Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе

Фесенко, Евгений Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе"

На правах рукописи

□03470044

Фесенко Евгений Евгеньевич

ИЗУЧЕНИЕ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА И НЕЙРАМИНИДАЗЫ ВИРУСА ГРИППА А НА СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

Специальность: 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино

2009

003470044

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики и клеточного стресса Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН и лаборатории биологических микрочипов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Озолинь Ольга Николаевна кандидат биологических наук Михайлович Владимир Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бурьянов Ярослав Иванович доктор биологических наук Филатов Феликс Петрович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН

Защита диссертации состоится " " июня 2009 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 002.038.01 в ИБК РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино

Автореферат разослан " " мая 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вирусы гриппа типа А (ВГА) активно циркулируют в природных резервуарах, вызывая инфекцию у человека, диких и домашних птиц, многих видов млекопитающих. Для человека опасность этой инфекции обусловлена существованием множества подтипов ВГА и его чрезвычайной изменчивостью. Основными факторами, определяющими патогенность и вирулентность вирусов гриппа, являются поверхностные антигены - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA).

К настоящему моменту серологически выделяют 16 вариантов НА (HI-HI 6) и 9 вариантов NA (N1-N9) [Fouchier R.A., 2005]. Вирусы с различными сочетаниями НА и NA могут быть обнаружены в популяциях диких водоплавающих птиц, являющихся естественным резервуаром инфекции. В отличие от птиц, в человеческой популяции до недавнего времени циркулировали штаммы, ассоциированные лишь с тремя вариантами гемагглютинина (HI, Н2, НЗ) и двумя вариантами нейраминидазы (N1, N2). Однако в последнее десятилетие отмечены случаи заражения человека не свойственными для человеческой популяции подтипами ВГА: H7N7, H7N3, H9N2 и H5N1. Ранее считалось, что эти подтипы не представляют серьезной опасности для людей и в случае заражения могут вызвать у них лишь конъюнктивит и легкое недомогание, в редких случаях - слабовыраженный респираторный синдром. Однако в 1997 г. вирусы подтипа H5N1 явились причиной чрезвычайно тяжелых форм заболевания среди людей - в Гонконге из 18 заболевших человек шестеро погибли, причем, все они заразились от цыплят [WHO report, 2009]. В 2003 году вспыхнула новая эпизоотия, вызванная вирусом H5N1 (или т.н. «птичьим гриппом»), которая продолжается и сегодня. Согласно данным ВОЗ, с момента начала эпизоотии заразились уже 411 человек, 256 из которых погибли. При этом в последние годы происходило непрерывное расширение ареала циркуляции штаммов «птичьего» гриппа, увеличился видовой спектр хозяев, возникла устойчивая тенденция повышения патогенности циркулирующих штаммов. Изучение генетических

-1 -

детерминант вирусов H5N1, вьщеленных у людей, погибших от птичьего гриппа, свидетельствует об их высокой вирулентности [Львов Д.К.,2006.]. Эти вирусы способны вызывать системное поражение органов, приводящее к быстрой гибели человека. Случаи передачи ВГА подтипа H5N1 от человека к человеку пока не зарегистрированы, однако, совместная циркуляция штаммов человеческого гриппа и птичьего гриппа повышает вероятность обмена вирусными сегментами между этими штаммами и возникновения нового варианта вируса, способного передаваться от человека к человеку, как это происходило в 1918, 1957 и 1968 годах при пандемиях "испанки", "гонконгского" и "азиатского" гриппа. Возможно, именно этим обусловлено возникновение вирулентного для человека штамма вируса «свиного» гриппа подтипа H1N1, уже унесшего жизни более 100 человек (к апрелю 2009 г.).

Появление штаммов, обладающих выраженным пандемическим потенциалом, а также не снижающийся уровень заболеваемости обуславливают необходимость поиска новых высокочувствительных и надежных экспресс-методов определения вирусного подтипа для прогнозирования эпидемий, осуществления эпидемиологического контроля, своевременного создания соответствующих вакцин.

К общепринятым методам определения вирусного подтипа относится иммунологический анализ, которому предшествуют стадии выделения вируса на куриных эмбрионах или на культуре ткани. Данный подход рассматривают в качестве «золотого стандарта», продолжительность которого составляет от 3 до 7 дней, требуемых для культивирования вируса. Молекулярно-генетические методы, основанные на обратной транскрипции и амплификации последовательностей генов гемагглютинина и нейраминидазы, характеризуются более высокой чувствительностью, а результаты идентификации вирусного подтипа могут быть получены в течение 3-6 часов. К настоящему времени предложен ряд методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, но из-за трудностей, связанных с количеством одновременно идентифицируемых в реакции мишеней, число подтипов, определяемых в одном анализе, остается весьма ограниченным.

В настоящей работе предложен оригинальный подход, основанный на методе гибридизации на олигонуклеотидном биочипе, который позволяет в течение 10 часов одновременно определять 15 вариантов гемагглютинина и 2 варианта нейраминидазы ВГА. Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А и разработка на основе полученных данных специализированного биологического микрочипа для молекулярного субтипирования ВГА.

Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей генов гемагглютинина и нейраминидазы и выявить внутри них вариабельные и консервативные участки для выбора специфичных олигонуклеотидных зондов. Определить мишени для амплификации и сконструировать специфичные праймеры.

2. Разработать биологический микрочип для определения подтипа ВГА.

3. Определить условия проведения реакции и способ введения флуоресцентной метки в анализируемую последовательность молекулы-мишени.

4. С помощью разработанного микрочипа выполнить молекулярное субтипирование штаммов ВГА, выделенных из клинического материала, полученного от диких и домашних птиц во время эпизоотий. Определить основные диагностические характеристики разработанного метода идентификации вирусного подтипа.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые создан специализированный биологический микрочип, позволяющий проводить молекулярное субтипирование 15 вариантов гемагглютинина и 2 вариантов нейраминидазы ВГА. Процедура определения вирусного подтипа не требует выполнения предварительных стадий культивирования вируса, а результаты анализа могут быть получены в течение 10 часов. Определены диагностические характеристики разработанного метода.

На выборке, включающей 41 полевой образец, собранный в районе эпизоотии, специфичность и чувствительность метода составили соответственно 100% и 76%. Аналитическая чувствительность составила 103 ЭЩЬо/мл. Полученные характеристики позволили успешно применить разработанный метод для определения подтипа вируса, вызвавшего эпизоотию. Необходимое оборудование установлено в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского и используется для определения этиологического агента эпизоотий и эпидемиологического мониторинга вирусов гриппа, циркулирующих в природных резервуарах.

Показано, что предложенный подход обладает высокой специфичностью, и может рассматриваться как универсальный инструмент для будущих разработок, нацеленных на генотипирование вирусов, характеризующихся высокой изменчивостью.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» (Новосибирск, 2006), на международной конференции «Commercial and Pre-commercial Cell Detection Technologies for Defence against Bioterror -Technology, Market and Society» (Брно, Чехия, 2006), на IV международной конференции «Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи в реферируемых журналах, 5 тезисов докладов на международных и отечественных конференциях.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 'Л£ источников. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит /рисунков и <j таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эталонные штаммы вируса гриппа А (п=19), имеющие установленную нуклеотидную последовательность генома и охарактеризованные серологически, были любезно предоставлены руководителем лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, академиком РАМН, проф. Н.В. Кавериным. Штаммы, использованные в данной работе, перечислены в таблице 1.

Таблица 1. Эталонные штаммы ВГА, использованные для оценки

специфичности разработанного метода.

Вирусы гриппа А

№ Штамм Подтип

1 A/WSN/33 H1N1

2 A/USSR/90/77 H1N1

3 A/Puerto Rico/8/34 H1N1

4 А/В razil/11/78 H1N1

5 A/Pintail Duck/Primorie/695/76 H2N3

6 A/Texas/1/77 H3N2

7 A/Victori a/3/75 H3N2

8 A/England/42/72 H3N2

9 A/Udom/307/72 H3N2

10 A/duck/Ukraine/1/63 H3N8

11 A/Duck/Czechoslovakia/56 H4N6

12 A/Mallard/Pensylvania/10218/84 H5N2

13 A/Ruddy Tumstone/DE/244/91 H5N2

14 А/Duck/ Ho Chi Minh/14/78 H5N3

15 A/FP V/Rostock/3 4 H7N1

16 A/FPV/Weybridge/34 H7N7

17 A/Swine/Hong Kong/9/98 H9N2

18 A/Chicken/Germany/49 H10N7

19 A/Pilot whale/Maine/328/84 H13N2

Клинические (полевые) образцы (п=123), изученные в данной работе были собраны в Новосибирской и Астраханской областях, республике Тыва и Приморском крае с 2005 по 2008 гг. Выделенный у птиц полевой материал представлял собой клоакальные смывы (87 образцов) и суспензии внутренних

органов (мозг, печень, селезенка; всего 36 образцов). Клоакальные смывы экстрагировались в растворе 5М гуанидинтиоцианата и замораживались в жидком азоте.

