Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств и эпитопный анализ аутоантител с помощью синтетических и рекомбинантных фрагментов β1-адренорецепторов человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рулева, Наталья Юрьевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1.Р-Адренергические рецепторы сердца человека 7 1.1.1 .Роль (3-адренорецепторов в нейрогормональной передаче сигнала, классификация, адренорецепторы миокарда

1.1.2.Механизмы функционирования (3-адренорецепторов

1.1.2.1 .(З-Адренорецептор-опосредованная сигнальная система

1.1.2.2.Регуляция (3-адренорецепторов

1.1.3 .Структура (3-адренорецепторов

1.1.3.1 .Общие сведения

1.1.3.2.Структура активного центра

1.1.3.3.Полиморфизм (3-адренорецепторов

1.2.(3-Адренорецепторы миокарда при хронической сердечной недостаточности '

1.2.1.Патогенное воздействие на кардиомиоциты хронической активации симпато-адреналовой системы

1.2.2.Изменения в |3-адренергической сигнальной системе кардиомиоцитов

1.3 .Аутоиммунные реакции и сердечная недостаточность

1 ААутоантитела к Р1 -адренорецепторам человека

1.4.1 .Свойства аутоантител in vitro

1.4.2.Физиологическая роль аутоантител

1.5.Эглин С как вектор для экспрессии белков и пептидов

1.6.3аключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1.Синтез пептидов

2.2.Получение рекомбинантного химерного белка эглин С-фрагмент pi-адренорецептора

2.3 .Электрофорез в ПААГ по (Laemmli, 1970)

2.4.Аутоантитела к р1-адренорецепторам человека

2.5 .Поликлональные антитела и конъюгаты

2.6.Моноклональные антитела и конъюгаты

2.7.Иммуноферментный анализ

2.8.Иммуноферментный анализ с использованием системы стрептавидин-биотин для иммобилизации пептида

2.9.Получение аффинных сорбентов с рекомбинантным химерным белком

2.10.Определение связывающей емкости аффинных сорбентов с химерным белком бетч-методом

2.11 .Определение концентрации белков

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1.Взаимодействие аутоантител с химически синтезированными фрагментами второй внеклеточной петли (31 -адренорецептора

3.2.Взаимодействие аутоантител с рекомбинантным химерным белком

3.3.Характеристика аутоантител к (31 -адренорецептора в сыворотке крови человека

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение свойств и эпитопный анализ аутоантител с помощью синтетических и рекомбинантных фрагментов β1-адренорецепторов человека"

Р1 -Адренорецепторы, в частности, локализованные на кардиомиоцитах, относятся к семейству в белок-сопряженных рецепторов и участвуют в передаче сигналов от симпато-адреналовой системы. Связываясь с нейромедиатором - норадреналином, выделяемым симпатическими нервными окончаниями внутри миокарда, (31-адренорецепторы стимулируют аденилатциклазу, что приводит к накоплению ц-АМФ в кардиомиоците и, в конечном итоге, к усилению сократимости сердца. Передача сигнала осуществляется при участии О белков, в первую очередь Обсс.

Известно, что длительная активация (31 -адренорецепторов за счет повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция может приводить к перерождению кардиомиоцитов и развитию сердечной недостаточности. В ответ на повышенный синтез катехоламинов при сердечной недостаточности происходит также десенситизация (31-адренорецепторов кардиомиоцитов, что в конечном итоге приводит к дальнейшему прогрессирующему нарушению сократимости сердца. В последнее время полагают, что, помимо норадреналина, хроническую патогенную стимуляцию кардиомиоцитов могут вызывать и аутоантитела к (31-адренорецепторам, впервые выявленные при нарушении регуляции деятельности сердца. Предполагают, что такие антитела могут стабилизировать активное состояние рецептора и играть существенную роль в происхождении и развитии сердечной недостаточности.

Целью настоящей работы является изучение иммунохимических свойств и эпитопный анализ аутоантител к ¡31 -адренорецепторам человека.

Для достижение этой цели были поставлены следующие задачи: 1 .Провести картирование антигенного эпитопа для аутоантител с помощью ряда химически синтезированных пептидов, соответствующих различным фрагментам второй внеклеточной петли рецептора.

2.Исследовать влияние пространственных факторов на связывание аутоантител при помощи рекомбинантного химерного белка с фрагментом рецептора.

