Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка на биобезопасность переноса генов при выращивании трансгенных растений сои в агроценозе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оценка на биобезопасность переноса генов при выращивании трансгенных растений сои в агроценозе"

На правах рукописи

□030583Б2

НАСОНОВА Диана Сергеевна

Оценка на биобезопасность переноса генов при выращивании трансгенных растений сои в агроценозе

03 00 23 — «биотехнология» 03 00 16 - «экология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003058362

Работа выполнена на кафедре экологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

Научные руководители

кандидат биологических наук, доцент Раскатов Вячеслав Андреевич Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Калашникова Елена Анатольевна кандидат биологических наук Сазонов Юрий Георгиевич

Ведущее учреждение

Биологический факультет МГУ имени М В Ломоносова

Защита состоится 25 мая 2007 в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д220 043 10 при Российском государственном аграрном университете -МСХА имени К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, ул Тимирязевская, 49 Тел/Факс (495) 976-2492, e-mail dissovet@timacad ru Ученый совет РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им НИ Железнова

Автореферат разослан 25 апреля 2007 г и размещен на сайте университета www timacad ru

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Трансгенная биотехнология - одна из самых передовых и стремительно развивающихся отраслей современной биоиндустрии и, в особенности, сельского хозяйства Уже сейчас посевы трансгенных растений (ТР) занимают более 81 млн га, судя по всему, процесс расширения применения ТР будет нарастать По прогнозам к 2007 г площади под ТР могут вырасти до 100 млн га На территории России ТР пока не выращиваются в промышленных масштабах Согласно существующим в стране нормам перед выпуском в окружающую среду каждый трансгенный сорт должен пройти испытания на биобезопасность Биобезопасность подразумевает отсутствие фактического или прогнозируемого нежелательного воздействия модифицированного организма в сравнении с исходным немодифицированным организмом на окружающую среду

ТР, полученные методами генной инженерии, несут новые гены, обладают новыми признаками, и представляют собой виды, не свойственные ни одной экосистеме планеты Необходимость проведения оценки биобезопасности основывается на принципе предосторожности, который гласит, что «отсутствие неоспоримых научных фактов не должно служить причиной отсрочки принятия мер для устранения или сведения к минимуму угрозы» (Конвенция о биологическом разнообразии, 1994 г) Оценка биобезопасности призвана помочь минимизировать потенциальный ущерб

Вопросы взаимодействия и сосуществования ТР с традиционными сортами и их дикими сородичами мало изучены Еще меньше исследовано влияние ТР на биоразнообразие и динамику популяций (Соколов и др , 2002)

Выявление и оценка экологических рисков, сопровождающих выпуск ТР в окружающую среду, позволит принять решение о допустимости или нежелательности возделывания ТР на территории России, а также предусмотреть комплекс профилактических и защитных мер по контролю проблемы «утечки генов», что имеет важное экологическое значение

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось изучение экологических рисков и оценка биобезопасности при выращивании гербицидоустойчивой сои в современных агроценозах с использованием оптимизированной системы экспресс диагностики

В соответствие с поставленной целью решались следующие задачи 1 Адаптировать метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ЯТ-РСЯ) для качественной и количественной оценки содержания рекомбинантной ДНК в растительном сырье для достоверной идентификации экологического риска утечки генов

2 Создать набор эталонов и оптимизировать систему защиты от возможных контаминаций (загрязнений) проб исследуемых объектов

3 Провести полевые испытания на биобезопасность трансгенной гербицидоустойчивой сои, изучить влияние фитогенных факторов на взаимодействие ТР с дикими сородичами, а также влияние антропогенного фактора на появление устойчивости к гербициду раундап у диких сородичей сои

4 Изучить специфику популяций диких сородичей культурной сои, выявить степень родства культурной и дикой сои и способность к гибридизации

5 Оценить экологические условия и биобезопасность при выращивании трансгенной гербицидоустойчивой сои в агроценозе

Научная новизна. Впервые разработаны методы экспресс диагностики качественного и количественного содержания рекомбинантной ДНК в растительном материале, обеспечивающие оптимизацию процесса при проведении исследований и интерпретации данных, создан набор эталонов

Впервые проведены экологические и геоботанические исследования популяций дикой сои в Дальневосточном регионе России и выявлена степень родства культурной и дикой сои путем генотипирования

Впервые изучена способность трансгенной гербицидоустойчивой сои к гибридизации с дикими сородичами и показана вероятность нарушения биоразнообразия в естественных местообитаниях популяций дикой сои в случае выращивания трансгенной сои

Практическая значимость. Методологическая часть работы проводилась в рамках разработки государственной системы диагностики генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в различных объектах В настоящее время усовершенствованные нами методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (МУК 4 2 1902-04, МУК 4 2 1913-04)

Полученные данные о генетической структуре природных популяций дикой сои могут быть использованы в селекционной работе, для создания новых нетрансгенных сортов сои с широким спектром адаптаций к экологическим факторам среды

Изучение взаимодействий ТР сои с дикими сородичами в агроценозе являлось частью масштабной работы по научно обоснованной оценке биобезопасности выращивания ТР на территории России и послужит источником объективного материала для экспертов, принимающих решение о

регистрации трансгенных сортов в Российской Федерации для промышленного выращивания

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на IV молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии (2004), на научно-практической конференции «Решение экологических проблем при производстве сельскохозяйственной продукции» Белгородской государственной сельскохозяйственной академии (Белгород, 2004), на ежегодных декабрьских научных конференциях Российского государственного аграрного университета - МСХА им К А Тимирязева (2004, 2005), на международной научной конференции молодых ученых, посвященной 140-летию МСХА им К.А Тимирязева «Молодые ученые - аграрной науке» (2005), на заседаниях кафедры экологии и факультета агрохимии, почвоведения и экологии Российского государственного аграрного университета - МСХА им К А Тимирязева (2003-2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объекта и процесса адаптации методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и приложений Работа изложена на 216 страницах машинного текста, включает 40 таблиц, 18 рисунков, список использованной литературы содержит 302 источника, в т ч 196 на иностранных языках

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Рассмотрены основные типы экологических рисков, непосредственно сопряженных с TP Это интрогрессия трансгенов - перенос с пыльцой TP чужеродных генов в исходно нетрансгенные сорта или их дикие сородичи и вызванное этим генетическое загрязнение сортов культивируемых растений и дикоросов, уменьшающее их биоразнообразие (вертикальная утечка генов) И перенос чужеродных генов TP в почвенные бактерии и другие почвенные микроорганизмы, контактирующие с остатками генетически модифицированных растений (ГМР), находящимися в почве (горизонтальная утечка генов)

Показано, что в настоящее время в соответствии с классификацией О Ренна (Renn, 1998), проблемы, связанные с возделыванием TP, относятся к трем типам риска «Медуза» (Вероятность нежелательного события и тяжесть его последствий не велики, но общественный мобилизационный потенциал этого

типа риска высок), «Пифия» (Вероятность нежелательного события и тяжесть его последствий неопределенны) или «Пандора» (Степень тяжести последствий неопределенна, как и вероятность самого нежелательного события, но если оно произойдет, его вредные последствия широко распространятся и/или будут существовать длительное время, и/или будут необратимыми) (Бельков и др, 2003)

Объект и методы исследования. Объектом нашего исследования стала генетически модифицированная соя линии GTS 40-3-2 (Monsanto Company) устойчивая к гербициду глифосату Трансгенная соя получена в результате вставки в геном культурной сои (Glycine max) гена кодирующего растительный фермент 5-енолпирувилшикимат-З-фосфат синтазу (EPSPS) почвенной бактерии Agrobactermm tumefaciens Выбор объекта объясняется следующими причинами

Генетически модифицированная соя, устойчивая к глифосату, на сегодняшний день одно из самых востребованных трансгенных растений Использование ее на засоренных сорняками полях не только дает прибавку урожайности (до 40 %), но и уменьшает количество вносимого гербицида, снижает затраты на культивирование почвы, потери воды Эти особенности ее агротехники обеспечивают производителям большую прибыль и имеют природоохранный характер. Устойчивая к гербицидам соя пока по-прежнему остается доминирующей среди трансгенных сельскохозяйственных культур в восьми странах мира США, Аргентине, Бразилии, Канаде, Мексике, Румынии, Уругвае и Южной Африке

Перечисленные обстоятельства наряду с намерениями оригинаторов этого объекта зарегистрировать его для выращивания на территории РФ делают генетически модифицированную сою, устойчивую к гербициду глифосату актуальным объектом для исследования

Район проведения испытаний на биобезопасность - Дальневосточный регион РФ, Амурская область, Приморский край Выбор района объясняется следующими причинами

Дальний Восток - один из основных районов в нашей стране, где возделывается культурная соя (Glycine soja) и единственный регион, где встречается дикорастущая соя. Дальневосточный регион является центром происхождения вида и поэтому риски «утечки» признака гербицидоустойчивости в природные популяции сои представляют наибольшую потенциальную опасность с точки зрения сохранения биоразнообразия

Экологические условия выращивания почва лугово-черноземовидная, с гумусовым горизонтом мощностью до 30 см и содержанием гумуса 5%, климат

резко-континентальный с чертами муссонности, годовое количество осадков 550 мм

Разработку системы экспресс диагностики качественного и количественного содержания рекомбинантной ДНК в растительном сырье проводили на основе метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (Hollande/ al, 1991)

Исследования генетической структуры популяций дикорастущих предков TP сои, собранных в центре их видообразования в Дальневосточном регионе России, проводились методами кариотипического (Palmer R G , Heer Н , 1973) и молекулярного анализов (Дорохов ДБ, Клоке Э, 1996) Результаты обрабатывались статистически

