Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Галактоманнаны семян бобовых отечественной флоры

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Галактоманнаны семян бобовых отечественной флоры"

РГБ ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК '¿и Г\] '"1

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н. БАХА

На правах рукописи

АНУЛОВ Олег Вячеславович

ГАЛАКТОМАННАНЫ СЕМЯН БОБОВЫХ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ФЛОРЫ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -2000

Работа выполнена в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.Д. Щербухин

Официальные опоиенты:

доктор биологических наук, профессор В.А. Пасешниченко доктор химических наук, профессор А.П. Сшпщып

Ведущая организация:

Институт элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова РАН

Защита состоится » 2000 г. в часов на заседании

диссертационного совета К.002.96.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН (г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, корпус 1).

Автореферат разослан

«/1 » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ЕШ. м Ъ О

Актуальность проблемы. Гетерополисахариды галактоманнаны относятся к группе запасных полисахаридов растений. У бобовых они локализованы в клеточных стенках эндосперма семян и являются наиболее распространённым типом углеводного резерва. Именно этим они вызывают наибольший теоретический интерес. Однако галактоманнаны полифункциональны (Вискепс^е, Ле1с1, 1996): кроме запасной они несут функцию субстанции агтрагирующей, т.е. удерживающей воду при набухании семян, а благодаря значительной плотности многих галактоманнанов, локализованных по периферии зародыша, им ещё придают и защитную функцию.

Практическое значение галактоманнанов сопоставимо с академическим интересом, который они вызывают. По масштабу использования в различных отраслях промышленности галактоманнаны и их производные занимают первое место после целлюлозы и крахмала. Эти полисахариды, благодаря уникальным свойствам своих водных растворов и отсутствию токсичности, используются в пищевой, текстильной, фармацевтической промышленности и медицине в качестве пищевых добавок, стабилизаторов, флоккулянтов, загустителей и гелеобразователей (в бинарных смесях).

В то же время информационный массив охватывает галактоманнаны (ГМ) бобовых в основном тропического и субтропического поясов (Farooqi а1., 1985; Buckeгidge Й а!., 1995), тогда как галактоманнаны бобовых умеренных широт исследованы явно недостаточно. Так, на сегодняшний день полностью отсутствует информация о химическом составе и полезных свойствах 74% представителей сем. бобовых, произрастающих на территории бывшего СССР (всего 2192 вида) (Растительные ресурсы, 1994). Данная тенденция

в полной мере характерна и для флоры России. В 1987 г. в лаборатории углеводов Института биохимии им. А.Н. Баха начались работы по изучению галакгоманнананов семян бобовых флоры СССР (Щербухин, Смирнова и др., 1987), благодаря чему была исследована целая группа галактомашшюв отечественной флоры. Становилось актуальным провести химический скрининг бобовых при достаточно репрезентативной выборке представителей различных таксонов семейства бобовых флоры России. Получить информацию о распространении галакгоманнананов среди бобовых, произрастающих в зоне умеренного климата. Выделить новые галактоманнаны и исследовать их моносахаридный состав, химическую структуру и физико-химические свойства. Изучить, по возможности, тонкое строение макромолекул изолированных галактоманнанов. Другой немаловажной мотивацией работы являлось, как её следствие, расширение базы данных по основным характеристикам галактоманнанов бобовых мировой флоры для более репрезентативных хемотаксономических и филогенетических обобщений. Исходя из этого были сформулированы задачи исследования:

Цели и задачи исследования.

■ Химический скрининг, включающий выделение и определение мономерного состава водорастворимых маннозосодержащих полисахаридов семян 59 видов бобовых, произрастающих на территории России.

■ Изолирование и очистка новых галактоманнанов из семян бобовых, относящихся к разным таксонам. Исследование состава, первичной

структуры и особенностей тонкого строения цепи гетерополисахаридов. Изучение физико-химических свойств водных растворов галактоманнанов.

■ Использование полученных данных в целях химической систематики и филогении бобовых.

■ Выявление среди бобовых российской флоры потенциального растительного источника коммерческих препаратов галактоманнанов.

Научная новизна работы.

Впервые выделены, очищены и охарактеризованы 6 галактоманнанов. Установлен их состав и первичное строение как (1—>6)-а-0-галактозил-(1->4)-р-0-маштнов; показано, что они имеют «гребенчатую» структуру макромолекулы. У двух галактоманнанов методом !3С-ЯМР количественно охарактеризовано распределение остатков а-галактозы вдоль главной цепи полимера Исследованы вязкость и оптическая активность водных растворов галактоманнанов, а также вычислены их молекулярные массы. Впервые проведен химический скрининг семян 59 видов сем. бобовых флоры России на наличие галактоманнанов с определением их содержания и соотношения мономеров в них. Существенно расширена база данных по бобовым Северной Евразии; показана возможность использования величины Man/Gal галактоманнанов в качестве химических маркеров Fia уровне рода в хемотаксономии семейства.

Практическая ценность работы

Галактоманнананы являются группой биологически активных полисахаридов с широким спектром применения в пищевой и

фармацевтической промышленности и большими масштабами производства (вне России). Сведения о распространении данных полисахаридов среди видов российской флоры бобовых представляют значение для поиска возможного источника галактомашшнов, адаптированного к климатическим условиям России. Галакгоманнаны одновременно могут служить источником получения D-машюзы, не производящейся в России.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на IV всероссийском съезде общества физиологов растений (Москва, Россия, 1999 г.), на Ш международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, Россия, 1999 г.), на семинаре кафедры ботаники и физиологии растеши МПГУ им. В.И. Ленина.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа (118 страниц, 12 рисунков, 14 таблиц) состоит из введения, обзора литературы, экпериментальной части, включающей описание материалов и методов работы, изложения результатов и их обсуждения, заключения, приложения, выводов и списка литературы (142 наименований).

Материалы и методы исследований.

В качестве объектов исследований использовали семена 59 видов бобовых, полученных из коллекций ботанических садов РАН, МГУ, Дагестанского ГУ, ВИЛР, из НПО «Корма», а также собственного сбора.

Выделение и очистку галактоманнанов, намеченных для подробного изучения их структуры и физико-химических свойств, проводили из семян 6 видов бобовых Astragalus falcatus, Astragalus lehmannianus, Amorpha fruticosa, Baptisia australis, Gleditsia triacanthos и Trifolium hybridum. Методы выделения, разнившиеся между собой, включали в себя 4 обязательных этапа: измельчение семян; фиксация измельчённых семян; водная экстракция растительного материала с последующим осаждением водорастворимых полисахаридов спиртом; избирательное осаждение галактоманнана в виде комплекса с медью и регенерация его из этого комплекса. Применительно к особенностям конкретных объектов эта схема модифицировалась дополнительными процедурами депротеинизации, очистки от липидов и др.

Химический скрининг семян проводили по модифицированной схеме получения галактоманнанов.

Общие сахара определяли по Дюбуа, уроновые кислоты по методу Блюменкранца, белок - по Лоури.

Исследования полисахаридов проводили с помощью химических методов (полный и частичный кислотный гидролиз, восстановление моно-и олигосахаридов), хроматографических методов (БХ, ТСХ и ГЖХ), а также спектроскопией ИК- и ,3С-ЯМР. Использовались также методы вискозиметрии и поляриметрии.

Результаты и их обсуждение.

Химический скрининг представителей семейства бобовых отечественной флоры.

В ходе химического скрининга были исследованны водорастворимые полисахариды из семян 59 видов бобовых. В семенах 46 видов бобовых были найдены галактоманнаны, что составляет 75% от общего числа исследованных видов. По ботанической классификации они относятся к 4 трибам (Amorpheae, Coroiiilleae, Hedysareae, Thermopsideae) и 15 родам (Amorpha, Baptisia, Chamaecytisus, Colutea, Coronilla, Hedysarum, Laburnum, Lespedeza, Lembotropis, Oxytropis, Onobrychis, Ononis, Robinia, Sarothamnus, Thermopsis) сем. бобовых.

Содержание ГМ в семенах исследованных видов составляет от 0.45 до 14% на воздушно-сухую массу семян. В целом, это ниже, чем сообщается для видов бобовых, произрастающих в тропическом, субтропическом поясах земного шара (Dea, Morrison, 1975; Buckeridge et al., 1995). Величина молярного соотношения маннозы и галактозы составляет от 1 до 2.7, что находится в границах, указанных для галактоманнанов семян бобовых (Щербухин, 1993). Очевидное преобладание видов, содержащих в семенах ГМ с соотношением Man/Gal<1.5, можно объяснить тем, что подавляющее большинство исследованных видов относились к наиболее распространенному в России подсемейству мотыльковых. Последние, как правило, характеризуются повышенной долей содержания D-галактозы (Edwards et al., 1992; Buckeridge et al., 1995).

В ходе скрининга ГМ не были найдены в семенах 13 видов, относящихся к 7 родам бобовых: Lathyrus, Maackia, Vicia, Albizia, Ammodendron, Caragana, Halimodendron. В диссертации полученный материал суммируется в двух таблицах.