Нуклсогндные последовательности генов гемагглютинина и нейраминидазы были взяты из банков данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и ISD (Influenza Sequence Database, www.flu.lanl.gov). Всего было проанализировано 3500 последовательностей. Анализ последовательностей производился с помощью программ Oligo 4.0-s [«Molecular Biology Insights», США] и BioEdit 7.0.1 [Hall Т.A., 1999]. Филогенетический анализ проводили с помощью программы MEGA 3 [Kumar S., 2003] методом ближайшего соседа [SaitouN., 1987].

Олигонуклеотиды и праймеры были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer («Applied Biosystems», США) стандартным фосфороамидитным методом и очищены при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ. Олигонуклеотиды содержали спейсер со свободной аминогруппой "3'-Amino-Modifier С7 CPG 500" («Glen Research», США) для последующей иммобилизации в гель.

Биологические микрочипы были изготовлены согласно протоколу, опубликованному ранее [Pankov et al., 2003].

Выделение вирусной РНК проводилось на базе Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН с помощью набора реагентов для выделения РНК («Нарвак», Россия) согласно протоколам производителя.

Подготовку образцов для гибридизации осуществляли в два этапа. На первом этапе проводили синтез кДНК и совместную амплификацию участков НА и NA сегментов с получением продуктов длиной 640 и 600 пар оснований, соответственно. В состав реакционной смеси (общим объемом 25мкл) входили ПЦР-буфер («Силекс», Россия), 0,2 мМ каждого dNTP, 5 Ед. Taq ДНК-полимеразы («Силекс», Россия), 25 Ед. M-MLV обратной транскриптазы («Силекс», Россия), 2 Ед. RNaseIN («Promega», США), 20 пмоль каждого из праймеров и 5 мкл препарата вирусной РНК. Амплификацию проводили на термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Реакционную смесь

-6-

инкубировали при 50°С в течение 30 минут, затем после 3-х минутной денатурации при 94°С следовал 31 цикл со следующим температурно-временным профилем: 94°С - 20 е., 58°С - 30 е., 72°С - 45 с. Завершающая стадия: 5 минут при 72°С. Продукты амплификации выявляли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Пробы, в которых обнаруживали специфические продукты, соответствующие подвижности 600 и 640 пар нуклеотидов, использовали в качестве матрицы для второй стадии.

На втором этапе проводили амплификацию участков НА- и КА- сегментов с получением продуктов длиной 300 и 390 пар оснований, соответственно. С целью получения одноцепочечных фрагментов использовали неравные концентрации праймеров. Реакционная смесь (25мкл) содержала ПЦР-буфер, 0,2 мМ каждого <ЮТР, 0,5 Ед. Тая ДНК полимеразы, праймеры в количестве 1 пмоль / 10 пмоль. Для проведения реакции использовали следующие температурно-временные условия: 94 °С -3 мин., 35 циклов (94 °С - 20 е., 58 °С - 30 е., 72 °С - 30 е.), 72°С - 3 мин. В качестве матрицы использовали 1 мкл реакционной смеси, полученной на 1 стадии ПЦР. Флуоресцентную метку вводили с помощью меченого нуклеозидтрифосфата (см. Результаты и обсуждение).

Гибридизацию проводили путем добавления 12 мкл смеси, получившейся после второй стадии амплификации к 24 мкл буфера, содержащего 1,5 М гуанидинтиоцианата, 0,075 М НЕРЕБ рН 7,5, и 7,5 мМ ЭДТА. Смесь вносили в гибридизационную камеру биочипа и инкубировали при 37°С. После гибридизации биочип промывали дистиллированной водой трижды в течение 60 с. при 37°С и высушивали.

Регистрацию результатов гибридизации осуществляли с помощью портативного анализатора биочипов (ИМБ РАН, Россия) и программного обеспечения «1п^е\уаге» («Биочип-ИМБ», Россия).

Приготовление референс-образцов с известной концентрацией вируса проводили с использованием эталонных штаммов вируса гриппа АЛУ8М/33(НШ1) и А/Ую1опаУЗ/75(НЗКт2). После культивирования вирусов в 10-дневных куриных эмбрионах, определяли их активность в реакции

-7-

гемагглютинации. Вирусный титр вычисляли при помощи модифицированного метода Рида-Менча [Fouchier R.A. et al, 2000]. Титр вируса гриппа AAVSN/33(H1N1) составлял 107 ЭИД50/Мл, вируса гриппа A/Victoria/3/75(H3N2) - 108 ЭИД50/МЛ- Затем были приготовлены десятикратные разведения препаратов вирусов в физиологическом растворе. Для выделения РНК было взято 200 мкл каждого разведения.

Флуоресцентные красители и их производные. На основе 5-аминоаллил-Т -д езохсиуридин-5' -трифосфата и ряда карбоксильных производных индодикарбоцианиновых красителей [Alexandrova L.A., 2008] в лаборатории были синтезированы 23 флуоресцентно меченных производных 2"-дезоксиуридин-5~-трифосфата (dUl-dU23) из них 20 новых, ранее не описанных. Синтез препаратов был проведен на базе ИМБ им. В.А. Энгельгардта д-ром А.В. Чудиновым. В качестве референс-красителя для выполнения сравнительного анализа использовали коммерческий препарат dUl[YuH„ J, 1994] (Рис.1).

Рис.1. Структура флуоресцентно меченного производного 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, dUl.

Полученные производные отличались по длине и заряду линкера, соединяющего индодикарбоцианиновый краситель с 5-аминоаллил-2'-дезоксиуридин-5ч-трифосфатом, природой и расположением заместителей, связанных с гетероциклическими фрагментами красителя, ориентацией карбоксиалкилыюй группы относительно главной оси флуорофора.

C2HS

ImD511~AADUTP

он

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ вариабельности генов поверхностных гликопротеинов вируса гриппа А. Выбор праймеров и олигонуклеотидных зондов

Известно, что во всех сегментах генома ВГА существуют общие для всех подтипов последовательности, включающие 13 нуклеотидов на 5'-конце и 12 нуклеотидов на З'-конце. Данные последовательности необходимы для репликации вирусного генома. Общий участок на З'-конце сегментов был использован для подбора последовательностей обратных праймеров для амплификации участков НА- и КА- генов. Для выбора прямых праймеров было проведено множественное выравнивание всех последовательностей генов НА и ЫА, депонированных в базе данных 1БО (www.flu.lanl.gov). Затем были сформированы консенсусные последовательности (КП) для НА- и ЫА- генов; найдены общие консервативные участки (мотивы) и выбраны последовательности- прямых праймеров для первой и второй стадий амплификации с соблюдением общ их принципов выбора праймеров. Длина амплифицируемой области для НАУИА генов составила 640/600 оснований для первого этапа ПЦР и 300/390 оснований для второго этапа ПЦР, соответственно.

Для выбора олигонуклеотидных зондов, способных специфично выявлять определенный подтип ВГА, использовали следующий алгоритм: все имеющиеся в базе данных последовательности НА- и ЫА- генов были разбиты на группы по определенным вариантам гемагглютинина (Н1, Н2, НЗ и т.д.) и нейраминидазы (N1, N2, N3 и т.д.). Получившиеся группы, в свою очередь, были разбиты на подгруппы по происхождению вируса (выделен у человека, птиц и т.д.). Для каждой из 40 получившихся подгрупп формировали КП. Затем определяли наиболее консервативные мотивы внутри ограниченного праймерами второго этапа амплификации участка геномного сегмента. В том случае, когда не удавалось выявить достаточно консервативный мотив, внутри подгруппы проводили филогенетический анализ последовательностей с последующим разделением ее на более мелкие подгруппы (Рис. 2).

-9-

Рис.2. Филогенетический анализ 523 последовательностей сегмента N1 штаммов, выделенных у человека. Последовательности разбиты на 4 1 подгруппы, внутри которых проводили поиск консервативных участков.

После этого, вновь формировали КП и проводили поиск консервативных участков. Всего было проанализировано 3500 последовательностей сегментов гемагглютинина и нейраминидазы ВГА. При подборе олигонуклеотидов мы руководствовались двумя основными требованиями:

^последовательности должны были быть специфичны к определенному подтипу ВГА; исключено перекрестное взаимодействие с другими подтипами вируса;

2) последовательности должны были быть специфичными для подавляющего большинства штаммов внутри подтипа.

По этой причине количество олигонуклеотидов, выбранных для определения конкретного варианта гемагглютинина или нейраминидазы, не являлось постоянной величиной, а зависело от числа выявленных консервативных участков в амплифицируемой области и от степени вариабельности внутри участка (Рис.3).

На основе проведенного анализа были выбраны праймеры для мультиплексной двухэтапной амплификации вирусных генов, сконструирован набор, состоящий из 41 дискриминирующего олигонуклеотида для специфичного анализа подтипов ВГА (Табл.2).