Полевой агроэкологический опыт по скрещиванию между двумя видами сои (дикорастущей Glycine Soja и культурной генетически модифицированной сои устойчивой к гербициду Раундап) проводились ВНИИСБ совместно с Центром «Биоинженерия» РАН в условиях свободного переопыления на экспериментальных участках Института сои ДВО РАСХН

Таблица 1

Схема опыта

1 Контроль 1 G soja

2 Контроль 2 GTS 40-3-2

3 Вариант 1 G soja + GTS 40-3-2 с междурядьем 15 см

4 Вариант 2 G soja + GTS 40-3-2 с междурядьем 45 см

5 Вариант 3 G soja + GTS 40-3-2 с междурядьем 60 см

6 Вариант 4 G soja + GTS 40-3-2 с междурядьем 70 см

Общая схема эксперимента (табл. 1) по оценке гибридизационной способности при свободном переопылении состояла в размещении на различных расстояниях друг от друга двух типов растений, так, что каждый рядок генетически модифицированной сои чередовался с рядком дикой сои, т е создавались оптимальные условия для перекрестного опыления В качестве доноров пыльцы были использованы трансгенные растения сои линии 40-3-2 характеризующиеся устойчивостью к гербициду глифосату Эти растения были предоставлены компанией Монсанто В качестве ловушек пыльцы использовали образцы дикой сои из коллекции Центра «Биоинженерия» РАН Опыт проведен в четырехкратной повторности на делянках размером 22 кв м

Для анализа отбирались семена, а также вегетативные части растений дикой сои методами сплошного и случайного рендомизированного отбора (Доспехов Б А, 1985) с последующим формированием средних проб (ГОСТ

13586 3) по вариантам Образцы подвергали лабораторному анализу разработанным методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

На второй год эксперимента дополнительно проведен опыт по высеву урожая семян дикой сои, собранного с опытных делянок (табл 2)

Таблица 2

Схема дополнительного опыта

1 Контроль 1 G soja

2 Контроль 2 GTS 40-3-2

3 Вариант 1 G soja из варианта 1

4 Вариант 2 G soja из варианта 2

5 Вариант 3 G soja из варианта 3

6 Вариант 4 G soja из варианта 4

Для контроля фитогенных взаимодействий в опытном агроценозе проведена обработка этих посевов 2% раствором гербицида раундап (360 г/л глифосата) в фазу 3-4 хорошо развитых листьев Через две недели после начала обработки оценивали процент гибели растений

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка методов экспресс диагностики рекомбинантной ДНК в растительном сырье

Методологическая часть исследований содержит описание разработанных и адаптированных нами методов определения количественного содержания гетеролотчных последовательностей чужеродной ДНК (трансгенной вставки) в растительном сырье, основанных на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени (ЛеаШте) Выбор метода для диагностики объясняется следующими причинами

С его помощью можно определять не только факт переноса встроенного фрагмента ДНК от растения к другим участникам биоценоза, но и количественные характеристики этого переноса

На сегодняшний день это наиболее совершенный, высокочувствительный, специфичный и производительный диагностический метод, позволяющий выявить единичную рекомбинантную ДНК за счет многократного увеличения количества копий тестируемых последовательностей ДНК

Технология ПЦР в реальном времени объединяет в себе амплификацию (умножение) ДНК с детекцией ПЦР продукта в одной пробирке Такой формат имеет ряд преимуществ, поскольку приводит к существенному снижению риска контаминации (загрязнения), который возникает при открывании пробирок и манипуляций с реакционной смесью после ПЦР

Накопление продуктов амплификации детектируется непосредственно во время ее проведения Причем, кинетика накопления ампликонов (продуктов ПЦР) напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, поэтому возможно провести количественные измерения рекомбинантной ДНК

Методы детекции продуктов ПЦР в реальном времени основаны на изменении флуоресценции, которое пропорционально увеличению количества ПЦР-продукта в ходе реакции Флуоресценция измеряется в течение каждого цикла ПЦР и на основании данных измерения строится график, позволяющий следить за ходом реакции Момент заметного увеличения сигнала и отрыв его от базовой линии, так называемый пороговый цикл, зависит от исходного количества ДНК- мишени Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл

В ходе подготовительной работы по адаптации методов количественной диагностики рекомбинантной ДНК в различных агроэкологических объектах подобрана схема выявления продуктов амплификации в режиме реального времени В ее основу легло сочетание интеркалирующего агента SYBR Green, флуоресценция которого возрастает при внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК, со специфичными для обнаруживаемых последовательностей ДНК-зондами TaqMan Assay, которые дополняют друг друга при построении графиков накопления продуктов ПЦР

Описаны методы отбора проб, подготовки проб к анализу, выделения ДНК с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид) Разработаны методы, направленные на выявление регуляторной последовательности 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и NOS-терминатора Т1 плазмиды Agrobacterium tumefasciens Присутствие этих наиболее распространенных элементов синтетических ДНК-конструкций однозначно свидетельствует о генно-инженерном происхождении объекта тестирования Показано, что определение количественного содержания этих регуляторных последовательностей параллельно с определением количественного содержания референсных последовательностей генома растения позволяет проводить анализ количественного содержания ГМИ (в %) Окончательное количественное определение трансгенной вставки предложено проводить путем тестирования конкретных трансформационных событий Для нашего

объекта - трансгенной сои, устойчивой к гербициду глифосат, создана методика дополнительного, подтверждающего анализа в исследуемом материале по идентифицикации собственно вставки - гена СР4 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS) Для сравнения и расчета количества ГМИ в общем количестве образца предложено ставить дополнительную реакцию по идентификации ДНК сои в исследуемом материале по фрагменту гена лекгина - запасного белка сои Лектин -природный белок сои и ПЦР-анализ дает положительную реакцию вне зависимости от того, какая соя содержится в исследуемом образце, трансгенная или натуральная Эта реакция используется в качестве точки отсчета и как контроль за выделением ДНК сои и ее доступностью для ПЦР Для оценки количественного содержания чужеродного гена в соевом сырье был использован специально созданный набор эталонов Метод адаптирован также для тестирования трансгенной кукурузы линий MON 810 и Bt-176, устойчивых к стеблевому мотыльку, с дополнительной реакцией определения гена зеина, и трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (ген cry 1П А), с дополнительной реакцией определения гена фосфоенолпируват карбоксилазы (табл 3)

Таблица 3

Количественная диагностика рекомбинантной ДНК Результаты адаптации методов

Объекты Тестируемый образец Предел обнаружения

Соя RoundUp Ready Зерно, мука, изоляты, готовые комбинированные продукты 0,01%

Кукуруза Моп810 Зерно 0,01%

Кукуруза Bt-176 Зерно 0,01%

Картофель (cry III А) Клубни, надземная часть 0,01%

В ходе адаптации методов протестированы и усовершенствованы амплификаторы российского производства «АНК-16» и «АНК-32» -программируемые высокоточные термостаты с возможностью возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации и проводить спектральный анализ четырех красителей одновременно

Составлен список объектов, пригодных для скрининговых исследований на наличие рекомбинантной ДНК с помощью адаптированных методов RealTime PCR

2. Изучение генетического разнообразия дикорастущей сон н степени ее родства с культурным видом

Исследования генетической структуры популяций дикорастущих предков ТР соя, собранных в центре их видообразования в Дальневосточном регионе России, проводились методами кар иотипического и молекулярного анализов. Анализ ДНК маркеров (ЯАРО) показал, что дикая соя имеет гораздо больший полиморфизм по сравнению с культурной (рис. 1). Этот факт может свидетельствовать о сравнительной узости генофонда дикой сои, использованной при доместикации этой культуры.

Рис. I. RAPD-слектры образцов дикорастущей сои, полученные с восемью произвольными пракмерамк.

Отмечена высокая изменчивость по ряду морфологических признаков дикорастущей сои. Показан высокий диапазон изменчивости по форме и величине листовых пластинок, размеру, форме, окраске листьев. Проведенный цитологический анализ образцов дикой сои из разных экологических ниш не выявил различий по числу хромосом. Для всех исследуемых образцов диплоидное число хромосом составило 2п==40, что соответствует ранее полученным данным (Пробатова, 1981, Соколовская и др, 1989). Полиплоидных и анеуплоидных растений среди анализируемых образцов дикой сои не выявлено.