Результаты скрининга значительно расширили базу данных по бобовым отечественной флоры и были использованы для целей хемотаксономии, а также при отборе видов для глубокого изучения галактоманнанов.

Исследование состава и структуры галактоманнанов семян бобовых.

Отобранную для исследования первичной и тонкой структуры, а также физико-химических свойств группу составили вошли Astragalus falcatus, Astragalus Uhmannianus, Amorpha fruticosa, Baptisia austral is, Gleditsia triacanthos и Trifolium hybridum. Моносахаридные компоненты галактоманнанов идентифицировались и определялись после полного кислотного гидролиза исследуемых препаратов методом ГЖХ. Было показано, что структурными компонентами являются галактоза и манноза, всегда с количественным преобладанием последней. Соотношение Man/Gal у разных видов варьировало от 1.17 до 2.3.

В гидролизатах препаратов, получаемых на разных этапах выделения, соотношение Man/Gal в процессе очистки практически не изменялось или изменялось незначительно (в диссертации приводятся хроматограммы и таблица). Для гетерополисахаридов постоянство соотношения моносахаридов является общепринятым критерием гомогенности, поскольку такая ситуация возможна лишь в том случае, если манноза и галактоза являются компонентами одной макромолекулы. Вероятность иного слишком мала. Прямое доказательство химической связи между маннозой и галактозой было затем получено для двух галактоманнанов анализом их восстановленных фрагментов, а для 4-х галактоманнанов - методом 13С-ЯМР-спектроскопии.

Анализ восстановленных фрагментов галактомаиначов Baptisia australis R.Br, Trifolium hybridum L.

Полисахариды расщепляли методом частичного кислотного гидролиза на фрагменты и выделяли суммарную фракцию олигомеров с СП=2-5. Затем фракцию восстанавливали боргидридом Na. При этом редуцирующие остатки олигомеров превращались в соответствующий спирт. После полного гидролиза восстановленных олигомеров гидролизат обрабатывали гидроксиламином. При этом все бывшие нередуцирующие остатки олигомеров превращались в альдононитриловые производные. «Помеченные» по-разному моносахаридные остатки ацетилировали и идентифицировали методом ГЖХ. При исследовании обоих галактоманнанов из спиртов был найден только маннит, а в виде альдононитрилов были найдены и галактоза и манноза. Отсутствие дульцита свидетельствовало о том, что остатки галактозы во всех фрагментах не занимали редуцирующих позиций, не связаны между собой, а присоединены к маннозным остаткам.

ИК-спектроскопия галактоманнанов.

Записывались ИК-спектры исследуемых галактоманнанов. В области 700-1100 см"1, характеристической для стереохимических особенностей углеводных структур были обнаружены полосы поглощения, обусловленные различными видами колебаний ß-маннопиранозных остатков (вблизи 900 см"1, при 875 см"1 и 820 см"1 ). В целом, кривая поглощения в низкочастотной области ИК-спектров изученных полисахаридов была подобна таковым у маннозосодержахцих полисахаридов, цепь которых построена целиком или из достаточно протяжённых участков образованных (1-»4)-Р-маннопирапозными остатками (Kato et al., 1973).

Положительный знак оптического вращения растворов галактоманнанов.

Из данных ИК-спектроскопии следовало, что в молекулах изучаемых галактоманнанов присутствуют 1,4-Р-маннозидные связи. Однако такие связи в полисахаридах детерминируют отрицательный угол оптического вращения, тогда как растворы галактоманнанов обладали положительным углом вращения. Это могло быть только в том случае, если D-галактоза имеет а-конфигурацию гликозидного центра, так как именно a-D-галактоза обладает очень высоким удельным вращением (Md ~ +150 (Н^О), и к тому же её содержание в изучаемых полисахаридах значительно: от 30 до 46%.

Конфигурация гликозидных связей в четырёх галакгоманнанах была установлена методом 13С-ЯМР спектроскопии (см. ниже).

Исследование строения галактоманнанов при помощи "С-ЯМР-спектроскопии.

Спектроскопия 13С-ЯМР позволила получить обширную информацию о первичном строении галактоманнанов из Astragalus falcatus, A. lehmannianus,Amorphafruticosa, Gleditsia triacanthos.

Вследствие большой молекулярной массы и высокой вязкости растворов, препятствующим получению хорошо разрешенных ЯМР-спектров, все ГМ до снятия спектров подвергали частичной деполимеризации, вслед за чем деполимеризованные галактоманнаны анализировали, убеждаясь, что основные структурные характеристики (соотношение Man/Gal, уд. вращение и ИК-спектр) не изменились. Это положение иллюстрируется в диссертации таблицей.

Подробно информацию о структуре галактоманнанов, полученную с помощью ЯМР-спектроскопии, разберем на примере проведенного нами исследования галакгоманнапа из семян ЫеёШа ХпасатЪон.

13С-ЯМР-спектроскопия галактоманнана &ей1Ыа ^шсапАгоя Ь.

В хорошо разрешённом спектре мы идентифицировали сигналы всех атомов углерода О-галакгозы и о-маннозы.

Рассмотрим сигналы «галактозной серии». Сравнивая их положение в спектре с положением пиков С-1 - С-6 свободной галактопиранозы (таблица 1, строки 1 и 2), мы видим, что только сигнал С-1 имеет смещение в сторону слабого поля (+6.55 м.д.), тогда как положение сигналов С-2 - С-6 совпадало с таковым свободной галактопиранозы. Это свидетельствовало о том, что только С-1 участвует в образовании химической (галактозидной) связи, т.е. галактоза не имеет заместителей ни в одном положении и потому представлена только концевыми звеньями. Наличие сигнала С-6 в области 62 м.д. указывает на пиранозную форму колец этого моносахарида, тогда как область 64-65 м.д., характерная для фураноз, свободна от сигналов (Чижов, Шашков, 1985). Определение конфигурации аномерного центра было проведено измерением константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) С-1 с ближайшим прогоном, которая оказалась равной 170 Гц, однозначно свидетельствуя об аксиально расположенным гидроксиле, т.е. а-конфигурации галактозных остатков (Во21ек, 1гтагс1, 1981).

Таблица 1.

Положение и интерпретация сигналов "С-ЯМР спектра деполимеризованного галактоманнана семян СЛсЛгл/а Шасап^ох Ь.

Моносахаридный остаток цепи полимера химические сдвиги, м.д.

С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6

а-О-галактопираноза* 93.5 69.6 70.4 70.6 71.7 62.4

а-П-галактопиранозил 100.0 69.7 70.5 70.7 72.5 62.4

Р-Б-маннопираноза 94.9 72.5 74.3 67.9 77.4 62.3

4-0-р-0-маннопиранозил 101.4 71.2 72.7 77.8 78.0 76.3 61.8

4,6-ди-0-[3-Б-маннониранозил 101.3 71.2 72.7 78.1 78.0 74.6 67.9

* - даны дая сравнения (Липкинд и др., 1987)

Рис. 1 13С-ЯМР спектр деполимеризованного галактоманнана (3%-ный раствор в Э20) из семян гледичии обыкновенной. Обозначения: М - монозамещенный остаток маннопиранозы; М+ - дизамещенный остаток маннопиранозы; Г - остаток галактопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридных остатках

Сигналы маннозы. В спектре их больше, чем галактозных. В частности, мы видим в спектре два сигнала С-1, три сигнала - С-4 и два С-6 (рис. 1, табл. 1). Измерением величины КССВ сигналов С-1, которая оказалась равной 161.1 Гц, была однозначно показана р-конфигурация аномерного центра маннозных остатков. Отношение интегральных интенсивностей сигналов С-1 маннозы и галактозы составляло 2.37, что находилось в соответствии с данными ГЖХ (табл. 2).

Сравнение положения сигналов шести атомов углерода маннозных остатков с положением таковых свободной маннопиранозы (табл. 1, строка 3) показывает, что в сторону слабого поля смещены сигналы С-1 (+6.6 м.д.), С-4 (+10 м.д.) и второй сигнал С-6 (+5.6 м.д.), указывая на участие этих атомов углерода в образовании ковалентных связей (Яипкинд, Шангков, 1987).

Сигнал С-6 маннозы наблюдался в виде двух пиков: сильнопольный (61.8 м.д.) свидетельствовал о пиранозной форме маннозных остатков (см. выше, о сигналах галактозы). Наличие второго сигнала С-6 (67.9 м.д.) и его сдвиг в сторону слабого поля (+6.06 м.д.) свидетельствовал о замещении части маннозных остатков по С-6. Участие С-6 в образовании химической связи подтверждалось и смещением сигнала соседнего с ним С-5 в противоположном направлении (-1.69 м.д.). Важным моментом является положение в спектре замещённого С-6 (67.9 м.д), свидетельствующее о присоединении к нему а-аномера, посколько замещение р-аномером вызвало бы сдвиг сигнала С-6 в область выше 70 м.д. (Щербухнн и др., 1987). В данном случае речь идёт о присоединении по С-6 а-галактозы. Подтверждением этому служит численное равенство отношения интенсивностей сигналов С-6 замещённых и незамещённых маннозных остатков (0.43) и соотношения галактозного и маннозного

компонента (0.42, по данным ГЖХ) в полисахариде. Таким образом, из спектральных данных следует принципиальный вывод о том, что оба мономера связаны между собой ковалентной связью, свидетельствуя о гетерополисахаридной природе исследуемого галактоманпана.