К1 [1551 {1561 {1571 {15В1 {1591 11601 ¡1611 ¡1651 (1631 (1641

|СТ015580| (НШ1) ААС^СООАСАаААТТСАТСЙАаТГЗАААТТазААТСАЛТасаАСТСТАТ^^^

(лтдеамо) (яти ..........л............................................■■ -

КЗБ312) АРЗ86776 СУ039660 СТ017371 А"Х060046 СУЭ0449& £185936 ] |АВ2743а4| (НШЗ) С1 ¿до/шс2е<?£ СЗ1допис1е(Л1йев

Н5

<аШ1) ........ А. А.

(1ШШ ..........А.

(Н1Н11 ..........к.

<Н1Н1) ..............................................

(Н1И2) .....а.. .суй..а.....о. .а. .ее.........саа.за.т.

(Н1Ы5) . .ТС.Д. .ь<а.. .А. .С.........С.А..............т,

(НПО) ........А.А............А..а...................

.... .А. .АЗА; . . А. .С. .0...... . .А. . .........а. .Т.

•4■■

■ I*

с |

51«.

•с

А. В. .А

СТ а. .А

сг а. .а

Н1

|1551 {1561

¡1611

}АР046080} * Ш5Я1) ААСАаАЙА0<1ААД?АА<ГГС0А(;ТААААТ?03АА1|^?3^^

1 1 [ЦСЧ1 \ ^ . ■ .. • - - г . ~ .

) АР046097| (Н5Ы1)

|МГС51Э2В.1| (К5Н1)' ..А..........................

|25ЭЫ181363| (Н5Ы1> ..А.................О.....в.'.

lAF0B2O4O.ll (И5Ш-> .....в.........НА......С.....

|АГ512925( 1Ш5Н2) .....<3.........ЙА......С.....

¡30526532.3| №N2) .....а......Я..НАС.....С.....

|АП01057| (Н5КЗ) ....................в. .в.....

¡АУ296С&6 1 (Н5Н8) .....О.........СЗАС.....С. . .С.

¡А¥9Э5886| ¡Н5НЭ) .............................

ОИдопис1еоъ1с1ев С11допис1ео11с1еа

[3621 |1631 {1641

};С1аГЧ8саЖ7г'?ЙСТАОСАОТ<53СААТ?

Н5 За-Н5.4 V -

с с; с с с С,

К"-

с Ч:

Н5 1 Н5. 2г- .'

Рис.3. Выравнивание нуклеотидных последовательностей участков сегмента гемагглютинина р; гриппа А (НШх, ШИх). Участки генома, к которым были подобраны олигонуклеотидные зонды, Позиции нуклеотидов пронумерованы относительно последовательности АР046080, выделенной олигонуклеотидных зондов указаны слева от их нуклеотидной последовательности и представленным в Табл.2 и на Рис.4.

Таблица 2. Дискриминирующие олигонуклеотиды для молекулярного

субтипирования ВГА.

Олиго-нуклеотид* Последовательность 5*—>3' ПОЗИЦИЯ Номер штамма

Ш., CTC ССТ GGG GGC AAT CAG 1632-1649 CY015580

HI.2 GAT TTT GGC GAT СТА TTC ААС 1584-1604 CY015580

Hl., GAT ТСТ GGC GAT СТА СТС ААС 1584-1604 CY015580

Н2.1 AAA TTG AGC AGC ATG GGG GTT 1592-1612 CY015135

Н2.2 AAA TTG AGC AAY ATG GGG GTT 1592-1612 CY015135

Н3.1 TOY TTT TTG CTT TGT GTT GTT 1626-1645 CY016108

НЗ-2 CTT ATG ACC ATG ATG TAT АСА 1510-1530 CY016108

НЗ.з GAA GCA TTA ААС AAC CGG TT 1536-1555 CY016108

Н3.4 ATT TCC TTT GCC ATA TCA TG 1608-1627 CY016108

НЗ/Н4 ATT TCA TTC GCC ATA TCA TG 1608-1627 CY016108

Н4 CGT WGC ACT RCT TTT AGC CTT 1623-1643 D90302

H5., TCA АСА GTG GCG AGT TCC 1597-1614 AF512925

Н5.г TCT ACG GTG GCG AGT TCC 1597-1614 AF512925

115., CAA TGG GAA CTT ACC AAA TAC 1565-1585 AF512925

Н5.4 CAA TGG GCA CTT АТС AGA TAC 1565-1585 AF512925

Н5.5 CAT GGT AGC TGG TCT RTC TTT 1629-1649 AF512925

Нб ATA GTA CGG TAT CGA GCA GT 1604-1623 CYO15451

Н7., GAG GCA ATA CAA AAC AGA ATT CA 1543-1565 CY015014

Н7.2 CAA TGC ARA ATA GAA TAC AGA TTG A 1547-1571 CY015014

H7/H10/HI5 TTT AGC TTC GGG GCA TCA TGT 1615-1635 CYO 15014

H8 GGC GGC CAG TCT TTG CTT 1608-1625 D90304

Н9. i TGT CGC CTC АТС TCT TGT G 1590-1608 AB256706

H9.J TTC TGG GCC ATG TCC AAT G 1636-1654 AB256706

1110 GGC TCT TCT GAA TAG ACT GAA С 1534-1555 M21647

Ш1 AGA TTC TAG TGG GAA TGT G 1592-1610 CY014719

Н12 GCA TCT АСА GCA GTG TTG CC 1608-1627 CY014598

Н13 ААС вТТ ТАС ААА ОСА ТТЛ ТС 1617-1636 М26091

Н14 СТТ ТОТ СТТ сет ССС АСТ СтАТ Т 1643-1664 СУ014604

Н15 ААТ АС С АТА АТО АТС ААТ С 1573-1591 СУ006032

N1., ттт САК АТС АТТ "ЮС ОАТ СС 1131-1150 О0376693

Н1.2 ТТТ САК АТС СТТ ТвО САГ СС 1131-1150 00376693

N1., С (ЗА ТАС АСС сов ЛОТ ТТГ АТ 1221-1240 1X3376693

N1.4 ООО ТАС АО С ССЛ АСТ ТТС ОТ 1221-1240 1X3376693

N1.5 ОСА ТАТ АСС ОвО АОТ ТТТ ОТ 1221-1240 Б<2376693

N2., ТбУ АТС ААУ АвС ТОТ ТТТ ТАТ О 1253-1274 СУ016118

N2.2 ТС У АТС ААТ МйС ТСС ТТТ ТАТ в 1253-1274 СУ016118

N2.3 ТСТ ввТ АТТ ТТС ТСТ ОГТ ОА 1223-1242 СУ016118

N2.4 ОСА ОАТ ААА ТАС ОСА АОТ САТ II74-1194 СУ016П8

N2.5 ОСА ОАТ САА ГАС АСА АСТ САТ 1174-1194 СУ016118

N2.6 вСА ОАС САО САС АСА АОТ САТ 1174-1194 СУ016118

N2., ОСА ОвТ САА ТАй АСА СОТ САТ 1174-1194 СУ016118

Разработка биологического микрочипа для определения подтипа вируса гриппа А

Структура и принципы работы биочипа

Был разработан биочип для молекулярного субтипирования ВГА, который позволяет определять 15 вариантов гемагглютинина и 2 варианта нейраминидазы, представляющих наибольший эпидемиологический интерес.

Биочип состоит из 47 гелевых элементов (ячеек). В 41 ячейке иммобилизованы индивидуальные олигонуклеотидные зонды; 3 ячейки служат для вычисления фонового сигнала и 3 - для обработки флуоресцентной картины (Рис. 4). Гелевые элементы с иммобилизованными олигонуклеотидами объединены в группы, служащие для определения одного подтипа (выделены прямоугольными рамками). В рядах Ь^ сосредоточены группы дискриминирующих олигонуклеотидов для типирования 15 вариантов гемагглютинина (Н1-Н15), а в рядах Ь и \ - первого и второго варианта нейраминидазы (N1, N2). Гелевые элементы а1, Я, ¡7 содержат

-13-

флуоресцентный маркер (М) для позиционирования сетки, формируемой программным обеспечением для определения интенсивности флуоресцентных сигналов в элементах микрочипа. Ячейки £4^6 (Т^) не содержат олигонуклеотидов и служат для вычисления фонового сигнала.

1 2 3 4 5 6 7

с1

9 Ь

®.......................................

©® © ©©@

(Н11) (Н12) @

©@)@@@

@ (N2^) @ @ @ (N2?)

Рис.4. Структура биочипа для типирования ВГА. М - флуоресцентный маркер для обработки гибридизационной картины. Н1х-Н15х, ШХ-Ы2Х - гелевые ячейки, содержащие олигонуклеотиды для определения соответствующих подтипов гемагглютинина и

нейраминидазы. Neg - контрольные гелевые ячейки, не содержащие олигонуклеотидов.