3.Охарактеризовать аутоантитела к (31-адренорецепторам в сыворотке крови человека.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рулева, Наталья Юрьевна

Выводы

1. При картировании второй внеклеточной петли [31 -адренорецептора человека (197-222) с помощью химически синтезированных фрагментов установлено, что основным местом связывания аутоантител является последовательность (204-210).

2. С помощью рекомбинантного химерного белка с фрагментом рецептора показано, что вторая внеклеточная петля (31-адренорецептора человека не содержит дополнительных конформационных эпитопов для связывания аутоантител.

3. С помощью разработанной тест-системы для определения аутоантител к

31-адренорецепторам на основе химически синтезированных и рекомбинантного фрагментов рецептора показано, что аутоантитела относятся к в и М иммуноглобулинам и являются низкоаффинными антителами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рулева, Наталья Юрьевна, Москва

1. Вейко В.П., Осипов A.C., Шехтер И.И., Буленков М.Т. и др. Химический синтез гена ингибитора протеиназ (эглин С) без использования Т4-ДНК-лигазы и его экспрессия в E.coli. 1995; 21(№5): 354-358.

2. Дзыбинская Е.В., Тоневицкий А.Г., Рулева Н.Ю., Козлов И.А. Аутоиммунизация к адренергическим рецепторам миокарда, как фактор риска при операциях по поводу ишемической болезни сердца (ИБС). Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, 2001, №3, стр. 105.

3. Красникова T.JL, Габрусенко С.А. ß-Адренергические рецепторы сердца в норме и при сердечной недостаточности. Успехи физиологических наук, 2000, №2, стр.35-50.

4. Рулева Н.Ю., Егорова Т.Г., Люкова Т.К., Домогатский С.П. Количественное определение иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови человека на микроколонках с иммобилизованным белком G. Депониров. В ЦМБ, № Д-25058 от 19.03.1996.

5. Фибих X., Клейст X. Определение аффинности антител. В кн. Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля. М., Медицина, 1987: 4257.

6. Benovic J.L., DeBlasi A., Stone W.C., et al. |3-Adrenergic receptor kinase: primary structure delineates a multigene family. Science. 1989; 246: 235240.

7. Birnbaumer L., Abramowitz J., Brown A.M. Receptor-effector coupling by G proteins. Biochim Biophys.Acta. 1990, 1031: 163-224.

8. Bourne H.R. How receptors talk to trimeric G proteins. Curr.Op.Cell Biol. 1997,9:134-142.

9. Bradford M. A rapid and sensitive quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 1976; 72: 248-254. Braunwald E., Bristow M.R. Congestive heart failure: fifty years of progress. Circulation. 2000, 102: IV-14-IV-23.

10. Bristow M.R.,Hershberger R.E., Port J.D. et al. betal- and beta2-adrenergic receptor mediated adenylate cyclase stimulation in nonfailing and failing human ventricular myocardium. Mol.Pharmacol. 1989, 35: 295-303.

11. Bristow M.R. Mechanism of action of beta-blocking agents in heart failure. Am.J.Cardiol., 1997, 80(11A): 26L-40L.

12. Brodde O.E. betal and beta2-adrenoceptors in the human hearts: Properties, function, and alterations in chronic heart failure. Pharmacol.Rev.199i; 43: 203-242.

13. Brodde O-E., Bouscher R., Tellkamp R., et al. Blunted cardiac responses to receptor activation in subjects with Thrl64Ile (^-adrenoceptors. Circulation. 2001; 103: 1048-1050.

14. Caforio A.L.P., Stewart J.T., Bonifacio E., Burke M. et al. Inappropriate major histocompatibility complex expression on cardiac tissue in dilated cardiomyopathy. J.Autoimmun. 1990; 3: 187-200.

15. Caforio A.L.P., Bonifacio E., Stewart J.T., Neglia D. et al. Novel organ-specific circulating cardiac autoantibodies in dilatted cardiomyopathy.

16. J. Am.Coll.Cardiol. 1990a; 15: 1527-1534.

17. Chien K.R. Genomic circuits and the intergrative diology of cardiac diseases. Nature. 2000; 407:227-232.

18. Cetta F., Michels V. The autoimmune basis of dilated cardiomyopathy. Ann.Med. 1995,27: 169-173.

19. Clark R.B., Kunkel M.W., Friedman J. Et al. Activation of cAMP-dependent protein kinase is required for heterologous desensitization of adenylyl cyclase in S49 wild-type lymphoma cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988; 85: 1442-1446.

20. Dixon R.A.F., Sigal I.S., Candelore M.R., Register R.B. et al. Structural features required for ligand binding to the ß-adrenergic receptor. EMBO J. 1987; 6: 3269-3275.

21. Dixon R.A.F., Sigal I.S., Rands E., Register R.B., et al. Ligand binding to the ß-adrenergic receptor involves its rhodopsin-like core. Nature. 1987a; 326: 73-77.

22. Dohlman H.G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. A family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Biochemistry 1987, 26: 26572664.

23. Dohlman H.G., Caron M.G., DeBlasi A., Frielle T. and Lefkowitz R.J. Role of extracellular disulfide-bonded systeines in the ligand binding function of the ßj-adrenergic receptor. Biochemistry. 1990; 29: 2335-2342.

24. Dorffel W.V., Felix S.B., Wallukat G., Brehme S. et al. Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy. Circ. 1997; 95: 1994-1997.

25. Dwyer M.A., Lu W., Dwyer J.J., Kossiakoff A.A. Biosynthetic phage display: a novel protein engineering tool combining chemical and genetic diversity. Chem. Biol. 2000; 7: 263-274.

26. Elenkov I.J., Wilder R.L., Chrousos G.P., Vizi E.S. In: The sympathetic nerve an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system. Pharmacol. Rev. 2000; 52: 595-638.

27. Feldman R.D. Adrenergic receptor polymorphysms and cardiac function (and dysfunction). Circulation .2001; 103: 1042-1043.

28. Freedman N.J., Liggett S.B., Drachman D.E., Pei G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. Phosphorilation and Desensitization of the Human P!-Adrenergic Receptor. J.Biol.Chem. 1995,270: 17953-17961.

29. Freedman N.I. & Lefkowitz. Desensitization of G protein-coupled receptors. Rec.Progr.Horm.Res., 1996, 51: 319-353.

30. Frielle T., Collins S., Daniel K.W., Caron M.G. et al. Cloning of the cDNA for the human pradrenergic receptor. Proc.Natl.Acad. Sci. 1987; 84: 7920-7924.

31. Fraser C.M. Site-directed mutagenesis of P-adrenergic receptors. J.Biol.Chem. 1989; 264: 9266-9270.

32. Fu L.X., Magnusson Y, Bergh C.H. et al. Localization of a functional autoimmune epitope on the muscarinic acetylcholine receptor-2 in patient with idiopathic dilated cardiomyopathy. J.Clin.Invest. 1993, 91: 1964-1968.

33. Fukuta S, Yoshinaga T, Yamakawa K. et al. Dilated cardiomyopathy with special reference to humoral immunity. Jan.Circulation J., 1992, 56: 10731080.

34. Gauthier C., Tavernier G., Charpentier F., Langin D., LeMarec H., Functional p3-adrenoceptor in the human heart. J.Klin.Invest. 1996, 98:556-562.

35. Green S.A., Turki J., Innis M., et al. Ammo-terminal polymorphisms of the human beta 2-adrenergic receptor impart distinct agonist-promoted regulatory properties. Biochemistry. 1994; 33: 9414-9419.

36. Hausdorff W.P., Caron M.G., Lefkowitz R.J. Turning off the signal: desensitization of |3-adrenergic receptor function. FASEB J. 1990; 4: 2881-2889.

37. Hawthorn M.H., Broadley K.J. Evidence from use of neuronal uptake inhibition that 31 -adrenoceptors, but not (32-adrenoceptors, are innervated. J.Pharm.Pharmacol. 1982,34:664-666.

38. Hopp T.P. and Woods K.R. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1981; 78: 3824-3828.

39. Horsfall A.C., Rose L.M. Cross-reactive maternal autoantibodies and congenital heart block. J.Autoimmun. 1992, 5: 479-493.

40. Jahns R., Boivin V., Siegmund Ch., Inselman G., Lohse M.J., Boege F. Autoantibodies activating human beta 1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 1999; 99: 649-654.

41. Jahns R., Boivin V., Siegmund C. et al. Activating beta-1-adrenoceptor antibodies are not associated with cardiomyopathies secondary to valvular or hypertensive heart disease. J.Am.Coll.Cardiol. 1999a, 34: 1545-1551.

42. Jahns R., Boivin V., Krapf T., Wallukat G. et al. Modulation of betal-adrenoceptor activity by domain-specific antibodies and heart failure-associated autoantibodies. J.Am.Coll.Cardiol. 2000, 36: 1280-1287.

43. Jameson B.A. and Wolf H. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput.Applic.Biosci. 1988; 4: 181.

44. Jones D.T., Reed R.R. Molecular cloning of five GTP-binding protein cDNA species from rat olfactory neuroepithelium: the large and small forms of Gs and olfactory-specific G-protein, G off. J.Biol.Chem. 1987, 265: 4507-4514.

45. Johnson M. The P-Adrenoceptor. Am.J.Respir.Crit.Care Med., 1998, 158: 146-153.

46. Kaneko K., Kanda T., Yamauchi Y., Hasegawa A. et al. C-reactive protein in dilated cardiomyopathy. Cardiology 1999, 91: 215-219.

47. Kuschel M., Zhou Y.Y., Spurgeon H.A., et al. P2-Adrenergic cAMP signalling is uncoupled from phosphorylation of cytoplasmic proteins in canine heart. Circulation. 1999; 99: 2458-2465.

48. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London). 1970; 227: 680-685.

49. Landzberg J.S., Parker J.D., Gauthier D.F., Colucci W.S. Effects of myocardial a 1-adrenergic receptor stimulation and blocade on contractility in humans. Circulation 1991, 84: 1608-1614.

50. Liggett S.B. Beta(2)-adrenergic receptor pharcogenetics. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000; 161: S197-S201.

51. Limas C.J., Goldenberg I.F., Limas C. Autoantibodies against beta-adrenoceptors in human idiopathic dilated cardiomyopathy. Circ.Res. 1989; 64: 97-103.

52. Lu W.Y., Starovasnik M.A., Dwyer J.J., Kossiakoff A.A., Kent S.B., Lu W. Deciphering the role of the electrostatic interactions involving Gly70 in eglin C by total chemical protein synthesis. Biochemistry. 2000; 39: 3575-3584.

53. Magnusson Y., Marullo S., Hoyer S., Andersson B., et al. Mapping of a functional autoimmune epitope on the beta 1-adrenergic receptor in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J.Clin.Invest. 1990; 86: 1658-1663.

54. Magnusson Y., Wallukat G., Waagstein F., Hjalmarson A., Hoebeke J. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization ofantibodies against the betal-adrenocepter with positive chronotropic effect. Circulation. 1994; 89: 2760-2767.

55. Matsui S., Fu M.L.X., Katsuda S., et al. Peptides derived from cardiovascular G-protein-coupled receptors induce morphological cardiomyopathy changes in immunized rabbits. JMCC 1997; 51: 321-324.

56. Maudsley S., Pierce K.L., Zamah A.M., et al. The ¡32-adrenergic receptor mediates extracellular signal-regulated kinase activation via assembly of a multi-receptor complex with the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 2000; 275: 9572-9580.

57. Merrifield R.B. Solid phase peptide synthesis. I. J.Am.Chem.Soc. 1963; 85:2149-2154.

58. Muller J., Wallukat G., Weng Y.-G., Dandel M. et al. Weaning from mechanical cardiac support in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. Circ. 1997; 96: 542-549.

59. Naparstek Y., Plotz P.H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu.Rev.Immunol. 1993; 11: 79-104.

60. Paque R., Gaunt C., Nealon T., Trousdale M. Assessment of cellmediated hypersensitivity against Coxsackie virus B3 indused myocarditisutilizing hypertonic sault extracts of cardiac tissue. J.Immunol. 1978, 120: 16721678.

61. Pitcher J., Lohse M.J., Codina J., et al. Desnsitization of the isolated (32-adrenergic receptor kinase, cAMP-dependent protein kinase, and protein kinase C occurs via distinct molecular mechanisms. Biochemistry. 1993; 31: 3193-3197.

62. Podlowski S., Wenzel K., Luther H.R., et al. (31-Adrenergic gene variations: a role in idiopathic dilated cardiomyopathy? J. Mol. Med. 2000; 78; 87-93.

63. Reishaus E.M., Innis N., Maclntyre N., Liggett S.B. Mutations in the gene encoding for the (32-adrenergic receptor in normal and asthmatic subjects. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1993; 8: 334-339.

64. Ristic A.D., Maisch B. Cardiac rhythm and conduction disturbances: what is the role of autoimmune mechanisms? Herz 2000, 25:181-188.

65. Robishaw J.D., Smigel M.D., Gilman A.D. Molecular basis for two forms of the G protein that stimulates adenylate cyclase. J.Biol.Chem. 1986; 261: 9587-9590.

66. Sabbah H.N. Apoptotic cell death in heart failure. Cardiovasc. Res. 2000, 45: 704-712.

67. Sanderson J.E., Koech D., Iha D., Ojiambo H.P. T-lymphocyte subsets in idiopathic dilated cardiomyopathy. Am.J.Cardiol. 1985, 55: 755-758.

68. Schulze K., Becker B.F., Schauer R et al. Antibodies to ADP-ATP carrier -an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy-impair cardiac function Circulation 1990, 81:959-969.

69. Seemuller U., Eulitz M., Fritz H., Strobl A. Structure of the elastase-cathepsin G inhibitor of the leech Hirudo medicinalis. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1980; 361: 1841-1846.

70. Staudt A., Schaper F., Stangl V. et al. Immunohistohemical changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorbtion therapy and subseguent immunoglobulin substituon. Circulation. 2001, 103: 2681-2686.

71. Stiles G.L., Strasser R.H., Lavin T.N, Jones L.R et al. The cardiac ß-adrenergic receptor. J.Biol.Chem. 1983; 258: 8443-8449.

72. Strader C.D., Candelore M.R., Hill W.S., Dixon R.A.F., Sigal I.S. Identification of two serine residues involved in agonist activation of the ß-adrenergic receptor. J.Biol.Chem., 1989, 264: 13572-13580.

73. Strader C.D., Sigal I.S., Candelore M.R., Hill W.S., Dixon R.A.F. Conserved aspartic residues 9 and 113 of the ß-adrenergic receptor have different roles in receptor function. J.Biol.Chem., 1988, 263:10267-10271.

74. Tota M.R., Candelore M.R., Dixon R.A.F., Strader C.D. Biophysical and genetic analysis of the ligand binding site of the beta-adrenoceptor. Trends Pharmacol. Sei. 1991; 12: 4-6.

75. Turki J., Lorenz J.N., Green S.A., et al. Myocardial signaling defects and impaired cardiac function of a human beta 2-adrenergic receptor polymorphism expressed in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996; 93: 1048310488.

76. Ungerer M., Bohm M., Elce J., Erdman E., Lohse M.J. Altered expression of p-adrenergic receptor kinase and P-adrenergic receptors in the failing human heart. Circ.1993; 87: 454-463.

77. Unites States Patent 5, 686, 564. Peptide derivatives corresponding to the carboxy terminal sequence of hirudin. 1997.

78. Venter J.G., Fraser C.M., Harrison L.C. Autonantibodies to beta2-adrenergic receptors: a possible cause of adrenergic hyporesponsiveness in allergic rhinitis and asthma. Science 1980, 207: 1361-1363.

79. Walker C.A., Spinale F.G. The structure and function of the cardiac myocyte: a review of fundamental concepts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999; 375-382.

80. Wallukat G., Wollenberger A., Morwinski R., Pitschner H.F. Anti-betal-adrenoreceptor antibodies with chronotropic activity from the serum of patients with dilated cardiomyopathy. J.moI.Cell Cardiol. 1995, 27: 397-406.

81. Wallukat G., Muller J., Podlowski S. et al. Agonist-like beta-adrenoceptor antibodies in heart failure. Am.J.Cardiol. 1999, 83(12A): 75H-79H.

82. Xiao R.P., Lakatta E.G. pi-Adrenoceptor stimulation and P2-adrenoceptor stimulation differ in their effects on contradiction, cytosolic Ca2+, and Ca2+ current in single rat ventricular cells. Circulation. 1993; 73: 286-300.

83. Xiao R.P., Avdonin P., Zhou Y.Y., et al. Coupling of P2-adrenoceptor to Gi proteins and its physiological relevance in murine cardiac myocytes. Circ.Res. 1999; 84: 43-52.

84. Yoshikawa T., Port J.D., Asano K., Chidiak P. et al. Cardiac adrenergic receptor effects of carvediol. Eur:Heart J. 1996, 17(suppl. B): 8-16.