Смещение сигнала С-4 в слабое поле (+10.2 м.д.) указывает на то, что в этом положении к остатку маннопиранозы присоединяется тоже остаток маннопиранозы, поскольку вопрос о позиции присоединения галактозы был рассмотрен выше.

Таким образом, данные 13С-ЯМР спектроскопии свидетельствуют о том, что в галактоманнане Gl. triacanthos оба мономера находятся в пиранозной форме, соотношение Man/Gal равно 2.37, маннопиранозные остатки имеют Р-конфигурациго и соединены между собой связью 1—>4, причем 42%, из них являются 4,6-О-дизамещёнными. По С-6 они замещены а-галактопиранозпыми остатками, которые сами пе имеют замещения, т.е. являются единичными концевыми остатками.

Более того, наблюдаемое в спектре расщеплете сигнала С-4 на три линии (рис. 1) позволяет получить информацию о гонкой структуре полимера.

Тонкая структура галактоманпана Gleditsia triacanthos.

Под тонкой структурой галактоманнанов понимают характер распределения а-галактозы вдоль цепи 1—>4 связанных маннопиранозных остатков.

Расщепление сигнала С-4 в 13С-ЯМР-спектре галактоманнанов на три линии позволяло получить такую информацию (Grasdalen, Painter, 1980). Этот феномен был ими объяснен влиянием ближайшего окружения маннозного остатка, ответственного за сигнал С-4. «Возмущающим

фактором» является наличие или отсутствие замещения галактозой этого или соседнего маннозного остатка, поскольку в остальном (конформация, замещение по С-4) соседние остатки идентичны. Т.о., спекггр позволяет заметить и определил, вариации в наличии или отсутствии заместителей у двух рядом стоящих маннозных звеньев («маннобиозных блоков»),

В рассматриваемом спектре сигнал С-4 расщеплён на три пика в узком интервале 0.5 м.д. (рис. 1, табл. 1). Сильнопольный пик (77.8 м.д.) принадлежит незамещённому маннобиозному блоку Ман-Ман; при наличии замещения галактозой у любого из остатков маннозы Ман-Маи(Гал) пик смещается в более слабое поле (78.0 м.д.) и, наконец, при наличии замещения у обоих соседних остатков манноз (Гал)Ман-Ман(Гал) - в ещё более слабое поле (78.1 м.д.). Маннобиозные блоки изображены на приводимой ниже схеме (шрифтом выделен остаток маннозы, С-4 которого ответственен за сигнал).

Гал Гал

I I

Ман—>Ман

Гал

Ман—>Ман

Гал *

Ман->Ман

Ман—>Ман

78.1 м.д. 78.0 м.д. 77.8 м.д.

Интенсивность каждого сигнала даёт возможность судить о количестве (встречаемости) каждого из маннобиозных блоков в полимерной цепи. Измерив интенсивность этих сигналов (планиметрия на развёртке участка спектра вблизи 78 м.д.) и принимая общую площадь сигнала за 100%, мы определили процентную долю таких блоков в цепи полимера. В цепи галактоманнана С. 1пасап1!юх количество блоков

составило 18%, 46% и 36%, соответствешю. Наличием сигнала двузамещенного маннобиозного звена (78.1 м.д.) в спектре галактоманнана G. triacanthos (Man/Gal 2.30) отрицается равномерное распределение галактозы в цепи, т.е. замещение ею каждого третьего остатка маннозы. Спектральные данные свидетельствуют о наличии в цепи этого галактоманнана участков с большей и меньшей плотностью галактозных заместителей.

13С-ЯМР спектроскопия галактоманнанов Astragalus falcatus, А. lehmannianus и Amorpha fruticosa.

Применяя аналогичные описанным выше подход и рассуждения было показано, что галактоманнаны A. falcatus, A. lehmannianus и Amorpha fruticosa построены однотипно. Из анализа ЯМР-спектров (рис. 2) следовало, что талактозные и маннозные остатки во всех 3 полисахаридах связаны ковалентно (позиция сигнала замещенного С-6), существуют в пиранозной форме (положение сигналов С-6 галактозы и маннозы), имеют маннозидную цепь 1-4 (сдвиг сигнала С-4 в слабое поле), часть маннозных остатков замещена еще и по С-6 галактозными остатками, определено соотношение мономеров (по интенсивностям С-1), установлена си-конфигурация галактозных и [^-конфигурация маннозных остатков. Все остатки а-галактопиранозы являются незамещенными (отсутствие сдвигов сигналов С-2 - С-6 по сравнению со свободной галакгопиранозой).

Для галактоманнана A. lehmannianus удалось получить сведения и о тонком строении полимерной цепи и количественно оценить встречаемость разнозамещенных маннобиозных блоков в ней. Блок Ман-Ман (3%); Ман-Ман(Гал) (65%) и (Гал)Ман-Ман(Гал) (31%). Интересно сравнить в этом аспекте этот высокозамещенный галактоманнан с низкозамещенным (вся цепь=1). A. lehmannianus (Man/Gal -1.24) 0.03 0.65 0.31

G. triacanthos (Man/Gal - 2.3) 0.36 0.46 0.18

Рис. 2. 13С-ЯМР спектры деполимеризованных галакгоманнанов (раствор в D30) из семян Astragalus falcatus (a), Astragalus lehmanmamts (б) и Amorpha frviicosa (в). Обозначения. М - монозамещенный остаток маннопиранозы; М* - дюамещенный остаток маннопиранозы; Г - остаток галактопиранозы Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридных остатках.

Из приведенных данных видно,что у первого галактоманнана число незамещенных («голых») матюбиозных звеньев- всего лишь 3%, тогда как у второго его встречаемость в 10 раз выше. И напротив, встречаемость моно- и двузамещенных блоков значительно выше у первого.

Физико-химические свойства водных растворов галактоманнанов. Вязкость.

Измерение относительной вязкости проводили при низких концентрациях галактоманнанов (менее 1%) в вискозиметре Оствальда. Как и предполагалось для линейных молекул, галактоманнаны обладали высоким инкрементом приведенной вязкости с резко выраженной зависимостью от концентрации. Все галактоманнаны имели высокое значение характеристической вязкости [ц] от 120 до 900 л/мг (табл. 2), что типично для полисахаридов с 1,4 диэкваториальными связями.

Молекулярные массы галактоманнанов.

Зависимость величины характеристической вязкости от молекулярной массы полимеров можно использовать для определения последней. Мы использовали для расчетов уравнение, предложенное Дублие и Лоном для галактоманнанов [ц] = 0.168 • СП098, где [т|] выражено в мл/г, СП - степень полимеризации (ОоиЬНег, Ьаипаи, 1977). Было найдено, что величины молекулярной массы исследованных галактоманнанов составляют от 134 до 997 кДа (табл. 2).

Оптическая активность водных растворов галактоманнанов.

Важное физико-химическое свойство растворов галактоманнанов в воде - их оптическая активность. Их растворы вращают плоскость поляризованного света вправо. Известно, что для 1,4-Р-о-маннанов характерен отрицательный угол вращения. Следовательно, положительную оптическую активность ГМ определяет высокое положительное вращение а-галактозного компонента. Этого следовало ожидать, так как а-галактоза обладает высокой положительной удельной активностью (+150°), а р-манноза - низкой отрицательной (-16.3°). С помощью поляриметра измеряли угол вращения раствора галактоманнана,

а затем расчитывали удельную активность (табл. 2). Однако в одном случае прямое измерение в поляриметре оказалось невозможным, поскольку раствор галактоманнапа A. lehmannianus обладал очень сильной опалесценцией. Мы поступили следующим образом.

Из литературы известно теоретическое обоснование взаимосвязи оптической активности замещенных маннанов с их моносахаридным составом (Kooiman, 1972). Нами на основании значительного числа экспериментальных данных была получена зависимость удельного вращения от содержания галактозы в галактоманнанах (приведена в диссертации). Обработанная нами математически эта связь выглядит следующим образом:

[a]D=-61.55±5.47-b3.20±0.27-G, при г=0.9850 и Sy=±3.93 п=12 где G - содержание галактозы (%) в галактоманнане.

Справедливость уравнения подтвердилась удовлетворительным совпадением опубликоватшх экспериментальных данных (случайная выборка) и рассчитанных по уравнению величин. Для галакгоманнана А. lehmannianus [а]о была рассчитана по этому уравнению (табл. 2).

Общая характеристика исследованных галактоманнанов.

Таким образом, с помощью химических методов, хроматографии и спектроскопии установлено, что компонентами макромолекулы изученных галактоманнанов являются маннопираноза и галактопираноза с количественным преобладанием первого компонента. Остатки галактопиранозы имеют a-конфигурацию гликозидного центра, а маннопиранозы - p-конфигурацию. Последние связаны между собой связью 1—>4, образуя главную цепь полимера. Часть маннопиранозных остатков имеет замещение в положении 6 единичными остатками а-галакгопиранозы, которые являются боковыми цепями минимальной длины (изображено на схеме), образуя макромолекулу типа «гребня».

D- Galp

D- Galp

Р р 6 р р 6 р р

-ИМапр4 -> 1Мапр4 1Мапр4 -> 1Мапр4 1Мапр4->

1

1«

1

1« 6 р

Р

Чередование 4,6-дизамещенных остатков маннозы (т. е. распределение галактозы .вдоль цепи) не является равномерным и различно - у разных галактоманнанов (стр. 16-17), образуя участки цепи с большей и меньшей плотностью галакгозных заместителей. Другие найденные характеристики сведены в табл. 2.

Таблица 2.

Характеристика исследованных галактоманнапов

Вид Выход,% Man/Gal MD Вязкость [rj], л/мг MM, кДа

Gieditsia triacanthos 11.4 2.30±0.09 36.3+2.9 690 789

Amorpha fruticosa 2.6 1.63±0.01 45.9+1.8 294 330

Baptisia australis 3.2 1.32+0.03 86.0+8.6 277.7 315

Astragalus falcalus 5.5 1.27±0.15 83.9±6.7 413 464

Astragalus lehmcmmamis 4.8 1.24±0.18 81.3 868.4 997

Trifolium hybridum (диплоидный) 1.5 1.15±0.06 83.7+2.8 121.6 134

Trifolium hybridum (тетраплоидный) 3.6 1.17 — — —

Характеристики описанных в литературе галактоманнанов и наши данные (включая скрининг) сведены в таблицу как приложение к диссертации.

Галактоманнаны семян и их характеристики как маркеры в хемосистематике бобовых.

В качестве основных биохимических признаков систематики бобовых мы выделили следующие характеристики этой группы растительных полисахаридов:

1. распространение среди представителей семейства бобовых, то есть наличие или отсутствие галактоманнанов в семенах;

2. содержание этих полисахаридов в семенах (количественная оценка);

3. соотношение моносахаридов (Man/Gal) как основную характеристику самих галактоманнанов.

В диссертации обсуждаются возможности и ограничения использования этих характеристик в качестве биохимических маркеров в систематике семейства. Благодаря этому анализу бобовые можно расматривать как единое семейство, включающее три подсемейства: цезальпиниевые, мимозовые и мотыльковые.

Выводы:

1. Впервые выделены и очищены шесть галактоманнанов из семян бобовых: Gleditsia triacanthos, Astragalus falcatus, Baptisia australis, Astragalus lehmannianus, Trifolium hybridum, Amorpha fruticosa. Установлено, что в состав макромолекул всех полисахаридов входят 2 моносахарида: D-манноза и D-галакгоза в различном молярном соотношении, которое варьирует от 1.15 до 2.3.

2. Установлено, что оба мономера представлены в форме пираноз, причем D-манноза имеет p-конфигурацию, а D-галактоза - а-конфигурацию своих аномерных центров. Химическими методами, а также методами ИК- и ЯМР-спектроскопии установлено, что галактоманнаны имеют «гребенчатую» структуру; главная цепь молекулы построена из 1,4-р-маннопиранозных остатков, 30-45% которых замещена в положении О-б единичными остатками D-галактопиранозы.

3. Распределение остатков а-галактопиранозы вдоль главной цепи различно у каждого галактоманнана. Методом 13С-ЯМР спектроскопии определена вероятность встречаемости замещенных галактозой двух рядом стоящих остатков маннопираноз (тонкое строение). Так, у галактоманнана Astragalus lehmannianus относительное количество незамещенных, однозамещенных и двузамещенных машюбиозных блоков Ман-Ман : (Гал)Ман-Ман : (Гал)Ман-Ман(Гал) в цепи составляло 0.03 : 0.32 : 0.65. У галактоманнана Gleditsia triacanthos с низким содержанием галактозы соотношение этих же блоков составило 0.36 :0.46 : 0.18.

4. Исследованы свойства водных растворов галактоманпанов. Они обладают высокой характеристической вязкостью (от 294 до 868 л/мг), свойственной для фибриллярных молекул. Определена средневязкостная молекулярная масса, которая составила от 330 до 997 кДа. Водные растворы галактоманпанов оптически активны: они обладают положительным удельным вращением (от 36.3 до 83.9 град.). Выведена формула, связывающая удельное вращение галактоманнанов с содержанием галактозных остатков в них.

5. Проведен химический скрининг семян 59 видов сем. бобовых, произрастающих на территории России, в результате которого у 46 видов обнаружены галактоманнаны. Определено их содержание (от 0.33 до 11.4%) и соотношение мономеров (от 1.09 до 2.70).

6. Показано, что величина Man/Gal может служить маркером для хемотаксономии семейства Fabaceae не только на уровне семейства, но и рода. Сделан прогноз, что 60-70% от общего числа видов бобовых, произрастающих на территории России, содержат в семенах галактоманнаны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Анулов О.В., Смирнова Н.И., Местечкина Н.М., Шретер И.А., Щербухин В.Д. Характеристика и структура галактоманнана астрагала серпоплодного (Astragalus falcatus Lam.) // Прикл. Биохимия и микробиология. 1995. Т. 31. № 6. С. 645-649.

2. Анулов О.В., Щербухин В.Д. Галактоманнаны семян некоторых видов сем. Fabaceae // Раст. Ресурсы. 1996. Т. № 3. С. 102-105.

3. Местечкина Н.М., Анулов О.В., Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Изучение галактоманнана семян Trifolium hybridum L. // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 6. С. 656-659.

4. Щербухин В.Д., Местечкина Н.М., Смирнова Н.И., Анулов О.В. Галактоманнан гледичии обыкновенной (Gleditsia triacanthos L.) // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №2. С. 213-216.

5. Анулов О.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Характеристика и структура семян баптизии южной ВарП.па аих1гаН.ч // Прикл.биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 6. С. 632-634.

6. Местечкина Н.М., Анулов О.В., Щербухин В.Д. Изучение галакгоманнана семян АтогрНа /гиНсояа Ь. // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т.34. № 5 С. 549-552.

7. Анулов О.В., Смирнова Н.И., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Содержание и состав некрахмальных водорастворимых полисахаридов семян некоторых видов сем. РаЬасеае //Физиология растений. 1998. Т. 45. № 6. С. 922-924.

8. Смирнова Н.И., Лобанова И.Е., Анулов О.В. Галакгоманнаны семян некоторых видов сем. РаЬасеае Сибири // Раст. Ресурсы. 1998. Т. 34. № 4. С. 68-71.

9. Анулов О.В., Пленник Р.Я. Зависимость содержания галактоманнанов в семенах некоторых видов рода Оху1гор1.ч (РаЬасеае) от условий их произрастания // Сибирский экологический журнал. 1999. Т. 6. № 3. С.

10. Анулов О.В. Перспективные виды бобовых флоры России в качестве потенциальных источников галактоманнов // Третий международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» 23-27 июня 1999 г., Пущино, С. 9-11.

11. Анулов О.В., Смирнова Н.И. Распространение запасных О-галакто-О-маннанов семян среди бобовых умеренного пояса Северной Евразии // IV съезд общества физиологов растений 3-9 октября 1999, Москва,тезисы докладов Т. 2. С. 520.

12.Анулов О.В., Щербухин В.Д., Местечкина Н.М., Смирнова Н.И. Роль галактоманнанов в хемосистематике семейства РаЬасеае // Ботанический журнал. 1999. Т. 84. № 8. С. 24-32.

13.Щербухин В.Д., Анулов О.В. Галакгоманнаны семян бобовых (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 3 С. 257-274.

14.Местечкина Н.М., Анулов О.В., Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Состав и структура макромолекулы галактоманнана семян Astragalus lehmannianus Bunge // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т. 36.

227-229.

№ 5 С. 582-587.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анулов, Олег Вячеславович

Введение.

Раздел I. Обзор литературы.

Глава 1. Запасные полисахариды семян бобовых.

1.1. Запасные ксилоглюканы бобовых.

1.2. Запасные галактаны (арабиногалактаны) бобовых.

Глава 2. Запасные галактоманнаны семян бобовых.

2.1. Распространение галактоманнанов семян среди таксонов бобовых.

2.2. Локализация галактоманнанов in vivo.

2.3. Выделение и очистка галактоманнанов.

2.4. Моносахаридный состав галактоманнанов семян бобовых.

2.5. Структура галактоманнанов семян бобовых.