При гибридизации с микрочипом флуоресцентно меченный фрагмент ДНК, полученный с помощью обратной транскрипции и амплификации РНК вируса, образует совершенный гибридизационный комплекс с комплементарным ему иммобилизованным олигонуклеотидом, что приводит к накоплению флуоресцентного сигнала в соответствующей ячейке. В пределах одной группы ячеек таких совершенных комплексов может образоваться несколько. В остальных группах ячеек образуются несовершенные гибридизационные комплексы, которые вследствие своей термодинамической нестабильности разрушаются при отмывке. Положительными (свидетельствующими о формировании совершенного гибридизационного комплекса) считали сигналы, более чем в 3 раза превышающие среднее значение флуоресценции трех контрольных ячеек, не содержащих олигонуклеотидов (54-£6). Таким образом, регистрация положительных сигналов в тех или иных группах позволяет сделать заключение о принадлежности исследуемого штамма к

соответствующему подтипу. Условия проведения гибридизации были оптимизированы таким образом, чтобы обеспечить возможность надежной интерпретации гибридизационной картины, как при помощи специализированных программных средств, так и визуально.

Оптимизация условий анализа

Разработанная процедура анализа состояла из 4 этапов: 1) выделение вирусной РНК; 2) проведение двухэтапной ОТ-ПЦР с образованием одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта; 3) гибридизация продуктов амплификации на олигонуклеотидном микрочипе; 4) регистрация и интерпретация результатов с использованием специализированного аппаратно-программного обеспечения. Основные усилия по оптимизации были направлены на выбор условий ОТ-ПЦР и способа введения флуоресцентной метки в пробу.

Условия ОТ-ПЦР подбирали, варьируя температуру отжига, концентрацию ионов магния, праймеров и фермента в реакционной смеси, количество РНК-матрицы, времена денатурации, отжига и элонгации. Оптимальные условия проведения амплификации, подобранные в результате выполненных экспериментов, приведены в разделе «Материалы и методы».

Для флуоресцентного маркирования нами было предложено использовать флуоресцентно меченные нуклеозидтрифосфаты. Преимуществом данного подхода, в сравнении с маркированием пробы посредством меченого по 5' концу праймера, является абсолютное увеличение количества молекул флуорофора в продукте амплификации, поскольку полимераза встраивает в случайном порядке меченые и немеченые нуклеозидтрифосфаты в синтезируемую цепь ДНК в процессе элонгации.

Сравнение различных производных проводили с помощью набора для выявления лекарственно-устойчивых форм туберкулеза «ТБ-Биочип» («Биочип-ИМБ», Россия) [Gryadunov D. et al 2005], позволяющего идентифицировать 29 мутаций в гене гроВ, ответственном за устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину и 19 мутаций в генах katG, inhA, ahpC, ответственных за устойчивость М. tuberculosis к изониазиду. В качестве

-15-

матрицы использовали выделенный препарат ДНК М. tuberculosis «дикого типа», содержащий 105 геном-эквивалентов. При использовании модифицированных флуоресцентно меченных нуклеозидтрифосфатов в стандартный протокол анализа вносили следующие изменения: на втором этапе амплификации использовали праймеры, не имеющие флуоресцентной метки на 5'-конце; реакционная смесь второго этапа содержала 8 нМ меченого Т-дезоксиуридин-51 -трифосфата.

Всего было проанализировано 23 модифицированных 21 -дезоксиуридин-5' -трифосфата (dUl - dU23). Сравнение гибридизационных сигналов, полученных при использовании модифицированных нуклеозидтрифосфатов, осуществляли следующим образом: вычисляли средний флуоресцентный сигнал /„ в ячейках, содержащих зонды, полностью комплементарные ДНК «дикого типа» М. tuberculosis. Данное значение нормализовали относительно /т, полученного при использовании референс-нуклеозидтрифосфата dUl. Оценка экспериментального разброса величины сигналов была получена с помощью вычисления стандартных отклонений сигналов по результатам трех экспериментов. Результаты сравнения уровней флуоресценции для различных модифицированных оснований приведены на Рис.5.

Полученные данные позволили выявить зависимость сродства нуклеозидтрифосфатов к ДНК полимеразе от расположения и природы заместителей в индолениновом ядре красителя, а также структуры линкера. Они послужили основанием для выбора dU20, как наиболее перспективного соединения. Использование этого субстрата повышает интенсивность гибридизационных сигналов в 6 раз по сравнению с dUl и в 2 раза по сравнению с флуоресцентно меченным по 5'-концу праймером (Рис.6).

Спектрофотометрическое сравнение флуоресцентно маркированных продуктов ПЦР, полученных с помощью меченого праймера и модифицированного нуклеозидтрифосфата, позволило примерно рассчитать количество включенных молекул красителя. Для одного из самых эффективных субстратов - dU2 (Рис. 5) оно составило 7 молекул на 1000 нуклеотидов.

' Рис.5. Сравнение нормализованного флуоресцентного сигнала,

I регистрируемого в ячейках микрочипа при использовании различных модифицированных нуклеозидтрифосфатов dU2-dU21, относительно референс-красителя dUl. Значение сигналов, полученных при испытании референс-красителя dUl, принято за 1 относительную единицу флуоресценции (o.e.).

-1

: -г : -

шШЩ

rz.

¡вИ

жш

¡¡Яш

Primer аиго

Рис.6. Сравнение нормализованного флуоресцентного сигнала, регистрируемого в ячейках микрочипа при использовании модифицированного нуклеозидтрифосфата dU20 и меченого праймера, относительно референс-красителя ёХЛ.

Следует обратить внимание на то, что использование меченых нуклеозидтрифосфатов позволило исключить появление неспецифических сигналов, связанных с частичным отжигом меченых праймеров на олигонуклеотидных зондах микрочипа. Модифицированный нуклеозидтрифосфат сЮ2 вошел в состав трех сертифицированных диагностических тест-систем.

Оценка специфичности и чувствительности разработанного метода

Способность разработанного биочипа специфично определять подтипы НА и МА проверяли на выборке, состоящей из 19 эталонных штаммов вируса гриппа А. Примеры гибридизационных картин представлены на Рис. 7. При анализе всех 19 эталонных штаммов, выделенных от птиц, человека или животных, не было отмечено перекрестного взаимодействия, когда положительный флуоресцентный сигнал наблюдался бы в ячейках, соответствующих разным подтипам НА и/или ЫА. Положительные сигналы в 5-10 раз превышали фоновое значение флуоресценции контрольных ячеек. При этих значениях дискриминации подтип гемагглютинина и нейраминидазы исследуемого образца вируса гриппа А однозначно определялся как с помощью программных средств, так и визуально.

1 2 3 4 5 6 7

А •

Р • •I

1 • ♦ • . 4

и • •

Н9

(с)

Рис.7. Гибридизационные картины, полученные при анализе эталонных штаммов А/и Б811/90/77/Н1N1 (а), АЛ)иск/Сгес1ю81оуа1аа/56/Н4М6 (Ь) и А/8\уте/Нопв Коп£/9/98/Н9Ы2 (с).

Для оценки аналитической чувствительности использовали десятикратные разведения штаммов А/\У8№33(Н1Ш) и АЛЛаопа/3/75(НЗМ2) с определенной концентрацией вирусных частиц. Каждое разведение анализировали в трех независимых экспериментах. Аналитическую чувствительность определяли как минимальную ЭИД5о/мл, при которой все три образца от каждого из двух эталонных штаммов успешно определяли на биологическом микрочипе. Аналитическая чувствительность составила 103 ЭИД50/мл.

Анализ штаммов ВГА, выделенных во время эпизоотии среди диких и домашних птиц, на биочипах

Разработанным методом всего было проверено 123 образца РНК, выделенного из материала, полученного от диких и домашних птиц во время эпизоотий на территории РФ в период с 2005 по 2008 год. Из них 69 образцов были собраны во время эпизоотий, вызванных вирусами гриппа А подтипа Н5№, сопровождавшихся гибелью дикой и домашней птицы. Остальные 54 пробы были собраны при отсутствии эпизоотических вспышек гриппа А у диких водоплавающих птиц.

Во время локальной эпизоотии в Новосибирской области в июле 2005 года с помощью разработанного метода был проанализирован 41 образец РНК, выделенной из клоакальных смывов клинически здоровых птиц (33 образца), из суспензий внутренних органов (мозг, печень, селезенка) погибших птиц (6 образцов) и птиц с клиническими проявлениями болезни (2 образца). Вызвавший эпизоотию подтип вируса был определен как А/Н5Ш (Рис.8А) для 16 образцов из 41. Все образцы были также проверены стандартными вирусологическими методами, включающими выделение вирусов с последующим типированием в реакциях гемагглютинации и торможения гемагтлютинации (в дальнейшем референс-метод). Сравнение данных, полученных с помощью разработанного метода и с использованием стандартного вирусологического подхода, выявило 5 ложноотрицательных результатов (Табл.3). Так как во всех 5 случаях исследуемая РНК была выделена из клоакальных смывов птиц, не имевших клинических симптомов

болезни, было высказано предположение, что используемая нами процедура пробоподготовки недостаточно эффективна при низком содержании вирусных частиц в образце.

