Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ В-МАННАНОВ СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ В-МАННАНОВ СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА *

На правах рукописи

л

ЕГОРОВ Александр Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ р .МАННАНОВ СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

Специальность 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004 _ л Ч У

-Ф

^ \

Работа выполнена в лаборатории Инженерной этимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.Д. Щербухни Официальные опоненты:

доктор биологических наук, профессор о.Л. Озерецковская доктор химических наук, профессор В.П. Варламов

Ведущая организация:

МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет

Зашита диссертации состоится « Э » 2004 г. в иг часов на

заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1,

Автореферат разослан « X » р^у/у^/^ьу 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гетерополисахариды — замещенные ß-маннаны бобовых — относятся к группе запасных полисахаридов. Они локализованы в клеточных стенках эндосперма и являются углеводным энергетическим резервом семян. Замещенные маннаны способны удерживать значительное количество воды и, благодаря этому, служат регулятором водного баланса семени при прорастании. У бобовых эта группа полисахаридов представлена исключительно галактоманнанами. Наличие близких им по структуре галактоглюкоманнанов, распространенных в семенах других семейств, например, ирисовых и лилейных, для бобовых оказалось уникальным, н к началу нашей работы такой полисахарид был изолирован из семян только одного вида. Помимо академического интереса эта группа полисахаридов имеет важное прикладное значение. По масштабу использования в различных отраслях промышленности галактомаинаны и их производные уступают только целлюлозе и крахмалу. Уникальные реологические свойства галактоманнанов в совокупности с отсутствием токсичности и наличием биологической активности позволяют применять их в пищевой, фармацевтической, медицинской промышленности, косметике и др. Следует отметить, что наряду с природными галактоманнанами используются и полусинтетические производные - например, этил-, карбоксиметил-, карбокси-, окснпропилгалактоманнаны (CKeng et al., 2002) и ряд других.

Особый интерес представляют сульфатированные галактомаинаны. К началу нашей работы исследования их не носили систематического характера. Известно, что три полученных деривата проявляли анткоагуляционную активность (Bode, Franz, 1989; Lima et al, 1996; Pires et al„ 2001). Между тем, поиски и создание альтернативы гепарину признано в мировой науке важной областью исследования ТЗипау, Linhardt, 1999; Yoshida, 2001). Причиной этого являются серьезные кдостатки препаратов гепарина — естественного антикоагулянта прямого (ействия, используемого в клинике. Одним из путей создания т.н. «гепариноидов» вляется сульфатирование полисахаридов растительного происхождения. Для о строения обоснованных выводов относительно биологической (в том числе,

нтикоагуляционноЙ) активности сульфатов гал tK-гоманнанов необходимо

ЦНБ МСХА -

фонд научной литературы :

™ 7о а I

получение и исследование серии препаратов, различающихся своими характеристиками. Это необходимо для выявления корреляции структура -функция и.направленного синтеза активных препаратов.

Изложенное выше определяет актуальность изучения новых замещенных р-маннанов, а также получение сульфатированных производных, обладающих антикоагуляционной активностью.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование новых замещенных р-маннанов семян бобовых и синтез сульфатов галактоманканов, обладающих антикоагуляционной активностью.

Эта цель в рамках диссертационной работы диктовала следующие задачи'.

■ Изолирование и исследование структуры галактоманнанов, представляющих научный и практический интерес.

• Выделение н характеристика новых галактоглкжоманнанов из разных частей семени Cere is canadensis L. (багрянника канадского).

• Разработка условий синтеза сульфатированных галактоманнанов с разными параметрами структуры. Тестирование их биологической активности. Научная новизна работы. Выделены и изучены состав и структура

галактоманнанов Cieditsia ferox Desf., Gleditsia triacanthos f. inermis L., Lotus cornicuJatus L. У первых двух галактоманнанов охарактеризовано тонкое строение, т.е. распределение остатков а-галактозы вдоль главной цепи. Определены параметры структуры макромолекул и их физико-химические свойства. Выделены и охарактеризованы галактоглюкоманнаны из эндосперма и кожуры семян Cercis canadensis L. Впервые обнаружено, что замещенные Р-маннаны аналогичного строения и близкого состава могут иметь различную локализацию в семени (эндосперм и кожура) и, соответственно, выполнять две разные функции -запасную и структурную. Проведено сульфатирование 4-х галактоманнанов с разным соотношением МангГал (1.1-5.2) и примерно равной молекулярной массой (ок. 100 кДа). Полученная высокая степень замещения не зависит от структурных параметров полисахаридов. В двух тестах in vitro - определение тромбкнового времени и ингибирование агрегации тромбоцитов — установлено, что полученные производные облапают антикоагуляционной активностью. Найдено, что величина

эффекта находится в прямой зависимости от содержания галактозы в галактоманнане.

Практическая ценность работы. Получены новые сведения о строении и свойствах замещенных р-маннанов - полисахаридов с широкими возможностями применения.

Разработаны условия и осуществлен синтез сульфатироваиных производных гал актом анналов.

Положительный результат тестирования биологической активности синтезированных сульфатов галактоманнанов дает основание для расширения работ по созданию активных гепариноидов.

