Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств рекомбинатной живой вакцины против гепатита В "Ревакс В" и разработка технологии её производства

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств рекомбинатной живой вакцины против гепатита В "Ревакс В" и разработка технологии её производства"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ НПО "ВЕКТОР"

. На правах рукописи

МУРАТОВ ПЕТ? ЮРЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЖИВСЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В 'ТЕВАКС В" И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЕЕ ПРОИЗВОДСТВА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени . .'кандидата биологических наук

Кольцова - 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте мал кулярной биологии- НПО "Вектор" Министерства эдравоохранен Российской Федерации'

Научные руководители:

доктор биологических наук С.В.Нетесов кандидат биологических наук А.С.Беляев

Официальные оппоненты:

доктотэ биологических наук С.К.ЗагребельныГ; кандидат медицинских наук А.Г.КуслиГ

Ведущая организация:

Томский научно-исследовательский институт

вакцин и сывороток Минздрава К'

в часов на заседании Специализированного совета

К 038.08.01 в Научно-исследовательском институте молекулярн! биологии НПО "Вектор" по адресу:

632159 п.Кольцове Новосибирская обл..Новосибирский р-он.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-и следовательского института молекулярной биологии НПО "Бекто;

Автореферат разослан НИМЯ 19а'3г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Бакита диссертации состоится

кандидат химических наук

ОЗДАЯ ХАРЛжтвиагпа», работы

Актуальность проблемы. В настояшев время заболеваемость ге-атигсм В вызывает боль шум тревогу у населения стран псего мир1;, том числе з России и СНГ. Основным источником инфекции служат роничрские носители ЕГВ, которых по данным ECO з мире насчитается более 200 миллионов человек, по прогнозам 75-10G »ялн ч* сторых умрут от последствий гепатита В. Ежегодно регистрируется олее 50 млн новых заболеваний. Носительство приводит к развитие яда опасных заболеваний. Гепатит В пеоелается от человеку к че-екку 'гаи« всего парентерально, однако заражение может происхо-ить при половом контакте, тесном бытсасм оСюнии, а также раясплацеитарным путем, принадлежит.к семейству гепадиззируссз. ГВ не сазмнсиается на большинстве культур клеток и не вызывает абслевания у лабораторных животных, за йюсаачением некоторых

ИДСЗ еысвих ПрИШТОЕ.

Залиым звеном в профилактика любого забсдевакия несомненно вляется вакшгаация; однако в России и зс зсем СНГ закшшз поста гепатита 3 пока не производится. За рубежом производятся лазкенная вакцина, приготовленная из сыворотки крови дснсосз -осителей HBsAg и субъединичные, полученные на основе оекоыби-ачтннх зга«уоз дрожжей и клеток млекопитающих, экепрессируташ нтигекь этого вируса. Однако широкое применение m в яагей тране ограничено из-за высокой стоимости препаратов. Прсазвсдг-во яе их технологически трудноосуществимо и весьма дсрсго. Почему актуальные является создание аффективной, безопасней л срогой вакцины против гепатита В, в частности на основе сектора пруса осповакцины (ВОВ).

Цель работы. Настоящая работа проводилась в 13ÎQ "Вектор" s 988- i992 годах по плану НИР объединения и в соответствии г; Го/дарственным заказом Министерства здравоохранения Российской едерации. Целью работы являлись разработка технологии полученуя изучение а ходе доклинического и клинического испытаний вакии-и против гепатита В для использования в медицинской практика.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработала технология получения вакцины гепатим 8 очиесн-сй концентрированной рекембинантней живо и сухой для нахоюгего рикчнения "Реваке Б" на основе рекембдаантиего зтамиа 2 ¿/.5 „2-5 iГКВ N2131). отдичашаяся от изее^ткых ране*.

Впервые показана ишуногенносгь живой рекомбинанткой оспен нс-гелатитвой вакцины на лкщях в виде индукции гуморального клеточного ответа на HBsAg, продемонстрированы ее безопасность сниженная по сравнению с исходным штаммом вируса 03 (LIVP) реак тогенность для ладей.

Проведено исследование везикулярного содержимого у вакцики рованыых препаратом "Реваке В". Показано, что большинство клоне вакцинного вируса содержат последовательность ДНК HEsAg и экс преесируют >4BsAg, остальная часть вирусной популяции кдентичк исходному штамму LIVP вируса ОБ и безвредна.

Разработаны инструкция по изготовлению и контролю вакщшъ экспериментально-производственный регламент и проект временно фармакопейной статьи на испытуемый препарат. Были выпущены лабс раторные и экспериментально-производственные серии препарат вакцины "Реваке Б".

Основная практическая значимость работы заключается б вог ысжности организации масштабного промышленного производства те* нелогичной, эффективной, безопасной и недорогой вакцина прота гепатита Б на основе разработанной технологии получения препарг та и результатов доклинического и клинического изучения вакцинь предназначенной для профилактики гепатита В и, попутно, нат> ральной оспы.

Б настоящее время первоочередная потребность в подобие препарате оценивается в 1,5 млн доз в год для России и 5 млн дс в год для стран быввего Ссша в целом.

Объем v. структура диссертации. Диссертация состоит из вве дения и трех глав: введения, литературного обзора, посвященног современному состояния дел в области Эпидемиологии и бислоп ЕГВ. вакцинопрофилактики гепатита В (глава 1), материалов и Mi тоюь исследования (глава 2), результатов работы и их оосувден! (глаза 3). выводов (глава i) и списка цитируемой литератур (глава Ь. £38 ссылок). Работа изложена на страницах машиновиенс го текста, включает 13 таблиц и 2 фигуры.

, Апробация работы. Материалы диссертации представлялись ) отраслевое совещании "Биотехнология Еакцин и лечебно-профилакт» ческих препаратов" (Кол: :ово, 1Q83), Все-союзной школе-семина] "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990), V Кснф< ренцки Российской АН "Новые направления биотехнологии" (Пущ

ю.1992), I Съезде иммунологов России (Новосибирск,1992).

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Использованные сокращения:

HSsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В, ЕГЗ - зи-зус гепатита В, BCG - Всемирная организация здравоохранения, ВСВ

■ вирус осповакцины, ТК -'тимидинкиназа, ХАО - хсрионазлантоис-гые оболочки, РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы, OCS - оспи-юобразушие единицы, РБТЛ - реакция бласттрансфсрмации лимфода-'ов, ИСК - индекс стимуляции клеток, КонА - конканаваяин A. £ГА

■ фитогемагглютинин, а.к,- аминокислота, Ш& - свободные от па-'огенксй микрофлоры, ИФ - иммуно-ферментяый.

OCHOSHCB СОДЕРЯАННВ РАБОТУ

Введение. Все работы, направленные на создание рексмбинзнт-!ых вакцин против гепатита В, основывались на экспрессии в рал-шчных векторных системах гена HBsAff, длиной 226 а.к. Однако, «комбияантный штамм BOB, экспрессирующий только HBsAg, сказался [езффективным в качестве вакцины: проведенные клинические.испь-■ания на добровольцах показали иммуногенность полученного препа-iara только в отношении антигенов вируса ОЗ.

Вместе с тем известно, что preS2-S-0eaoK является гораздо ¡олее сильным и полноценных иммуногеном, чем S-белок (KEsAg), юзтому считается^ что вакцина против гепатита В на основе ВОВ, фодуцирушая рreS2-S-белок, окажется эффективной и в отношении дтигенов ВГВ.

Использование рекомбинантной вакцины против гепатита В на снове ВОВ имеет преимущество перед другиыи экепресси;/озими истемами, позволяя осуществлять экспрессию встроенных з геном OB протективных антигенов вируса гепатита В не только з культу-е клеток, но и в организме привитого, моделируя естественней пфекционный процесс. Кроме того ВСВ вирокэ испытан во «негих тралах мира по программе ВСВ "Ликвидация натуральней сспы", апример штамм LIVP вируса CS. Поэтому BCÖ рассматривает аолуче-ие вакцин на основе рекоыбинантных штаммов ВОВ как одно из ерспективных направлений, в том числе против гепатита В.

аресте с этим векторные антигены - белки ВС® - индуипзугт бразование полноценного иммунитета к BGB. что позволяет расс-

матривать подобные препараты б качестве средства сдномомектк! вакпик&цки и против гепатита В, и против оспы.

Б ЕЗ С' "Вектор" был разработай рекомбин&чткый штамм виру! осповакцшш, посученный путем встройки в ген тинидинниназы (И стаыма 1ЛУР вируса СВ. фрагмента ДНК. вируса гепатита Б. кодируй ¡к-г о синтез рга££- и НВз- антигенов НТВ, в котором экспресс: антигенов вируса гепатита Б осуществляется под контролем ра ке-всБдШегс 7,5К промотора ВСЕ, с эффективный синтетическим са ?оь-- инициации трансиюшщии..

; Разработка технологии получения вакцины против гепати-1- ■•?•-:■.■.::.- В".

Пое^риюыались попытки поиска подходящей техыологтеск системы, сянако от многих приелось отказаться ввиду либо их н технологичности, либо высокой стоимости.

Виг.о принято решение использовать стадию- пассирования в ручного материала на кохэ телят, аналогичную ныне используем при производстве вакцины оспенной живой сухой. Таким образо била разработана следующая принципиальная схема производства: вакцинный итамы й?,532-Б (ГКВ N2131)

{ пассирование на СШ> куриных эмбрионах исходный материал (эталонный производственный игами)

I пассирование на СПФ куриных эмбрионах посевной вирус (первичный полуфабрикат) { пассирование на коже телят детрит (соскоб) '

{ гомогенизация, очистка ьируссодеркацая суспензия (вторичный полуфабрикат)

1 добавление стабилизатора ваклина в жидком виде

4 ровлив в ампулы, лиофндизация готовый препарат

Вакшша "Реваке В" представляет собой лиофилизированную : русеодержацую суспензии в аипулаз. Препарат проходил контроль нормативны« тестам (контрольные точки производства).

2.Докликичеекое изучение препарата вакцины "Реваке В".

Спещ'4-ическая акту ность. Определяли с помощью стандарт«) иетода титрования вчрусньк частиц на ХАО РКЭ. Препарат содерс в 1 ш ке менее 2,5-10® ОСЕ, одна прививочная доза для челоы

не менее 1С9 ОСЕ в 0.01 мл для накожной прививки методом ыно~ гстсенного накалывания или накгашой скарификации.

Генетическая однородность и экспрессия HBsAg. Ксдичестзен--..( контролем генетической однородности Еирусной популяции слу-кт определение процентного количества клонов вирусных частиц, '.спрессируших HBsAg. Для этого разведенную вакцинную суспензии зонировали до отдельных бляиек на мсиослсе перевиваемой ¡с/льту-j клеток почки зеленой мартышки CV-1 под агзроЕкы покрытием, тязки отбирали, ресуспендировали з питательной среде и заоазадн лнослон клеток CV-1 в S6-луночных планшетах. Зараженные клетки гкубирсзали и определяли наличие HBsa? з образцам с ::смоаью Ъ тест-системы для выявления HBsAg, который обнаруживался гнее чем з 80.™ образцов. Показано, что такая доля зкспресс;^-'/*^ а клонов достаточна для индукции иммунного отейтз. Качественны показателе« активности препарата "Реваке 3" слузит количесг-■з экспрессируемсго KBsAg. Вакцина индуцировала KBsAg с кенцент-здяэй не- менее 50 нг/глл/10б клеток при заражении вирусной сус-?нгией вакцины монослоя ¡снеток СУ-í.

7окскч;;сеть закшяы. Исследовали на беспородных белых kKcaz ;и внутрибркгглнном и скарифшациокном способах введения, а гак-j на кроликах при наксхнсм введении, состояние имнунизировашшх 530ТНШ сравнивали с летваттй.'и, пслучивсими растворитель и ис-атэмм LIVP вируса ОБ. Изучение токсичности показало, что жцкна "Реваке В" в дозе 1 • 107 ОСв/хизотаое зазызага измене-га,по характеру я внешним признвкаы не отличишь от изменений, »•зыззенше ВС® и ке считавшихся токсическими. Значительно Сальте дозы вакцины "Ревше В" вызывали более шражакную рзшоиа ría зедение у шлей, но на у кроликов.

Стабильность. Вакцина "Реваке В" сказалась достаточно стз-спьныы и, кроме того, термостабидышм аппаратом. Препарат :с-у-элся в в ад 9 готовой формы, яри хранении при 37°С з tc-'í'1«:« 2S /ток яэ наблюдалось более чем 2-3-крагясгэ енкгекия г.ггр.ч (не ■ш? 1Ч08 ОСЕ/42.). Не выявлено тsraa еккхеяия татра .~t'¡ гля-;лы!су хранении.

Изучение иммуногениости. Проводили с псиезьп лизеГсяя va-кроликов и низиих приматов (макаки резус). Уьпги линии ВА1Б/с вводили педкедно вакцину "Резаке Г;"1 в эзе 2-4-107 0С£/«£еь. Контролен слуаиля две группы ыы^ей: птр-

бой аналогично вводили BOB (LIVP) в ток же дозе, второй - растворитель оспенной вакцины. Кровь отбирали до иммунизации и зато еженедельно, начиная с 7 суток после иммунизации. Антитела ¡ HBsAg выявляли методом твердофазного И2> анализа. 1*аксимум анткте-лообразования к HBsAg приходился на 8 неделю со дне введешь препарата вакцины "Реваке В".

С целью подтверждения полученных результатов и количествен' ной кх оценки (с помощью принятой б мире системы оценки содержа ккя антител к HBsAg в международных единицах (мМЕ/мл - mlU/ml) ■ полоаитедьным считается сигнал,превышающий ЮыМЕ/мл) были пое тавлены дополнительные эксперименты на шиш с использование, геи-системы для выявления антител к HEsAg фирмы "Abbott". Отбо крови у мышей (беспородных и BALB/c) производили только на 8 не деле после введения "Реваке В" б дозе 2-4-107 ОСЕ/мышь. Резуль таты исследования показали, что защитный титр антител к HBsA (>-10 мЫ2/мл) был обнаружен у линейных мышей только при подкозк ном введении вакцины "Реваке В".

Антитела у кроликов определяли с помощью ИФ тест-систем фирмы "Abbott". Наибольшая индукция антител к HBsAg у кролике наблюдалась при накожном введении вакцины в дозе 10б ОСЕ. Обна руживали антитела к HBsAg 50% животных, причем у 2íZ обнаружь вался иммунный ответ, превышавший 100 мМЕ/мл. При введении ос пенной вакцины индукции антител к HBsAg не наблюдалось.