Таблица 3. Сравнение результатов молекулярного субтипирования ВГА на биочипе с референс-методом при расшифровке эпизоотии в Новосибирской

области 2005 ( истинно-положительные

иилини, ¿.\J\JJ Vчувствительность —-»100%'

истинно - положительные + ложно - отрицательные

истинно-отрицательные \

специфичность =--—--*100%/'

истинно - отрицательные + ложно - положительные

Подтип 1Ш1 Референс-метод Специфичность, % Чувствительность, %

+ - Всего

Биочип + 16 0 16 100% 76%

- 5 20 25

Всего 21 20 41

Это предположение было подтверждено при анализе образцов, собранных при отсутствии эпизоотической вспышки гриппа А. Из 54 клоакальных смывов, взятых у диких водоплавающих птиц Приморского края в 2005 году, только для 2 образцов наблюдали специфичные полосы при электрофоретическом анализе продуктов ОТ-ПЦР. При последующей гибридизации этих двух образцов подтип ВГА был определен (подтип А/НЗ). В то же время по результатам стандартного вирусологического тестирования положительными оказались 10 образцов (подтипы А/НЗ, А/Н4). Эти данные свидетельствуют о необходимости совершенствования процедуры пробоподготовки (в первую очередь выделения РНК).

В дальнейшем, при определении этиологического агента эпизоотий в качестве материала для выделения РНК мы использовали только суспензии внутренних органов погибших птиц или птиц, имевших клинические проявления болезни. Анализируемые образцы были получены при эпизоотиях в Астраханской области, республике Тыва, Приморском крае. С помощью

разработанного метода в качестве этиологического агента, вызвавшего эпизоотии, был определен подтип А/Н5К1 вируса гриппа А, что было полностью подтверждено стандартным вирусологическим типированием (Табл.4).

Таблица 4. Результаты тестирования полевых образцов, выделенных при эпизоотиях в различных регионах РФ, полученные с помощью разработанного и референс- методов.

География эпизоотии Количество образцов Определение подтипа ВГА

Биочип Референс-метод

Астраханская область, 2005 10 Н51Ч1 10/10 Н5Ш 10/10

Республика Тыва, 2006 4 Н5№ 4/4 Н5Н1 4/4

Приморский край, 2008 4 Н5М1 4/4 Н5№ 4/4

При расшифровке эпизоотии в Приморском крае весной 2008 года, при анализе полевого материала с помощью нашего метода было установлено, что штамм из Приморья отличается по структуре гемагглютинина и нейраминидазы от штаммов, выделенных во время эпизоотий в Новосибирске, Астраханской области и Тыве и не относится к Цинхай-Сибирскому генотипу 2.2. В частности, мы наблюдали существенные различия в картине гибридизации с олигонуклеотидными зондами биочипа (Рис. 8). Степень гомологии нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина приморских и Цинхай-Сибирских штаммов составила 92,9-95,3 %, гена нейраминидазы - 94,1-95,3 %. Это значит, что гибридизационный анализ на биочипе может быть использован для первичного экспресс-генотипирования высоковирулентных штаммов ВГА, подобных штамму «птичьего» гриппа Н51Ч1.

Таким образом, продемонстрирована принципиальная возможность применения разработанного подхода для определения подтипа вируса гриппа А, вызвавшего эпизоотшо. Показано, что гибридизационный анализ на биочипе обладает рядом преимуществ, как перед иммунологическим методом (высокая скорость анализа, отсутствие стадии культивирования, не

1 *

2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

Н5

а Г#"

• • • • •

«» в -V

Н5

Рис. 8. Гибридизациониые картины, полученные при установлении этиологического агента эпизоотии в 2005 и 2008 годах. А- картина гибридизации при анализе А/сЫскеп/МоУоз1Ыгзк/64/05 (Н5№) Цинхай-сибирского генотипа 2.2. Б — картина гибридизации при анализе А/сЫскеп/Рптоц'е/1/08 (Н51\И) генотипа 2.3.2.

требует набора эталонных иммунных сывороток), так и перед группой методов, основанных на ОТ-ПЦР (больший спектр определяемых подтипов). Безусловным преимуществом анализа подтипа ВГА на биочипе по сравнению с прямым секвенированием генов поверхностных гликопротеинов является низкая себестоимость.

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа 3,5 тысяч депонированных в базы данных последовательностей генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А определены консервативные участки, пригодные для субтипирования широкого спектра различных подтипов ВГА. Подобраны специфичные праймеры для одновременной амплификации фрагментов генов поверхностных гликопротеинов.

2. Проанализировано 23 новых флуоресцентно меченных производных 2'-дезоксиуридин- 5'-трифосфата и определены 4 наиболее перспективных соединения для маркирования анализируемой молекулы-мишени.

3. Разработан биологический микрочип, позволяющий идентифицировать 15 вариантов гемагглютинина (Н1-Н15) и 2 варианта нейраминидазы (N1, N2) вируса гриппа А.

4. С помощью разработанного подхода выполнен анализ вирусных нуклеиновых кислот, содержащихся в 123 полевых образцах, выделенных из клинического материала, полученного от диких и домашних птиц во время эпизоотий.

5. На выборке из 41 образца определены специфичность и чувствительность предложенного метода идентификации вирусного подтипа (100% и 76%, соответственно). Аналитическая чувствительность метода составила 103 ЭИД50/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Fesenko Е.Е., Kireyev D.E., Gryadunov D.D., Mikhailovich V.M., Grebennikova T.V., L'vov D.K., Zasedatelev A.S. Oligonucleotide microchip for subtyping of influenza A virus. Influenza and Other Respiratory Viruses, 2007, Vol.1, Issue 3, p.121-132

2. Д.К. Львов, М.Ю. Щелканов, H.A. Власов, А.Г. Прилипов, П.Г. Дерябин, И.Т. Федякина, И.В. Галкина, А.Д. Забережный, О.В. Ляпина, О.В. Шляпникова, Д.Е. Киреев, Е.Е. Фесенко, В.М. Михайлович, А.С. Заседателев, Е.Н. Любченко, С.С. Яковлев, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов, D.Suarez. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа А / H5N1 на Дальнем Востоке. Вопросы вирусологии, 2008, N.4, стр. 4-9

3. Е.Е. Фесенко, Д.Е. Киреев, Т.В. Гребенникова, Д.А. Грядунов, В.М. Михайлович, Д.К. Львов, А.С. Заседателев. Применение биологического микрочипа для выявления и типирования вирусов гриппа А. Материалы

четвертой международной конференции Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии, Пущино, 15-18 октября, 2007, с. 145

4. Е.Е. Фесснко, Д.Е. Киреев Выявление и типирование вируса гриппа А с использованием биологических микрочипов, Сборник тезисов 11-й школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА", Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, с.287

5. E.E.Fesenko, D.E.Kireev, V.M. Mikhailovich, T.V.Grebennikova, A.S. Zasedatelev Oligonucleotide microchip for influenza A virus surveillance, Materials of conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov, Kyiv, 20 - 22 of September, 2007, p. 118

6. E.E. Fesenko, D. Kireev, D.A. Gryadunov, D.A. Khodakov, A.I. Myznikova, V.M. Mikhailovich, T.V. Grebennikova, A.S. Zasedatelev. Biological Microchips for genetic subtyping of Influenza A viruses. International Scientific Conference "Modern Problems in Genetics". Minsk, Belarus. 2005, p. 257

7. A.I. Myznikova, S.A. Lapa, I.M. Susloparov, E.E. Fesenko, A.U. Kozlova, D.A. Khodakov. Biological Microchip for Orthopoxvirus, Herpesvirus and Varicella-Zoster viruses differentiation. International Scientific Conference "Modern Problems in Genetics". Minsk, Belarus. 2005, p. 281

Подписано в печать: 30.04.2009

Заказ № 1991 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фесенко, Евгений Евгеньевич

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Характеристика вирусов гриппа А

Классификация

Структура вириона

Организация генома и функции вирусных белков

Жизненный цикл вируса гриппа А

Особенности патогенеза и клиники

Эпидемиология вирусов гриппа А и межвидовая трансмиссия

Методы определения подтипа вируса гриппа А

Иммунологические методы

Молекулярно-генетические методы

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и «real-time» ПЦР 33 Изотермальная реакция транскрипционно-опосредованной амплификации нуклеиновых кислот (NASBA)

Петлевая изотермальная амплификация (LAMP) 38 Чувствительность и специфичность амплификационных методов

ДНК микрочипы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе"

Вирусы гриппа типа А (ВГА) активно циркулируют в природных резервуарах, вызывая инфекцию у человека, диких и домашних птиц, многих видов млекопитающих. Для человека опасность этой инфекции обусловлена существованием множества подтипов ВГА и его чрезвычайной изменчивостью. Основными факторами, определяющими патогенность и вирулентность вирусов гриппа, являются поверхностные антигены -гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA).