Апробация работы, Основные положения работы были представлены на V Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, Россия, 2003) и на Ш Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2004).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 5 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экпериментальной части, включающей в себя описание материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (118 наименований, в том числе 98 на иностранных языках). Работа изложена на 105 страницах, включает 18 рисунков и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Семена Cercts canadensis L., Gleditsia triacanlhos f, inermis L. и Gleditsia ferox Desf. были предоставлены дня исследования из коллекции бобовых Ботанического сада Ростовского государственного университета, ¿oft« corniculattts L. - из коллекции семян Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН. Видовая аутентичность исследованных семян подтверждена ведущими специалистами вышеуказанных организаций. Дм сульфатирования были выделены и очищены 4 растительных галактоманнана из коллекции семян нашей лаборатории.

Выделение и очистку замещенных р-маннанов из семян проводили по схеме, которая включала измельчение н фиксацию семян кипящим SO %-ным этанолом, волную экстракцию полисахаридов, избирательное осаждение замещенных маннанов из раствора в виде комплекса с ионами Си2+. При выделении галактоманнанов из конкретных объектов вводились дополнительные стадии: обработка растительного материала бензолом; депротеинизация полученного полисахарида с помощью проназы (из Streptomyces grisens, КФ 3.4.244, удельная активность - 8 ед/мг ) и/или по методу Севага. В некоторых случаях выделение полисахаридов осуществляли из изолированных частей семени. При экстракции галактоглкжоманнанов дополнительно использовали растворы NaOH различной концентрации.

Для установления состава, структуры и свойств полисахаридов в работе использовались следующие методы: полный и частичный кислотный гидролиз, частичная деполимеризация, анализ состава ©лигосахарвдов, ферментативный гидролиз, бумажная, тонкослойная, газо-жидкостная, ионообменная и гельпрокикающая хроматография, ИК- и 13С-ЯМР-спектроскопия, поляриметр ия, вискозиметрия и другие.

Для определения содержания введенных в полисахарид SO31 "-групп, использовали известный турбядиметрический метод (Dodgson, Price, 1962). Калибровочный график строили для растворов KjSOj различной концентрации.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Изучение галактоманнанов семян Lotus cornlculatus L., Gleditsia triacanthosf. inentiis L,, Gleditsia ferox Desf.

Выход очищенных препаратов галактоманнанов из семян L, corniculatus., G. triacanthosf. inermis составил 1.65 и 15.4 % соответственно. Полисахарид семян G. ferox выделяли из изолированного эндосперма; выход в пересчете на целые семена составил 18.9 %. Полученные препараты представляли собой негигроскопичные, белые или кремовые порошки без запаха,

MoHOcaxapttdHый состав. На ранних этапах выделения препараты содержали от 4 до б сахаров - рамнозу, арабинозу, ксилозу, глюкозу, маннозу и галактозу,

причем последние два значительно преобладали. В процессе очистки содержание сопутствующих Сахаров снижалось до следовых количеств, тогда как соотношение маннозы и галактозы практически не изменялось. Поскольку постоянство соотношения мономеров является общепринятым критерием гомогенности для гетерополисахаридов, был сделан вывод о том, что полученные препараты представляли собой галактоманнаны.

Анализ олигосахаридое галактоманнанов L. comiculatus и G. triacanthos / inermis позволил установить, что остатки галактозы во всех фрагментах не занимают редуцирующих позиций в макромолекуле, не связаны между собой, а присоединены к звеньям маннозы. Последние занимают как концевые, так и нередуцирукпцие позиции.

С помощью ферментативного гидролиза эндо-1,4-[3-маннаназой (из Bacillus subtilis, КФ 3.2.1.78, удельная активность 12.8 ед/мг) галактоманнанов L. comiculatus и G triacanthos f. inermis было показано наличие 1,4-р-маннозндной связи в основной цепи полимеров. За процессом следили по изменению приведенной вязкости растворов полисахаридов. Приведенная вязкость раствора гатактоманнана L. comiculatus за 5 ч снизилась на 23 %, а для раствора G triacanthos f. inermis - на 83 %. Результаты позволили предположить, что скорость и глубина гидролиза значительно отличались для этих двух замещенных маннанов. Как известно (McCleary et al„ 1983), эффект энзиматического расщепления галактоманнанов зависит от количества и расположения вдоль основной цепи боковых a-D-галактопиранозных остатков, поскольку заместители создают стерические затруднения для действия фермента. Таким образом, результаты гидролиза объясняются различным содержанием галактозы в полисахаридах (45.1 % и 29.2 % соответственно).

ЯК-спектроскопия. Для всех исследуемых галактоманнанов были записаны ИК-спеюры. Кривые поглощения всех трех полисахаридов оказались подобны. В области 700-1200 см"1 были обнаружены характеристичные для маннопиранозных остатков полосы поглощения 900-920 см"1, 870-875 см"1 и 812-820 см*1. В целом, такой тип кривой поглощения в низкочастотной области ПК-спектров характерен для полисахаридов, у которых главная цепь полностью или на довольно про-

тяжеииых участках образована Р-маннопиранозными остатками со связью 1—» 4 (Ка1ое1а1., 1973).

Одним из свидетельств в пользу а-конфигурации гликозидного центра галактозы в галактоманнанах является положительный знак оптического вращения их растворов. Как известно, {^-маннаны обладают отрицательными величинами оптической активности, тогда как растворы исследованных полисахаридов имели положительный угол вращения (табл. 2). Это могло быть только в том случае, если остаток О-галактозы находился в а-конфигурации, так как именно а-О-галактоза обладает высоким положительным удельным вращением.

Для окончательного установления структуры макромолекул галактоманнанов была использована >3С-ЯМР спектроскопия. Большая молекулярная масса галактоманнанов препятствовала получению хорошо разрешенных ЯМР-спектров, поэтому полисахариды подвергали частичной деполимеризации по методу Божика (Вогюк еТ а!. 1981). Полученные фрагменты по структуре полностью соответствовали исходным макромолекулам, отличаясь кратно уменьшенной молекулярной массой. ЯМР-спектры исследованных галактоманнанов по набору сигналов резонанса атомов углерода были идентичны, поэтому подробно остановимся на анализе только одного спектра — галактоманнана й. /егох.

На рис. 1 представлен 13С-ЯМР-спектр галактоманнана (7 /егох\ в табл. 1 приведены величины химических сдвигов сигналов резонанса и их интерпретация.

Сравнение химических сдвигов сигналов С-атомов галактозных остатков с химическими сдвигами сигналов свободной галактозы (табл. 1) показывает, что только С-1 атом этого моносахаридного остатка испытывает сдвиг в слабое поле (+ 6.7 м.д.), так называемый «а-эффект». Это свидетельствовало о его участии в образовании ковалентной (галактозидной) связи. Величина химического сдвига характерна для а-конфигурации аномерного центра галактозы. Химические сдвиги сигналов остальных атомов галактозных остатков практически не отличались от аналогичных сигналов атомов свободной а-галактопиранозы, что свидетельствовало об отсутствии у них заместителей. Положение сигнала С-б однозначно указывало на гтираиозный размер цикла галактозных остатков полисахарида.

остаток 1>-маннопиранозы; М* - д¡помещенный остаток; 1У-маннопиранозы; С - остаток О-галактопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридн ых остатках.

Таблица 1

Положение и интерпретация сигналов ,3С~ЯМР спектра деполимеризованного галактоманнана семян С, /егох

Моносахаридный остаток цепи полимера Химические сдвиги, мл.

С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6

': ■"лГЧ™"* ш-

а-Р-галактопиранозил 100.2 69.9 70.7 70.9 72.6 62.6

ш т т ш

4-0-Р-0-манионира1{озил 101.6 71.5 11.9 77.9 78.2 76.5 62.0

4,6-д"-0-(}-1)-маннопира нозил 101.4 71.1 72.5 78.2 78.4 74.9 68.0

- даны для сравнения (Липкинд м др., 1987)

Таким образом, а-галактозные остатки полимера являются нередуцирующими и незамещенными, т.е. единичными звеньями.

Рассмотрим серию сигналов маннозных остатков в спектре. С-2 и С-3 имели по одному сигналу, С-1, С-5 и С-6 — по два, а С-4 - три сигнала. Конфигурация аномерного центра маннозных остатков была определена как р по величине химического сдвига С-5 (76.5 мл). Сравнивая положение сигналов атомов углерода маннозных остатков с положением сигналов свободной Р-маннпнранозы (табл 1), можно видеть, что смещение в сторону слабого поля испытывали сигналы С-1 (+ 6.7), С-4 (+ 10.5) и второй сигнал С-6 (+ 6.0 м.д.). Это доказывает участие этих атомов в образовании ковалентных связей.

Положение пика С-6 свидетельствовало о существовании маннозных остатков полимера в пиранозной форме. Химический сдвиг второго сигнала С-6 указывал на его замещение а-аномером (т.е. галактозой). Этот факт в совокупности с участием С-1 галактозных остатков в образовании ковалентной связи является доказательством гетерополисахаридной природы изучаемого галактоманнана.

Химический сдвиг сигнала С-4 говорит о наличии в положении 4 заместителя, которым также является р-маниопираноза, так как галактоза присоединена по С-6. Расщепление сигнала С-4 на 3 линии (77.9,78.2 и 78.4 м.д.) связано с наличием (или отсутствием) галакгозилирования по С-6 у двух соседних остатков (СгазсЫеп, Рат1ег,1980). Первый сигнал принадлежит незамещенному галактозой «маннобиозному блоку» Ман-Ман, средний - сумме двух разных однозамещенных блоков (Гал)Ман-Ман и Ман-Ман (Г ал) и третий - слабопольный сигнал - блоку с двумя галактозными заместителями - (Гал)-Ман-Ман(Гал), Соотношение инггенсивносгей этих сигналов, найдено как 0.37 : 0.47 : 0.16 соответственно (вся цепь принята за 1). Указанное соотношение характеризует вероятность встречаемости различных блоков в маннопиранозной цепи.

Из соотношения интегральных интенсивностей сигналов С-1 маннозы и галактозы получаем соотношение мономеров 2.55. Отношение интенсивности сигнала С-6 замещенного остатка маннозы к сумме обоих сигналов С-6

характеризует долю замещенных остатков маннозы в цепи - 0.38. Обе величины находились в хорошем соответствии с данными ПЖХ (2.54 и 0.39 соответственно).

Таким образом, данные 13С-ЯМР спектроскопии свидетельствуют о том, что в галактоманнане G. ferox оба мономера находятся в пиранозной форме, соотношение Man:Gal равно 2.55, манногтиранозные остатки имеют реконфигурацию И соединены между собой связью 1—► 4, причем 47 % из них являются 4,6-ди-О-замещёниыми. По С-б они замещены a-галактоииранозными остатками, которые сами не имеют замещения, т.е. являются единичными концевыми остатками.

Применяя аналогичные рассуждения, было показано, что галактоманнаны G. triacanthos f, inermis и L. corniculatus имеют подобную структуру. Из их ЯМР-спектров следовало, что галактозные и маннозные остатки в обоих полисахаридах связаны коваленгно и существуют в ггиранозной форме. В обоих полисахаридах D-маннопиранозные звенья посредством 1,4-р-связи образуют полимерную цепь, в которой часть маннозных остатков замещена по С-б единичными остатками а-га-лактопиранозы. Определенное по интегральным интенсивностям сигналов С-1, соотношение мономеров для G. triacanthos f. inermis составило 2.4:1, для L. cor-niculatus -12:1, что хорошо согласуется с данными ГЖХ (табл. 2). Интенсивность трех линий сигнала С-4 в спектре галактоманнана G, triacanthos f. inermis свидетельствовала, что встречаемость блоков Ман-Ман составила 34 %, (Гал)Ман-Ман и Мал-Ман(Гал) — 50 %, (Гшг)Ман-Ман(Тал) — 16 В спектре галактоманнана L. cornicitlatus не удалось получить разрешение сигнала С-4.

Фшико-хш.1 ических свойства растворов галактоманнанов. Вязкость. Измерение относительной вязкости проводили при низких концентрациях растворов гапактоманнанов (менее 1%) в вискозиметре Оствальда. Все галактоманнаны обладали высоким инкрементом приведенной вязкости с резко выраженной зависимостью от концентрации и имели высокое значение характеристической вязкости (табл. 2), что характерно для жестких фибриллярных макромолекул.

Таблица 2

Характеристика исследованных галактоманнанов

Га ла ктома н нан Выход, % Man: Gal [«ID,* Вязкость [ill, мл/г MM, кДа

L. corniculatus 1.65 1.22 + 84,1 559 640

G. triacanthosf. Ittermis 15.4 2.42 + 31.0 578 660

G.ferox 18.9 2.54 + 30.5 1430 1660

Величина характеристической вязкости использовалась для расчета молекулярной массы (табл. 2) по уравнению, предложенному Дублие и Лонэ для галактоманнанов (Doublier, Launay, 1977).

Растворы галактоманнанов обладали оптической активностью. Величины их удельного вращения приведены в табл. 2.

Таким образом, с помощью химических, хроматографических и спектроскопических методов установлено, что макромолекулы изученных галактоманнанов состоят из маннопиранозы и галактошаранозы с количественным преобладанием первого компонента. Остатки галактопиранозы имеют а-кон-фигурацию гликозидного центра, а маннопиранозы — ^-конфигурацию. Последние связаны между собой связью 1^4, образуя главную цепь полимера. Часть маннопиранозных остатков имеет замещение в положении С-6 единичными остатками а-галактопиранозы, которые являются боковыми цепями минимальной длины. То есть, все изученные нами полисахариды имеют «гребенчатый» тип строения макромолекул.

2. Изучение галактоглюкоманнанов нэ семян Cercis canadensis L.

Для определения моносахаридного состава частей семени С. canadensis был проведен хроматографический анализ гидролизатов эндосперма, кожуры и зародыша. Наибольшее количество маннозы (72 %) содержалось в эндосперме. Значительное количество маннозы было найдено и в кожуре (45 %), поэтому было

принято решение о выделении полисахаридов, как из эндосперма, так и из кожуры.

Галактогяюкоманнан, выделенный из эндосперма. В водном экстракте эндосперма количество маннозосодержащих полисахаридов (после селективного осаждения) оказалось крайне низким и составило всего 0.06 %. Затем продолжали экстракцию 15 %-ньш КаОН. Выход полисахаридов в этом случае составил 18.0 %, из них маннозосодержащих - 9.6 %.

Моносахаридный состав галактоглюкоманнанов, выделенных из эндосперма, приведен в табл. 3. В обоих полисахаридах (водная и щелочная экстракция) мажорный сахар - манноза (83.4 % и 82.9 %), в обоих случаях содержится небольшая примесь арабинозы, Различия заключаются в соотношениях галактозы и глюкозы. В галактоглюкаманкане, полученном водной экстракцией, содержание галактозы превалирует над содержанием глюкозы. В полисахариде из щелочного экстракта это соотношение обратное.

Для установления первичной структуры галактоглюкоманнанов была использована 1ЭС-ЯМР-спектроскопия. Спектр (рис. 2) был снят в В20 при рН ~ И для полисахарида, полученного щелочной экстракцией и затем подвергнутого

Таблица 3

Соотношение (весовое) моносахаридов в гаяаюпоглюкоманнанах, выделенных из эндосперма и кожуры

Эндосперм Кожура

Моносахариды Водная экстракция Щелочная экстракция Щелочная экстра кии я

Препарат 1 Препарат 2

Рамноза 0 0 0108 ±0.02 0

Арабиноза 0.19 ±0.01 0.28 ±0.03 0.16 ±0.01 0.10 ±0.03

Кснлоэа 0 0 0.07 ±0 0

Манноза 1233 ±0.09 10.42 ±0.22 4.50 ±0,36 4.66 ±0.22

Галактоза 1.27 ±0.06 0.87 ±0 04 0.90 ±0.07 0.80 ±0.08

Глюкоза 1 1 1 1

частичкой деполимеризации. Анализируя полученный спектр, мы можем сделать вывод о том, что в составе полимера нет фураноз, поскольку величины химических сдвигов сигналов С-1, С-4 и С-6 (табл. 4) каждого мономера характерны для пнранозных форм (Bock, Pedersen, 1983).

Рассмотрим сигналы атомов углерода галактопиранозн ых остатков. На их «-конфигурацию указывает химический сдвиг С-) (99.5 м.д.). Положение всех сигналов галактозных остатков за исключением С-1 [фактически совпадает с аналогичными сигналами свободной галактопиранозы (табл. I). Следовательно, остатки галактозы не имеют замещений, а значительный сдвиг сигнала С-î в слабое поле (+ 6.0 м.д.) объясняется участием этого атома в образовании гликозидной связи.

Судя по величине химического сдвига сигнала С-1 остатков глюкозы в полимере, последние имеют p-конфигурацию глюкозидного центра. Сравнивая

Рис; 2. '3С-ЯМР-спектр галактоглюкоманнана из эндосперма С. canadensis. М— монозамещенный остаток D-маннопираназы; М* - дтамещенпый остаток Т>-лшннопираиозы; Gat — остаток D-галактопиранозы; Glc — остаток глюкопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридных остатках.

Таблица 4

Положение и интерпретация сигналов в иС-ЯМР-спеюпре галактоглюкоманнана С сапа<1епв1$

Моноса харкдный остаток цепи полимера Химический сдвиг, м.д.

С1 С 2 сз С 4 С 5 С6

99.5 68.7 70.3 70.8 72.4 62.65

4-О-р-О-Мапр 101.4 71.75 73.05 77.3 76.7 62.05

4,6-<1Ю-р-Г)-Магу? 100.5 71.75 73.05 77.3 75.7 67,2

^^ЛПКОШртШП«^. ; ; 10« 74.75 74.55 76.15 80.0 76.4 61.8

Шй

• - Дано для сравнения (С^ркШ еХ а\„ 1988)

положение сигналов свободной р-Э-глюкопиранозы и глюкозных звеньев полимера (табл. 4) приходим к выводу, что у последних атомы С-1 и С-4 участвуют в образовании гликозидных связей, о чем свидетельствуют сдвиги в слабое поле (+ 7.1 и + 9.1 м д.). Остальные сигналы практически совпадают, указывая на отсутствие замещения в соответствующих позициях.

Анализ сигналов манноттс остатков полимера позволяет заключить, что они имеют Р-хонфигурацию аномерного центра, о чем можно судить по химическому сдвшу С-5. В сильном поле маннозным остаткам принадлежали два сигнала С-6 (62.05 и 67.2 м,д.). Второй, менее интенсивный сигнал С-6 в более слабом поле (+ 5.15 мд.) появился благодаря наличию замещения в згой позиции у части ман-нопиранозных звеньев. Химический сдвиг второго сигнала свидетельствовал о замещении а-аномером, т.е. в данном случае об а-галактозилировании по С-6 определенной доли остатков маннопиранозы. Сравнивая химические сдвиги сигналов свободной р-Р-маннопнранозы и остатков Р-1>-маннопиранозы полимера (табл. I И 4), мы видим, что сигналы С-1 и С-4 последних значительно смещены в слабое поле (+ 7.5 и + 9.4 м.д.), указывая на участие этих атомов в образовании гликозидной связи 1,4.

Суммируя изложенное выше, можно сделать вывод, что макромолекула изученного полисахарида сочетает в себе элементы строения глюко- и галахтоманнака. Имеется линейная цепь из 1,4-0-связанных Б-глюко- и Б-манно-пиранозных остатков (структура глюкоманнана), причем к части последних по С-6 присоединены единичные остатки а-Ц-галактопиранозы, образуя «гребень» (структура галактоманнана). Схематически это можно изобразить следующим образом:

а-Са1р 1 6

0-Мапр (1-4)-(}-Маг1р (1-4) - р-Мапр (1-4)- р-&ср (1-4)- 0-Мапр (1-4)

Гялактоглюкоманнан, выделенный из кожуры. Для выделения полисахаридов использовали схему, описанную для получения полимеров из эндосперма. Выход их из водного экстракта составил 3.3 %, из щелочного (с последующим выделением маннозосодержащмх полисахаридов) - 16.9 %.

Моносах аридный состав полисахаридов устанавливали с помощью хроматографического анализа. В препарате, экстрагированном водой, были найдены рамноза, арабнноза, манноза, галактоза и глюкоза в приблизительно равных количествах. Можно было предположить, что данный препарат содержит набор гемицеллюлоз.

Из щелочного экстракта кожуры был селективно выделен маниозосодержащий полисахарид - препарат 1 (табл. 3), в котором были обнаружены мажорные моносахариды - манноза, глюкоза и галактоза, небольшая примесь арабинозы, в следовых количествах идентифицировались рамноза и ксилоза. Отсюда следовало, что препарат 1 может являться галактоглюкоманнаном. Для подтверждения этого предположения, повторили осаждение ионами Сц2+ - препарат 2. Потери при повторной очистке составили лишь 8.5 %, При сравнении состава препаратов 1 и 2 (табл. 3) оказалось, что содержание арабинозы уменьшилось, исчезли рамноза и ксилоза, а соотношение основных моносахаридов практически не изменилось. Этот факт свидетельствовал

в пользу того, что препарат, выделенный из кожуры, также представлял собой гетерополисахарвд — галактоглюкоманнан.

Для сравнения полисахаридов, выделенных из эндосперма и кожуры, были сняты их ИК-спектры. В характеристической для углеводов области (700-1200 см"1) кривые поглощения были идентичны друг другу, а также спектрам исследованных нами ранее замещенных р-ман налов.

Если состав галактоглюкоманнана, выделенного из кожуры (выход 16.9 %), сопоставить с таковым для полисахарида, полученного при щелочной экстракции из эндосперма (выход 9.6 %), то становится очевидным, что в этих галакто-глнжоманнанах молярные соотношения Глю : Гал совпадают, при этом резко различаются соотношения Ман : Гал (табл. 3). В два раза меньшее Ман : Гал в экстрагированном из кожуры полисахариде означает увеличение вдвое боковых ответвлений основной цепи, представленных единичными остатками галактопиранозы. При этом, как известно, повышается растворимость 1,4-р-ман-нанов и, как следствие, облегчается их экстракция. Это подтвердилось более высоким выходом препарата 1,

Полученные результаты свидетельствуют о том, что из разных частей семени С. canadensis мы извлекли аналогичные по составу галактоглюкомалнаны. Этот факт представляет большой интерес. Известно, что в кожуре семян подсемейства цезалытиниевых мажорными полисахаридами являются арабинаны различного состава и структуры, в то время как в эндосперме В качестве мажорных полисахаридов содержатся галактоманнаны. Арабинанам в составе гемицеллюлоз придается опорная функция, а галактоманнаны представляют собой резервные полисахариды. Т.к. и в кожуре и в эндосперме семян С. canadensis, принадлежащему этому же подсемейству, нами обнаружены галактоглюкомаинаны, можно предположить, что в данных семенах галактоглюкомалнаны могут иметь разные функции.

3. Сульфатированные галактоманнаны - потенциальные гепариноиды.

На основе известных принципов получения сульфатов полисахаридов (Pires et aL, 2001; Huynh et a!., 2001; Geresh et al., 2002) пами была разработана методика

сульфатнрования галактоманнанов. Она содержит три этапа: 1 - подготовка полисахарида; 2 — реакция сульфатнрования и 3 — очистка производного и получение натриевой соли сульфата галактоман нана.

1 этап. Сульфатирование чаще всего проводится в среде безводного димегилформамида (ДМФА), в котором галактоманнаны не растворяются. Для минимизации сложностей, возникающих вследствие проведения химического синтеза в гетерогенной фазе, галактоманнан был переосажден спиртом из водного раствора, а затем осадок полисахарида был последовательно промыт спиртом и ДМФА в 3-кратноЙ повторности для каждого растворителя. Такая подготовка образца была необходима для лучшей сольватации ОН-групп полисахарида.

2 этап. Реакцию сульфатнрования проводили в строго безводной среде в присутствии триэтиламина (ТЭА). Сульфатирование осуществлялось с помощью пиридин-50з комплекса, который всегда применяется в избытке по отношению к количеству свободных ОН-групп гексозных остатков в полисахариде. В наших экспериментах использовался трехкратный молярный избыток. Реакция проводилась в течение 4 ч при постоянном перемешивании и заданной температуре.

3 этап. Для остановки реакции сульфатнрования добавляли ледяную воду и ТЭА. Полученную смесь диализовали. Затем раствор пропускали через ионообменную колонку (Н+-форма). Для получения Na-соли сульфата галактоманнана, его раствор нейтрализовали 1М CHjCOONa и полисахарид осаждали.

Эксперименты по синтезу сульфатов галактоманнанов и испытанию их антикоагуляционной активности проводились на четырех галактоманнан ах с различным соотношением Ман:Гал (табл. 5).

1 - Galega orienlhatis; 2 - Cyamopsis tetragonoloba; 3 — Ceratonia siliqua; 4 - Sophora japónica. Эти полисахариды далее для краткости в тексте, таблицах и рисунках будут названы 1 — Галета; 2 - Гуар; 3 - Локуст бин; 4 - Софора.

Для всех галактоманнанов с помощью деполимеризации были получены фрагменты макромолекул с молекулярными массами в интервале 80 - 100 кДа, с неизмененной структурой, которая была подтверждена сохранением соотношения

мономеров и идентичностью ИК-спектров исходных и деполимернзованных полисахаридов.

Сульфатированные производные галактоманнанов были синтезированы в одинаковых условиях при С = 60 °С. Для доказательства присутствия сульфогрупп в продуктах синтеза были записаны РЖ-спектры. Дня всех сульфатов галактоманнанов наблюдали интенсивную полосу поглощения при 1250 ± 3 см'1, которая принадлежит валентным колебаниям 5=0. Этот факт свидетельствует о замещении части свободных гвдроксилов ЭОз'"группами. В качестве примера приведены ИК-спеюры Гуара до и после сульфатирования (рис. 3). Результаты количественного определения сульфогрупп в полученных производных представлены в табл. 5, Из приведенных данных следует, что достигнутая нами степень замещения (05) не зависит от величины соотношения мономеров в данных галактоманнанах.

Рис 3. ЯК-спектры исходного (А) и сул ьфатироеанного (В) Гуара. Стрелкой отмечено положение полосы поглощения группы $>-0.

Таблица 5

Содержание сульфогрупп в синтезированных производных галактоманнанов

Галактоманнан Кол-во вОД % ОБ МангГал до реакции Ман:Гал после реакции

Галега 5230 1.85 1,07 1.13

Гуар 46.41 1.46 1.70 1.64

Локуст бив 45.70 1.42 2.80 2.88

Софора 52.28 1.85 5.30 5.21

Более высокая Бв с крайними значениями Ман : Гал по сравнению с двумя промежуточными, возможно, объясняется тем, что сульфатирование в первую очередь проходит по первичным ОН-группам, т.е. группам находящимся при шестом атоме углерода (МЗЬпег е1 а!., 2001). В часто-(Галега) и редкозамещенных (Софора) галактом анналах большинство таких свободных групп, принадлежащих галакгопиранозному остатку в первом случае и маннопиранозному во втором, оказываются одинаково доступными для реакции сульфатирования. Для 2-х других галактоманнанов с промежуточными величинами соотношения мономеров, видимо, возникают стерические затруднения для синтеза.

Чтобы убедиться в отсутствии деградации полисахаридов в процессе сульфатирования, дня всех полученных производных определяли мономерный состав. Как видно из табл. 5, соотношение мономеров сохранилось для всех сульфатов галактоманнанов. Для полисахарида Гуарадо и после сульфатирования была проведена гельнроникающая хроматография. Максимум пика сульфопроизводного имел меньшее время удерживания по сравнению с исходным полисахаридом, что свидетельствовало об увеличении молекулярной массы за счет сульфатирования. На хроматограмме сульфатированного полисахарида была выявлена ыизкомолекуяярная фракция в количестве 3.1 аА, которая, вероятно, могла принадлежать продуктам деградации. Поэтому можно полагать, что в процессе синтеза деградация галактоманнанов не происходит или наблюдается в очень слабой степени.

т-с

Рис. 4. Зависимость степени сульфа-

т

а

Чтобы иметь возможность вводить заданное количество сульфогрупп, мы решили выявить зависимость степени сульфатировалия от температуры (при прочих равных условиях). На рис 4, представлены результаты для галакто-маннана Гуара при разных температурах в интервале 19 - 60 °С. Как видим, зависимость ЮЗ - температура оказа-

тироеания от температуры для га- лась линейной с хоро1ШШ коэффи.

позволяет контролировать глубину сульфатирования.

Биологическая активность сульфатированных галактоманнанов. Из литературы известно (Alban, Franz, 2001), что многие сульфополисахарнды проявляют антикоагуляционную активность. С целью выяснения, обладают ли полученные нами производные галактоманнанов этими свойствами, в их присутствии было проведено 2 анализа: определение тромбинового времени и степень агрегации тромбоцитов. Исследования были проведены в клинико-биологической лаборатории института хирургии им. A.B. Вишневского РАМН.

Первый тест — определение тромбинового времени - позволил установить зависимость времени коагуляции плазмы от концентрации сульфатов галактоманнанов. Как видно из рис. 5, в пределах использованных концентраций зависимости линейны, кроме того, угол наклона зависит от соотношения моносахаридов в галактоманнане. Наибольший угол, а, следовательно, наивысшая активность наблюдалась для галактомаянана Галеги, соотношение МашГал в котором составляет 1.13. Наименьшая активность была отмечена для галактоманнана Софоры, которая имеет наибольшее соотношение МашГал 5.21, Таким образом, антикоагулянтные свойства сульфатированных производных зависят от содержания галактозы в исходном полисахариде. Для подтверждения этого положения была построена зависимость увеличения времени образования

лактоманнана Гуар

циентом корреляции (г = 0.9995), что

5-1-,--■--1---т-I-,-Г---г—

С.Е}00 С.№2 а.№ 0.00« 00» 0.010

КОНЦЕНТРАЦИЯ. П

Рис. 5. Зависимость времени коагуляции плазмы от концентрации сульфатов галактоманнанов; 1 - Галега, 2 - Гуар, 3 - Локуст бин, 4 — Софора

тромбоцитарного сгустка в присутствии сульфатов галактоманнанов (по сравнению с чистой плазмой) от содержания галактозы в полисахаридах. Из рис. 6 видно, что зависимость является линейной. Поэтому очевидно, что существует прямая корреляция между антикоагуляционной активностью сульфатов галактоманнанов и степенью замещения р-маннанов в интервале соотношений МангГап 1.1 -5.2.

Второй тест — измерение агрегационной активности тромбоцитов — проводили на агрегометре в присутствии индуктора АДФ. Результат, т.е. величина активности выражается отношением предельного процента оптического пропускания в эксперименте по сравнению с таковым в донорской плазме, принимаемым за 100 %. Иначе говоря, чем меньше пропускание, тем больше иншбированне процесса агрегации тромбоцитов. Результаты представлены на рис. 7. Как видно, наименьшее пропускание наблюдается в присутствии галактоманнана Галеги, наибольшее — галактоманнана Софоры. Таким образом,

ГАЛАКТОЗА, V.

Рис. 6. Зависимость увеличения тром~ бинового времени в присутствии сульфатов галактоманнанов (сш1(Г'%) от содержания в них галактозы: 1 - Галега, 2—Гуар, 3 - Локуст бин, 4 — Софора

•А

2 (C = 10<S%):

Рис. 7, Коагулогралшы донорской

* плазмы в присутствии сульфа-3

тированных галактомапнанов

1 — Галега, 2 - Гуар, J - Локуст

'в ' " ]з ' 'з ■ ' 'б 'ь ' '7 ' 'в ' бин, 4 - Софора, 5 - донор

мы наблюдаем ту же тенденцию — прямую зависимость проявляемого эффекта от содержания галактозы в полисахариде.

Проведенные исследования безусловно свидетельствуют, что сульфатярованные галактоманнаны обладают антитромботической активностью, что проявилось в прямом антикоагуляционном эффекте при определении тромбинового времени и снижении функциональной активности тромбоцитов. Дальнейшее развитие работы предполагает определение активности полученных производных в других общепринятых тестах, а также установление величины эффектов в зависимости от физико-химических параметров макромолекул полисахаридов. Это необходимо для выяснения механизма взаимодействия сульфатов галактоманнанов с компонентами системы свертывания крови и направленного синтеза активных препаратов.

1. Из семян Gleditsia ferox Desf., Gleditsia triacanthos f. inermis L., Lotus cormculatus L. выделены галактоманнаны с различным малярным соотношением мономеров (Ман:Гал) 2.54, 2.42 и 1.22 соответственно. С помощью химических, физико-химических методов и спектроскопии (ИК- и 1ЭС-ЯМР) установлено строение полисахаридов. Их макромолекулы представляют собой основную цепь из 1,4-|1Ю-манно1шранозных звеньев,

ВЫВОДЫ

определенная часть которых в положении С-б замещена единичными остатками а-галактопиранозы. .Для двух первых галактоманнанов установлена тонкая структура, т.е. распределение галактозы вдоль основной цепи.

2. Галактоманнаны обладали оптической активностью: положительное удельное

вращение [а]о находилось в интервале 30.5 — 84.1°, Водные растворы полисахаридов отличались высокой вязкостью ([л] = 559 - 1430 мл/г), свойственной фибриллярным макромолекулам. На основе значений характеристической вязкости рассчитаны величины их молекулярной массы: 600- 1660кДа.

3. Из эндосперма и кожуры семян Сегпв сткнЛеШь Ь. впервые выделены

галактоглюкоманнаны, определен их мономерный состав. Дня одного из них с помощью 13С-ЯМР-спектроскопии установлена первичная структура: его главная цепь представлена 1,4-{НЭ-глюко- и маннопиранозными остатками, последние замещены по С-6 единичными остатками а-галактопиранозы. Впервые обнаружено, что аналогичные по составу и строению полисахариды локализованы в разных частях семени (эндосперм и кожура) и имеют, по-видимому, разные функции - запасную и структурную,

4. Найдены условия синтеза, контролирующие степень сульфатирования

галактоманнанов и установлено, что существует прямая корреляция между количеством инкорпорированных сульфогрупп и температурой проведения реакции.

5. Получены сульфатированные производные 4-х галактоманнанов с разным

соотношением Ман:Гал (1.1 - 5.2). Установлено, что степень замещения в разработанных условиях реакции не зависит от содержания галактозы в полисахаридах.

6. В двух анализах гп \iiro показано, что полученные сульфаты галактоманнанов

обладают антикоагуляционной активностью. Они увеличивают тромбиновое время и снижают функциональную активность тромбоцитов. При этом установлено, что величины обоих эффектов зависят от содержания галактозы в галапоманнанах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Анулов О.В., Пономаренко С.Ф., Егоров А.В. Галахтоманнаны семян

некоторых видов сем. Fabaceae it Растительные ресурсы. 2003. Т. 39. № 1, С. 80-83.

2. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д, Установление первичной и

тонкой структуры галактоманнана семян Gleditsia triacanthos f. inermis L. // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т, 39. № 4, С. 452-456,

3. Егоров А,В., Местечкина Н.М., Пленник Р.Я., Щербухин В.Д.

Водорастворимый галактоманнан семян Lotus corniculatus L.: строение и свойства И Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 5. С. 577-580.

4. Егоров А.В., Анулов О.В., Щербухин ВД. Гледичия как источник

галактоманнанов — растворимых пищевых волокон // Труды V Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Москва. 2003. Т. 3. С 333-335.

5. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Состав и структура

макромолекулы галактоманнана семян Gleditsia ferox И Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № з. С. 370-375.

6. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Сульфатированные

галактоманнаны бобовых - как потенциальные гепариноиды // Материалы III Всероссийской школы-конфереицин «Химия и биохимия углеводов». Саратов. 2004. С. 30.

7. Местечкина Н.М., Егоров А.В., Анулов О.В., Щербухин В.Д, Изучение

галактоглюкоманнанов из семян Cercis canadensis L. ¡1 Прикладная биохимия И микробиология. 2005. (в печати).

Издательство ООО "МАКС Прем ". Лицензия ИД >6 00510 от 01Л 2.99 г. Подписано к печати 01.10.2W4r. Формат 60x90 1/16. Печдист 1,3. Тираж 120 экз. Заказ 1013. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им, М.ВЛомоносова.