2.6. Физико-химические свойства водных растворов галактоманнанов.

2.7. Метаболизм галактоманнанов в семенах бобовых.

2.7.1. Биосинтез галактоманнанов.

2.7.2. Деградация галактоманнанов в процессе прорастания семян.

2.8. Роль галактоманнанов в хемотаксономии бобовых.

2.9. Практическое использование галактоманнанов.

Раздел II. Экспериментальная часть.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Растительный материал.

3.2. Выделение и очистка галактоманнанов. Методика химического скрининга.

3.3. Общие методы.

3.4. Методы установления состава и структуры галактоманнанов.

3.5. Методы исследования физико-химических свойств растворов галактоманнанов.

Глава 4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Химический скрининг представителей семейства бобовых отечественной флоры

4.2. Выделение и очистка галактоманнанов семян бобовых с целью изучения их структуры и физико-химических свойств.

4.2.1. Выделение галактоманнана Gleditsia triacanthos, интродуцированной в Москве.

4.2.2. Выделение галактоманнана Astragalus falcatus.

4.2.3. Выделение галактоманнанов Baptisia australis.

4.2.4. Выделение галактоманнанов Trifolium hybridum (диплоидного и тетраплоидного сортов).

4.2.5. Выделение галактоманнана Amorpha fruticosa.

4.2.6. Выделение галактоманнана Astragalus lehmannianus.

4.3. Исследование состава и структуры выделенных галактоманнанов.

4.3.1. Моносахаридный состав галактоманнанов семян. Критерий гомогенности галактоманнанов.

4.3.2. Анализ восстановленных фрагментов галактоманнанов Baptisia australis, Trifolium hybridum.

4.3.3. ИК-спектроскопия галактоманнанов.

4.3.4. Положительный знак оптического вращения растворов галактоманнанов.

4.3.5. Исследование строения галактоманнанов при помощи 13С-ЯМР-спектроскопии.

4.3.6. Первичное строение галактоманнана Gleditsia triacanthos.

4.3.7. Тонкая структура галактоманнана Gleditsia triacanthos.

4.3.8. "С-ЯМР спектроскопия галактоманнанов Astragalus falcatus, А. lehmannianus и Amorpha fruticosa. Тонкое строение галактоманнана А. lehmannianus.

4.4. Физико-химические свойства водных растворов галактоманнанов.

4.5. Общая характеристика исследованных галактоманнанов.

4.6. Использование галактоманнанов семян и их характеристик как маркеров в хемосистематике бобовых.

4.7. Зависимость содержания галактоманнанов семян некоторых сибирских видов Oxytropis от условий их произрастания.

4.8. Бобовые российской флоры как источники коммерческих препаратов галактоманнанов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Галактоманнаны семян бобовых отечественной флоры"

Актуальность проблемы. Гетерополисахариды галактоманнаны относятся к группе запасных полисахаридов растений. У бобовых они локализованы в клеточных стенках эндосперма семян и являются наиболее распространённым типом углеводного резерва. Именно этим они вызывают наибольший теоретический интерес. Однако галактоманнаны полифункциональны (Вискепс^е, Яе1(1, 1996): кроме запасной они несут функцию субстанции аттрагирующей, т.е. удерживающей воду при набухании семян, а благодаря значительной плотности многих галактоманнанов, локализованных по периферии зародыша, им ещё придают и защитную функцию.

Практическое значение галактоманнанов сопоставимо с академическим интересом, который они вызывают. По масштабу использования в различных отраслях промышленности галактоманнаны и их производные занимают первое место после целлюлозы и крахмала. Эти полисахариды, благодаря уникальным свойствам своих водных растворов и отсутствию токсичности, используются в пищевой, текстильной, фармацевтической промышленности и медицине в качестве пищевых добавок, стабилизаторов, флоккулянтов, загустителей и гелеобразователей (в бинарных смесях).

В то же время информационный массив охватывает галактоманнаны (ГМ) бобовых в основном тропического и субтропического поясов (Farooqi е1 а1., 1985; Вискепс^е Й а1., 1995), тогда как галактоманнаны бобовых умеренных широт исследованы явно недостаточно. Так, на сегодняшний день полностью отсутствует информация о химическом составе и полезных свойствах 74% представителей сем. бобовых, произрастающих на территории бывшего СССР (всего 2192 вида) (Растительные ресурсы, 1994). Данная тенденция в полной мере характерна и для флоры России. В 1987 г. в лаборатории углеводов Института биохимии им. А.Н. Баха начались работы по изучению галактоманнананов семян бобовых флоры СССР (Щербухин, Смирнова и др., 1987), благодаря чему была исследована целая группа галактоманнанов отечественной флоры. Становилось актуальным провести химический скрининг бобовых при достаточно репрезентативной выборке представителей различных таксонов семейства бобовых флоры России. Получить информацию о распространении галактоманнананов среди бобовых, произрастающих в зоне умеренного климата. Выделить новые галактоманнаны и исследовать их моносахаридный состав, химическую структуру и физико-химические свойства. Изучить, по возможности, тонкое строение макромолекул изолированных галактоманнанов. Другой немаловажной мотивацией работы являлось, как её следствие, расширение базы данных по основным характеристикам галактоманнанов бобовых мировой флоры для более репрезентативных хемотаксономических и филогенетических обобщений. Исходя из этого были сформулированы задачи исследования:

Цели и задачи исследования.

Химический скрининг, включающий выделение и определение мономерного состава водорастворимых маннозосодержащих полисахаридов семян 59 видов бобовых, произрастающих на территории России.

Изолирование и очистка новых галактоманнанов из семян бобовых, относящихся к разным таксонам. Исследование состава, первичной структуры и особенностей тонкого строения цепи гетерополисахаридов.

Изучение физико-химических свойств водных растворов галактоманнанов.

Использование полученных данных в целях химической систематики и филогении бобовых.

Выявление среди бобовых российской флоры потенциального растительного источника коммерческих препаратов галактоманнанов.

Научная новизна работы.

Впервые выделены, очищены и охарактеризованы 6 галактоманнанов. Установлен их состав и первичное строение как (1->6)-а-В-галактозил-(1-»4)-Р-0-маннанов; показано, что они имеют «гребенчатую» структуру макромолекулы. У двух галактоманнанов методом 13С-ЯМР количественно охарактеризовано распределение остатков а-галактозы вдоль главной цепи полимера Исследованы вязкость и оптическая активность водных растворов галактоманнанов, а также вычислены их молекулярные массы. Впервые проведен химический скрининг семян 59 видов сем. бобовых флоры России на наличие галактоманнанов с определением их содержания и соотношения мономеров в них. Существенно расширена база данных по бобовым Северной Евразии; показана возможность использования величины Man/Gal галактоманнанов в качестве химических маркеров на уровне рода в хемотаксономии семейства.

Практическая ценность работы.

Галактоманнананы являются группой биологически активных полисахаридов с широким спектром применения в пищевой и фармацевтической промышленности и большими масштабами производства (вне России). Сведения о распространении данных полисахаридов среди

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Анулов, Олег Вячеславович

Выводы:

1. Впервые выделены и очищены шесть галактоманнанов из семян бобовых. Gleditsia triacanthos, Astragalus falcatus, Baptisia australis, Astragalus lehmannianus, Trifolium hybridum, Amorpha fruticosa. Установлено, что в состав макромолекул всех полисахаридов входят 2 моносахарида: D-манноза и D-галактоза в различном молярном соотношении, которое варьирует от 1.15 до 2.3.

2. Установлено, что оба мономера представлены в форме пираноз, причем D-манноза имеет ß-конфигурацию, а D-галактоза - а-конфигурацию своих аномерных центров. Химическими методами, а также методами ИК-и ЯМР-спектроскопии установлено, что галактоманнаны имеют «гребенчатую» структуру; главная цепь молекулы построена из 1,4-ß-маннопиранозных остатков, 30-45% которых замещена в положении О-б единичными остатками D-галактопиранозы.

3. Распределение остатков а-галактопиранозы вдоль главной цепи различно у каждого галактоманнана. Методом 13С-ЯМР спектроскопии определена вероятность встречаемости замещенных галактозой двух рядом стоящих остатков маннопираноз (тонкое строение). Так, у галактоманнана Astragalus lehmannianus относительное количество незамещенных, однозамещенных и двузамещенных маннобиозных блоков Ман-Ман : (Гал)Ман-Ман : (Гал)Ман-Ман(Гал) в цепи составляло 0.03 : 0.32 : 0.65. У галактоманнана Gleditsia triacanthos с низким содержанием галактозы соотношение этих же блоков составило 0.36 : 0.46 : 0.18.

4. Исследованы свойства водных растворов галактоманнанов. Они обладают высокой характеристической вязкостью (от 294 до 868 л/мг), свойственной для фибриллярных молекул. Определена средневязкостная молекулярная масса, которая составила от 330 до 997 кДа. Водные растворы галактоманнанов оптически активны: они обладают положительным удельным вращением (от 36.3 до 83.9 град.). Выведена

94 формула, связывающая удельное вращение галактоманнанов с содержанием галактозных остатков в них. •

5. Проведен химический скрининг семян 59 видов сем. бобовых, произрастающих на территории России, в результате которого у 46 видов обнаружены галактоманнаны. Определено их содержание (от 0.33 до 11.4%) и соотношение мономеров (от 1.09 до 2.70).

6. Показано, что величина Man/Gal может служить маркером для хемотаксономии семейства Fabaceae не только на уровне семейства, но и рода. Сделан прогноз, что 60-70% от общего числа видов бобовых, произрастающих на территории России, содержат в семенах галактоманнаны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анулов, Олег Вячеславович, Москва

1. Анулов О.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Характеристика и структура галактоманнана семян баптизии южной Baptisia australis (L.) R.Br. //Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 6. С. 632-634.

2. Анулов О.В., Пленник Р.Я. Зависимость содержания галактоманнанов в семенах некоторых видов рода Oxytropis (Fabaceae) от условий их произрастания // Сибирский экологический журнал. 1999. Т. 6. № 3. С. 227229.

3. Анулов О.В., Смирнова Н.И., Местечкина Н.М., Шретер И.А., Щербухин В.Д. Характеристика и структура галактоманнана астрагала серпоплодного (,Astragalus falcatus Lam.) // Прикл. биохимия и микробиология. 1995. Т. 31. № 6. С. 645-649.

4. Анулов О.В., Смирнова Н.И., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Галактоманнаны семян некоторых видов бобовых // Физиология растений. 1998. Т. 45. № 6. С. 922-924.

5. Анулов О.В., Щербухин В.Д. Галактоманнаны семян некоторых видов сем. Fabaceae II Раст. ресурсы. 1996. Т. 32. № 3. С. 102-105.

6. Липкинд Г.М., Шашков A.C., Кочетков Н.К. Структурный анализ полисахаридов с линейным повторяющимся звеном на ЭВМ по данным спектров 13С-ЯМР // Биоорг. Химия. 1987.Т.13. № 6. С. 833-841.

7. Местечкина Н.М., Анулов О.В., Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Изучение галактоманнана семян Trifolium hybridum L. II Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 6. С. 656-659.

8. Местечкина Н.М., Анулов О.В., Щербухин В.Д. Изучение галактоманнана семян Amorpha fruticosa L. // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 5. С. 549-552.

9. Местечкина Н.М., Довлетмурадов К., Щербухин В.Д. Галактоманнан семян солодки обыкновенной (Glyzyrrhiza glabra) // Прикл. биохимия и микробиология. 1991. Т. 27. №. 3. С. 435-441.

10. Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Изучение галактоманнана семян Galega orientalis Lam. // Прикл. биохимия и микробиология. 1990а. Т. 26. № 6. С. 799-803.

11. Методы химии углеводов / Ред. Кочетков H.K. М.: Мир, 1967. С. 286.

12. Пленник Р. Я. Морфологическая эволюция бобовых юго-восточного Алтая. Новосибирск: Наука, 1976. 216 с.

13. Пономаренко С.Ф. Порядок 86. Fabales. Семейство Fabaceae. / Сравнительная анатомия семян. Т. 5. СПб.: Мир и семья, 1996. С. 264-298.

14. Растительные ресурсы России и сопредельных государств. СПб.: Наука, 1994.271 с.

15. Смирнова Н.И., Довлетмурадов К., Щербухин В.Д. Изучение структуры и свойств галактоманнана семян Lagonychium far dum. II Прикл. биохимия и микробиология. 1987. Т. 23. № 4. С,467-471.

16. Смирнова Н.И., Лобанова И.Е., Анулов О.В. Галактоманнаны семян некоторых видов сем. Fabaceae сибири // Раст. Ресурсы. 1998. Т. №. С.

17. Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Галактоманнан семян Gleditsia caspia (гледичии каспийской). // Прикл. биохимия и микробиология. 1988. Т. 24. № 5. С. 653-659.

18. Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Структура и 13С-ЯМР-спектроскопия галактоманнана семян Indigofera tinctoria II Прикл. биохимия и микробиология. 1989. Т. 25. №2. С. 226-231. 21.Черепанов С. К. Сосудистые растения СССР. Ленинград: Наука, 1981. С. 147-249.

19. Чижов О.С., Шашков А.С. // Прогресс химии углеводов / Ред. Торгов И.В. М.: Наука, 1985. С. 30-54.

20. Щербухин В.Д. Галактоманнаны отечественной флоры // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. № 6. С. 803-813.

21. Щербухин В.Д. Галактоманнаны семян некоторых видов порядка Fabales, произрастающих в СССР // Раст. ресурсы. 1991. Т. 27. № 2. С. 1-8.

22. Щербухин В. Д., Анулов О.В. Галактоманнаны семян бобовых (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т. 35. № 3 С. 257-274.

23. Щербухин В.Д., Местечкина Н.М. Способ получения D-маннозы. А. с. № 2065499//И. 1996. №23.

24. Щербухин В.Д., Местечкина Н.М., Смирнова Н.И., Анулов О.В. Галактоманнан гледичии обыкновенной (Gleditsia triacanthos L.), интродуцированной в России // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №2. С. 213-216.

25. Щербухин В.Д., Смирнова Н.И., Довлетмурадов К. Установление1 Яструктуры галактоманнана Lagonychium farctum методом С-ЯМР спектроскопии // Прикл. биохимия и микробиология. 1987. Т. 23. № 4. С. 467-471.

26. Яковлев Г.П. Бобовые земного шара. Л.: Наука, 1991.144 с.

27. AlamN., Gupta Р.С. Structure of water-soluble galactomannan from the seeds of Teramnus labialis II Carbohydr. Res. 1986. V. 153. № 2. P.334-338.

28. A1-Kaisey M.T., Wilkie C.B. The polysaccharides of agricultural lupin seeds // Carbohydr. Res. 1992. V.227. P. 147-161.

29. Anderson E. Endosperm mucilages of legumes. Occurrence and composition I I Ind. and Eng. Chem. 1949. V. 41. № 12. P. 2887-2890.

30. Andrews P., Hough L., Jones J.K.N. Mannose-containing polysaccharides. I. The galactomannans of lucerne and clover seeds // J. Amer. Chem. Soc. 1952. V. 74. P.4029-4032.

31. Aspinall G.O., Whyte J.N.C. Polysaccharides of soy-beans. Part I. Galactomannans from the hulls // J. Chem. Soc. 1964. P. 5058-5063.

32. Bailey R. W. Polysaccharides in the Leguminosae. Chemotaxonomy of the Leguminosae. Academic Press: London, 1971. P. 503-541.

33. Bhattacharyya S.B., Das A.K., Banerji N., Farooqi M.I.H. A water-soluble galactomannan from Sesbania aegyptiaca seeds // Phytochemistry. 1983. V.22. №1. P. 161-164.

34. Blake D.E., Hamblett C. J., Frost P.G., Judd P.A., Ellis P. R. Wheat bread supplemented with depolymerized guar gum reduces the plasma cholesterol concentration in hypercholesterolemic human subjects // Am. J. Clin. Nutr. 1997. V.65. № 1. P.107-113.

35. Bjorndal H., Lindberg B., Svensson S. Gas-liquid chromatography of partially methylated alditols as their acetates // Acta Chem. Scand. 1967. V. 21. № 7. P. 1801.

36. Blumencrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids // Analyt. Biochem. 1973. V. 54. № 2. P. 484-489.

37. Bock K., Pedersen Ch., Pedersen H. Carbon-13 nuclear magnetic resonance data for oligosaccharides // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1984. V. 42. P. 193-225.11

38. Boziek S., Izzard M., Morrison A. The C-n.m.r. spectra of (1—>6)-a-D-galactosyl-(l —>4)-(3-D-mannans. // Carbohydr. Res. 1981. V. 93. № 2. P.279283.

39. Bresolin T. M., Sander P.C., Reicher F., Sierakowski M.R., Rinaudo M., Ganter J. L. M. S. // Viscometric studies on xanthan and galactomannan systems. Carbohydr. Polym. 1997. T.33. №2/3. C. 131-138.

40. Brillouet J. M., Riochet D. Cell Wall polysaccharides and lignin in cotyledons and hulls of seeds of various lupin (Lupinus L.) species // J. Sci. Food Agric. 1983. V. 34. P. 861-868.

41. Buckeridge M.S., Dietrich S.M.C. Galactomannans from Brazilian legume seeds //Revtabrasil Bot. 1990. V. 13. № 2. P. 109-112.

42. Buckeridge M.S., Panegassi Y.R., Rocha D.C., Dietrich S.M.C. Seed galactomannan in the classification and evolution of the Leguminosae // Phytochemistry. 1995. V. 38. № 4. P. 871-875.

43. Buckeridge M.S., Reid J.S.G. Major cell wall storage polysaccharides in legume seeds: Structure, catabolism and biological functions // Ciencia e Cultura. 1996. V. 48. №3. P. 153- 162.

44. Buckeridge M. S., Rocha D.C., Reid J.S.G., Dietrich S. M. C. Xyloglucan structure and post-germinative metabolism in seeds of Copaifera langsdorfii from savanna and forest populations // Physiologia Plantarum. 1992. V. 86. P. 145151.

45. Bulpin P.V., Gidley M.J., Jeffcoat R., Underwood D. R. Development of a biotechnological process for the modification of galactomannan polymers with plant a-galactosidase // Carbohydr. Polym. 1990. V. 12. № 2. P. 155-168.

46. Cerezo A. S. The constitution of a galactomannan from the seed of Gleditsia amorphoides //J.Org. Chem. 1965. V. 30. P. 924-926.

47. Clarke M. T., Majewich T. G., Modi J. J. Ethyl galactomannan film properties for use in personal care applications // Res. Disci. 1996. V. 384. P. 232-236.

48. Courtois J.E., Le Dizet P. Recherches sur les galactomannananes. V. e tude de Taction d une preparation commerciale d'hemicellulase // Bull. Soc. Chim. Biol. 1968. V. 50. №10. P. 1695-1710

49. Courtois J.E., Le Dizet P. Recherches sur les galactomannanes. VI action de quelques mannanases sur diverses galactomannanes // Bull.Soc. Chim. Biol. 1970. V. 45. № 1. p. 15-22.

50. Courtois J.E., Le Dizet P. Recherches sur les galactomannananes. IV. action de quelques preparations enzymatiques sur les galactomannanes de trefle et gleditschia // Bull.Soc. Chim. Biol. 1963. V. 45. № 7-8. C. 743-747.

51. Courtois J. E., Le Dizet P., Robic D. Étude complementare de la structure de trois galactoxyloglucanes (Amyloïdes) de granes // Carbohydr. Res. 1976. V. 49. P. 439-449.

52. Daoud Kamel M. The reserve polysaccharide of the seed of fenugreek: its digestibility and its fate during germination // Biochem. J. 1932. V.26. C.255-263.

53. Davis A.L., Hoffmann R.A., Russell A.L., Debet M. JH and I3C-NMR characterization of the digalactosylmannopentaose liberated from legume seed galactomannan by p-mannanase action // Carbohydr. Res. 1995. V. 271. № 1. P. 43-54.

54. Dea I.C.M., Morrison A. Chemistry and interaction of seed galactomannans // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1975. V. 31. P. 241-312.

55. Dey P. Biochemistry of a-D-galactosidic linkages in the plant kingdom // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1980. V. 37. P. 283-372.

56. Dey P. Biochemistry of plant galactomannans // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1978. V. 35. P. 341-376.

57. Doublier J.L., Launay B. Propriétés rheologiques des solutions aqueuses de galactomannanes: role de la masse moleculaire mayenne et de la concentration // Cahiers Croupe Franc. Rheol. 1977. V. 4 № 5. P. 191-198.

58. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956 V. 28 №3. P. 350-356.

59. Edwards M., Bulpin P.V., Dea I.C.M., Reid J.S.G. Biosynthesis of legume-seed galactomannans in vitro II Planta. 1989. V. 178. № 1. P. 41-51.

60. Edwards M., Reid J.S.G. Galactomannans and other cell wall storage polysaccharides in seeds. Food Polysaccharides and their application. N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 1995. P. 155-185.

61. Edwards M., Scott C., Gidley M.J., Reid J.S.G. Control of mannose/galactose ration during galactomannan formation in developing legume seeds // Planta. 1992. V. 187. P. 67-74.

62. Farooqi M.I.H., Kapoor V.P., Khan P.S.H. Phytochemical observations on the seed galactomannan contents in some Indian Leguminosae // Research and Industry. 1985. V. 30. № 1. P. 144-149.

63. Ford C. W. Galactomannan from the seed of Indigofera spicata // Aust. J. Chem. V. 22. № 10. P. 2005-2009.

64. Gidley M. J., McArtur A., Underwood D. R. 13C NMR characterization of molecular structures in powder, hydrates and gels of galactomannans and glucomannans // Food Hydrocolloids. 1991. V. 5. № 1-2. P. 129-140.

65. Grasdalen H., Painter T. N.M.R. studies of composition and sequence in legume-seed galactomannans // Carbohydr. Res. 1980. V. 81. № 1. P. 59-66.

66. Gupta А. К. N.m.r. studies of composition and side-chain arrangement in Sesbania aegyptiaca seed galactomannan I I Carbohydr. Res. 1989. V. 188. P. 239-244.

67. Gupta A. K., BeMiller J. N. A galactomannan from Crotalaria medicaginea seeds // Phytochemistry. 1990. V. 29. № 3. P. 853-855.

68. Gupta A.K., Bose S. Structure of the D-galacto-D-mannan isolated from the seeds of Melilotus indica All // Carbohydr. Res. 1986. V. 153. № 1. P. 69-77.

69. Gupta A. K., Chougule M. A., Padalkar R. K., Yadav V. K. A galactomannan from Cassia spectabilis DC seeds // Indian J. Chem., 1995. V. 34B. № 10. P. 889892.

70. Gupta A. K., Grasdalen H. A D-galacto-D-mannan from Melilotus officinalis seeds // Carbohydr. Res. 1988. V.173. № 1. P. 159-168.

71. Gupta D. S., Jann В., Bajpai K. S., Sharma S. C. Structure of a galactomannan from Cassia alata seed // Carbohydr. Res. 1987. V. 162. № 2. P.271-276.

72. Gupta R., Gupta P. Chandra A neutral seed-gum from Crotalaria verrucosa II Carbohydr. Res. 1988. V. 181. P. 287-292.

73. Gupta R., Knare N., Singh V., Gupta P.C. A neutral seed-gum from Cassia renigera II Carbohydr. Res. 1987. V. 159. № 2. P. 336-340.

74. Gurha S.Gopal, Singh L. Structural studies of the D-galacto-D-mannan from the seeds of Parkinsonia aculeata Linn. // Carbohydr. Res. 1988. V. 183. № 1. P. 144-149.

75. Hegnauer R. Uber das Endosperm der Leguminosen // Pharmazeutische Zentralhalle fur Deutschland. 1957. V. 96. № 4. P. 141-148.

76. Hegnauer R., Grayer-Barkmeijer R.J. Relevance of seed polysaccharides and flavonoids for the classification of the leguminosae: a chemotaxonomic approach // Phytochemistry. 1993. V. 34. № 1. P. 3-16.

77. Heyne E., Whistler Roy L. Chemical composition and properties of guar polysaccharides // J. Amer. Chem. Soc. 1948. V. 70. P. 2249-2252.

78. Hirst E.L., Jones J.K.N. The galactomannan of carob-seed gum (gum gatto) // J. Chem. Soc. 1947. P. 1278-1282.

79. Hoffman J., Lindberg B., Painter T. The distribution of the D-galactose residues in guaran and locust bean gum // Acta Chem. Scand. 1976. V.30. P.365-376.

80. Horvei F. K., Wickstrom A. The structure of a galactomannan from White Clover seeds {Trifolium repens L.) // Acta Chem. Scand. 1964. V. 18. № 3. P.833-835.

81. Hsu D.-S., Reeves R. E. The structure of nasturtium amyloid // Carbohydr. Res. 1967. V. 5. № 1. P. 202-209.

82. Kantouch F., Ragheb A. Preparation and characterization of polyacrylic acid-leucaena gum as a thickener in reactive dye printing pastes // Polym. Polym. Compos. 1997. V. 5. № 2. P. 139-144.

83. Kapoor V.P. A galactomannan from the seeds of Delonix regia I I Phytochemistry. 1972. V. 11. № 3. P. 1129-1132.

84. Kapoor V.P., Mukherjee S. Isolation of five oligosaccharides from the galactomannan of Cassia absus seed // Phytochemistry. 1971. V. 10. P. 655-659.

85. Kato K., Nitta M., Mizuno T. Infrared spectroscopy of some mannans // Agric. Biol. Chem. 1973. V. 37. № 2. P. 433-435.

86. Kooiman P. Structures of the galactomannans from seeds of Annona muricata, Arenga saccharifera, Cocos nucifera, Convolvulus tricolor and Sophora japonica II Carbohydr. Res. 1971. V. 20. № 2. P. 329-337.

87. Kooiman P. The constitution of the amyloid from seeds of Annona muricata L. // Phytochemistry. 1967. V. 6. № 11. P. 1665-1673.

88. Kooiman P. The relation between monosaccharide composition and specific optical rotation of galactomannans from plant seeds // Carbohydr. Res. 1972. V. 25. P. 1-9.

89. Kooiman P. On the occurrence of amyloids in plant seeds // Acta Bot. Neeland. 1960. V. 9. № 2. P. 208-219.

90. Larson E.B., Smith F. The constitution of the galactomannan of the seeds of the Kentucky coffee bean (Gymnocladus dioica) II J. Amer. Chem. Soc. 1955. V. 77. P. 429-432.

91. Leschziner C., Cerezo A.S. The structure of a galactomannan from the seed of Gleditsia triacanthos II Carbohydr. Res. 1970. V. 15. P. 291-299.

92. Lima M.M.S., Ono L., Reicher F., Sierakowski M.R. Natural and sulfated polysaccharides from Caesalpiniaceae seeds // Lat. Am. Appl. Res. 1996. V. 26. P. 1-3.

93. Lipkind G.M., Shaskov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computer assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13C-NMR date // Carbohydr. Res. 1988. V. 175. № 1. P. 59-76.

94. Mallet I., McCleary B.V., Matheson N.K. Galactomannan changes in developing Gleditsia triacanthos seeds // Phytochemistry. 1987. V. 26. № 7. P. 1889-1894.

95. Manzi A.E., Ancibor E., Cerezo A.S. Cell-Wall carbohydrates of the endosperm of the seed of Gleditsia triacanthos II Plant Physiol. 1990. V. 92. № 4. P. 931-938.

96. Manzi A.E., Cerezo A.S., Shoolery J.N. High resolution 13C-N.M.R. spectroscopy of legume-seed galactomannans // Carbohydr. Res. 1986. V. 148. №2. P. 189-197.

97. McCleary B.V. Enzymic interaction in the hydrolysis of galactomannan in germinating guar: the role of exo-p-mannanase // Phytochemistry. 1983. V. 22. № 3. P. 649-658.

98. McCleary B.V. Modes of action of {3-mannanase enzymes of diverse origin on legume seed galactomannans // Phytochemistry. 1979.V. 18. № 5. P.757-763.

99. McCleary B.V. Purification and properties of a p-D-mannoside mannohydrolasefrom guar//Carbohydr. Res. 1982. V.101. № 1. P. 75-92.

100. McCleary B. V., Matheson N. K. Action patterns and substrate-binding requirements of P-D-mannanase with mannosaccharides and mannan-type polysaccharides//Carbohydr. Res. 1983. V. 119. P. 191-219.

101. McCleary B. V., Matheson N. K., Small D. M. Galactomannans and a galactoglucomannan in legume seed endosperm: structural requirements for (3-mannanase hydrolysis//Phytochemistry. 1976. V. 9. P. Ill 1-1117.

102. McCleary B. V., Nurten E., Taravel F. R., Joseleau J.-P. Characterisation of oligosaccharides prodused on hydrolysis of galactomannan with (3-D-mannanase // Carbohydr. Res. 1983. V. 118. P. 91-109.

103. Misra A.N., Baweja J.M. Modified guar gum as hydrophilic matrix for controlled release tablets // Indian Drugs. 1997. V. 34. № 4. P. 216-223.

104. Morimoto J.Y., Unrau I.C.J., Unrau A.M. Chemical and physical properties and the enzymatic degradation of some tropical plant gums // Agr. and Food Chem. 1962. V.10.№ 2. P. 134-137.

105. Muralikrishna G., Tharathan R.N., Bhat U. Ramadas Heterogeneity and structural investigation of galactomannans isolated from the seeds of Cassia sericea // Carbohydr. Res. 1988. V.182. № 1. P.l 19-125.

106. Nagori B.P., Mathur N.K. Preparation of galactomannans beads for pharmaceutical applications // Indian J. Chem. Technol. 1996. V. 3. № 5. P. 279281.

107. Parker M.L. Cell Wall storage polysaccharides in cotyledons of Lupinus angustifolius L. I. Deposition during seed development // Protoplasma. 1984. V. 120. №3. P. 224-232.

108. Petkowicz C.L.O., Sierakowksi M.R., Ganter J.L.M.S., Reicher F. Galactomannans and arabinans from seeds of Caesalpiniaceae // Phytochemistry. 1998. V. 49. №3. P. 737-743.

109. Rees D., Scott W. Conformational analysis of polysaccharides: stereochemical significance of different linkage positions in linked polysaccharides//J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1969. V. 18. P. 1037-1038.

110. Reid J.S.G., Bewley J. D. A dual role for the endosperm and its galactomannan reserves in the germinative physiology of fenugreek (Trigonellafoenum-graecum L.), an endospermic leguminous seed//Planta. 1979. V. 147. №2. P. 145-150.

111. Reid J.S.G., Edwards M., Gidley M.J., Clark A.H. Enzyme specificity in galactomannan biosynthesis // Planta. 1995. V. 195. № 4. P. 489-495.

112. Reid J.S.G., Edwards M.E., Gidley M.J., Clark A.H. Mechanism and regulation of galactomannan biosynthesis in developing leguminous seeds // Biochem. Soc. Transaction. 1992. V.20. № 1. C. 23-26.

113. Reid J.S.G., Meier H. Chemotaxonomic aspects of the reserve galactomannans in leguminous seeds // Z. Pflanzenphysiol. 1970. V. 62. P. 8992.

114. Rizvi S.A.I., Gupta P.C., Kaul R.K. The structure of a galactomannan from the seeds of Cassia nodosa II Planta Medica. 1971. V. 20. № 1. P. 24-32.

115. Schulze E., Steiger E. Zur Kenntnis des Paragalaktans // Landwirtsch Vers. Stn. 1892. V.41.P. 220-223.

116. Sen A.K., Banerji N. A water-soluble galactomannan from the seeds of Indigofera tinctoria linn II Carbohydr. Res. 1986. V. 157. P. 251-256.

117. Shcherbukhin V.D. Galactomannans from seeds of leguminous plants found in the Soviet Union // Food Hydrocolloids. 1992. V.6. № 1. P. 3-7.

118. Singh R.B., Jindal V.K. Galactomannan from Cassia javanica seeds. Isolation and structure elucidation of oligosaccharides // Polish J. Chem. 1983. V. 57. P. 1263-1266.

119. Sinha M.P., Tiwari R.D. The structure of a galactomannan from the seeds of Desmodium pulchellum //Phytochemistry. 1970. V. 9. № 8. P. 1881-1883.

120. Smith F. The constitution of carob gum // J. Amer. Chem. Soc. 1948. V. 70. P. 3249-3253.

121. S0mme R. The structure of a galactomannan from Anthyllis vulneraria L. // Acta Chem. Scand. 1967. V. 21. № 3. P. 685-690.

122. S0mme R. The structure of a galactomannan from Lotus corniculatus L. // Acta Chem. Scand. 1966. V. 20. № 2. P. 589-590.

123. S0mme R. The structure of a galactomannan from Medicago lupulina L. // Acta Chem. Scand. 1968. V. 22. № 3. P. 870-876.

124. Soni S.K., Bose S. Seed galactomannans and their structure // J. Scientific Industrial Research. 1985. V. 44. № 10. P. 544-547.

125. Srivastava H.C., Singh P.P., Subba Rao P.V. A galactomannan from seeds of Sesbania grandiflorapers II Carbohydr. Res. 1968. V. 6. P. 361-366.

126. Tewary K., Khare N., Singh V., Gupta P.C. A non-ionic seed-gum from Cassia corymbosa II Carbohydr. Res. 1984. V. 135. № 1. p. 141 -146.

127. Tookey H.L., Lohmar R.L., Wolff I.A., Jones Q. New sources of seed mucilages //Agr. and Food Chem. 1962. V. 10. № 2. P. 131-133.

128. Unrau A.M., Choy Y.M. Identification of linkages of a galactomannan isolated from seed of Caesalpinia pulcherima II Carbohydr. Res. 1970. V. 14. P.151-158.

129. Varma R., Wardi A. N., Varma R. S. Separation of aldononitryl acetatates of neutral sugars by GLC and its application to polysaccharides // J. Chrom. 1973. V. 77. № l.p. 222.

130. Vogel T., Schleiden M. J. Über das amyloid, eine neue pflanzensubstanz // Ann. Phys. Chem. 1839. V. 119. P. 240-252.

131. Whistler R.L. Solubility of polysaccharides and their behavior in solution // Advances Chem. Series. 1973. № 117. P. 242-254.

132. Whistler Roy L., Saamio J. Galactomannan from soy bean hulls // J. Amer. Chem. Soc. 1957. V.79. P. 6055-6057.

133. Williams J., Villarrora H., Petek F. a-galactosidases II, in and IV from seeds of Trifolium repens I I Biochem. J. 1978. V. 175. P. 1069-1077.108

134. York W.S., H. van Halbeek, Darvill A.G., Albersheim P. Structural analysis of xyloglucan oligosaccharides by 'H-n.m.r. spectroscopy and fast-atom-bombardment mass spectrometry // Carbohydr. Res. 1990. V. 200. P. 9-31.

135. Zawadzki-Baggio S.F. Sierakowksi M.R., Correa J.B.C., Reicher F. A linear (1—>5)-linked a-L-arabinofuranan from the seeds of guapuruvu (Schizolobium parahybum) // Carbohydr. Res. 1992. V. 233. P. 265- 269.