К настоящему моменту серологически выделяют 16 вариантов НА (HIHI 6) и 9 вариантов NA (N1-N9). Вирусы с различными сочетаниями НА и NA могут быть обнаружены в популяциях диких водоплавающих птиц, являющихся естественным резервуаром инфекции. В отличие от птиц, в человеческой популяции до недавнего времени* циркулировали, штаммы, ассоциированные лишь с тремя вариантами гемагглютинина (Hl, Н2, НЗ) и двумя вариантами нейраминидазы (N1, N2). Однако в последнее десятилетие отмечены случаи заражения человека не свойственными для человеческой популяции подтипами ВГА: H7N7, H7N3, H9N2 и H5N1. Ранее считалось, что эти подтипы не представляют серьезной опасности для людей и в случае заражения могут вызвать у них лишь конъюнктивит и легкое недомогание, в редких случаях - слабовыраженный респираторный синдром. Однако в 1997 г. вирусы подтипа H5N1 явились причиной чрезвычайно тяжелых форм заболевания среди людей - в Гонконге из 18 заболевших человек шестеро погибли, причем, все они заразились от цыплят [1]. В 2003 году вспыхнула новая эпизоотия, вызванная вирусом H5N1 (или т.н. «птичьим гриппом»), которая продолжается и сегодня. Согласно данным ВОЗ, с момента начала эпизоотии заразились уже 411 человек, 256 из которых погибли. При этом впоследние годы происходило непрерывное расширение ареала циркуляции штаммов «птичьего» гриппа, увеличился видовой спектр хозяев, возникла устойчивая тенденция повышения патогенности циркулирующих штаммов. Случаи передачи ВГА подтипа Н5Ш от человека к человеку пока не зарегистрированы, однако, совместная циркуляция штаммов человеческого гриппа и птичьего гриппа повышает вероятность обмена вирусными сегментами между этими штаммами и возникновения нового варианта вируса, способного передаваться от человека к человеку, как это происходило в 1918, 1957 и 1968 годах при пандемиях "испанки", "гонконгского" и "азиатского" гриппа. Возможно, именно этим обусловлено возникновение вирулентного для человека штамма вируса «свиного» гриппа подтипа НШ1, уже унесшего жизни более 100 человек (к апрелю 2009 г.).

К общепринятым методам определения вирусного подтипа относится иммунологический анализ, которому предшествуют стадии выделения вируса на куриных эмбрионах или на культуре ткани. Данный подход рассматривают в качестве «золотого стандарта», продолжительность которого составляет от 3 до 7 дней, требуемых для культивирования вируса. Молекулярно-генетические методы, основанные на обратной транскрипции и амплификации последовательностей генов гемагглютинина и нейраминидазы, характеризуются более высокой чувствительностью, а результаты идентификации вирусного подтипа могут быть получены втечение 3-6 часов. К настоящему времени предложен ряд методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, но из-за трудностей, связанных с количеством одновременно идентифицируемых в реакции мишеней, число подтипов, определяемых в одном анализе, остается весьма ограниченным.

Целью данной работы являлось изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А и разработка на основе полученных данных специализированного биологического микрочипа для молекулярного субтипирования ВГА, который позволял бы в сжатые сроки идентифицировать широкий спектр подтипов ВГА.

В работе отражены следующие результаты:Впервые создан специализированный биологический микрочип, позволяющий проводить молекулярное субтипирование 15 вариантов гемагглютинина и 2 вариантов нейраминидазы ВГА. Процедура определения вирусного подтипа не требует выполнения предварительных стадий культивирования вируса, а результаты анализа могут быть получены в течение 10 часов. С помощью разработанного подхода выполнен анализ вирусных нуклеиновых кислот, содержащихся в 123 полевых образцах, выделенных из клинического материала, полученного от диких и домашних птиц во время эпизоотий. На выборке, включающей 41 полевой образец, собранный в районе эпизоотии, специфичность и чувствительность метода составили соответственно 100% и 76%. Аналитическая чувствительность составила 10 ЭИД50/мл. Полученные характеристики позволили успешно применить разработанный метод для определения подтипа вируса, вызвавшего эпизоотию. Необходимое оборудование установлено в» Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского и используется дляопределения этиологического агента эпизоотий и эпидемиологического мониторинга вирусов гриппа, циркулирующих в природных резервуарах.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Фесенко, Евгений Евгеньевич

ВЫВОДЫ

2. Проанализировано 23 новых флуоресцентно меченных производных 2,-дезоксиуридин- 5"-трифосфата и определены 4 наиболее перспективных соединения для маркирования анализируемой молекулы-мишени.

10" ЭИДзо/мл.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моим научным руководителям Владимиру Михайловичу Михайловичу и Ольге Николаевне Озолинь. Я искренне признателен Дмитрию Кирееву, активному участнику экспериментов, за помощь в работе, Дмитрию Грядунову, Сергею Лапе - за поддержку и ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Александру Васильевичу Чудинову - за синтез модифицированных нуклеозидтрифосфатов, Сергею Панькову, Эдуарду Яковлевичу Крейндлину - за подготовку микрочипов для проведения экспериментов, Сергею Суржикову - за синтез олигонуклеотидов, Александру Сергеевичу Заседателеву - за помощь и поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный метод идентификации подтипа вируса гриппа А на биологическом микрочипе является чувствительным, специфичным инструментом многопараметрического анализа, позволяющим получать воспроизводимые результаты. Его дальнейшее развитие и внедрение в лабораторную практику будут способствовать улучшению эпидемиологического контроля вирусов гриппа, что особенно актуально в условиях появления штаммов, обладающих выраженным пандемическим потенциалом. Гибридизационный анализ на биочипе обладает рядом преимуществ, как перед иммунологическим методом (высокая скорость анализа, отсутствие стадии культивирования, не требует набора эталонных иммунных сывороток), так и перед группой методов, основанных на ОТ-ПЦР (больший спектр определяемых подтипов). Безусловным преимуществом анализа подтипа ВГА на биочипе по сравнению с прямым секвенированием генов поверхностных гликопротеинов является низкая себестоимость.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фесенко, Евгений Евгеньевич, Пущино

1. Claas Е.С., Osterhaus A.D., Van Веек R., et al. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus // Lancet. 1998. — Vol.351.-P.472-477.

2. Fauquet С. M., Mayo M. A., Maniloff J., et al. Virus taxonomy, eighth report //

3. Elsevier. -2005. P. 681-693.

4. Fouchier R. A. M., Bestebroer Т. M., Herfst S., et al. Detection of influenza Aviruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 4096-4101.

5. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T., et al. Evolution and ecology ofinfluenza A viruses // Microbiol. Rev. -1992.-Vol.56(l). -P.152-179.

6. Compans R.W., Meier-Ewert H., Palese P. Assembly of lip id-containingviruses // J. Supramol. Struct. -1974. -Vol.2(2-4). -P.496-511.

7. Chu C.M., Dawson I.M., Elford W J. Filamentous forms associated with newlyisolated influenza virus // Lancet—1949.-P.602-603.

8. Steinhauer D.A., Skehel J.J. Genetics of influenza viruses //Annu. Rev. Genet.-2002. -Vol.36: -P.305-332.

9. Momose F., Basler C. F., O'Neill R. E., et al. Cellular splicing factor RAF2p48/NPI-5/BATl/UAP56 interacts with the influenza virus nucleoprotein and enhances virus RNA synthesis // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 18991908.

10. Martin K., and Helenius A. Nuclear transport of influenza virus nucleoproteins.

11. The viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import // Cell. -1991.-Vol. 67.-P. 117-130.

12. Ruigrok R. W., Barge A., Durrer P., et al. Membrane interaction of influenzavirus Ml protein // Virology. 2000. - Vol. 267. - P. 289-298.

13. Roberts P. C., Lamb R. A., and Compans R. W. The Ml and M2 proteins ofinfluenza A virus important determinants in filamentous particle formation // Virology. 1998. - Vol. 240. - P. 127-137.

14. Ciampor F., Bayley P.M., Nermut M.V., et al. Evidence that the amantadineinduced, M2-mediated conversion of influenza A virus hemagglutinin to the low pH conformation occurs in an acidic trans Golgi compartment // Virology-1992. —Vol. 188(1). -P.14-24.

15. Hughey P.G., Roberts P.C., Holsinger L.J., et al. Effects of antibody to theinfluenza A virus M2 protein on M2 surface expression and virus assembly // Virology-1995. -Vol.212(2).-P.411-421.

16. Fields Virology Fifth Edition /ed. by D. M. Knipe. -Lippincott Williams &1. Wilkins, 2007.-3,177p.

17. Connor R.J., Kawaoka Y., Webster R.G., et al. Receptor specificity in human,avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates // Virology -1994. -Vol.205(l). -P. 17-23.

18. Ito T., Couceiro J.N., Kelm S., et al. Molecular basis for the generation in pigsof influenza A viruses with pandemic potential // J. Virol. -1998. -Vol.72(9). -P.7367-7373.

19. Matrosovich M.N., Matrosovich T.Y., Gray T., et al. Human and avianinfluenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2004. -Vol. 101(13). -P.4620-4624.

20. Gambaryan A.S., Robertson J.S., Matrosovich M.N. Effects of egg-adaptationon the receptor-binding properties of human influenza A and B viruses // Virology-1999. —Vol.258(2). -P.232-239.

21. Mochalova L., Gambaryan A., Romanova J., et al. Receptor-binding propertiesof modern human influenza viruses primarily isolated in Vero and MDCK cells and chicken embryonated eggs // Virology -2003. -Vol.313(2). -P.473-480.

22. Glaser L., Stevens J., Zamarin D., et al. A single amino acid substitution in1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity // J. Virol. -2005. -Vol.79(17). -P. 11533-11536.

23. Stegmann T. Membrane fusion mechanisms: the influenza hemagglutininparadigm and its implications for intracellular fusion //Traffic. -2000-Vol.l(8). -P.598-604.

24. Cros J.F., Palese P. Trafficking of viral genomic RNA into and out of thenucleus: influenza, Thogoto and Borna disease viruses //Virus. Res. -2003. -Vol95(l-2). -P.3-12.

25. Krug R.M. Priming of influenza viral RNA transcription by cappedheterologous RNAs //Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1981. -Vol.93. -P.125-149.

26. Barrett T., Wolstenholme A.J., Mahy B.W. Transcription and replicationofin?uenza virus RNA //Virology-1979. -Vol.98. -P.211-225.

27. Beaton A.R., Krug R.M. Transcrip-tion antitermination during in?uenzaviraltemplate RNA synthesis requires the nucleocapsid protein and the absence of a 50capped end // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1986. -Vol.83. -P.6282-86.

28. Bui M., Wills E.G., Helenius A., et al. Role of the influenza virus Ml proteinin nuclear export of viral ribonucleoproteins //J.Virol.-2000. -Vol.74(4). -P.1781-1786.

29. Hirayama E., Atagi H., Hiraki A., et al. Heat shock protein 70 is related tothermal inhibition of nuclear export of the influenza virus ribonucleoprotein complex //J.Virol. -2004. -Vol.78(3). -P. 1263-1270.

30. Schmitt A.P., Lamb R.A. Influenza virus assembly and budding at the viralbudozone //Adv.Virus.Res. -2005. -Vol.64. -P.383-416.

31. Doms R.W., Lamb R.A., Rose J.K., et al. Folding and assembly of viralmembrane proteins //Virology. -1993.-Vol. 193(2). -P.545-562.

32. Sugrue R.J., Belshe R.B., Hay A.J. Palmitoylation of the influenza A virus M2protein //Virology.-1990.-Vol. 179(1). -51-56.

33. Ono A., Freed E.O. Role of lipid rafts in virus replication //Adv.Virus.Res.2005.-Vol.64.-P.311-358.

34. Bourmakina S.V., Garcia-Sastre A. The morphology and composition ofinfluenza A virus particles are not affected by low levels of Ml and M2 proteins in infected cells //J.Virol. -2005.-Vol.79(12). -P.7926-7932.

35. Avalos R.T., Yu Z., Nayak D.P. Association of influenza virus NP and Mlproteins with cellular cytoskeletal elements in influenza virus-infected cells //J.Virol. -1997. -Vol.71(4). -P.2947-2958.

36. Bancroft C.T., Parslow T.G. Evidence for segment-nonspecific packaging ofthe influenza A virus genome //J.Virol. -2002. -Vol.76(14). -P.7133-7139.

37. Enami M., Sharma G., Benham C., et al. An influenza virus containing ninedifferent RNA segments //Virology. -1991. -Vol.l85(l). -P.291-298.

38. Comprehensive Virology: Reproduction of Large RNA Viruses //Fraenkel

39. Conrat H., Wagner R.R., -New York,NY:Plenum,1975. -P. 179-252.

40. Fujii Y., Goto H., Watanabe T., et al. Selective incorporation of influenza virus

41. RNA segments into virions //Proc.Natl.Acad.Sci.USA -2003. -Vol. 100(4). -P.2002-2007.

42. Watanabe T., Watanabe S., Noda T., et al. Exploitation of nucleic acidpackaging signals to generate a novel influenza virus-based vector stably expressing two foreign genes //J.Virol. -2003. -Vol.77(19). -P. 1057510583.

43. Fujii K., Fujii Y., Noda T., et al. Importance of both the coding and thesegment-specific noncoding regions of the influenza A virus NS segment for its efficient incorporation into virions //J.Virol. -2005. -Vol.79(6). -P.3766-3774.

44. Nayak D.P., Hui E.K., Barman S. Assembly and budding of influenza virus

45. Virus.Res. -2004. -Vol. 106(2). -P. 147-165.

46. Schmitt A.P., Lamb R.A. Influenza virus assembly and budding at the viralbudozone //Adv.Virus.Res. -2005. -Vol.64. -P.383-416.

47. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., et al. Influenza virus matrixprotein is the major driving force in virus budding //J.Virol. -2000. -Vol.74(24).-P.l 1538-11547.

48. Luo C., Nobusawa E., Nakajima K. An analysis of the role of neuraminidase inthe receptor-binding activity of influenza B virus: the inhibitory effect of

49. Zanamivir on haemadsorption //J.Gen.Virol. -1999. -Vol.80(Pt 11). -P.2969-2976.

50. Palese P., Tobita K., Ueda M., et al. Characterization of temperature sensitiveinfluenza virus mutants defective in neuraminidase //Virology. -1974. -Vol.61 (2). -P.397-410.

51. Liu C., Eichelberger M.C., Compans R.W., et al. Influenza type A virusneuraminidase does not play a role in viral entry, replication, assembly, or budding //J.Virol. -1995. -Vol.69(2). -P. 1099-1106.

52. Wagner R., Matrosovich M., Klenk H.D. Functional balance betweenhaemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections //Rev.Med.Virol. -2002. -Vol.l2(3). -P.159-166.

53. Грипп: Руководство для врачей / под ред. Г. И. Карпухина. СПб.:1. Гиппократ, 2001. 360 с.

54. Chan Р. К. Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong

55. Kong in 1997 // Clin. Infect. Dis. 2002. - Vol. 34, suppl. 2. - P. S58-S64.

56. Tam J. S. Influenza A (H5N1) in Hong Kong: an overview // Vaccine. 2002.-Vol. 20 suppl. 2. — P.77-81.

57. World Health Organization. WHO inter-country consultation: influenza

58. A/H5N1 in humans in Asia // WHO, Manilla, Philippines, 6-7 May 2005, document available at http://www. who.int54. de Jong M. D., Hien Т. T. Avian influenza (H5N1) // J. of Clin. Virol. 2006.-Vol. 35.-P. 2-13.

59. Stieneke-Grober A., Vey M., Angliker H., et al. Influenza virus hemagglutininwith multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease // EMBO Journal. 1992. - Vol. 11. - P. 2407-2414.

60. Rott R. The pathogenic determinan of influenza virus // Vet. Microbiol.1992.-Vol. 33.-P. 303-310.

61. Banks J., Speidel E. C., McCauley J. W., and Alexander D. J. Phylogeneticanalysis of influenza H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses //Archives of Virology. 2000. - Vol. 145. - P. 1047-1058.

62. Rohm C., HorimotoT., Kawaoka Y., et al. Do hemagglutinin genes of highlypathogenic avian influenza viruses constitute unique phylogenetic lineages? //Virology. 1995. - Vol. 209. - P. 664-670.

63. Scholtissek C., Rohde W., Von Hoyningen V., Rott R. On the origin of thehuman influenza virus subtypes H2N2 and H3N2 //Virology. -1978. -Vol.87. -P. 13-20.

64. Orlich M., Gottwald H., Rott R. Nonhomologous recombination between thehemagglutinin gene and the nucleoprotein gene of an influenza virus //Virology. -1994. -Vol.204. -P.462-465.

65. Campbell C. H., Webster R. G. and Breese S. S. Fowl plague virus from man

66. J.of Infect.Diseases. 1970. - Vol.122. -P.513-516.

67. Taylor H. R. and Turner A. J. A case report of fowl plague keratoconjunctivitis

68. British J.of Ophthalmology. 1977. - Vol.61. - P. 86-88.

69. Webster R. G., Geraci J. R., Petursson G., and Skirnisson K. Conjunctivitis inhuman being caused by influenza A virus of seals //New England J. of Medicine. 1981. - Vol.304. - P.911.

70. Kurtz J., Manvell R. J. and Banks J. Avian influenza virus isolated from awoman with conjunctivitis //Lancet. 1996. - Vol.348. - P.901-902.