Проведено генотипирование дикорастущей Glycine Soja и культурной сои G. Мах (табл. 4). На основании попарного сравнения RAPD-фрагментов с последующей группировкой образцов определены внутривидовые генетические

расстояния между отдельными популяциями дикой сои, а также междвидовые и межсортовые генетические расстояния Сравнение проводили путем расчета индекса генетического сходства 2Нав/(Нл+Ми), где Ыд и Ив - число фрагментов у генотипов А и В Идв - число одинаковых фрагментов у генотипов А и В

Таблица 4

Результаты генотипирования Glycine Soja и G max

Виды Индекс генетического сходства

G soja 0 27-0 69

Glycine max 0 47-0 51

G soja

G soja 071

G Falcata

Glycine max 0 22

Показано, что генетическое расстояние между наиболее удаленными образцами G Soja (0,69) приближалось к генетическому расстоянию между G Soja и G Falcata (0,71) Небольшие различия между наибольшими внутривидовыми и межвидовыми генетическими расстояниями не могут быть интерпретированы как отражение становления нового вида в пределах популяций дикой сои, а указывает на генетическое разнообразие растений

Установлено, что в популяциях дикой сои существует тренд генетической изменчивости, связанный с их экологической адаптированностью Полученные данные свидетельствуют об активном процессе формирования генетически отличающихся групп дикой сои

По результатам геоботанических исследований установлено, что дикая соя ведет себя как антропофильный рудеральный сорняк На сельскохозяйственных угодьях, в т ч на полях пропашных культур дикая соя встречается редко Этому способствуют ее особенности - длительный вегетативный период, малая семенная активность, отсутствие приспособлений для дальнего рассеивания семян Полученные данные свидетельствуют о низкой вероятности засорения агроценозов дикорастущей соей в случае, если она приобретет признак устойчивости к глифосату

3. Диагностика переноса генов к диким сородичам и оценка биобезопасности выращивания трансгенной гербицидоустойчивой сои в

агроценозе

Для сои определены следующие факторы, способные повлечь перенос генной вставки СР4

- перекрестное опыление (гибридизация)

- вирусный перенос (трансдукция)

- перенос с помощью корневых выделений или микробиоты

С позиции оценки биобезопасности основным фактором риска является гибридизация, в результате которой существует вероятность миграции и закрепления признака устойчивости к гербициду в популяции дикой сои Необходимо отметить, что растения сои относятся к типичным самоопылителям с клейстогамными (закрытого типа) цветками Однако при высокой температуре и пониженной влажности воздуха возможно самораскрывание цветков В некоторых случаях цветки могут повреждаться различными видами насекомых и становиться цветками открытого типа Эти факторы обеспечивают их доступность для насекомых-опылителей и некоторую вероятность переопыления как между сортами внутри вида, так и между видами сои По литературным данным перекрестное опыление у сои составляет менее одного процента (Caviness, 1966) Рядом авторов экспериментально продемонстрирована возможность получения гибридов между культурным видом сои Glycine max (L ) Merr и многолетними дикими видами (Ladizinsky et al, 1979, Smgh et al, 1987), а также между однолетним видом G soja Sieb & Zucc (Ahmad et al, 1977, Smgh & Hymowitz, 1988, Palmer et al, 2000)

С растений дикой сои, высаженных в полевом агроэкологическом опыте на различных расстояниях от генетически модифицированной сои, в полевых условиях случайным образом были проанализированы 257 цветков При анализе этой выборки было установлено, что 1,9% от общего числа составили цветки открытого типа Таким образом, в нашем опыте при свободном переопылении потенциально около двух процентов цветков могли быть переопылены растениями культурной гербицидоустойчивой сои

Для анализа отбирались семена, а также вегетативные части растений дикой сои по вариантам Образцы подвергали лабораторному анализу разработанным методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Как показали результаты тестирования (табл. 5), переопыления между двумя анализируемыми видами не наблюдалось По результатам анализов

установлено, что перенос генной вставки от трансгенной гербицидоустойчивой сои к дикой сое Glycine Soja в агроценозе не происходит (табл 6, 7, 8)

Таблица 5

Результаты анализа семян на наличие регуляторных последовательностей 35S и NOS*

Повто рность Всего проанализировано проб

1 2 3 4

Контроль 1 - - - - 363

Контроль 2 + + + + 377

Вариант 1 - - - - 1365

Вариант 2 - - - - 365

Вариант 3 - - - - 165

Вариант 4 - - - - 166

* «-» означает отсутствие искомых ДНК фрагментов в исследуемых образцах, «+» их наличие

Таблица 6

Результаты анализа семян на наличие гена EPSPS*

Повто] рность Всего проанализировано проб

1 2 3 4

Контроль 1 - - - - 363

Контроль 2 + + + + 377

Вариант 1 - - - - 1365

Вариант 2 - - - - 365

Вариант 3 - - - - 165

Вариант 4 - - - - 166

* «-» означает отсутствие искомых ДНК фрагментов в исследуемых образцах, «+» их наличие

Таблица 7

Результаты анализа вегетативных частей растений наличие регуляторных последовательностей 35S и NOS*

Повто рность Всего проанализировано проб

1 2 3 4

Контроль 1 - - - - 360

Контроль 2 + + + + 380

Вариант 1 - - - - 682

Вариант 2 - - - - 362

Вариант 3 - - - - 160

Вариант 4 - - - - 162

* «—» означает отсутствие искомых ДНК фрагментов в исследуемых образцах, «+» их наличие

Таблица 8

Результаты анализа вегетативных частей растений на наличие гена ЕР8Р8*

Повто рность Всего проанализировано проб

1 2 3 4

Контроль 1 - - - - 360

Контроль 2 + + + + 380

Вариант 1 - - - - 682

Вариант 2 - - - - 362

Вариант 3 - - - - 160

Вариант 4 - - - - 162

* «-» означает отсутствие искомых ДНК фрагментов в исследуемых образцах, «+» их наличие

На графике (рис 2) представлены результаты количественного выявления гена СР4 в 4 образцах растений в двукратной повторности, а также результаты реакции, используемые для построения калибровочной кривой (5 разведений в трехкратной повторности) Наличие линий соответствует положительным результатам и отражает поведение эталонов, использованных для построения калибровочной кривой, отсутствие линии в вариантах с опытными образцами свидетельствует об отсутствии трансгенной вставки.

флюорссиснцян

Рис. 2. Количественное выявление гена СР4 Результаты РТ-ПЦР, нормированные по эталону

На второй год эксперимента дополнительно проведен опыт по высеву урожая семян дикой сои, собранного с опытных делянок Для контроля фитогенных взаимодействий в опытном агроценозе проведена обработка этих посевов гербицидом раундап в фазу 3-4 листьев

Все 1630 растений дикой сои, семена которых были собраны из ловушек, так же как и контрольные растения (контроль 1 - G soja) были нежизнеспособны и погибали через две недели после обработки раундапом Тогда как растения второго контрольного варианта (контроль 2 - GTS 40-3-2) были устойчивы к гербициду и нормально развивались (табл 9) Эти обработки подтвердили отсутствие приобретенного признака устойчивости к гербициду у дикой сои Таким образом, в случае, когда донором пыльцы выступала генетически модифицированная культурная соя, в естественных условиях межвидовых гибридов с дикорастущей соей получить не удалось

Таблица 9

Гибель растений после обработки раундапом, %

Повто рность Всего растений в варианте

1 2 3 4

Контроль 1 100 100 100 100 491

Контроль 2 0 0 0 0 431

Вариант 1 100 100 100 100 410

Вариант 2 100 100 100 100 405

Вариант 3 100 100 100 100 415

Вариант 4 100 100 100 100 400

Таким образом, в смешанных посевах культурной гербицидоустойчивой и дикой сои влияние фитогенного экологического фактора практически отсутствует и вероятность переопыления не превышает двух процентов Испытания показали стабильность популяций дикой сои рядом с агропопуляциями TP

ВЫВОДЫ

1 Адаптирован метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR) для качественной и количественной оценки содержания рекомбинантной ДНК в соевом, кукурузном и картофельном сырье

2 В процессе апробации методов создан набор эталонов и оптимизирована система защиты от возможных контаминаций (загрязнений) проб исследуемых объектов

3 Предложено идентифицировать в исследуемом материале собственно вставку, ген СР4 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы (EPSPS), используемый в генетической инженерии для получения растений с повышенной устойчивостью к гербициду раундап (глифосат)

4 Для расчета количества ГМИ в образце разработан и апробирован дополнительный показатель - реакция идентификации ДНК сои в исследуемом материале по фрагменту гена лектина - запасного белка сои

5 Испытания на биобезопасность показали, что перенос генной вставки от трансгенной гербицидоустойчивой сои к дикой сое Glycine Soja в агроценозе не происходит В случае, когда донором пыльцы выступала генетически модифицированная культурная соя, в естественных условиях межвидовых гибридов с дикорастущей соей не выявлено

6 Показано, что появление межвидовых гибридов с дикорастущей соей, если донором пыльцы выступает культурная в естественных условиях возможно, поскольку у обоих видов, являющихся типичными самоопылителями, свободное переопыление может составлять до 2%

7 Данные генотипирования подтверждают достаточное генетическое удаление популяций дикой сои от культурных сортов сои

8 При анализе данных геоботанических исследований популяций дккой сои установлено, что соя обладает признаками антропофильного рудерального сорняка - произрастает вблизи жилья и на пустырях, а на сельскохозяйственных угодьях встречается редко Полученные данные свидетельствуют о низкой вероятности засорения агроценозов дикорастущей соей, что особенно важно в случае, если она приобретет признак устойчивости к глифосату

9 Обработки гербицидом раундап посевов дикой сои, семена которой получены в условиях свободного переопыления с культурной гербицидоустойчивой соей, приводят к их полному уничтожению, что подтверждает отсутствие генетической устойчивости к гербициду у дикой сои

10 Влияние фитогенного фактора на взаимодействие гербицидоустойчивой и дикой сои незначительно При переопылении дикой сои пыльцой трансгенных растений вероятность гибридизации не превышает 2%

11 Отсутствие межвидовых гибридов свидетельствует о стабильности генома диких популяций сои, произрастающих рядом с агропопуляциями

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Насонова Д С , Лунин В Г , Раскатов В А Применение метода ПЦР для биотестирования изменений генома растений // Сборник докладов студенческой научной конференции, М, МСХА, 2002 С 248-253

2 Насонова Д С , Лунин В Г , Раскатов В А Разработка системы экспресс-диагностики генетически модифицированных растений // Сборник докладов студенческой научной конференции, М , МСХА, 2003 С 308-313

3 Насонова Д С Разработка тест-системы для экспресс диагностики изменений в растительном геноме // Сборник докладов IV молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» М , ВНИИСБ, 2004 С 25-27

4 Насонова Д С , Раскатов В А, Лунин В Г Оценка биобезопасности генетически модифицированных источников и мониторинг трансгенных растений в окружающей среде и продуктах питания // Сборник трудов научно-

практической конференции «Решение экологических проблем при производстве сельскохозяйственной продукции», Белгород, БелГСХА, 2004 С 56-58

5 Насонова Д С , Раскатов В А, Лунин В Г Мониторинг трансгенных растений в окружающей среде // Сборник научных трудов Международной научной конференции молодых ученых, посвященной 140-летию МСХА им К А Тимирязева «Молодые ученые - аграрной науке», М, 2005 С 683-688

6 Насонова Д С, Раскатов В А, Лунин В Г Экологические риски выращивания трансгенных растений // Сборник «Доклады ТСХА» Выпуск 278, М, 2006 С 663-667

7 Насонова Д С , Раскатов В А, Лунин В Г Оценка переноса генов при выращивании трансгенных растений сои // Журнал «Известия ТСХА», Выпуск 2, М, 2007

1,0 печ л

Тир 100 экз

Зак 369

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Насонова, Диана Сергеевна

Основные обозначения и сокращения

Введение

Глава 1 Современное состояние проблемы оценки биобезопасности трансгенных растений (Обзор литературы)

1.1. Понятие биобезопасности

1.2. Динамика распространения ГМ культур

1.3. Классификация рисков, сопряженных с ГМ растениями

1.4. Научные критерии и основания для оценки риска

1.5. Подходы к оценке риска культивирования ГМ культур

1.6. Основные экологические риски выращивания ГМ культур

1.7. Утечка генов от ГМ культур к диким сородичам

1.8. Краткая характеристика сои линии GTS 40-3

1.9. Биология, экология и распространения дикой сои

1.10. Испытания на биобезопасность

1.11. Цель и задачи исследования

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Методы исследования

Глава 3. Методологическая часть

3.1. Выделение ДНК из растительных объектов.

3.2. Полимеразная цепная реакция

3.2.1. Подбор схемы выявления продуктов амплификации

3.2.2. Выбор и усовершенствование прибора для РТ-ПЦР

3.2.3. Выбор и обоснование мишени

3.2.4. Подбор праймеров

3.2.5. Подбор зондов

3.2.6. Программа амплификации

3.2.7. Состав реакционной смеси

3.2.8. Наши наблюдения и разработки 125 3.2.9 Настройка параметров расчета

3.2.10. Схемы проведения анализов

3.2.11. Интерпретация результатов и критерии достоверности

3.2.12. Защита от возможных контаминаций (загрязнений) проб исследуемых объектов

3.2.13. Результаты адаптации и апробации методов

Глава 4. Экспериментальная часть

4.1. Изучение генетического разнообразия дикорастущей сои и степени ее родства с культурным видом

4.1.1. Морфологический и цитологический анализ

4.1.2. Генотипирование

4.1.3. Интерпретация результатов

4.1.4. Оценка способности G. soja к сорнячанию

4.2. Диагностика переноса генов к диким сородичам и оценка биобезопасности выращивания трансгенной гербицидоустойчивой сои в агроценозе

4.2.1. Оценка способности сои к перекрестному опылению

4.2.2. Оценка переноса генов при выращивании трансгенной гербицидоустойчивой сои в агроценозе

4.2.3. Обсуждение результатов 168 Выводы 170 Список литературы

Основные обозначения и сокращения

ВПК - внутренний положительный контроль

ГМ - генетически модифицированный

ГМИ - генетически модифицированные источники

ГМО - генетически модифицированные объекты

ГМР - генетически модифицированные растения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КО - калибровочные образцы

ОКО - отрицательный контроль выделения

ПКО - положительный контрольный образец

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени TP - трансгенные растения

35S-промотор

Bt - Bacillus thuringiensis

NOS - терминатор

PCR - полимеразная цепная реакция

PT-PCR - полимеразная цепная реакция в реальном времени

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка на биобезопасность переноса генов при выращивании трансгенных растений сои в агроценозе"

Трансгенная биотехнология - одна из самых передовых и стремительно развивающихся отраслей современной биоиндустрии и, в особенности, сельского хозяйства. Уже сейчас посевы трансгенных растений (TP) занимают более 90 млн га, судя по всему, процесс расширения применения TP будет нарастать. По прогнозам в 2007 г. площади под TP могут вырасти до 100 млн га. На территории России TP пока не выращиваются в промышленных масштабах. Согласно существующим в стране нормам перед выпуском в окружающую среду каждый трансгенный сорт должен пройти испытания на биобезопасность. Биобезопасность подразумевает отсутствие фактического или прогнозируемого нежелательного воздействия модифицированного организма в сравнении с исходным немодифицированным организмом на окружающую среду.

TP, полученные методами генной инженерии, несут новые гены, обладают новыми признаками, и представляют собой виды, не свойственные ни одной экосистеме планеты. Необходимость проведения оценки биобезопасности основывается на принципе предосторожности, который гласит, что: «отсутствие неоспоримых научных фактов не должно служить причиной отсрочки принятия мер для устранения или сведения к минимуму угрозы» (Конвенция о биологическом разнообразии, 1995). Оценка биобезопасности призвана помочь минимизировать потенциальный ущерб.

Вопросы взаимодействия и сосуществования TP с традиционными сортами и их дикими сородичами мало изучены. Еще меньше исследовано влияние TP на биоразнообразие и динамику популяций (Соколов и др., 2002).

Выявление и оценка экологических рисков, сопровождающих выпуск TP в окружающую среду, позволит принять решение о допустимости или нежелательности возделывания TP на территории России, а также предусмотреть комплекс профилактических и защитных мер по контролю проблемы «утечки генов», что имеет важное экологическое значение.

Целью данной работы являлось изучение экологических рисков и оценка биобезопасности при выращивании гербицидоустойчивой сои в современных агроценозах с использованием оптимизированной системы экспресс диагностики.

В соответствие с поставленной целью были решены следующие задачи:

1. Адаптировать метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR) для качественной и количественной оценки содержания рекомбинантной ДНК в растительном сырье для достоверной идентификации экологического риска утечки генов.

2. Создать набор эталонов и оптимизировать систему защиты от возможных контаминаций (загрязнений) проб исследуемых объектов.

3. Провести полевые испытания на биобезопасность трансгенной гербицидоустойчивой сои, изучить влияние фитогенных факторов на взаимодействие TP с дикими сородичами, а также влияние антропогенного фактора на появление устойчивости к гербициду раундап у диких сородичей сои.

4. Изучить специфику популяций диких сородичей культурной сои, выявить степень родства культурной и дикой сои и способность к гибридизации.

5. Оценить экологические условия и биобезопасность при выращивании трансгенной гербицидоустойчивой сои в агроценозе.

Научная новизна работы заключается в разработке методов экспресс диагностики качественного и количественного содержания рекомбинантной ДНК в растительном материале, обеспечивающих оптимизацию процесса при проведении исследования и интерпретации данных. В рамках выполнения работы проведены экологические и геоботанические исследования популяций дикой сои в Дальневосточном регионе России и выявлена степень родства культурной и дикой сои путем генотипирования. Впервые изучена способность трансгенной гербицидоустойчивой сои к гибридизации с дикими сородичами и показана вероятность нарушения биоразнообразия в естественных местообитаниях популяций дикой сои в случае выращивания трансгенной сои.

Методологическая часть работы проводилась в рамках разработки государственной системы диагностики генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в различных объектах. В настоящее время усовершенствованные в ходе выполнения работы методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (МУК 4.2.1902-04, МУК 4.2.1913-04).

Полученные данные о генетической структуре природных популяций дикой сои могут быть использованы в селекционной работе, для создания новых нетрансгенных сортов сои с широким спектром адаптаций к экологическим факторам среды.

Изучение взаимодействий TP сои с дикими сородичами в агроценозе являлось частью масштабной работы по научно обоснованной оценке биобезопасности выращивания TP на территории России и послужит источником объективного материала для экспертов, принимающих решение о регистрации трансгенных сортов в Российской Федерации для промышленного выращивания.

Объектом нашего исследования стала генетически модифицированная соя линии GTS 40-3-2 (Monsanto Company) устойчивая к гербициду глифосату. Трансгенная соя получена в результате вставки в геном культурной сои (Glycine max) гена кодирующего растительный фермент 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (EPSPS) почвенной бактерии

Agrobacterium tumefaciens. Район проведения испытаний на биобезопасность - Дальневосточный регион РФ, Амурская область, Приморский край.

Разработку системы экспресс диагностики качественного и количественного содержания рекомбинантной ДНК в растительном сырье проводили на основе метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (Holland etal, 1991)

Исследования генетической структуры популяций дикорастущих предков TP сои, собранных в центре их видообразования в Дальневосточном регионе России, проводились методами кариотипического (Palmer R.G., Heer Н., 1973) и молекулярного анализов (Дорохов Д.Б., Клоке Э, 1996).

Полевой агроэкологический опыт по скрещиванию между двумя видами сои (дикорастущей Glycine Soja и культурной генетически модифицированной сои устойчивой к гербициду Раундап) проводился совместно с ВНИИСБ и Центром «Биоинженерия» РАН в условиях свободного переопыления на экспериментальных участках Института сои ДВО РАСХН. Согласно схеме эксперимента растения размещались так, что каждый рядок генетически модифицированной сои чередовался с рядком дикой сои, т.е. создавались оптимальные условия для перекрестного опыления. Для анализа отбирались семена, а также вегетативные части растений дикой сои методами сплошного и случайного рендомизированного отбора (Доспехов Б.А., 1985) с последующим формированием средних проб (ГОСТ 13586.3) по вариантам. Образцы подвергали лабораторному анализу разработанным методом экспресс диагностики на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени.

На второй год эксперимента дополнительно проводился опыт по высеву урожая семян дикой сои, собранного с опытных делянок. Для контроля фитогенных взаимодействий в опытном агроценозе осуществлялась обработка этих посевов 2% раствором гербицида раундап (360 г/л глифосата) в фазу 3-4 хорошо развитых листьев. Через две недели после начала обработки оценивался процент гибели растений.

Результаты исследований представлялись на IV молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии (2004), на научно-практической конференции «Решение экологических проблем при производстве сельскохозяйственной продукции» Белгородской государственной сельскохозяйственной академии (Белгород, 2004), на ежегодных декабрьских научных конференциях Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К.А Тимирязева (2004, 2005), на международной научной конференции молодых ученых, посвященной 140-летию МСХА им. К.А. Тимирязева «Молодые ученые - аграрной науке» (2005), на заседаниях кафедры экологии и факультета агрохимии, почвоведения и экологии Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К.А. Тимирязева (2003-2006). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Автор глубоко благодарна своему научному руководителю - доценту Вячеславу Андреевичу Раскатову, а также Владимиру Глебовичу Лунину за методическую помощь и постоянную поддержку при выполнении настоящей диссертационной работы. Автор также признательна академику РАСХН B.C. Шевелухе, профессорам Е.А. Калашниковой и Н.Б. Прониной, Д.Б. Дорохову, Е.Ю. Сорокиной и С.В. Боровской за консультации и критические замечания.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Насонова, Диана Сергеевна

Выводы

1. Адаптирован метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR) для качественной и количественной оценки содержания рекомбинантной ДНК в соевом, кукурузном и картофельном сырье.

2. В процессе апробации методов создан набор эталонов и оптимизирована система защиты от возможных контаминаций (загрязнений) проб исследуемых объектов.

3. Предложено идентифицировать в исследуемом материале собственно вставку, ген СР4 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы (EPSPS), используемый в генетической инженерии для получения растений с повышенной устойчивостью к гербициду раундап (глифосат).

4. Для расчета количества ГМИ в образце разработан и апробирован дополнительный показатель - реакция идентификации ДНК сои в исследуемом материале по фрагменту гена лектина - запасного белка сои.

5. Испытания на биобезопасность показали, что перенос генной вставки от трансгенной гербицидоустойчивой сои к дикой сое Glycine Soja в агроценозе не происходит. В случае, когда донором пыльцы выступала генетически модифицированная культурная соя, в естественных условиях межвидовых гибридов с дикорастущей соей не выявлено.

6. Показано, что появление межвидовых гибридов с дикорастущей соей, если донором пыльцы выступает культурная в естественных условиях возможно, поскольку у обоих видов, являющихся типичными самоопылителями, свободное переопыление может составлять до 2%.

7. Данные генотипирования подтверждают достаточное генетическое удаление популяций дикой сои от культурных сортов сои.

8. При анализе данных геоботанических исследований популяций дикой сои установлено, что соя обладает признаками антропофильного рудерального сорняка - произрастает вблизи жилья и на пустырях, а на сельскохозяйственных угодьях встречается редко. Полученные данные свидетельствуют о низкой вероятности засорения агроценозов дикорастущей соей, что особенно важно в случае, если она приобретет признак устойчивости к глифосату.

9. Обработки гербицидом раундап посевов дикой сои, семена которой получены в условиях свободного переопыления с культурной гербицидоустойчивой соей, приводят к их полному уничтожению, что подтверждает отсутствие генетической устойчивости к гербициду у дикой сои.

10. Влияние фитогенного фактора на взаимодействие гербицидоустойчивой и дикой сои незначительно. При переопылении дикой сои пыльцой трансгенных растений вероятность гибридизации не превышает 2%.

11. Отсутствие межвидовых гибридов свидетельствует о стабильности генома диких популяций сои, произрастающих рядом с агропопуляциями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Насонова, Диана Сергеевна, Москва

1. Ала А.Я. Изменчивость и наследственность дикой уссурийской сои // Научно-технический бюллетень СО ВАСХНИЛ, Новосибирск, 1984, с.5-25.

2. Ала А.Я. Использование спонтанного опыления у сои при межвидовой гибридизации //Доклады ВАСХНИЛ. 1988. Т.6. С.10-12.

3. Балашова Н.Н., Лахматова И.Т., Лупашку Г.А. Трансгенные растения в сельском хозяйстве и возможный риск в связи с проблемами иммунитета живых организмов // С.-х. биол., 2001, 5: С. 3-13.

4. Баранов А.С., Кревер О.Н., Разбаш О.А. Обеспечение экологической безопасности при использовании генетически модифицированных организмов // Сб. материалов Круглого стола Всероссийской конференции по экологической безопасности. М., 2002, 255с.

5. Вельков В.В. Соколов М. С., Медвинский А. Б. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия. 2003.№ 2. С. 74-96.

6. Воложенин А.Г. Основные вопросы агротехники сои. Владивосток: Приморск. кн. изд-во. 1962. 21 с

7. Воложенин А.Г. Сорняки и меры борьбы с ними. Владивосток: Дальне вост.кн. изд-во. 1969. 76 с.

8. Глазко В.И. Генетически детерминированный полиморфизм ферментов у некоторых сортов сои (Glycine max) и дикой сои (Glycine soja) // Цитология и генетика. 2000. Т. 34. № 2. С. 77-83.

9. Глазко В.И., Дубин А.В., Календарь Р.Н. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR маркеров // Цитология и генетика. 1999. Т. 33. № 5. С. 47-51.

10. Гончаров Ю.Л. Общие положения опытов в оценке биобезопасности трансгенных растений // Серия "Генетическая инженерия и экология".

11. М: Центр "Биоинженерия" РАН, 2001. Т.2. с. 120.

12. Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа растительных геномов. // Генетика. 1996. Т. 33. № 3. С. 358-365.

13. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М. Агропромиздат, 1985. -351с.

14. Дымина Г.Д. Луга юга Дальнего Востока. Новосибирск: Наука. 1985. 188с.

15. Жученко А.А. Адаптивный потенциал культурных растений (эколого-генетические основы). Кишинев, 1988.

16. Жученко А.А. Роль генетической инженерии в адаптивной системе селекции растений // Сельскохозяйственная биология, 2003, №1, С. 333.

17. Киль В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука к ^/-защищенному картофелю. // Агро XXI Современное растениеводство России: практика и научные достижения. 2003-2004, №№ 7-12, с.22-24.

18. Комаров B.JI. Происхождение культурных растений. Избр.соч. M.-JL: Изд-во АН СССР. 1958. T.XII. С. 7-256.

19. Комаров B.JL Типы растительности Южно-Уссурийского края. Избр.соч. -М.: Изд-во АН СССР. 1953. T.IX. С. 545-742.

20. Комаров В.Л., Клобукова-Алисова Е.Н. Определитель растений Дальневосточного края. Л.: Изд-во АН СССР. 1931. Т. 1. 662 с. 1932. Т.2. С. 623-1175.

21. Конов А.Л. Биотехнология и "горизонтальный" перенос генов: Можно ли съев ГМ-продукты, приобрести устойчивость к антибиоти-кам? // Экология и жизнь. 2002, №2. сс.66-68.

22. Корецкая Л.А. Кормовые ресурсы Зейско-Буреинской равнины. М.: Изд-во АН СССР. 1956. 77 с.

23. Коттер Д. Генетически модифицированная соя (Roundup Ready) Обсуждение экологического риска возделывания трансгенных сортов сои, устойчивых к гербициду раундапу. (Великобритания). : науч. обзор // Аграр.Россия, 2005; N 1, - С. 54-58

24. Куликов A.M. ГМО и риски их использования // ГМО скрытая угроза России. - М. ОАГБ, ЦЭПР, 2004, С. 46-71

25. Куренцова Г.Э. Растительность Приханкайской равнины и окружающих предгорий. -M.-JL: Изд-во АН СССР. 1962. 137 с.

26. Маак Р. Путешествие по долине р.Уссури. Санкт-Петербург. 1861. Т.2. 344с.

27. Маниатис Т. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984.

28. Международная Конвенция по биоразнообразию, 1995. М., с. 8.

29. Мельникова А.Б. Сосудистые растения. В кн.: Флора и растительность Большехехцирского Заповедника (Хабаровский край). Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1986. С. 102-183.

30. Методические указания по испытанию трансгенных сортов, устойчивых к гербицидам / ВНИИФ, 2000 г. 18 с.

31. Надыкта В.; Угрюмов Е.П.; Савва А.П. Успехи и проблемы введения в открытые биоценозы трансгенных сельскохозяйственных культур // Информ.бюл.ВПРС МОББ/Междунар.орг.по биол.борьбе с вредными животными и растениями, 2002; N 33, - С. 191-193

32. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А., Петухов А.И., Королев А.А., Аксюк И.Н., Сорокина Е.Ю. Современные подходы к оценке безопасности генетически модифицированных источников пищи. Опыт изучения соевых бобов линии 40-3-2 // Вопросы питания, 1999.

33. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии высших растений М.: Наука, 1988.

34. Полевая геоботаника / Под ред. Е.М Лавренко. JL: Наука. 1959-1976. Т. 1-5.

35. Правила по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР. Утверждены Министерством сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации и департаментом ветеринарии, 1995.

36. Пробатова НС, Рудыко Э.Г. Хромосомные числа некоторых видов сосудистых растений Дальнего Востока // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук. 1981. Вып. 2. № ю. С. 77-82.

37. Ракитский В.Н. Токсиколого-гигиенические аспекты оценки безопасности применения гербицидов на трансгенных культурах // Серия "Генетическая инженерия и экология". М.: Центр "Биоинженерия" РАН-2001. Т.2. с. 125.

38. Сеитова A.M. и др. Оценка генетического разнообразия дикорастущей сои (Glycine soja Siebold et Zucc.) в Дальневосточном регионе России. // Генетика, 2004, т 40, №1, с 1-8

39. Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник / B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин и др. / Под ред. B.C. Шевелухи. М.: Высш. шк., 2003. - 469 с.

40. Семенюк Е.Г. Проблемы риска трансгенных растений. Пущино, 2000.

41. Скворцов Б.В. Дикая и культурная соя Восточной Азии // Вести. Манчжурии. Харбин, 1927. № 9. С. 35-43.

42. Соколов М.С., Марченко А.И. Потенциальный риск возделывания трансгенных растений и потребления их урожая. // Сельскохозяйственная биология, 2002, № 5, с 3-22

43. Соколовская А.П., Пробатова Н.С, Рудыка Э.Г. Хромосомные числанекоторых видов флоры советского Дальнего Востока из семейств Actinidiaceae, Aristolochiaceae, Fabaceae, Ranunculaceae, Saxifragaceae // Ботан.журн. 1989. Т. 74. №2. С 268-271.

44. Сорные растения Приморского края /Отв.ред. СС.Харкевич. -Владивосток: Дальневосточной, изд-во. 1981. 253 с.

45. Сорные растения СССР. Л.: Изд-во АН СССР. 1934. Т. 3. 447 с.

46. Сосудистые растения советского Дальнего Востока /Отв. редактор Харкевич С.С. Л.: Наука. 1989. Т. 4. 378 с.

47. Трансгенные растения новое направление в биологической защите растений. Материалы международной научно-практической конференции. - Краснодар, 2003, 245 с.

48. Угрюмов Е.П. Новый путь Результаты испытаний гербицидоустойчивых трансгенных сортов сои, кукурузы, сахарной свеклы в условиях Краснодарского края. // Гл.агроном, 2005; N 2, - С. 73-74

49. Ульянова Т.Н. Сегетальная флора Приморского края // Ботан.журн. -1978. Т. 63. №7. с. 1004-1016.

50. Федоренко В.Ф.; Буклагин Д.С.; Аронов Э.Л. Генетически модифицированные растения и продукты питания: реальность и безопасность: аналитический обзор // Москва; Россельхоз, 2005, - с. 198

51. Флора СССР. Т. 13.-М.-Л.: Изд-во АН СССР. Т. 13. 1948. С. 526-528.

52. Цаценкин И.А., Савченко И.В., Дмитриева СИ. Методические указания по экологической оценке кормовых угодий тундровой и лесной зон

53. Сибири и Дальнего Востока по растительному покрову. М.: ВАСХНИЛ. 1978. 300 с.

54. Чернов Ю.И. Биологическое разнообразие: сущность и проблемы // Успехи современной биологии. 1991. Т. 111. Вып. 4. С. 499-507.

55. Шага B.C. Флора поймы р. Бурей // Научн.докл.высшей школы. Биолог.науки. 1973. № 5. С. 71-77.

56. Шашкин И.К. Сорные растения южной части Дальневосточного края. -Хабаровск: Дальгиз. 1936.

57. Шевелуха B.C. Биотехнология и биобезопасность // С.-х. биол., 2002, 3:С. 3-15.

58. Advice on the implications of the farm-scale evaluations of genetically modified herbicidetolerant crops. Advisory committee on releases to the environment. January 2004

59. AGBIOS (2006). Biotech Crop Database, www.agbios.com

60. Ahmad Q.N., Britten E.J., Byth D.E. Inversion bridges and meiotic behavior in species hybrids of soybeans // J Hered. 1977. V.68. P.360-364.

61. Ammann K. Effects of biotechnology on biodiversity: herbicide-tolerant and insectresistant GM crops // Trends in Biotechnology, 2005. 23: 388-394.

62. Ammann K, Jacot Y, and Rufener Al Mazyad P. Field releases of transgenic crops in Switzerland an ecological risk assessment of vertical gene flow // Vol. Band 1 -Materialien,- 1996. pp. 101-157. BATS, Basel.

63. Ammitzboll H, Mikkelsen TN, and Jorgensen RB. Transgene expression and fitness of hybrids between GM oilseed rape and Brassica гара II Environmental Biosafety Research, 2005. 4: 3-12.

64. Barry, G. F.; Kishore, G. M.; Padgette, S. R.; Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvateshikimate-3-phosphate synthases. U.S. Patent 5627061-A9, 1997.

65. Beckie, H.J.; Hall, L.M.; Warwick, S.I. Impact of herbicide-resistant crops as weeds in Canada, proceedings Brighton Crop Protection Council // Weeds. -2001. P. 135-142

66. Bekal S, Brousseau R, Masson L, Prefontaine G, Fairbrother J, Harel J Rapid identification of Escherichia coli pathotypes by virulence gene detection with DNA microarrays // J Clin Microbiol. 2003 .vol.41, N5: pp.2113-2125.

67. Bensasson D, Boore JL and Nielsen KM. Genes without frontiers? // Heredity 2004.92,483^189

68. Berdal K.G.; Hoist-Jensen A. Roundup ready soybean event-specific realtime quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses // Europ.Food Res.Technol., 2001; Vol.213,N6,-P.432-438

69. Bernard, R.L. and M.G. Weiss. Qualitative Genetics. Soybeans, Production and Uses // B.E. Caldwell (ed.).Agronomy Series, American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA. 1973. P. 117-154.

70. Birch ANE, and Wheatley RE. GM pest-resistant crops: assessing environmental impacts on non-target organisms // Issues in Environmental Science and Technology, -2005. 21: 31-57.

71. Bishop C. Neural Networks for Pattern Recognition. Oxford: Univ. Press, 1995.

72. Brookes G., Barfoot P. GM Crops: The Global Economic and Environmental Impact The First Nine Years 1996-2004 // PG Economics Ltd., Dorchester,-2005

73. Broue, P., Douglass, I., Grace, J.P. and Marshall, D.R. Interspecific hybridisation of soybeans and perennial Glycine species indigenous to Australia via embryo culture // Euphytica 31,- 1982. 715-724.

74. Browne M.W. A comparison of factor analytic techniques // Psychometrika. -1968. V.33.P. 267-334.

75. Burke JM, and Rieseberg LH. Fitness effects of transgenic disease resistance in sunflowers // Science, 2003. 300: 1250-1250.

76. Caetano-Anolles, G. and Gresshoff, P.M. (Eds). DNA Markers: Protocols, Applications and Overviews. New York: Wiley, 1997.

77. Cavinesss C.E. Estimates of natural cross-pollination in jackson soybeans in Arkansas // CropSci. 1966.V.6. P.211-219.

78. CBD. Cartagena protocol on biosafety to the Convention on Biological Diversity, Secretariat of the Convention on Biological Diversity, Montreal, 2000

79. Chapin FS, Zavaleta ES, Eviner VT, Naylor RL, Vitousek PM, Reynolds HL, Hooper DU, Lavorel S, Sala OE, Hobbie SE, Mack MC, and Diaz S. Consequences of changing biodiversity // Nature, 2000. 405: 234-242.

80. Cherve A.M., Eber E, Renard M. Gene flow from oilseed rape to weeds. In Gene Flow and Agriculture Relevance for Transgenic Crops // Proceedings of a Symposium held at the University of Keele, Staffordshire 12-14 April 1999, P. 125-130.

81. Chowdhury EH, Mikami O, Nakajima Y, Hino A, Kuribara H, Suga K, Hanazumi M, Yomemochi C. Detection of genetically modified maize DNA fragments in the intestinal contents of pigs fed StarLink CBH351 // Vet Hum Toxicol. 2003. vol.45, N 2: pp.95-96.

82. Conner AJ, Glare TR, and Nap J-P. The release of genetically modified crops into the environment. Part II. Overview of ecological risk assessment // Plant Journal, 2003. 33: 19^6.

83. Dale PJ, Clarke B, and Fontes EMG. Potential for the environmental impact of transgenic crops. Nature Biotechnology, 2002. 20: 567-574.

84. Dale PJ. Public concerns over transgenic crops // Genome Res. 1999. vol.9, N12: pp.1159-1162.

85. Dalton R. Superweed stady falters as seed firms deny access to transgene. // Nature,-2002.V. 419. P. 655.

86. Edwards K., Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis //Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. №6. P. 1349.

87. Ellstrand NC, Prentice HC, and Hancock JF. Gene flow and introgression from domesticated plants into their wild relatives // Annual Review of Ecology and Systematics, 1999. 30: 539-563.

88. European Commission (2000a). Communication from the Commission on the precautionary principle, Commission of the European Communities, Brussels.

89. European Community (2001). Directive 2001/18/EC of the European Parliament and of the council of 12 March 2001 on the deliberate release into the environment of genetically modified organisms and repealing Council

90. Directive 90/220/EEC, European Parliament and the Council of the European Union, Brussels.

91. Fagan J.; Schoel В.; Haegert A.; Moore J.; Beeby J. Performance assessment under field conditions of a rapid immunological test for transgenic soybeans // Intern.J.Food Sc.Technol., 2001; Vol. 36, N 4, - P. 357-367

92. Fanizza, G, Colonna, G, Resta, P. and Ferrara, G. The effect of the number of RAPD markers on the evaluation of genotypic distances in Vitis vinifera // Euphytica- 1999. 107,45-50.

93. FAO. The state of food and agriculture agricultural biotechnology, meeting the needs of the poor? Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 2004

94. Fekuda, Y. Cytological studies on the wild and cultivated Manchurian soybeans (Glycine L.). Japanese Journal of Botany, 1933. 6. P. 489-506.

95. Felsot A. Herbicide Tolerant Genes. Pt. 1: Squaring Up Roundup Ready Crops. Agrichemical and Environmental News, September, 2000. Is. 173 (http://www. aenews. wsu. edu/SeptOOAENews/SeptOOAENews. htm #anchor5301 120)

96. Funke, R. P.; Kolchinsky, A.; Gresshoff, P. M. Physical mapping of a region in the soybean (Glycine max) genome containing duplicated sequences // Plant Mol. Biol. 1993, 22, 437-446.

97. Gai, J.Y. et al. Studies on the evolutionary relationship among ecotypes of G. max and G. soja in China. // Acta Agron. China 26, 2000, P. 513-520

98. Giovannetti M. The ecological risks of transgenic plants // Riv. Biol. -2003.vol. 96, N2, pp.207-223.

99. Gizlice Z., Carter Т.Е., Gerig T.M. et al. Genetic relationships within old US soybean cultivar groups // Crop Sci. 1996. V. 36. P. 743-752.

100. GM Science Review Panel. GM science review: first report, Department of Trade and Industry, 2003.

101. Goklany IM. From precautionary principle to risk-risk analysis. Nature Biotechnology, -2002. 20: 1075.

102. Grant, J.E. Interspecific hybridization in Glycine Willd. Subgenus Glycine (Leguminosae) II Australian Journal of Botany 1984. 32, 655-663.

103. Gueritaine G, Bazot S, and Darmency H. Emergence and growth of hybrids between Brassica napus and Raphanus raphanistrum. II New Phytologist, -2003. 158: 561-567.

104. Gueritaine G, Sester M, Eber F, Chevre AM, and Darmency H. Fitness of backcross six of hybrids between transgenic oilseed rape {Brassica napus) and wild radish (Raphanus raphanistrum). II Molecular Ecology, 2002. 11: 1419-1426.

105. Hails RS. Assessing the risks associated with new agricultural practices. // Nature,-2002. 418: 685-688.

106. Hails RS, and Morley K. Genes invading new populations: a risk assessment perspective. // Trends in Ecology & Evolution, 2005. 20: 245-252.

107. Halfhill MD, Millwood RJ, Raymer PL, and Stewart CN. ^/-transgenic oilseed rape hybridization with its weedy relative, Brassica гара. II Environmental Biosafety Research, 2002. 1: 19-28.

108. Hansen LB, Siegismund HR, and Jorgensen RB. Introgression between oilseed rape (Brassica napus L.) and its weedy relative B. rapa L. in a natural population. // Genetic Resources and Crop Evolution, 2001. 48: 621-627.

109. Hansen LB, Siegismund HR, and Jorgensen RB. Progressive introgression between Brassica napus (oilseed rape) and B. rapa. Heredity, 2003. 91: 276-283.

110. Harwood J, and Stokes K. Coping with uncertainty in ecological advice: lessons from fisheries. // Trends in Ecology & Evolution, 2003. 18: 617— 622.

111. Heid, C. A.; Stevens, J.; Livak, K. J.; Williams, P. M. Real time quantitative PCRJ/Genome Res. 1996, 6,986-994.

112. Hermann, F.J. A revision of the genus Glycine and its immediate allies. // USDA Technical Bulletin 1962. 1268,1-79.

113. Hilbeck A. et al. Effects of transgenic Bacillus thuringiensis corn fed prey on the mortality and development time of immature Chrysoperle carnea. II Environ. Entomol. 1998. V. 17. P. 480-487.

114. Hill RA, and Sendashonga C. General principles for risk assessment of living modified organisms: Lessons from chemical risk assessment. // Environmental Biosafety Research, 2003. 2: 81-88.

115. Ho MW, Cummins J. and Ryan A. Cauliflower Transgenic Instability. ISIS Reprints, ISIS Publications 2002: www.i-sis.org.uk

116. Ho MW, Ryan A and Cummins J. Hazards of transgenic plants with the cauliflower mosaic viral promoter. // Microbial Ecology in Health and Disease: 2000. vol. 12: pp.6-11.

117. Holland P., Abramson R.D., Watson R. and Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction products by utilizing the 5 -3' exonucleaseactivity of thermos acuaticus. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1991. Vol.88, p.7276-7280

118. Hood, M.J. and Allen, F.L. Interspecific hybridization studies between cultivated soybean, Glycine max and a perennial wild relative, G. falcata. // Agronomy Abstracts, Proceedings of the American Society of Agronomy, -1980, P.58.

119. Huberty, C.J. Discriminant Analysis. // Rev Educat. Res., 1975. 45, 543598.

120. Hymowitz, T. On the domestication of the soybean. // Economic Botany -1970. 24,408-421.

121. Hymowitz, T. and Newell, C.A. Taxonomy of the genus Glycine, domestication and uses of soybeans. I I Economic Botany 1981. 37, 371-379.

122. Jacob D, Lewin A, Meister B, Appel B. Plant-specific promoter sequences carry elements that are recognised by the eubacterial transcription machinery. //Transgenic Res.-2002. vol.11, N3: pp.291-303.

123. James C. Global status of commercialized biotech/GM crops: 2005, ISAAA Brief, 2005, No. 34. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, Ithaca, NY.

124. James C. Preview: Global status of commercialized transgenic crops // ISAAA Briefs, 2004, No. 32. ISAAA, Ithaca NY.

125. Jennings JC, Kolwyck DC, Kays SB, Whetsell AJ, Surber JB, Cromwell GL, Lirette RP, Glenn КС. Determining whether transgenic and endogenous plant DNA and transgenic protein are detectable in muscle from swine fed

126. Roundup Ready soybean meal. // J Anim Sci. 2003. vol.81N6: pp. 14471455.

127. Kanazawa A., Tozuka A., Akimoto S. Phylogenetic relationships of the mitochondrial genomes in the genus Glycine subgenus Soja // Genes Genet. Syst. 1998. V. 73. №4. P. 255-261.

128. Karasawa, K. Crossing experiments with Glycine soja and G. gracilis. // Genetica 1952.26, 357-358.

129. Keim P., Beavis W., Schupp J., Freestone R. Evaluation of soybean RFLP marker diversity in adapted germplasm//Theor. Appl. Genet. 1992 . V. 85. P. 205-212.

130. Khan MS, Maliga P. Fluorescent antibiotic resistance marker for tracking plastid transformation in higher plants. // Nat Biotechnol. 1999. vol.17, N9: #910-915.

131. Kharbin 9, 35-43. Thomson, J.A., Nelson, R.L. and Vodkin, L.O. Identification of diverse soybean germplasm using RAPD markers. // Crop Science 1998, 38,1348-1355.

132. KresovichS., Williams J. G.K, McFersonJ.R. et al. Characterization of genetic identities and relationships of Brassica oleracea L. via a random amplified polymorphic DNA assay // Theor. Appl. Genet. 1992. V. 85. P. 190-196.

133. Ladizinsky G., Newel C.A., Hymowitz T. Wide crosses in soybeans: prospects and limitations// Euphytica. 1979. V.28. P.421-423.

134. Lehesranta SJ, Davies HV, Shepherd LVT, Nunan N, McNicol JW, Auriola S, Koistinen KM, Suomalainen S, Kokko HI, and Karenlampi SO.

135. Comparison of tuber proteomes of potato varieties, landraces, and genetically modified lines.//Plant Physiology,-2005. 138: 1690-1699.

136. Levidow L. Precautionary risk assessment of J5f-maize: what uncertainties? Journal of Invertebrate Pathology, 2003. 83: 113-117.

137. Lin CT, Lin WH, Lyu YL, Whang-Peng J. Inverted repeats as genetic elements for promoting DNA inverted duplication: implications in gene amplification//Nucleic Acids Res. -2001. vol.29, N17: pp.3529-3538

138. Lin J J., Kuo J., Ma J. et al. Identification of molecular markers in soybean comparing RFLP, RAPD and AFLP DNA mapping techniques // Plant Mol. Biol. Rep. 1996. V. 14. №2. P. 156-169.

139. Lipp M., Brodman P., Pietsch et al IUPAC Collaborative Trial Study of a Method to detect Genetically Modified Soy Beans and Maize in Dried Powder //Journal of AOAC International 1999.-V.82.- N.4.-P.923-929.

140. Livak, K. J. Quantitation of DNA/RNA using real-time PCR detection. Perkin-Elmer's website (http://www2.perkin-elmer.com), 1996.

141. Long, J.S. Confirmatoiy Factor Analysis. Beverly Hills, USA: Sage Pubs. -1983

142. Mantel, N. The detection of disease clustering and a generalized regression approach. // Cancer Res. 1967. 27,209-220.

143. Marroquin L.D. et al. Bacillus thuringiensis (Bt) toxin susceptibility and isolation of resistence mutants in the nematode Caenorhaaditis elegans. //Genetics. 2000.V. 155, N 4, p. 1693-1669.

144. Mason P, Braun L, Warwick SI, Zhu B, and Stewart CN. Transgenic Bt-producing Brassica napus: Plutella xylostella selection pressure and fitness of weedy relatives. // Environmental Biosafety Research, 2003. 2: 263-276.

145. Maughan PJ, Saghai MaroofMA, Buss G.R. Microsatellite and amplified sequence length polymorphisms in cultivated and wild soybean // Genome. -1995. V. 38. P. 715-723.

146. McLaughlin A, and Mineau P The impact of agricultural practices on biodiversity. //Agriculture Ecosystems & Environment, 1995. 55: 201-212.

147. Miller H.I. Report on the World Health Organization Working Group on Health Implications of Biotechnology. // Recomb. DNA Tech. Bull., 1983, vol.6, N 2 pp.65-66.

148. Morley Mr. The United Kingdom Parliament. The Commons Hansard Written Answers text for Wednesday 25 June 2003, Volume No.407,Part No.416, http://www.parliament. thestationeryoffice. со. uk/pa/cm200203 /cmhamrd//vo030625/index/30625-x.htm

149. Moyes CL, Lilley JM, Casais CA, Cole SG, Haeger PD, and Dale PJ. Barriers to gene flow from oilseed rape (Brassica napus) into populations of Sinapis arvensis. II Molecular Ecology, 2002. 11: 103-112.

150. Nakayama, Y. and Yamaguchi, H. Natural hybridisation in wild soybean (Glycine max ssp. soja) by pollen flow from cultivated soybean (G. max ssp. max) in a designed population. // Weed Biology and Management 2, 2002, P.25-30.

151. Nasarabadi S., Milanovich F., Richards J. and Belgrader P. Simultaneous detection of TaqMan probes containing FAM and TAMRA reporter fluorophores. BioTechniques 1999. Vol.27(6), p 1116-1117

152. Nielsen Kaare M, Bones Atle M., Smalla Kornelia, Elsas Jan D. van Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria a rare event? // FEMS Microbiology Reviews 22 -1998. 79-103

153. NRC. Risk assessment in the Federal Government: Managing the process, National Research Council, National Academy Press, Washington DC, 1983

154. NRC. Genetically modified pest-protected plants science and regulation, Sciences NRCNAo, National Academy Press, Washington DC, 2000

155. NRC. Environmental effects of transgenic plants the scope and adequacy of regulation, National Research Council, National Academy Press, Washington DC, 2002

156. Owen M.D.K. Current use of transgenic herbicide-resistant soybean and corn in the USA // Crop Protect., 2000; Vol. 19,N 8/10, - P. 765-771

157. Palmer R.G. and Heer H. A root tip squash technique for soybean chromosomes // Crop science. 1973. V.13. P.389-391.

158. Palmer R.G., Sun H., Zhao L.M. Genetics and Cytology of Chromosome Inversions in Soybean Germplasm. // Crop Sci. -2000. V.40. P.683-687.

159. Permingeat H.R.; Reggiardo M.I.; Vallejos R.H. Detection and quantification of transgenes in grains by multiplex and real-time PCR // J.agr.Food Chem., 2002; Vol. 50, N 16, - P. 4431-4436

160. Petricciani J.C. An overview of safety and regulatory aspects of the new biotechnology. // Regul. Toxicol. Pharmacol. 1983, vol. 3 , N 4, pp.428-433.

161. Phipps RH, Deaville ER, Maddison ВС. Detection of transgenic and endogenous plant DNA in rumen fluid, duodenal digesta, milk, blood, and feces of lactating dairy cows. // J Dairy Sci. 2003. vol.86, N12: pp.40704078.

162. Powell, W. et al. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. // Mol. Breed. 1996. 2, 225-238.

163. Pretty J. The rapid emergence of genetic modification in world agriculture: contested risks and benefits. // Environmental Conservation, 2001. 28: 248262.

164. Quist, D.; Chapela, I. Transgenic DNA Introgressed into Traditional Maize Landraces in Oaxaca, Mexico // Nature 414, 6863, 2001. P. 541-543

165. Raffensberger C, and Tickner J, eds. Protecting public health and the environment: Implementing the precautionary principle, pp. 1-385. Island Press, Washington DC, 1999

166. Renn O. Three Decades of risk research: accomplishments and new challengers. Risk Research 1998 V.l.

167. Robinson RA, and Sutherland WJ. Post-war changes in arable farming and biodiversity in Great Britain. // Journal of Applied Ecology, 2002. 39: 157176.

168. Rogers S.O. & Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. -1985, 5, pp. 69-76.

169. Root-Bernstein R.S. The problem of problems. // J. Teor. Biol., 1982, 99: pp.193-201.

170. Roseland CR. LMOs and the Environment. Proceedings of an International Conference. OECD, 2001, P.55-103,197-235

171. Scrieber J.M. Commentary Bt or not Bt: Is that the question? // Proc. Natl. Acad. Sci USA, - 2001. V. 98, N 22. P. 12328-12330.

172. Singh R.J. and Hymowitz T. The genomic relationship between Glycine max (L.) Merr. And G.soja Sieb.and Zucc. as revealed by pachytene chromosome analysis // Theor. Appl. Genet. 1988. V.76. P.705-711.

173. Singh R.J., Kollipara K.P., Hymowitz T. Intersubgeneric hybridization of soybeans with a wild perennial species, Glycine clandestina Wendl. // Theor. Appl. Genet. 1987. V.74. P.391-396.

174. Singh, R.J. and Hymowitz, T. An intersubgeneric hybrid between Glycine tomentella Hayata and the soybean, G. max. (L.) // Merr. Euphytica 1985. 34,187-192.

175. Skea DL, Christopoulous P, Plaut AG, Underdown BJ. Studies on the specificity of the IgA-binding lectin, jacalin. // Mol Immunol. 1988. vol.25, N(l) pp. 1-6.

176. Skorupska N.T., Shoemaker R.C., Warner A. et al. Restriction fragment length polymorphism in soybean germplasm of the Southern USA // Crop Sci. 1993. V. 33. P. 169-176.

177. Snow AA, Andersen B, and Jiurgensen RB. Costs of transgenic herbicide resistance introgressed from Brassica napus into weedy B. rapa. Molecular Ecology, 1999.8:605-615.

178. Snow AA, Andow DA, Gepts P, Hallerman EM, Power A, Tiedje JM, and Wolfenbarger LL. Genetically engineered organisms and the environment: Current status and recommendations. // Ecological Applications, 2005. 15: 377-404.

179. Snow AA, Pilson D, Rieseberg LH, Paulsen MJ, Pleskac N, Reagon MR, Wolf DE, and Selbo SM. A Bt transgene reduces herbivory and enhances fecundity in wild sunflowers. // Ecological Applications, 2003. 13: 279-286.

180. Stewart CN, Halfhill MD, and Warwick SI. Transgene introgression from genetically modified crops to their wild relatives. // Nature Reviews Genetics, -2003.4: 806-817.

181. Stoate C, Boatman ND, Borralho RJ, Carvalho CR, de Snoo GR, and Eden P. Ecological impacts of arable intensification in Europe. // Journal of Environmental Management, 2001, 63: 337-365. •

182. Suter GWI. Ecological risk assessment, Lewis Publishers, Boca Raton FL, USA, 1993

183. Taylor N.B.; Fuchs R.L.; MacDonald J.; Shariff A.R.; Padgette S.R. Compositional analysis of glyphosate-tolerant soybeans treated with glyphosate // J.agr.Food Chem., 1999; Vol.47,N 10, - P. 4469-4473

184. Terry C.F.; Harris N. Event-specific detection of roundup ready soya using two different real time PCR detection chemistries // Europ.Food Res.Technol., 2001; Vol.213,N 6, - P. 425-431

185. Thomson J.A., Nelson R.L., Vodkin L.O. Identification of diverse soybean germplasm using RAPD markers. // Crop Sci. 1998. V. 38. P. 1348-1355.

186. Thormann, C.E., Ferreira, M.E., Camargo, L.E.A., Tivang, J.G. and Osborn, T.C. Comparison of RFLP and RAPD markers to estimating geneticrelationships within and among cruciferous species. // Theor. Appl. Genet. 1994. 88,973-980.

187. Tilman D, Cassman KG, Matson PA, Naylor R, and Polasky S. Agricultural sustainability and intensive production practices. // Nature, 2002. 418: 671— 677.

188. TransGen. Weltweiter Anbau von GV-Pflanzen. 2006www.transgen.de/gentechnik/pflanzenanbau/531 .doku.html

189. Tyagi S and Kramer F.R. Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. II Nature Biotechnology 1996. Vol.14, p303-308

190. Tyagi S, Marras A.E. and Kramer F.R. Wavelength-shifted molecular beacons.// Nature Biotechnology 2000. Vol.l8, pi 191-1196

191. Vacher C, Weis AE, Hermann D, Kossler T, Young C, and Hochberg ME. Impact of ecological factors on the initial invasion of Bt transgenes into wild populations of birdseed rape {Brassica гара). // Theoretical and Applied Genetics,-2004.109: 806-814.

192. Van Gressel M.F. Glyphosate-resistent horseweed. // Weed Science. -2001.V.49. P. 703-705.

193. Vollenhofer S.; Burg K.; Schmidt J.; Kroath H. Genetically modified organisms in food-screening and specific detection by polymerase chain reaction // J.agr.Food Chem., 1999; Vol.47,N 12, - P. 5038-5043

194. Vos, P. et al. AFL.P: a new technique for DNA fingerprinting. // Nucl. Acids Res.-1995. 23,4407-4414.

195. Warwick S, and Stewart CN. Crops come to wild plants how domestication, transgenes, and linkage together shape ferality. in "Crop ferality and volunteerism" (Gressel J, ed.), 2005. pp. 9-30. CRC Press -Taylor & Francis Group, Boca Raton FL.

196. Williams J. G.K., Kubelik A.R., Livak К J. DNA polimorphisms amplified by arbitraiy primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

197. Wilson A, Latham J, and Steinbrecher R. Genome scrambling myth or reality? Transformation-induced mutations in transgenic crop plants, Technical Report. EcoNexus, Brighton UK, 2004

198. Wolfenbarger LL, Phifer PR. "The ecological risks and benefits of genetically engineered plants". // Science. 2000, Dec 15; 290(5499), pp.2088-2093.

199. Yap E.P.H., Lo Y.-M.O., K.A.Fleming K.A., McGee J.O'D. False-positives and Contamination in PCR. In: PCR Technology, Current Innovations. Ed. G.Griffin, A.M.Griffin, CRC Press, 1994