05 индукции клеточного иммунного ответа у иммунизировании мышей судили по спленощтоБ пролиферировать при добавлении к н; HBs-, pre S2 (34-32) и ВОВ-антигеноБ в РЕМ. Пептид -pre-S (54-323 является синтетическим аналогом аминокислотной последс вательносги 14-32 а.к.pre-S2-области ВГВ. Мыщам линии BALB/ подкожно вводили вакцину 'Тевакс В" или ВОВ (контроль) в до: 2-4-Ю7 ООВ/мл, дополнительным контролем служили интактные ыыш Спленоциты выделяли из селезенок мышей стандартным методом на сутки после иммунизации. Постановку РБТЛ осуществляли стандарт ним методом, результаты представляли в виде ИСК по отношению в? личин имп/мин Е образцах с антигеном и без него (концентрат пол обирали заранее).,. Выло показано, что наиболее интенсивно npi лкрерируют в ответ на с~'шуляцию специфическими антигенами ш фецкта,выделенные от мышей,иммунизированных вакциной "Реваке В'

Динамику РВТЛ изучали также на макаках. Трех обезьян накож-з иммунизировали вакциной "Реваке В" в дозе 107 ООЕ/мл. Моно-гклеарные клетки выделяли из гепаринизироЕзнной венозной крови гандартным методом центрифугирования в градиенте плотности злл-верографина, кровь отбирали в в течение 112 суток. Показа-э, что иммунизация обезьян Макака резус вакциной "Регакс В" эиводит к возникновению специфического клеточного иимуннсго от-?тз на HBsAg и ВОВ у всех трех лшвотных, при этом динамика от-гта несколько различалась у каждого животного. Максимальные ИСК зиходшшсь в оснозном на 5 - 7 неделю с момента иммунизации.

Определение у макак антител к pre-S2-области KSsAs; ВГВ пробили методом конкурентного ингибироваиил связывания антител с мобилизованным антигеном. Зля сенсибилизации твердей хазы ;;с-:льзовался кояъюгат пептида pre S2 (14-32) с бычьим сызсготсч-At альбумином (ЕСА). Анти-pre 52-антитела выявлялись у С из 2 гкак ло 7-3 недели, впоследствии антитела обнаружены не были.

Антитела к KSsAg у макак выявить не удалось, что. вероятно, Зусдовлено невысокой иммуногенностыо вакцины ''Резаке В" для «них приматов. •

Таким образом, вакцина против гепатита В "Реваке В" облада-1 специфической иммуногенностью для лабораторных жизотных.

Полученные в ходе доклинических испытаний результаты позволяй разработать Программу клинических испытаний на добрезель-зх. При ее рассмотрении и на основании результатов доклиничес-« испытаний Комитет МИЕП Министерства здравоохранения принял ?шение о проведении клинических испытаний препарата.

3. Клиническое изучение препарата вакцины "Реваке 3" на -бровольцах. 3.1. Описание испытаний.

В качестве препаратов введения были использованы:

- вакцина гепатита В очипенная концентрированная рексмСя-антная яивая сухая для накежнего применения "Реваке Е".

- вакцина оспенная хиваэ сухая (НГ.О "Вирисн", г. Томск).

- плацебо - растворитель оспеннси вакцины диесй с уз с Я ШО "Бирион", г. Тсмек).

- вакцина против гепатита 3 "Entjerlx 3" проигнсдстаа :игкы Rttn-Kloir» ßlolc?icaii> (Бельгия). Препарат пилставллет cdCih ?к::чонна.ч?ну» дрожжевую какцииу гтротлз гепатита В, солергалую пшенный VE.TA* (1 деза - 1X3 чкг НЕзЛ?).

В качестве добровольцев были отобраны лица в возрасте 16-лет (кители п.Кольцове к г. Новосибирска, имеющие вакикнальн знаки). От прививок были отведены имгвеие противопоказан

. согласно Программе испытании. СеропозитиБЯые по маркерам ЕГЬ оыли еке-очеш в число добровольцев. Была выделена подгруппа ли имеисс; антитела к Н5зА?. Сформированы следукде группы:

Лкца в количестве 67 человек, которым первоначально вводи загавау "Реваке В" нашита в область плеча методом ивожесгвенв то наказывай« е дозе 5- Ю® ООЕ на человека, через 45 суток Си иасделеш на 3 группы:

:-ог. группа - повторное введение Егкцины "Реваке В" ь ч же дозе (Зг человек - вое муэкчякы, средни* воврасг - £0+2 года 2-ая группа - введение плацебо, л&чсою методом множестве ноге накалывания - 15 человек (все ыукчиш, средний возраст года;. Сюда же организационно входиль подгруппа, состояв и:- с» человек, имевшие антитела к НЬзА£ до вакцинации, и на&люг емай отдельно с цельо выявления' влияния вакцинации "Реваке Е" ранее сформированный уровень антител к НЬзА£.

Ь-ъя группа - введение вакцины "Епз;ег1х Б" лицам, серонег тйьным по антителам к НВзАг после первичной вакцинации, внут{ А2>?чю - 13 человек (все мужчины, средний возраст - 20+2 годг 1р?ти& группы были представлены:

»-■ой группа - гидам этой группы (2Ь человек - 19 пухши '.■■гжы, срсдаш! возраст 34+9 лет) вводили вакцину оспенную жш \:гус- в область плеча методом множественного накалывания г д< . 1: на человека.

Ь-ая группа - в количестве 17 человек (16 женщин/1 мужчга ::релви£ возраст - 35+5 лет), которым трехкратно вводили вакш "Епк г.Ъ: В" в качестве препарата сравнения внутримышечно тре: оатно с интервалом 30 суток от'каждого введения.

6-ая группа - плацебо (25 человек. - 13 хенв»1н/12 мугкхц средний возраст - ЗЫЬ лет). Волонтерам этой группы однокра-вводили растворитель вакцины оспенной иакожно в область ше' методом множественного накалывания.

■ Осмотр вакцинированных всех групп осуществлялся в сроки порядке, указанные в Пр "рамке испытаний. Все добровольцы про: ■осмотр через 6 меся пев со дня последнего введения п;>епара (отдаленное наблюдение). Привитые опытных групп были обследов

на наличие H&sAg б крови, который обнаружен не был.

ЭЛ. Результаты клинического обследования добровольцев foCsap и мекткие реакции).

Влс.у/ниг вакшж "Реваке 3" (первое - волонтерам 1-ой - 3-ей групп, второе - волонтера.4. 1-ой группы) и оспенной (4-ая группа) пюкватэ в оргглиз«? яриьитых изменения, которые характеризовались местжчл пергичнкми реакциями.

Снсие р»-ашда у вакцинированных 'Тевакс В" и оспенной вакциной етигсены к реакциям легкой степени. Повторное введение "?t-BüKc В" тоске вызывало обдую реакцию легкой степени. Бе было осечено аовывеккя теьшерьтуры, изменения обаего состояния, аллергических реакций. У лиц, получквзих вакцину "Engerix В" и плацебо, обгке и местное реакции не выявлялись. По продолжительности местил реакций, по их проявлению в виде инфильтрата к кожных вакцинальное}: элементов был сделан вывод о меньшей оеакто-генности закшш "Реваке В" по сравнении с оспенной вакциной. V лиц, лслучнг?:т,:х только 1!л!пщну "Engerix В" (5 группа) и плацебо (ó группа;, ке Сшс выявлено каких-либо общих и местных реакций.

3.2. Результаты изменил вируса, выделенного от добровольцев.

Материал для исследований (содержимое везикул), выделенный от двух добровольцев ка 4 сутки после первого введения вакцины "Реьакс Е" б:и клокирозан на культуре клеток CV-1 под агаровш покрытием и исследован на экспрессию HBsAg. Обнаружено, что 75t клонов вирусного материала от первого добровольца и 62,52 клонов от второго экепрессируют KBsAg.

Кз основе этих результатов были отобраны клоны.содеркакие к нессдержадае ген ЕГВ, которые были размножены на У.АО РКЭ и очи-с?аы. Полученные из них препараты днк гидродизовааи рестрюггазой Hind Iii. гидролиза?« подвергали электрофорезу в агарозном геле. В глчестве кентролей использовали Hincä Ш-гидролизаты IHK ис~ хелнего клопа BGB (пггамм '...¡VP) и эталонного штамма 'Тевакс В". Рестрккционный анализ препаратов ДНК свидетельствовал о соответствии клонов эталонному штамм-/ вакцины "РеЕакс В" - для зкс-прессирувщих HBsAg и исходному штамму BCQ - для незкспресскрую-иих. Часть вирусной популяции, лишенная встроеиного гена ВГВ была препаративно наработана на ХАО РКЭ и дополнительно исследована с помогаю лабораторных показателей безвредности на животных.

-to-

результаты показали, что эта часть вирусной популяции нетоксична, специфически безвредна, не обладает некротической и нейропа-тогенной активностью. .

Другие результаты, полученные в'ходе клинических испытаний, также показали безопасность вакцины "Реваке В" (авторскими не являются, однако были получены под руководством соискателя).

3.3. Изучение индукции гуморального специфического иммунного ответа у добровольцев.

Антитела против HBsAg определяли с помощью экспериментальной Ш тест-системы для выявления антител к HBsAg. После первого введения вакцины "Реваке В" антитела к КЕсА? были обнаружены на .30 сутки у 11,37. привитых (7 из 62 обследованных) - табл. 1.

В подгруппе добровольцев, однократно привитых вакциной "Ре-вакс В", у которых антитела к HBsAg были обнаружены до закшша-ции, отмечено двукратное увеличение уровня антител к HBsAg, что свидетельствовало о выраженном эффекте усиления.

В 1-ой группе повторное введение вакцины ."Реваке В" приводило к увеличению числа лиц, серопозитивных во антителам к HBsAg до 52Х £19 из 37) на 75 сутки и до 607. (22 из 37) на 185 сутки.

Во 2-ой группе процент сероконверсии по антителам к KEsAg составил 1QZ, (1 из 10), не изменившись впоследствии.

В 3-ей группе количество лиц, имевзих антитела к HBsA?, на 3D сутки после введения "Engerix В" (75 сутки) достигло 53,87. (7 из 13), впоследствии снизившись до 23.lt (3 из 13) к 185 суткам.

В 4-ой грутше прививка вакциной оспенной живой сухой не пркводща к существенным изменениям в отношении антител к KS2A?.

В 5 группе определение антител к HBsAg проводили толькс после завершения курса вакцинации. На 30 сутки после введена третьей (последней) дозы вакцины "Engerix В" количество лиц, имевши антитела к HBsAg, составило 641 (11 из 17), на 60 сутю - &2Z (10 из 16).В б-ой группе лиц с антителами к но было.

Таким образом, при двукратном введении вакцины "Реваке В' достигался примерно такой же уровень сероконвегсин, что и пр; трехкратней вакцинации "Engerix Б", несмотря на белее сн;иенны1 г. первом случае уровень аягителсоСразсвания к HE^Ag, Необходим; ссс'а отметить, что группа, вакцинированная препаратом "&ееп: г--и rryrnai состояла из ж-шцин '.при однем мукчнне), тогда .и: ::г:!нитые лг^пагагеы "Ровакс В" ii-v'-ъи гсулпш - только мух-

-Ii-

чины. Имеются данные, показывавшие, что уровень антителообразо-эакия к KBsAg после вакцинации "Engerix В" у женщин в 3 раза вь1-ае такового у мужчин. Возможно именно этим объясняются результаты наличия более еысских титров антител к HBsAg в 5-ой группе по ¡равнению с результатами, полученными в 1-ой группе.

Полученные результаты в 3-ей группе позволили также сделать зьжсд о наличии иммунного прайюфования вследствие введения испытуемого препарата, что становится очевидным при последупаем однократном введении ватаиш "Engerix В".

Обаее количество лиц 1-ой группы, отреагировавших на HBsAg-рпецкфическим имунным ответом, составило 28 из 37 - 721 (лица, у которых был выя-иен положительный и гуморальный, к клеточный от-зет). Следует вместе с тем подчеркнуть, что процент сероконвер-:ии по антителам к HBsAg возматао и выше (положительным считается ответ >-10 мЬЕ/мл), ибо чувствительность использованной нами отечественной тест-системы - (30+3) мМЕ/мл.

Определение антител к вирусу осповакшны проводили с подошью КФ тест-системы. _ Изучение специфического иммунного ответа та ВОЗ (табл.2) дало следующие результаты: до вакцинации антитела к ВСВ имели 13,42 добровольцев (9 из 67), на 30 сутки после введения вакцины "Реваке В" - B8Z (59 и? 67).

В 1-ой группе ревакцинация испытуемым препаратом привела к росту количества серопозитивкых по антителам к ВСВ - до 1002 (ЗГ* ¿з 37) к 75 суткам); до вакцинации было 18Z серолозитивных (7 ив 39 добровольцев впоследствии составивших эту группу).

Во 2-ой группе выявлено 8В,6t серопозитивных на-60 сутки от тчала вакцинации (13 из 15) до вакцинации - 6,62 (1 из iE;.

В 3-ей группе антитела к ВСВ обнаруживали 92,3 5 волонтеров : 75 суткам (12 из 13), до вакцинации - 7.7Z (: из 13,.

На 185 сутки существенных изменений в динамике антителоос-эазования к ВОВ в этих группах не наблюдалось.

В 4-ой группе к?» Г:!: добровольцев, однократно привитых вал-дан ой оспенной живой сухой, до вакцинации антитела к ВОЗ были выявлены у 202 (б из 25). После вакцинации ан-итела к ВСВ обнаруживались на 30 и 60 сутки' у 92Z (23 из 25) добровольцев.

В 5-ой группе определение антител к ВСЁ не проводили. В 5-ой группе введение растворителя не приводило к изменениям в штктелообразовании к ВС®.

•12"

Динамика образования антител к йВзАе у добровольцев

Таблица 1

Паи наблюдении .

0 30 75 185

Сероконвереия (в X) 0* (0-6) 11,3* (5-22)

Среднегеометрические значения. ШЕ/ид >30* 24,2x7,1*

1 группа Сч%) Среднегеометрические значения, ыЫЕ/ш! 0(С-$) >30 15,4(0-«) | Ш34-«> ¡6СШ-?*) 32,4+6,5 1 ¡40,2+8,1 ! |

2 гоуппа Сероконвереия (в 7.) 0 (0-31) 10 ! 10*« ( 10 (0-44) ] (0-4-1) | (0-44;

Среднегеометрические значения, ыН2/ш >30 , 31,5+6,5 1 31,6-6,4 |31,5+6,5 " I " 1 ~

3 группа Сероконвереия (в 2) 0 (0-25) *** С* (0-36) С4 -п (85-81) 23,1 (6-51)

Среднегеометрические значения, ШЕУт >30 41,6+3,5 42,5+17,1 50,1+10,(

4 группа. Серокснверскл (в X) 1С (4-36) 15 (4-2«) 18** (4-26) 16 , (4-36)

Среднегеометрические значения, ыШ/ил 24,2*18,9 63,25+31,3 87,3+17,5 69,7+17,'

Ъ группа*** Сероконвереия (в 2) 0 (0-20) 64 (33-86) 62 ' (35-85) -

Среднегеометрические авачеина.имг/ид >30 103,1+30,3 100,0+30,1 -

В группа Сероконвереия (в Л) С со-ш 0 (0-14) 0 (0-14) 0 (0-20)

'''»\Or4J

-наче * -

о -

!

>30

>33

>30

' 4 и I

г г е сые т риче ские кия.1й£/ия

дышье для добровольцев. впоследствии составивши 1, 2 я ■уппу: ** - процент серокоиверсии на 60 сутки; кр'овь отбирали на СО и 60 сутки после третьей вакцинация 5 скосках приведены доверительные интервалы. Среднегео--значения расчитани только для серопозитивных по •;л:д! к НВзЛ*; волонтеров и приведены со среднеквадратичес-сткддценилш! С 135 ).

Таблица 2

Динамика образования антител к ВОВ у добровольцев

Дни наблюдений

!..... ! 0 30 75 185

Се реконверсия (в 1) 13,-4* (6-24)* 88ж (78-95)*

Среднегеометрические значения, мМЕ/мл 128,4+25,7-> <520.8+104,,

1 группа Серскокверсия (в %) 18 (8-34) 92 (78-98) 100 (90-100) 100 (90-100)

Среднегеометрические значения. мНЕ/ш 132,3+30,4 541,2+216,' 1 3440+791 3520+810

2 группа Сероконверсия (в Т.) 6,6 (0-30) 86,6 (60-98) 66,6 ** (75-100)-** 80 (52-96)

Среднегеометрические значения,мКЕ/мл 100^23 '510+112 494+109 441,4+97

3 группа Сероконверсия (в X) 7.7 (0-36) 92,3 (64-100) 92,3 (54-100) 92,3 (64-100)

Среднегеометрические вначения,мЫЕ/мд 100+21 505,6+101,: 482+96 463+93

4 группа Сероконверсия (в £) 20 (7-41) 92 (74-90) 92 ** (74-99)** 92 (74-99)

Среднегеометрические значения,ыМЕ/кл 145,3+34,9 1318+316 1240+298 1054*474

6 группа Сероконверсия (в X) 20 (7-41) 20 (7-41) 16 ** (4-36)** 29 (10-55)

Среднегеометрические значения,мЫЕ/мл 153,1+33.2 114,8+24.1 128.6+27.1 148.8^31

^ - данные для добровольцев, впоследствии составивших 1, 2 и 3 группу;

** - процент сероконверсии на 60 сутки;

а скобках приведены доверительные иятервзлы. Среднегеометрические вначения расчитаны только для серопозитивяых пс антителам к ВОВ волонтеров и приведены со срехнеквадратически-ия отклонениями (1д5)-

Таким образом, однократное введение добровольцам вакциш "Реваке В" и оспенной вакциш живой сухой приводило примерно \ одинаковому уровню сероконверсии по антителам к ВОВ, титр антител во втором случае, однако, выше. Повторное введение вакциш "Реваке В" приводило к образованию значительно более высокой титра антител к ВСВ по сравнении с титром, достигаемым в результате однократного введения оспенной вакцины.

3.4. Изучение клеточного иммунного ответа у добровольцев.

Определение спонтанной пролиферации и блаеттрансформирувде] активности лимфоцитов на воздействие In vitro митогеноз в результате вакцинации проводили с целью оценки 4ункшональной а» тизности иммунокемпетенгных клеток.

Постановку Р5ТЛ осуществляли стандартным методом, иепользо зади ранее подобранные концентрации штегеяоз и антигенов.

Первичное введение "Реваке В" приводило к активации Т-кле-точного иммунитета, что проявилось в повышении уровня спонтанно: пролиферации мононуклеаркых клеток более чем вдвое (на 10 сутки с постепенным снижением к 30 суткам- После ревакцинировачия по кааатели неспецифической активации соответствади таковым до вак цинашш во 2-оЯ и 3-ей группах, оставаясь несколько повышенным а 1-ой. Результата определения митогензависимой бласттрансформа щш до и после вакцинации (ревакцинации) добровольцев свидетель ствовали в целом об умеренном воздействии вакцины "Реваке В" н иммунную систему.

Была изучена также тенденция в развитии антигеиспецифичес хого клеточного иммунного ответа.Результаты изложены в таблице за положительный ИСК для HBsAg принимался ответ >-1,4. для ВОВ достоверно превышавший ИСК до вакцинации.

У 26Z (17 из 65 обследованных) добровольцев до вакцинаци обнаруживались сенсибилизированные к НЕзАг лимфоциты, у ЗЗХ (2 из 65) - к ВСВ.

Первое введение препарата сопровождалось повышением урови спонтанной пролиферации лимфоцитов, при этом средние показател ИСК на специфические антигены несколько снизились. КодичестЕ ответивши на HBsAg лиц составило 281 (17 из 81), а на ВС® Z5.6X {IS кэ 60). Вместе с этим выявлен спешфический ответ волонтеров, до вакцинации не обнаруживавших положительный ИСК i иггдгены : для HBsAg к лля ВСВ - 242 (11 из 45).

Пэсле повторного введения препарата "Реваке В", когда приз-гаки кеспещ;ф;;ческой активации исчезают, увеличивается средний юкззатедъ ИСК па антигены, а-количество лип 1-ой группы,ответивших на КВзАе составило 27,82 (14 из 37), из них не имели положительный ИСК на НВ5А£ до вакцинации - 30% (8 из 27); для ВОЗ эти ю!кзатели составили 51,37. (19 из 37) и 60% (12 из 20) соответственно. Вэ 2-ой группе средние ИСК на НВзЛр продолжали снижаться.

В 3 группе средний показатель ИСК на антигены заметно сни-»ивппзсь на 60 сутки, достигал первоначального уровня для НЕзАб и ¡есколько превысил его для БОВ на 75 сутки.

Таким образом, наибольшее количество волонтеров, реагиро-зэвиих клеточкой пролиферацией на КВзАд и ВСВ выявлено среди ре-5зкцинярованны>: препаратом "Реваке Е".

Таблица 3

ЛСК под действием специфических антигенов

75 сутки

Группы ¡до вакцинац) 30 сутки | БО сутки

волонте- i---i-т-1-1-

ров I BGB 1 HBsAgi BOB IKBsAg | BOB ¡HBsAgl BOB IHBsAgl

1 группа

-,-,

2.3 1.57 1.68 1.16 i

2 группа 1.35* 1.21* 1.15* 1.17* 1.5 0.85 0.98 1.1

3 группа

0.9 0.81 1.44 1.4

данные для добровольцев, впоследствии составивших 1-3 гр.

Таким образом, результаты клинической апробации вакцины Реваке В" на ограниченной группе добровольцев говорят о том, то препарат вызывает слабые местные реакции, умеренно реактоге-ен. безвреден, не обладает побочным действием, достаточно иыму-огенен. Более вкпажен!..«й иммунный ответ наблюдается при двук-атном введении препарата. Вакцина "Реваке В" практически не уо-упает по сероконверски зарубежному препарату однонаправленного ействкя (дрожжевой субъ-елиннчной вакцине "Engerix В"). Испытуе-ый препарат вызывает менее выраженные местные реакции по срав-ению с вакциной оспенной живой сухой, практически не уступая по ммуногенности этому препарату.

-16-

ЕШОДЫ

1. Разработана технология получения вакцины против гепатита 3 "Реваке В" на основе рекомбинантного штата BOB 37,5S2-S. Сфоридена нормативно-техническая документация.

2. Отработана технологическая схема производства этой вак-цикы в промышленных условиях, на- основе которой изготовлены экспериментально-производственные серии вакцины "Ревакс В".

3. Впервые показана дашуногеянсстъ. живой рекомбинантной ое-пенно-гепатитной вакцины на добровольцах в виде индукции гуморального и клеточного ответа на поверхностный антиген ВГВ.

4. Продемонстрированы безопасность и сниженная по сразненге с исходным штаммом BOB (LIYP) реактогекность рекомбинантной вак айны против гепатита В "Реваке В" для лхздей.

5. Исследовано вируссодердалэе везикулярное содержимое добровольцев, вакцинированных препаратом '"Реваке В". Показанс что большинство клонов вакцинного вируса содержат зстроенну последовательность ДНК ЕГВ и экспрессируюг HBsAg, сстзльна часть вирусной популяции идентична исходному штампу BOB (UVF) является безвредной.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах

1. Беляев A.C.. Дмитриев И.П.. Игнатьев Г.Ы., Ш«з?нкэ ?.( Лутикцева Н.Й.. Сабиров А.Н., Самуков В.В.. Секеноьа Л. Н.. Aüwc сов А. Д., Рухавияников Ы.Ю, U'/ратов П.Ю., Мнкрюкоз K.P.., Еевл* гина Л.Р., Константинов А.П., Сандахчиез Л.С. Рексмбккаитиый т рус оспавакцины, зкспрессируадий средний pro 22-3-Селок ободе» вируса гепатита В. Индукция гуморального и клеточного иммунитет оря Ккшунйзации лабораторных животных // Докл.АН СССР. 139£ 7.314. HZ. С. 488-491.

2. Муратов П.Ю., Лшггриев И. П., Беляев А. С, Изучение нмг не-5 ¡'.алогических свойств рекомбинаатных вташов ословакци) (в?,5£2-2 a v?,5c).экспресеирушикс антигены вируса гепатита В Тегнеы докладов Всесоюзного семинара "Молекулярная Сиод-гия ve^icasd". Ленинград. 19эС. С. 57.

'J. Ьедя^Е A.C.. Дмитриев Н.П., ai/ратов П.Ю.. <1ролов И.Б <Чп":ангкий О. Я.. Угманов И.Х.. Агапов Е.В.. Кслыхадов A.A.. Н '.3-, ^аяДзхчиев ЛВектор осповакаины. как вектор а

зздания вакцин. Некоторые итоги и перспективы. - Тезисы докла--:в V конференции РАН "Новые направления биотехнологии". Пущино. >92. С. 51.

4. Муратов П.Ю., Дмитриев Л.П., Беляев A.C. Иммуно-биологи-;ские исследования рекомбинантной вакцины против гепатита В ■евгкс 3". В кн. : Материалы I съезда' иммунологов России. РН031. звосийирск. 1992. С.319.

5. Ыуратов П.Ю., Дмитриев И.Д., Беляев A.C., Рукавишников Ю., Еетессв C.B. Еивая рекомбиначгная вакцина "РеЕакс В" для зофилактмки гепатита В и способ ее получения // Заявка на па-!Н?N5066983, дата приоритета 16.0?.92 г.