71. Beare A. S. and- Webster R. G. Replication of avian influenza viruses inhumans //Archives of Virology. 1991. - Vol.119. - P.37-42.

72. Peiris M., Yam Y. C., Chan K. H., et al. Influenza A H9N2: aspects oflaboratory diagnosis //J. of Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37. - P.3426-3427.

73. Koopmans M., Fouchier R., Wilbrink B., et al. Update on human infectionswith highly pathogenic avian influenza virus A/H7N7 during an outbreak in poultry in The Netherlands // Eurosurveillance Weekly. 2003. - Vol.7. -P.1-5.

74. Tweed S.A., Skowroski D.M., David S.T., et al. Human illness from avianinfluenza H7N3, British Columbia //Emerg. Infect. Dis. -2004. -Vol.10. -P.2196-2199.

75. Stamboulian D., Bonvehi P. E., Nacinovich F. M., Cox N. Influenza //Infect.

76. Dis. Clin. North. Am. 2000 March. - Vol.14. - P. 141-166.

77. Woolcock P. R., Mcfarland M. D., Lai S., and Chin R. P. Enchanced recoveryof avian influenza virus isolates by a combination of chicken embryo inoculation methods //Avian Dis. 2001. - Vol.45. - P. 1030-1035.

78. World Health Organization. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance // WHO, Geneva, 2002, document WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5Rev. 1 available at http://www.who.int

79. Gavin P. J., Thompson R. B. Jr. Review of Rapid Diagnostic Tests for1.fluenza //Clin. And Appl. Immunol. Reviews. 2003. - Vol.4. - P. 151172.

80. Leonardi G. P., Leib H., Birkhead G. S., et al. Comparison of rapid detectionmethods for influenza A virus and their value in health-care management of institutionalized geriatric patients //J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32(l). — P.70-74.

81. Ray C. G., Minnich L. L. Efficiency of immunofluorescence for rapiddetection of common respiratory viruses //J. Clin. Microbiol. 1987. -Vol.25(2). -P.355-357.

82. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Moss A. A. and Rasmussen R. P., Continuousfluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification //BioTechniques. -1997. -Vol.22. -P.134-138.

83. Morrison T. B., Weis J. J. and Wittwer C. T., Quantification of low-copytranscripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification //BioTechniques. -1998. -Vol.24. -P.954-958.

84. Didenko V., DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer

85. FRET): Designs and Applications. //Biotechniques. -2001. -Vol.31(5). -P. 1106—1121.

86. Watson D.E., Li B., TaqMan applications in genetic and molecular toxicology1.t. J. Toxicol. -2005. -Vol.24(3). -P.139-145.

87. Marras S.A., Tyagi S., Kramer F.R., Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes //Clin. Chim. Acta. — 2006. —Vol.363(l-2). —P.48-60.

88. Lee C. W., Suarez D. L. Application of real-time RT-PCR for the quantitationand competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus //J. Virol. Methods. 2004. - Vol.119. - P. 151-158.

89. Munch M., Nielsen L. P., Handberg K. J., and Jorgensen P. H. Detection andsubtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA //Arch. Virol. 2001. - Vol.146. - P.87-97.

90. Spackman E., Senne D. A., Myers T. J., et al. Development of a Real-Time

91. Reverse Transcriptase PCR Assay for Type A Influenza Virus and the Avian

92. H5 and H7 Hemagglutinin Subtypes //J. Clin. Microbiol. 2002. -Vol.40(9). -P.3256-3260.

93. Stone B., Burrows J., Schepetuik S., et al. Rapid detection and simultaneoussubtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR //J. Virol. Methods. 2004. - Vol. 117. - P. 103-112.

94. Wright K. E., Wilson G. A. R., Novosad D. Typing and subtyping of influenzaviruses in clinical samples by PCR //J. of Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.l 180-1184.

95. Takao S., Shimazu Y., Fukuda S., et al. Neuraminidase subtyping of humaninfluenza A virusesby RT-PCR and its application to clinical isolates //Jpn. J. Infect. Dis. 2002. - Vol.55. P.204-205.

96. Vabred A., Sapin G., Lezin B., et al. Comparison of three non-nested RT-PCRfor the detection of influenza A viruses //J. of Clin. Vir. 2000. - Vol. 17. -P.167-175.

97. Compton J., Nucleic Acid Sequence-Based Amplification //Nature. -1991.1. Vol.350.-P.91-92.

98. Lau L. T., Banks J., Aherne R., et al. Nucleic acid sequence-basedamplification methods to detect avian influenza virus //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - Vol.313. - P.336-342.

99. Moore C., Hibbitts S., Owen N., et al. Development and evaluation of a realtime nucleic acid sequence based amplification assay for rapid detection of influenza A //J. Med. Virol. 2004. - Vol.74. - P.619-628.

100. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA //Nucleic Acids Research. -2000. -Vol.28.

101. Poon L. L. M., Leung C. S. W., Chan K. H., et al. Detection of humaninfluenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification //J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol.43. - P.427-430.

102. Jayawardena S., Cheung C.Y., Barr I., Chan Kwok H., Chen H., Guan Y.,

103. Peiris J. S. M., Poon L.L. Loop-mediated isothermal amplification for influenza A (H5N1) virus //Emerg. Infect. Dis. -2007. -Vol. 13(6). -P.899-901.

104. Suarez D.L., Amaresh D., Ellis E. Review of Rapid Molecular Diagnostic

105. Tools for Avian Influenza Virus //Avian. Diseases. -2007. -Vol.51. -P.201-208.

106. Tanigava M., Gotoh M., Machida M., Okada T., Oishi M. Detection andmapping of mismatched base pairs in DNA molecules by atomic force microscopy//Nucl. Acids Res. -2000. -Vol.28(9). -P.l-5.

107. Li J., Chen S., and Evans D. H. Typing and subtyping influenza virus using

108. DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR //J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39. - P.696-704.

109. Sengupta S., Onodera K., Lai A., and Melcher U. Molecular detection andidentification of influenza viruses by oligonucleotide microarray hybridization //J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41. - P.4542-4550.

110. Kessler N., Ferraris O., Palmer K., et al. Use of the DNA Flow-Thru chip, athree-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses //J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.32. - P.2173-2185.

111. Lodes M., Suciu D., Elliott M. et al. Use of semiconductor-basedoligonucleotide microarrays for influenza a virus subtype identification and sequencing. //J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol.44. - P. 1209-18.

112. Townsend M.B., Dawson E.D., et al. Experimental evaluation of the FluChipdiagnostic microarray for influenza virus surveillance //J. Clin. Microbiol. -2006. -Vol.44(8). -P.2863-71.

113. Dawson E.D., Moore C.L., Smagala J.A., et al. MChip: a tool for influenzasurveillance //Anal. Chem. -2006. -Vol.78(22). -P.7610-7615.

114. Wang Z., Daum L.T., Vora G.J. et al. Identifying influenza viruses withresequencing microarrays //Emerg. Infect. Dis. -2006. -Vol.12. -P.638-646.

115. Quan P.L., Palacios G., Jabado O J., et al. Detection of Respiratory Viruses and

116. Subtype Identification of Influenza A Viruses by GreeneChipResp Oligonucleotide Microarray //J.Clin.Microbiol. -2007. -Vol.45. -P.2359-2364.

117. Han X., Lin X., Liu B., et al. Simultaneously subtyping of all influenza Aviruses using DNA microarrays //J. Vir. Methods. -2008. -Vol.152. —P. 117121.

118. Huang Y., Tang H., Duffy S., et al. Multiplex assay for simultaneously typingand subtyping influenza viruses by use of an electronic microarray //J.Clin.Microbiol. -2009. -Vol.47(2). -P.390-396.

119. Gall A., Hoffmann B., Harder T., et al. Design and Validation of a Microarrayfor Detection, Hemagglutinin Subtyping, and Pathotyping of Avian Influenza Viruses //J.Clin.Microbiol. -2009. -Vol.47. -P.327-334.

120. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method forreconstructing phylogenetic trees //Mol. Biol. Evol. -1987. -Vol.4(4). — P.406-425.

121. Fouchier R. A. M., Bestebroer T. M., Herfst S., et al. Detection of influenza Aviruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene //J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38. - P. 4096-4101.

122. Kuznetsova V.E., Vasiliskov V.A., Antonova O.V., Mikhailovich V.M.,

123. Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. New indodicarbocyanine dyes for the biological microchip technology //Bioorg. Khim. -2008. -Vol.34(l). -P.141-144.

124. Yu H., Chao J., Patek D., Mujumdar R., Mujumdar S., Waggoner A.S. Cyaninedye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes. //Nucleic. Acids. Res. -1994. -Vol.22(15). -P.3226-3232.

125. Gryadunov D., Mikhailovich V., Lapa S. et al: Evaluation of hybridization onoligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis //Clin. Microbiol. Infect. -2005. -Vol.11. -P.531-539.

Информация о работе

Фесенко, Евгений Евгеньевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы