resistance and World Grains. -CRC Press, Boca Raton, Florida. -2001. -P. 101-163.щ

97. Owen, M.D. Herbicide-resistant crops and weed resistance to herbicides Текст. / M.D. Owen, I.A. Zelaya // Pest Manag Sci. -2005 Mar. -№61(3). -P. 301-311.

98. Palmer R.G. Genetics and Cytology of Chromosome Inversions in Soybean Germplasm Текст. / R.G. Palmer, H. Sun, L.M. Zhao // Crop Sci. -2000. -V.40. -P.683-687.

99. Paterniani, E. Effective maize pollen dispersal in the field Текст. / E. Paterniani, A. C. Stort II Euphytic. 1974. -№23. -P. 129-134.

100. Peakall, R. A new technique for monitoring pollen flow in orchids Текст. / R. Peakall //Oecologia (Berl.) 1989. -V. 79. - P. 361-365.

101. Perry, L. Early maize agriculture and interzonal interaction in southern Peru Текст. / L. Perry, D.H. Sandweiss, D.R. Piperno, K. Rademaker, M.A. Malpass A. Umire, P. de la Vera // Nature.-2006.-V.440.-P.76-79.

102. Pietsch, К. Screeningverfahren zur Identifizierung "gentechnish veränderter" pflanzlicher Lebensmittel Текст. / К. Pietsch, H.U. Waiblinger, P. Brodman, A. Würz // Dtsch.Lebensm.Rundsch. -1997. -№93. -P.35-38.

103. Plaisted, R. L. Potato Текст. / R. L Plaisted // In: W. R Fehr, H. H Hadley; Hybridisation of crop plants. American Society of Agronomy, Madison .-1980. -P. 483-494.

104. Pleasants, J.M. Pollen deposition on milkweed leaves under natural conditions Текст. / J. M. Pleasants, R. L. Hellmich, L. C. Lewis // Presentation at the Monarch Butterfly Research Symposium. -Chicago, 1999.

105. Raybould, A.F. Genetically modified crops and hybridization with wild relatives: a UK perspective Текст. / A. F. Raybould, A. J. Gray // Journal of Applied Ecology. -1993. -№ 30. -P. 199-219.

106. Raynor, G.S. Dispersion and deposition of corn pollen from experimental sources Текст. / G. S. Raynor, E. C. Ogden, J. V. Hayes // Agron. J. 1972. -V. 64.-P. 420-427.

107. Rieseberg, L.H. Introgression and its consequences in plants. Hybrid zones and the evolutionary process (Harrison R. ed.) Текст. / L. H. Rieseberg, J. Wende. -London : Oxford University Press. 1993. -P. 70-102

108. Saiki, R.H. Enzymatic amplification of beta-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of Sickle cell anemia Текст. / R.H. Saiki, S. Scharf, F. Faloona [et.all.] // Science. -1985. -V.230. -P.1350-1354.

109. Salamov, A.B. About isolation in corn Текст. / A. B. Salamov // (Russian translation by Michael Afanasiev in 1949). -Sel. I. Sem. -1940. P. 3.

110. SAP. Bt-Plant-pesticides risk and benefit assessments Текст. // Report No 2000-07.-March 12.-2001.

111. SAP. Gene Flow. Outcrossing questions Текст. // Report № 2000-07. March 12. -2001. http://www.epa.gov.

112. Schreiber, G.A. Foods produced by means genetic engineering, 2nd Status report Текст. / G.A. Schreiber, K.W. Bogl // Federal Institute for Health protection of consumers and veterinary medicine. -Berlin, 1997; BgVV Hefte 1.

113. Scientific Methods Workshop: Ecological and Agronomic Consequences of Gene Flow from Transgenic Crops to Wild Relatives Текст. -Meeting Proceedings, The Ohio State University, March 5, 6. 2002.

114. Scott, S. E. Transgene risk is low Текст. / S. E. Scott, M. J. Wilkinson // Nature. -1998. -№ 393. -P. 320.

115. Sears, M.K. Impact of Bt corn pollen on monarch butterfly populations Текст. / M. К. Sears, D. Stanley-Horn // In: C. Fairbairn, G. Scoles, A.

116. McHughen (Eds.) Proceedings of the 6th International Symposium on The

117. Biosafety of Genetically Modified Organisms. -Canada: University Entension Press, 2000.

118. Seiler, G.J. Utilization of wild sunflower species for the improvement of cultivated sunflower Текст. / G. J. Seiler // Field Crops Res. 1992. - V. 30. -P. 195-230.

119. Shirai, N. Safety assessment of genetically engineered food: detection and monitoring of glyphosate-tolerant soybean Текст. / N. Shirai, K. Momma, S. Ozawa [et.all.] // Biosci Biotechnol. Biochem. -1998. -№62(7). -P.l461-1464.

120. Singh, R.J. Intersubgeneric hybridization of soybeans with a wild perennial species, Glycine clandestina Wendl Текст. / R.J. Singh, K.P. Kollipara, T. Hymowitz// Theor. Appl. Genet. -1987. -V.74. -P. 391-396.

121. Singh, R.J. The genomic relationship between Glycine max (L.) Merr. And G.soja Sieb.and Zucc. as revealed by pachytene chromosome analysis Текст. / R.J. Singh, T. Hymowitz // Theor. Appl. Genet. -1988. -V.76. -P. 705-711.

122. Skvortzow, В. V. The soybean—wild and cultivated in Eastern Asia Текст. / В. V. Skvortzow // Proc Manchurian Res Soc. -Publ Ser A. Natural History Sect. -1972. -No. 22. -P. 1-8.

123. Sluyter, A. Early maize (Zea mays L.) cultivation in Mexico: dating sedimentary pollen records and its implications Текст. / A. Sluyter, G. Dominguez // Proc Natl Acad Sci U S A.-2006.-V. 103(4).-P. 1147-1151.

124. Snow, A. A. Fitness costs associated with transgenic glufosinate tolerance introgressed from Brassica napus ssp oleifera (oilseed rape) into weedy Brassica rapa Текст. / A. A. Snow, R. Jorgensen // In: Gene Flow and

125. Agriculture: Relevance for Transgenic Crops. -1999. -Lutman, P. (ed). BCPC

126. Symposium Proceedings No. 72.

127. Snow, A.A. Fecundity, phenology and seed dormancy of Fi wild-crop hybrids in sunflower (Helianthus annuus, Asteraceae) Текст. / A. A. Snow, P. Moran-Palma, L. H. Rieseberg, A. Wszelaki // Am. J. Bot. 1998. - V. 85. - P. 794801.

128. Steward, C.N. Increased fitness of transgenic insecticidal rapeseed under insect selection pressuse Текст. / С. N. Steward, J. N. All, P. L. Raymer, Ramachadrans // Mol. Ecol. 1997. - V. 6. - P. 773-779.

129. Stewart, C.N. Chloroplast transgenic plants are not a gene flow panacea Текст. / С. N. Stewart, С. S. Prakesh // Nat. Biotechnol. - 1998. - V. 16. - P. 401.

130. Studer, E. Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybean and maize Текст. / E. Studer, C. Rhuner, J. Ltithy, P. Hubner// Z.Lebensm.Unters.Forsch. -1998. -№207. -P.207-213.

131. Taylor, B. Isolation of plant DNA and RNA Текст. / Taylor В., Powell A. // BRL Focus 4(3). 1982. -P.4-6.

132. U.S.Department of Agricultural. Implications of Testing and Segregating Nonbiotech Crops for Grain Grades and Standarts Текст. / Economic Research Service, Economic Issues in Agric.Biotechnology // AIB-762.

133. USDA / APHIS. Petition 94-257-01 for determination of nonregulated status for Colorado potato beetle-resistant potato lines ВТ 6, ВТ 10, ВТ 12, ВТ 16,

134. ВТ 17, ВТ 18, ВТ 23 Текст. Environmental Assessment and Finding of No Significant Impact (March 2, 1995).

135. Weatherwax, P. Structure and development of reproductive organs Текст. / P. Weatherwax // In: Sprague, G. F. (ed.), Corn and corn improvement. -New York: Academic Press, 1955. -Chap. III. P. 89-121.

136. Weil, J.H. Are genetically modified plants useful and safe? Текст. / J.H. Weil // IUBMB Life. -2005. -Apr-May. -57(4-5). -P. 311-314.

137. White, T.J. The future of PCR technology: diversification of technologies and applications Текст. / T.J. White // Trends in Biotech.-1996.-14.-P.478-483.

138. Wilkes, H.G. Hybridisation of maize and teosinte, in Mexico and Guatemala and the improvement of maize Текст. / H. G. Wilkes // Economic Botany. -1977.-31.-P. 254-293.

139. Wilkinson, M. J. A direct regional scale estimate of transgene movement from GM oilseed rape to its wild progenitors Текст. / M. J. Wilkinson, J. Davenport., Y. M. Charters [et. all.] // Molecular Ecology. -2000. -№ 9. -P. 983-991.

140. Wozniak, C.A. Gene Flow assessment for Plant-Incorporated Protectants by the biopesticide and pollution prevention division, U. S. EPA Текст. / С. A. Wozniak // Gene Flow Workshop, The Ohio State University, March 5, 6, 2002.-P. 146-161.

Информация о работе

Крутенко, Дмитрий Викторович
кандидата биологических наук
Краснодар, 2006
ВАК 06.01.11

Диссертация

Изучение вертикального переноса генов от биозащищенных растений к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы