Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств рекомбинантной живой вакцины против гепатита в "Ревакс В" и разработка технологии ее производства

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств рекомбинантной живой вакцины против гепатита в "Ревакс В" и разработка технологии ее производства"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧЕО-ИС£Ш2ДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИОЛОГМ НПО "ВЕКТОР"

Р Г б од

3 0 А В Г 1993 . На правах рукописи

МУРАТОВ ПЕТР ЮРЬЕЕИЧ

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМЕМНАНТНОЙ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В "РЕВАКС Е" И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЕЕ ПРОИЗВОДСТВА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени :-вндидата биологических наук

Кольцово - 2993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии- НПО "Вектор" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук С.В.Нетесоъ кандидат биологических наук А.С.Беляев

Официальные олпоненты:

доктор биологических наук С.Н.Загребельный кандидат медицинских наук А.Г.КуслкГ-

Ведущая организация:

Томский научно-исследовательский институт

вакцин и сывороток Минздрава №

Защита диссертации состоится " 01" Оптяорз 19Э 3 г.

О оо '

ь -у ~ часов на заседании Специализированного совета К 098.08.01 в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор" по адресу:

632159 п.Кольцово Новосибирская обл..Новосибирский р-ок.

. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-ио-еледэвательского института молекулярной биологии НПО "Вектор"

Автореферат разослан "2.4" и)-0/)А 15£3 г.

Ученый секретарь Специализированного советь

кандидат химических наук

С5ПАЯ ХЯРШЕР1ХТЖА РДЕОТН

Актуальность проблемы. 3 настоящее время заболеваемость гепатитом В вызывает большую тревогу у населения стран всего мзточ. в тем числе в России и СНГ. Основным источником тдакцли слуха? хронические носители 2ГВ, которых по данным 2CG з мире насчитывается более 300 миллионов человек, по прогноза« 75-100 млн >г-которых умрут от последствий гепатита 3. Ежегодно регистрируется более 50 млн новых заболеваний. Носительство приводит к развитию ряда опасных заболеваний. Гепатит 3 передается от человеку к человеку чаи» всего парентерально, однако заражение можат происходить при половом контакте, теонсм бнто.ьсы обзении, а также трансплацентаркым путем, принадлежит к семейству гепалназисуссв. ВГВ не размножается на большинстве культур клеток и не вызывает заболевания у лабораторных дизотных, за исключением некоторых ВИДОВ ЕЫСЕИХ приматов.

Важным звеном з профилактике любого заболевания несомненно является вакцинация; однако в России и вс всем CIS* закцина против гепатита В покз не производится. За рубежом производите:! плазменная вакшна, приготовленная из сыгорсгки крови доноггз -носителей КЕоЛд и субъединич.чые, полученные на основе рексмСн-нантньи штаммов дрогшей и клеток млекопитающих, зкспрессируюшю: антигены этого вируса. Однако широкое применение их: в нагпей стране ограничено из-за высокой стоимости препаратов. Производство хе их технологически труднеосуществимо и весьма дорого. Поэтому актуальным является создание эффективной, безопасной и недорогой вакцины против гепатита В, в частности на основе лектора пируса осповакцины (ВОВ).

Цель работы. Настраивая работа проводилась п НПО "Вектор" а 1Q88-1992 годах по плану НИР объединения и в соответствии с Государственным заказом Министерства здравоохранения Российской Хедерации. Целью работы являлись разработка технологии позу«}«'* и изучение в ходе доклинического и клинического испытаний законны против гепатита В для использования а медицинской практ:1№.

Научная новизна и практическая ценность работа.

Разработана технология получения вакцины гег.ати?! 3 очищенной концентрированной рекомбинантной дивей сузсй для .чагсэшеге .гркыенеиия "Реваке 3" на основе ре кс иС он т н с г о zrzuaia »/руса •В зУ. 5 02-S (ГХВ S2131), отличасааася от известны! ране-.

Впервые показана иммуногенностъ живой рекомбинантной оспен-но-гепатитной вакцины на людях в виде индукции гуморального и клеточного ответа на НЕбА^, продемонстрированы ее безопасность и енюенная по сравнению с исходным кташом вируса ОВ (1ЛУР) реак-тогенность для людей.

Проведено исследование везикулярного содержимого у вакцинированных препаратом •Тевакс В". Показано, что большинство клонов вакцинного вируса содержат последовательность ДНК НЕбАе и зкс-иреасирувт НВэАк, остальная часть вирусной популяции идентична исходному штамму МУР вируса ОВ и безвредна.

?азра£отакы инструкция по изготовлению и контролю вакцины, экспериментально-производственный регламент и проект временной фармакопейной статьи на испытуемый препарат. Были выпущены лабораторные и экспериментально-производственные серии препарата вакцины "Реваке В".

Основная практическая значимость работы заключается в возможности организации масштабного промышленного производства технологичной, эффективной, безопасной и недорогой вакцины против гепатита В на основе разработанной технологии получения препарата и результатов доклинического и клинического изучения вакцины, предназначенной для профилактики гепатита В и, попутно, натуральной оспы.

В настоящее время первоочередная потребность в подобном препарате оценивается в 1,5 шш доз в год для России и Б млн дог в год для стран бывшего Союза в целом.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав: введения, литературного обзора, посвященного современному состоянию дел в области эпидемиологии и биологии ЕГВ, вакцинспрофилактики гепатита В (глава 1), материалов и методов исследования (глава 2), результатов работы и их обсуждения ¡глаза 3). выводов (глава 4) и списка^^х^тируемой литературы (глава Ь, 238 ссилок). Рабс'та изложена на страницах машинописного текста, включает 13 таблиц и 2 фигуры.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на отраслевом совещании "Биотехнология вакцин и лечебно-профилактических препаратов" (Кол юво, 1989). Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1690), V Конференции Российской АН "Новые направления биотехнологии" (Пути-

но,1992), I Съезде иммунологов 'России (Новосибирск, 1932).

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Использованные сокращения:

HEsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В, ЕГЗ - вирус гепатита В, 303 - Всемирная организация здравоохранения, BGB

- вирус осповакщны, ТК -'тшидиякиназа, ХАО - хорионаллантоис-ные' оболочки, РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы, OCS - оспи-нообразувшие единицы, РБТЛ - реакция бласттрансформашш лимфоцитов. ИСК - индекс стимуляции клеток, КонА - коякзназалик А. ITA

- фитсгемагглмтиккн, з.к.- аминокислота, СШ> - свободные от патогенней микрофлоры, Ш - иммуво-ферменткый.

оснсвноз содеряанз ?тут

Введение. Все работы, направленные на создание рекомсинзат-кых вакцин против гепатита 3, основывались на экспрессии в различных векторных системах гена HBsAg-, длиной 225 а. к. Однако, рексмбинЕНтлый птачм ВОВ, этепрессирухшдай только fffisAg, сказался неэффективным в качестве вакцины: проведенные клинические.испытания на добровольцам показали иммуногенноотъ полученного препарата только в отношений антигенов вируса OB.

Вместе с тем известно, что preSS-S-белск является гораздо более сильным и полноценным иммуногенез, чем S-бедок (HEsAs), поэтому считается, что вакцина против гепатита В на основе 303, продуцирующая preS2-S-белок, окажется эффективной и в отношении антигенов ЕГВ.

Использование рекембинантной вакцины против гепатита 3 на основе ВОВ имеет преимущество перед другими экспрессигу-яими системами, позволяя осуществлять экспрессию встроенных з генсм ВОВ протективных антигенов вируса гепатита В не только а культуре клеток, но и в организме привитого, моделируя естественней инфекционный процесс. Кроме того ВОВ пироко испытан во многих странах мира по программе BCS "Ликвидация натуральней если", например штамм L!VP вируса СВ. Поэтому ВСБ рассматривает получение вакцин на основе рекомбинантнщ штаммов BGB как одно из перспективных направлений, в том числе против гепатита В.

Вместе с этим векторные антигены - бедки ECB - индутвтруют образование полноценного иммунитета к. ВСа, что позволяет расс-

ыатривать подобные препараты ь качестве средства одномоментной вгкакк&цки и против гепатита В, и против ошш.

В КЗ? "Вектор" бкл разработан рекомбинангккй кташ вируса оепозакпины, полученный путем встройки в ген тимидинкиназы (ГК) сташа вируса СВ, фрагмента ЛНК вируса гепатита В, кодиру»-зк-го сиктев ргеЗ£- и. ННз- антигенов НГБ, ь котором экспрессия антигенов вируса гепатита Б осуществляется под контролем ранне- позднего 7.5К. промотора ВОВ, с эффективным синтетическим сай-тж кыпхиашп; транскрипции.

: Разработка технологии получения вакцины против гепатк-гч "Реьаг.? I:".

Предпринимались попытки поиска подходящей технологической системы, однако от многих пришлось отказаться ввиду либо их не-ТСХНСЯОГИЧНОСТЕ, либо высокой стоимости.

Биго принято решение использовать стадию- пассирования вирусного материала на коже телят, аналогичную ныне используемой при производстве вакшнк оспенной живой сухой. Таким образоы, была разработана следуодая принципиальная схема производства: вакцинный штамм ь?,552-3 (ГКВ N2131)

4 пассирование на СПФ куриных эмбрионах исходный материал (эталонный производственный втамм)

| пассирование на СПФ куриных эмбрионах посевной вирус (первичный полуфабрикат) 4 пассирование на коже телят детрит (соскоб) ■

4 гомогенизация, очистка вируссодержащая суспензия (вторичный полуфабрикат)

4 добавление стабилизатора вакиина в хидкш виде

4 розлив в ампулы, лиофилизация готовый препарат

Вакинна "Реваке В" представляет собой лиофилизированную вн-руссодержавую суспензию в ампулах. Препарат проходил контроль пс нормативным тестам (контрольные точки производства).

£.Локдиническое изучение препарата вакцины "Реваке В".

Специфическая акти ноегь. Определяли с помощью стандартного метода титрования вчрусных частиц на ХАО РКЗ. Препарат содержал г- 1 мл не мевее 2.Б-10е ОСЕ. одна прививочная доза для человека

- не менее 10а ООЕ в 0,01 ид для накожной прививка методом множественного накалывания или наложной скарификации.

Генетическая однородность и экспрессия НВяД?. Наяячестаенным контролем генетической однородности вирусной популяции служит определение процентного количества клонов вирусных частиц, экслрессирухших НВаАй.Для этого разведенную вакцинную суспензия клонировали до отдельных бляшек на мснослое перевиваемой культуры клеток почки зеленой мартышки СУ-1 под агаровьм покрытием. Бляшки отбирали, ресуспеядарсвали в питательной среде и зарахалн монослой клеток СУ-1 в 9б-луночных планшетах. Эарааенные клетка инкубировали и определяли наличие НВзА® в образцах с лсмсщь« ЙФ тест-системы для выявления НВзАг, который обнаруживался не ывкеэ чем з 80% образцов. Показано, что такая доля экспресскру»-шсс клонов достаточна для индукции иммунного ответа. Качественным показателем активности препарата "Реваке 3" слугит количество зкспрессируемого НВзАе. Вакцина индуцировала КЕзАа; г концентрацией не менее 50 нгУмл/Юб клеток при заражении вирусной суспензией вакцины монослоя клеток СУ-1.

Токсичность вакшшы. Исследовали на беспородных белых шзаз: при внутрибрюпиннсм и скарификационном способах введения, а тач-жз на кроликах при накожном введении, состояние иммунизированных тавотных сравнивали с .тавотными, получившею растворитель и исходный иташ ЫУР вируса ОБ. Изучение токсичности показало, что вакцина 'Тевакс В" в дозе 1*ю7 ООЕ/яизотное вызывала изменения, по характеру и внешним признакам не отличимым от изменений, вызываемых ВОЗ и- не считающихся токсичесгеши. Значительно большие дозы вакцины 'Тевакс В" вызывали более аыражеяную реакции на зведение у мышей, но не у кроликов.

Стабильность. Вакцина "Реваке В" сказалась достаточно стабильным и, кроме того, термостабильным препаратом. Препарат изучался а виде готовой формы, яри хранении при 27°С в течение 23 суток не наблюдалось более чем 2-3-крагного снихеяля пера (не яиж? ГЮ3 ООЕ/мд). Не выявлено текасе снюййия титра яри длительном хранении.

Изучение нммуиогенности. Проводили с псысгьа ¿кнейшж рн-зей, кроликов и низших приматов (макаки резус).

Ушам линии ЕА1_В/с вводили подкожно вакцину "Реваке В" з дозе 107 оса/мьшь. Контролем служила дзе груспн мьшей: гн?р-

вой аналогично вводили В<В (LIVP) в той же дозе, второй - растворитель оспенной вакцины. Кровь отбирали до иммунизации и ватем еженедельно, начиная с 7 суток после иммунизации. Антитела к HBsAg выявляли методом твердофазного ИФ анализа.Максимум антите-лээбразования к HBsAg приходился на 8 неделю со дня введения препарата вакцины "Реваке Б".

С целью подтверждения полученных результатов и количественной их оценки (с помощью принятой в мире системы оценки содержания антител к HBsAg в международных единицах (мЫЕ/мл - mIU/ml) -положительным считается сигнал»превышающий 10мШ/мл) были поставлены дополнительные эксперименты на мышах с использованием тест-системы для выявления антител к HBsAg фирмы "Abbott". Отбор крови у мьшей (беспородных и BALB/c) производили только на 8 неделе после введения "Реваке В" в дозе 2-4-107 ОСЕ/мышь. Результаты исследования показали, что защитный титр антител к HBsAg (>-J0 мМЕ/ш) был обнаружен у линейных шяей только при подкожном введении вакцины "Реваке В".

Антитела у кроликов определяли с помошью ИФ тест-системы фиркы "Abbott". Наиболызая индукция антител к HBsAg у кроликов наблюдалась при накожном введении вакцины в дозе 10б ОСЕ. Обнаруживали антитела к HBsAg 50Х животных, причем у 21% обнаруживался иммунный ответ, превышавши 100 мМЕ/мл. При введении оспенной вакцины индукции антител к HBsAg не наблюдалось.

Об индукции клеточного иммунного ответа у иммунизированных cno««iue стн

мыпек судили по спленоцитов пролиферировать при добавлении к нш H3s-. pre S2 (14-32) и ВОВ-антигеноь в PBTJJ. Пептид -pre-S2 (14-32) является синтетическим аналогом аминокислотной последовательности 14-32 а.к.рге-Б2-области БГВ. Мышам линии BALb/c подкожно вводили вакцину 'Тевакс В" или ВОВ (контроль) в дозе 2-4"Ю7 ОСЕ/мл, дополнительным контролем служили интактные мыши. Сплеяоцить выделяли из селезенок мышей стандартным методой на Q сутки после иммунизации. Постановку РБТЛ осуществляли стандартным методом, результаты представляли в виде ИСК по отношению величин имл/ыин в образцах с антигеном и без него (концентрации подобирали заранее). Было показано,что наиболее интенсивно про-лнферируют в ответ на симуляцию специфическими антигенами лимфоциты ,еьщелейные от мышей,иммунизированных вакциной "Реваке В".

Яинамику PBTJ1 изучали также на макаках. Трех обезьян накож-но иммунизировали вакциной "Реваке В" в дозе 107 ООЕ/ыл. Моно-нуклеарные клетки выделяли из гепаринизироЕанной венозной крови стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности фе-колл-верографина, кровь отбирали в в течение 112 суток. Показана, что иммунизация обезьян Макака резус вакшшой "Реваке В" приводит к возникновению специфического клеточного иммунного ответа на HBsAg и ВОВ у всех трех животных, при этем динамика ответа несколько различалась у каждого лшвотного. Максимальные ИСК приходились в основном на 5 -7 неделю с момента иммунизации.

Определение у макак антител к рге-22-области HBsA£ П"В про-аодили методом конкурентного ингибирогалия связывания антител с иммобилизованным антигеном. Для сенсибилизации твердей 'разы использовался ко.чьюгат пептида pre- S2 (.14-22) с бычьим сывороточным альбумином (ЕСА). Анти-pre 52-ачтитела выявлялись у 2 из 3 макак до 7-8 недели, впоследствии антитела обнаружены не были.

Антитела к HBsAg у макак выявить не удалось, что. вероятно, обусловлено невысокой кммуногенностью вакцины "реваке В" для иизаих приматоз.

Таким образом, вакцина против гепатита В "Реваке В" обладала специфической лммуногенностыо для лабораторных животных.

Полученные в ходе доклинических испытаний результаты позволили разработать Программу клинических испытаний на добровольцах. При ее рассмотрении и на основании результатов доклинических испытаний Комитет ШСВП Министерства здравоохранения принял решение о проведении клинических испытаний препарата.

3. Клиническое изучение препарата вакцины "Реваке В" на добровольцах. 3.1. Описание испытаний.

В качестве препаратов введения были использованы:

- вакцина гепатита В очиценная концентрированная рексмСа-нантная живая сухая для накежного применения "Реваке 2".

- вакцина оспенная хиьая сухая (НПО "Вириск". г. Томск).

- 'плацебо - растворитель оспенной вакцины «ивей сухой (НПО "Вирной", г. Томск).

- закцяна против гепатита В "Engerix 3" производства ритмы 3r.t t ft-Klein« Bloicgical:s ¡Бельгия). Лсепара? представляет собой 'г^ксчоннантную zvcxxeвую вакцину против гепатита Е, ссд-зрдалуг

уивекики <1 деза - СО чкг rSsAç!.

-е-

Ъ качестве добровольцев были отобраны лица в возрасте 18-40 лет Сзсители п. Кольцове и г. Новосибирска, имешле вакцинальные знаки). От прививок были отведены ляда, имеваие противопоказания '. согласно Программе испытаний. Серопозитивныг по паркерам НТВ не были включены в число добровольцев. Била выделена подгруппа лиц, имеЕЮв: антитела к HBsAg. Сформирована следующие группы:

Лчца е количестве 67 человек, когорта первоначально еводшш закишу "Реваке В" накожно в область плеча методом мнохестьеккс-го накалывания в дозе 5'106 ООЕ на человека, через 45 суток были разделены на 3 группы:

i-as группа - повторное введение вакцины "Реваке В" в той "же лове ;.3S человек - все мужчины, средний возраст - 20+2 года;-, £-ая группа - введение плацебо, накожно методом «нокесгвев-ногс накалывания - 15 человек (ьое мужчины, средний возраст -года). Сюда же организационно входила подгруппа, состоящая аз f> человек, имевши антитела к HBsAc до вакцинации, и наблюдаема« отдельно с целью выявления влияния вакцинации "Реваке В" на ранее сформированный уровень антител к HBsAg.

3-ья группа - введение вакцины "Engerix В" лицам, серонега-гх&иы по антитела« r. HBsAg после первичной вакцинации, внутри-«йв»чк> - 13 человек (все мужчины, средний возраст - 20+2 года), другие группы были представлены:

4~га: группа - лицам этой группы (25 человек - 19 мужчин/о .и-"., средний возраст 34+9 лет) вводили вакцину оспенную живую ■ ,;ууг- £ область плеча методам множественного накалывания в дозе . ОСЕ на человека.

-ая группа - в количестве 17 человек (16 кенвдн/1 мужчина, с;йдник ьозрзст - 35+2 лет), которым трехкратно вводили вакцину "Eriitrix В" ь качестве препарата сравнения внутримышечно трехкратно с иктерьалом 30 суток от каждого введения.

б-as группа - плацебо (25 чьловек. - 13. женщин/12 мужчин, средний возраст - ЗЫ& лет). Волонтерам этой группы однократно агодкли растворитель вакцины оспенной накожно в Ьбласгь плеча, методой множественного накалывания.

Осмотр вакцинированных всех групп осуществлялся в сроки и в порядке, указанные в Пр -ракме испытаний. Все добровольцы прошли ооыотр черев б месяцеЕ со дня последнего введения препаратов (отдаленное наблюдение). Привитые опытных групп были обследованы

на наличие HBsAg в крови, который обнаружен не был.

3.1. Результаты клинического обследования добровольцев (обтие у. местные реакции).

Введение вакцин "Реваке В" (первое - волонтерам 1-ой - 3-ей групп, второе - волонтерам 1-ой группы) и оспенной (4-ая группа) вызывало в организме привитых изменения, которые характеризовались местными первичными реакциями.

ОЗж реакции у вакцинированных "Реваке В" и оспенной вакциной отнесены к реакциям легкой степени. Повторное введение "Реваке такие вызывало общую реакцию легкой степени. Не было отмечено повышения температуры, изменения общего состояния, аллергических реакций. У лиц. получивших вакцину "Engerix В" и плацебо, общие и местные реакции не выявлялись. По продолжительности местных реакций, по их проявлению в виде инфильтрата у кежкых вакцинальных элементов был сделан вывод о меньшей оеактс-генности вакцины "Реваке В" по сравнению с оспенной вакшшок. У лиц, получивших только вакцину "Engerix В" (5 группа) и плацебо (б группа), не было выявлено каких-либо общи и местных реакций.

3.2. Результаты изучения вируса, выделенного от добровольцев.

Материал зля исследований (содержимое везикул)," выделенный от дЕух добровольцев на 4 сутки после-первого введения вакцины "Реваке В" был клонирован нз культуре клеток CV-1 под агаровым покрытием и исследован на экспрессию HBsAg. Обнаружено, что 75Z ионов вирусного материала от первого добровольца и 62,52. клонов от второго зкепрессирумт KBsAg.

Вз основе этих результатов были отобраны клоны,содержащие и несодерлащк ген БГВ, которые были размножены на ХАО РКЭ и очищены. Полученные из них препараты ДНК гидролизовали рестриктазой Hlnd IM. гидролмзаты подвергали электрофорезу в агароэном геле. В качестве контроле^ использовали Hind ]I1-гидролизаты ДНК исходного клона ВОВ (итзмм L.IVP) и эталонного штамма 'Тевакс В". Рестрикционный анализ препаратов ДНК свидетельствовал о соответствии клонов эталонному штамму вакцины "Реваке В" - для экс-прессируквдх HBsAg и исходному штампу ВОВ - для иеэкспрессирую-щих. Часть вирусной популяции, лишенная встроенного гена ЕГВ была препаративно наработана на ХАО РКЭ и дополнительно исследована с помощью лабораторных показателей безвредности на животных,

- КЗ-

результаты показали, что эта часть вирусной популяции нетоксична, специфически безвредна, не обладает некротической и нейропа-тогенвой активностью.

Другие результаты, полученные в'ходе клинических испытаний, также показали безопасность вакцины "Реваке В" (авторскими не являются, однако были получены под руководством соискателя).

3.3. Изучение индукции гуморального специфического иммунного ответа у добровольцев.

Антитела против HBsAg определяли с помогаю экспериментальной Ш тест-системы для выявления антител к HBsAg. После первого введения вакцины "Реваке В" антитела к КЬсАг были обнаружены на ЭО сутки у 11.Эй привитых (7 из 62 обследованных) - табл.1.

Е подгруппе добровольцев, однократно привитых вакциной "Ре-вакс В", у которых антитела к HBsAg были обнаружены до вакцинации, отмечено двукратное увеличение уровня антител к HBsAg, что свидетельствовало о выраженной эффекте усиления.

В 1-ой группе повторное введение вакцины "Реваке В" приводило к увеличение числа лиц, ееропозитивкых по антителам к HBsAg до 522 (19 из 3?) на 75 сутки и до 602 (22 из 37) на 185 сутки.

Во 2-ой группе процент сероконверсии по антителам к KBsAg составил 102 (1 иа 10), не изменившись впоследствии.

В 3-ей группе количество лиц, имевших антитела к HBsAg, на ЭО сутки после введения "Engerix В" (75 сутки) достигло 53,87. (7 из 13), впоследствии снизившись до 23,IX (3 из 13) к 185 суткам.

В 4-ой группе прививка вакциной оспенной дивой сухой не приводила к существенным изменениям в отношении антител к"HBsAg.

В 5 группе определение антител к HBsAg- проводили только после завершения курса вакцинации. На 33 су?га после введения третьей (последней) дозы вакцины "Engerix В" количество лиц, амевлза антитела к HBsAg. составило 647. (11 из 17), иа 60 сутки - 621 (10 иа 16).В 6-ой группе лиц с антителами к HB:-.Ag не было.

Таким образом, при двукратном введения вакцины "Реваке В" достигался примерно такой же уровень сероконверсии, что и при трехкратной вакцинации "Engerix S", несмотря на б алее осиянный г. порвем случай уровень антителооСрззсЕаиня к HEcAj?. Необходимо хс£о отметить, что группа, вакцинированная препаратом "Engerix .ы rr-ynrraj состояла из ä-h:u*.h '.при одном' мужчине). тогда .-г'л-.утъй' пг-.*пссатсм "Реваке 5" «l-j-ьи гсут.пы) - только «ух-

чнни. Имеются данные, показывавшие, что уровень антител образования к HBsAg после вакцинации "Engerix В" у женщин в 3 раза выше такового у мужчин. Возможно именно этим объясняются результаты наличия более высоких титров антител к HBsAg в 5-ой группе по сравнению с результатами, полученными в 1-ой группе.

Полученные результаты в 3-ей группе позволили также сделать вывод о наличии иммунного праймирования вследствие введения испытуемого препарата, что становится очевидным при последующем однократном введении вакцины "Engerix Б".

Сбкее количество лиц 1-ой группы, отреагировавших на НВаАр специфическим инунным ответом, составило 28 из 37 - 72Х (лица, у которых был выявлен положительный и гуморальный, и клеточный ответ). Следует вместе с тем подчеркнуть, что процент сероконвер-сии по антителам к HBsAg возможно и выше (положительным считается ответ >-10 ыМЕ/мл), ибо чувствительность использованной нами отечественной тест-системы - (30+3) мМЕ/мд.

Определение антител к вирусу осповакцины проводили с помощью И$> тест-системы. Изучение специфического иммунного ответа на ВОВ (табл.2) дало следующие результаты: до вакцинации антитела к ВС® имели 13,42 добровольцев (9 из 67), на 30 сутки после введения вакцины "Реваке В" - 88Х (59 и? 67).

В 1-ой группе ревагащнация испытуемым препаратом привела к росту количества серопозитивкых по антителам к ВСВ - до 1001 (37 из 37) к 75 суткам); до вакцинации было 18Х серопозитивньк (7 иг 39 добровольцев впоследствии составивших эту группу).

Во 2-ой группе выявлено 86,6t серопозитивных на 60 сутки от начала вакцинации (13 из 15) ло вакцинации - 6,BS (1 кз 1D;.

В 3-ей группе антитела к ВОВ обнаруживали 92,3 Z волонтеров к 75 суткам (12 из 13), до вакцинации - 7,71 (: из 53,.

На 185 сутки существенных изменений в динамике антктелооб-разозания к ВОВ в этих группах не наблюдалось.

В 4-ой группе из добровольцев, однократно привитых вакциной оспенной живой сухой, до вакцинации антитела к ВОВ были выявлены у 20% (6 из 25). После вакцинации ан~итела к ВОЗ обнаруживались на 30 и 60 сутки'у 02Z (23 из 25) добровольцу.

•В 5-ой группе определение антител к ВСВ не проводили. В 6-ой группе введение растворителя не приводило к изменениям б антктелообразовании к ВС®.

-12- Таблица 1

Динамика образования антител к НЕзАг у добровольцев

Дни наблюдений .

0 30 75 | 185

Сероконзерсия (в 2) 0* (0-5) 11.3л (5-22) 1 1 1 *

Среднегеометрические значения, ШЕ/ил >30* 34,5+7,1* |

1 группа Св У.) Среднегеаметриуеские значения, мМЕ/мл осо-з) >30 *5,4С«-32>: 52 С34-ее) 32,415,5 | 43,118.5 1 £0(48-75) 40,2+8,1

2 гоуппз Сгрсконверсйл (в 2) 0 (0-31) 1 10 1 ю-** (С-44) I ' (0-44) 10 (0-44)

Среднегеометрические значения, мШ-Ума >30 , 31.5+6,5 31,5+6,4 31.516.5

3 группа Серскоязерсия (в 2) 0 (0-25) 7,7 (0-36) 53,8 (25-81) 23,1 (в-ё1)

Среднегеометрические гначення.ыИЕУыд >30 41,618.6 42,5117,1 50.1110,3

4 груша Сероксяверсия (в 2) 16 (4-36) 15 (4-36) 16** (4-56) 16 .(4-36)

Среднегеометрические значения,ыМЕ/мл 94,2118,9 93,25131,3 87,3117,5 89,7117,9

б группа*** Серокснверсия (в I) 0 (0-20) 64 (33-86) 62 (35-85) -

Среднегеометрические значения. мЫЕ/т >30 103,1130,9 100,01X3.1 -

б группа Сереконверсия Св 2) С (0-14) 0 (0-14) 0 С0-14) 0 (0-20)

Среднегеометрические значения .мйУкд >30 >30 >30 >30

* - данные для добровольцев, впоследствии составивших 1. 2 и

3 ггупту; ** - процент сероконверсии на 60 сутки;

*** - краЕЬ отбирали на ЭО и 60 сутки после третьей вакцинации;

В скобках приведены доверительные интервалы. Среднегеометрические значения расчмтаяы только для серопсзитивных по к ННаА? волонтеров и приведены со среднеквадратнчес-лэс! спаоиешимн (195).

Таблица £

Динамика образования антител к ВОВ у добровольца

Дни наблюдений

0 30 I 75 185

Серокснверсия (в ") 13,4* (6-24)* 88« (78-95)*

Среднегеометрические значения, мМЕ/ш 128,4+25,71 «20,8+104,!

1 группа | Серокснверсия (в 2) | 18 | (5-34) а2 (78-98) 100 (90-100) 100 (90-100)

Среднегеометрические значения,мЫВ/мл 132,3+30,4 541,2+216,^ ; 3140+791 3520+810

2 группа Серокснверсия (б 7.) 6,6 (0-30) 86,6 (60-98) 86,6 ** (75-100)** 80 (52-95)

Среднегеоме триче с кие значения.мМЕ/мл 1СШ23 510+112 494+109 441,4+97

3 группа Сероконверсия (в X) 7.7 (0-36) 92,3 (64-100) 92,3 (64-100) 92.3 (64-100)

Среднегеометрические значения,мЫЕ/мл 100121 505,6+'01, . 482+96 463+93

' 4 группа Сероконверсия (в *) 20 . (7-41) 82 (74-99) 92 ** (74-99)** 92 (74-98)

Среднегеометрические значения,ыЬЕ/кл 145.3+34,9 1318+316 1240+298 1054+474

6 группа Сероконверсия (в X) 20 (7-41) 20 (7-41) 16 ** (4-36)** 29 (10-56)

Среднегеометрические значения,мНЕ/мл 158,1+33.2 114,8+24,1 128,8+27,1 148,8+31

* - данные для добровольцев, впоследствии составивших 1, 2 и 3 группу;

** - процент сероконверсия на 60 сутки;

В скобках приведены доверительные интервзлы. Среднегеометрические значения расчитаны только для серопоэитив.чых пс антителам к ВОВ волонтеров и приведены со среднеквадратически1-ми отклонениями (195).

Гакиы образом, однократное введение добровольцам вакцины "Реваке В" и оспенной вакцины живой сухой приводило примерно к одинаковому уровню сереконверсии по антителам к ВОВ, титр антител во втором случае, однако, выше. Повторное введение вакцины 'Тевакс В" приводило к образованию значительно более высокого титра антител к ВОВ по сравнению с титром, достигаемым в результате однократного введения оспенной вакцины.

3.4. Изучение клеточного иммунного ответа у добровольцев.

■Определение спонтанной пролиферации и бласттрансформирувдй активности лиироцигов на воздействие in vitro штогенон в результате вакцинаши проводили с целью оценки функциональной активности иммуноксыпетентннх клеток.

Постановку РВТЛ ссугестзляля стандартным методом, использовали ранее подобранные концентрации митогенов и антигенов.

Первичное введение "Реваке В" приводило к активации Т-- клеточного иммунитета, что проявилось в повышении уровня спонтанной пролиферации мононукле арных клеток более чей вдвое (на 10 сутки) с постепенным снижением к 30 суткам. После ревакцинирования показатели неспецифической активации соответствадм таковым до вакцинации во 2-ой и 3-ей группах, оставаясь "несколько повышенными в 1-ой. Результаты определения нитогенаависимой бласттрансформа-ц$ш до и после вакцинации (ревакцинации) добровольцев свидетельствовала в целом об умеренном воздействия вакцины "Реваке В" на иммунную систему.

Была изучена также тенденция в развитии антигенспецифичес-кого клеточного иммунного ответа.Результаты изложены в таблице 3, аа положительный ИСК для HBsAg принимался ответ >~1,4, для ВОВ -достоверно превышавший ИСК до вакцинации.

У 262 (17 из 65 обследованных) добровольцев до вакцинация обнаруживались сенсибилизированные к HBsAg лимфоциты, у 33S (21 аз 65) - к все.

Первое введение препарата сопровождалось повыоением уровня спонтанной пролиферации лимфоцитов, при этом средние показатели ИСК на специфические антигены несколько снизились. Количество ответивших на HBsAg лиц составило 2S2 (1? из 61), а на ВОВ -£6,51 (16 из 60). Вместе с этим выявлен специфический ответ у зелентеров. до вакцинации не обнаруживавших положительный ИСК на ,-„:тигены : для HBsAg и для ВСЕ - 24Z (11 из 45).

После повторного введения препарата "Реваке В", когда признаки неспедафической активации исчезают, увеличивается средний показатель ИСК на антигены, а-количество лиц 1-ой группы,ответивших на HBsAg составило ЭТ.82 (14 из 37), из них не имели положительный ИСК на HBsAg до вакцинации - 307. (8 из 27); для ВС8 зть показатели составили 51,3% (19 из 37) и 607. (12 из 20) соответственно. Во 2-ой группе средние ИСК на HBsAg продолжали снижаться.

В 3 группе средний показатель ИСК на антигены заметно снизившись на SO сутки, достигал первоначального уровня для HBsAg и несколько превысил его для ВОВ на 75 сутки.;

Таким образом, наибольшее количество волонтеров, реагировавших клеточной пролиферацией на KBsAg и ВОВ выявлено среди ре-вакцинированных препаратом "Реваке Е".

Таблица 3

КО; под действием специфических антигенов

I-!---1-!-!-1

I Группы | до вакцкнащ 30 сутки | 60 сутки | 75 сутки j

¡волонте- (-;-i-1-н-!-1-:-!

1 ров | ВСВ |HBsAg| ВОВ ¡HBsAg | BOB |HBsAg] ВС® ¡HBsAgj j-1-i-1-1-s_i_:_,_i_|

|1 группа 2.3 1.57 1.68 1.16 j

! !

!2 группа 1.35* 1.21* 1.15* 1.17* 1.5 0.85 0.98 1.1 I

! ' 1

|3 группа 0.9 0.81 1.44 1.4 |

I_|

данные для добровольцев,впоследствии составивших 1-3 гр.

Таким образом, результаты клинической апробации вакцины "Реваке В" на ограниченной группе добровольцев говорят о том, что препарат вызывает слабые местные реакции, умеренно реактеге-нек, безвреден, не обладает побочным действием, достаточно имму-ногенен. Более выражений иммунный ответ наблюдается при двукратном введении препарата. Вакцина "Реваке В" практически не уступает по сероконверсии зарубежному препарату однонаправленного действия (дрожжевой субъеднйичной вакцине "Engerix В"). Испытуемый препарат вызывает менее выраженные местные реакции по сравнению с вакциной оспенной живой сухой, практически не уступая по иммуногенности этому препарату.

1. Разработана технология получения вакцины против гепатита В "Реваке В" на основе рекомбинантного штамма ВСЕ B7.5C2-S. Оформлена нормативно-техническая документация.

2. Отработана технологическая схема производства этой вакцины в проыьшенных условиях, на основе которой изготовлены экспериментально-производственные серии вакцины "Реваке Е".

3. Впервые показана иммуногенноеть дивой рекомбинаитной сс-пенно-гепатигной вакцины на добровольцах в виде индукции гуморального и клеточного ответа на поверхностный антиген ВГ8.

4. Продемонстрированы безопасность и сниженная по сравнению о исходный втаммом BOB (LIVP) реактогенность рекомбинаяткой вакцины против гепатита Б "Реваке 3" для людей.

5. ЯссдедоБано вяруссодерладее везикулярное содержимое у добровольцев, вакцинированных препаратов "Реваке В". Показано, что большинство клонов вакцинного вируса содержат встроенную последовательность ДНК ВГВ и зкспрессируют НБзАг, остальная часть вирусной популяции идентична исходному штамму ЕС© (L1VP) и является безвредной.

Результаты диссертации опубликована в следующих.работах:

1. Беляев A.C., Дмитриев И.П.. Игнатьев Г.Ы.. Ммгенко Г-А.. Путикцеза Н.И.. Сабиров А.Н.. Самуков В.В., Семенова Л.Н., Шю-. сов А.Д., Рукавишников Ы.Ю. Муратов П.Ю., Ммкрвкоа H.H., Еевля-гинаХР., Константинов А.П., Сандахчиев Л.С. Рекомбинантный вирус осповакцшш, экспрессируюсий средний pre 32-3-белок оболочки ¿¡яруса гепатита В. Индукция гуморального и клеточного иммунитета ара ишуккзации лабораторных ашвотких /У Докл.АН СССР. ЮЭО. Т.334. N2. С.488-491,

2. Ыуратсь H.D., Дмитриев И.П., Беляев A.C. Изучение имму-ко- биологических свойств рекоыбюштшх штампов осповакцины is7,5S2-2 а у?.5с).эксярессирую1Ш антигены вируса гепатита В,-Тезисы докладов Есесавзнсгс семинара "Уолокулярная биология и жздцша". Ленинград. 1980. С. 57.

3. Зсля»з А.0., Дмитриев И.П., Муратов П.Ю.. Фролов И.В.. <Чч\:;ш:>:га С. л., Усманов 'А. У,.. Агапов Е.В.. Кслкхалов A.A.. Не-

:.Ъ.. Сандахчиев Л.С. Зектоо осповакцины. «сак вектор для

создания вакцин. Некоторые итоги и перспективы. - Тезисы докладов V конференции РАЛ "Новые направления биотехнологии". Пушино. 1992. С.51.

4. Муратов П.Ю., Дмитриев Л.П., Беляев A.C. Иммунобиологические исследования рекомбинантной вакцины лрогив гепатита В "Реваке Б". В кк.: Материалы I съезда иммунологов России. РНСМ. Новосибирск. 1932. С.319.

5. Муратов П.Ю., Дмитриев К.Л., Беляев A.C., Рукавишников Ы.Ю., Нетессв С.В. Зйшая рекомбиначгная вакцина "Реваке В" для профилактики гепатита В и способ ее получения // Заявка на патент N5066933, дата приоритета 16.07.92 г.