Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры замещенных β-маннанов семян бобовых и синтез их биологически активных сульфатированных производных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры замещенных β-маннанов семян бобовых и синтез их биологически активных сульфатированных производных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

На правахрукописи

ЕГОРОВ Александр Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ Р-МАННАНОВ СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в лаборатории Инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН-

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.Д. Щербухин Официальные опоненты:

доктор биологических наук, профессор О.Л. Озерецковская доктор химических наук, профессор В.П. Варламов

Ведущая организация:

МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет

Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в_часов на

заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гетерополисахариды - замещенные (3-маннаны

бобовых - относятся к группе запасных полисахаридов. Они локализованы в клеточных стенках эндосперма и являются углеводным энергетическим резервом семян. Замещенные маннаны способны удерживать значительное количество воды и, благодаря этому, служат регулятором водного баланса семени при прорастании. У бобовых эта группа полисахаридов представлена исключительно галактоманнанами. Наличие близких им по структуре галактоглюкоманнанов, распространенных в семенах других семейств, например, ирисовых и лилейных, для бобовых оказалось уникальным, и к началу нашей работы такой полисахарид был изолирован из семян только одного вида. Помимо академического интереса эта группа полисахаридов имеет важное прикладное значение. По масштабу использования в различных отраслях промышленности галактоманнаны и их производные уступают только целлюлозе и крахмалу. Уникальные реологические свойства галактоманнанов в совокупности с отсутствием токсичности и наличием биологической активности позволяют применять их в пищевой, фармацевтической, медицинской промышленности, косметике и др. Следует отметить, что наряду с природными галактоманнанами используются и полусинтетические производные - например, этил-, карбоксиметил-, карбокси-, оксипропилгалактоманнаны (Cheng et al., 2002) и ряд других.

Особый интерес представляют сульфатированные галактоманнаны. К началу нашей работы исследования их не носили систематического характера. Известно, что три полученных деривата проявляли антикоагуляционную активность (Bode, Franz, 1989; Lima et al, 1996; Pires et al., 2001). Между тем, поиски и создание альтернативы гепарину признано в мировой науке важной областью исследования (Gunay, Linhardt, 1999; Yoshida, 2001). Причиной этого являются серьезные недостатки препаратов гепарина - естественного антикоагулянта прямого действия, используемого в клинике. Одним из путей создания т.н. «гепариноидов» является сульфатирование полисахаридов растительного происхождения. Для построения обоснованных выводов относительно биологической (в том числе, антикоагуляционной) активности сульфатов галактоманнанов необходимо

получение и исследование серии препаратов, различающихся своими характеристиками. Это необходимо для выявления корреляции структура-функция и направленного синтеза активных препаратов.

Изложенное выше определяет актуальность изучения новых замещенных Р-маннанов, а также получение сульфатированных производных, обладающих антикоагуляционной активностью.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование новых замещенных Р-маннанов семян бобовых и синтез сульфатов галактоманнанов, обладающих антикоагуляционной активностью.

Эта цель в рамках диссертационной работы диктовала следующие задачи:

• Изолирование и исследование структуры галактоманнанов, представляющих научный и практический интерес.

• Выделение и характеристика новых галактоглюкоманнанов из разных частей семени Cercis canadensis L. (багрянника канадского).

• Разработка условий синтеза сульфатированных галактоманнанов с разными параметрами структуры. Тестирование их биологической активности. Научная новизна работы. Выделены и изучены состав и структура

галактоманнанов Gleditsiaferox Desf., Gleditsia triacanthosf. inermis L., Lotus corniculatus L. У первых двух галактоманнанов охарактеризовано тонкое строение, т.е. распределение остатков а-галактозы вдоль главной цепи. Определены параметры структуры макромолекул и их физико-химические свойства. Выделены и охарактеризованы галактоглюкоманнаны из эндосперма и кожуры семян Cercis canadensis L. Впервые обнаружено, что замещенные аналогичного

строения и близкого состава могут иметь различную локализацию в семени (эндосперм и кожура) и, соответственно, выполнять две разные функции -запасную и структурную. Проведено сульфатирование 4-х галактоманнанов с разным соотношением Ман:Гал (1.1-5.2) и примерно равной молекулярной массой (ок. 100 кДа). Полученная высокая степень замещения не зависит от структурных параметров полисахаридов. В двух тестах in vitro - определение тромбинового времени и ингибирование агрегации тромбоцитов - установлено, что полученные производные обладают антикоагуляционной активностью. Найдено, что величина

эффекта находится в прямой зависимости от содержания галактозы в галактоманнане.

Практическая ценность работы. Получены новые сведения о строении и свойствах замещенных р-маннанов - полисахаридов с широкими возможностями применения.

Разработаны условия и осуществлен синтез сульфатированных производных галактоманнанов.

Положительный результат тестирования биологической активности синтезированных сульфатов галактоманнанов дает основание для расширения работ по созданию активных гепариноидов.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на V Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, Россия, 2003) и на III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 5 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экпериментальной части, включающей в себя описание материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (118 наименований, в том числе 98 на иностранных языках). Работа изложена на 105 страницах, включает 18 рисунков и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Семена Cercis canadensis L., Gleditsia triacanthosf. inermis L. и Gleditsiaferox Desf. были предоставлены для исследования из коллекции бобовых Ботанического сада Ростовского государственного университета, Lotus corniculatus L. - из коллекции семян Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН. Видовая аутентичность исследованных семян подтверждена ведущими специалистами вышеуказанных организаций. Для сульфатирования были выделены и очищены 4 растительных галактоманнана из коллекции семян нашей лаборатории.

Выделение и очистку замещенных Р-маннанов из семян проводили по схеме, которая включала измельчение и фиксацию семян кипящим 80 %-ным этанолом, водную экстракцию полисахаридов, избирательное осаждение замещенных маннанов из раствора в виде комплекса с ионами Си2+. При выделении галактоманнанов из конкретных объектов вводились дополнительные стадии: обработка растительного материала бензолом; депротеинизация полученного полисахарида с помощью проназы (из Streptomyces grisens, КФ 3.4.244, удельная активность - 8 ед/мг ) и/или по методу Севага. В некоторых случаях выделение полисахаридов осуществляли из изолированных частей семени. При экстракции галактоглюкоманнанов дополнительно использовали растворы NaOH различной концентрации.

Для установления состава, структуры и свойств полисахаридов в работе использовались следующие методы: полный и частичный кислотный гидролиз, частичная деполимеризация, анализ состава олигосахаридов, ферментативный гидролиз, бумажная, тонкослойная, газо-жидкостная, ионообменная и гельпроникающая хроматография, ИК- и 13С-ЯМР-спектроскопия, поляриметрия, вискозиметрия и другие.

Для определения содержания введенных в полисахарид SO31- -групп, использовали известный турбидиметрический метод (Dodgson, Price, 1962). Калибровочный график строили для растворов К^04 различной концентрации.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Изучение галактоманнанов семян Lotus corniculatus L., Gleditsia triacanthosf. inermis L., Gleditsiaferox Desf.

Выход очищенных препаратов галактоманнанов из семян L. corniculatus., G. triacanthosf. inermis составил 1.65 и 15.4 % соответственно. Полисахарид семян G. ferox выделяли из изолированного эндосперма; выход в пересчете на целые семена составил 18.9 %. Полученные препараты представляли собой негигроскопичные, белые или кремовые порошки без запаха.

Моносахаридный состав. На ранних этапах выделения препараты содержали от 4 до 6 Сахаров - рамнозу, арабинозу, ксилозу, глюкозу, маннозу и галактозу,

причем последние два значительно преобладали. В процессе очистки содержание сопутствующих Сахаров снижалось до следовых количеств, тогда как соотношение маннозы и галактозы практически не изменялось. Поскольку постоянство соотношения мономеров является общепринятым критерием гомогенности для гетерополисахаридов, был сделан вывод о том, что полученные препараты представляли собой галактоманнаны.

Анализ олигосахаридов галактоманнанов L. corniculatus и G. triacanthos f. inermis позволил установить, что остатки галактозы во всех фрагментах не занимают редуцирующих позиций в макромолекуле, не связаны между собой, а присоединены к звеньям маннозы. Последние занимают как концевые, так и нередуцирующие позиции.

С помощью ферментативного гидролиза эндо-1,4^-маннаназой (из Bacillus subtilis, КФ 3.2.1.78, удельная активность 12.8 ед/мг) галактоманнанов L. corniculatus и G triacanthosf. inermis было показано наличие 1,4-р-маннозидной связи в основной цепи полимеров. За процессом следили по изменению приведенной вязкости растворов полисахаридов. Приведенная вязкость раствора галактоманнана L. corniculatus за 5 ч снизилась на 23 %, а для раствора G triacanthosf. inermis — на 83 %. Результаты позволили предположить, что скорость и глубина гидролиза значительно отличались для этих двух замещенных маннанов. Как известно (McCleary et al, 1983), эффект энзиматического расщепления галактоманнанов зависит от количества и расположения вдоль основной цепи боковых a-D-галактопиранозных остатков, поскольку заместители создают стерические затруднения для действия фермента. Таким образом, результаты гидролиза объясняются различным содержанием галактозы в полисахаридах (45.1 % и 29.2 % соответственно).

ИК-спектроскопия. Для всех исследуемых галактоманнанов были записаны ИК-спектры. Кривые поглощения всех трех полисахаридов оказались подобны. В области 700-1200 см-1 были обнаружены характеристичные для маннопиранозных остатков полосы поглощения 900-920 см"1, 870-875 см'1 и 812-820 см-1. В целом, такой тип кривой поглощения в низкочастотной области ИК-спектров характерен для полисахаридов, у которых главная цепь полностью или на довольно про-

тяженных участках образована р-маннопиранозными остатками со связью 1—» 4 (Каго ег а1., 1973).

Одним из свидетельств в пользу а-конфигурации гликозидного центра галактозы в галактоманнанах является положительный знак оптического вращения их растворов. Как известно, р-маннаны обладают отрицательными величинами оптической активности, тогда как растворы исследованных полисахаридов имели положительный угол вращения (табл. 2). Это могло быть только в том случае, если остаток Б-галактозы находился в а-конфигурации, так как именно а-Б-галактоза обладает высоким положительным удельным вращением.

Для окончательного установления структуры макромолекул галактоманнанов была использована 13С-ЯМР спектроскопия. Большая молекулярная масса галактоманнанов препятствовала получению хорошо разрешенных ЯМР-спектров, поэтому полисахариды подвергали частичной деполимеризации по методу Божика (Бойек ег а1. 1981). Полученные фрагменты по структуре полностью соответствовали исходным макромолекулам, отличаясь кратно уменьшенной молекулярной массой. ЯМР-спектры исследованных галактоманнанов по набору сигналов резонанса атомов углерода были идентичны, поэтому подробно остановимся на анализе только одного спектра- галактоманнана G.ferox.

На рис. 1 представлен 13С-ЯМР-спектр галактоманнана G ferox\ в табл. 1 приведены величины химических сдвигов сигналов резонанса и их интерпретация.

Сравнение химических сдвигов сигналов С-атомов галактозных остатков с химическими сдвигами сигналов свободной галактозы (табл. 1) показывает, что только С-1 атом этого моносахаридного остатка испытывает сдвиг в слабое поле (+ 6.7 м.д.), так называемый «а-эффект». Это свидетельствовало о его участии в образовании ковалентной (галактозидной) связи. Величина химического сдвига характерна для а-конфигурации аномерного центра галактозы. Химические сдвиги сигналов остальных атомов галактозных остатков практически не отличались от аналогичных сигналов атомов свободной а-галактопиранозы, что свидетельствовало об отсутствии у них заместителей. Положение сигнала С-6 однозначно указывало на пиранозный размер цикла галактозных остатков полисахарида.

остаток D-маннопиранозы; М+ - дизамещенный остаток; D-маннопиранозы; G - остаток О-галактопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов вмоносахаридных остатках.

Таблица 1

Положение и интерпретациясигнало^3С-ЯМРспектра деполимеризованного галактоманнана семян О./вгох

Моносахаридный остаток цепи полимера Химические сдвиги, м.д.

С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6

. ^ (Х-О-галактопираноза' 93& 69,6 70.4 70.6 71.7 62.4

о-Ю-галактопираиозил 100.2 69.9 70.7 70.9 72.6 62.6

• - - • . •« ,..... л V „ , 0-В-маянот*раноза 94,9 - 72.5 . ! , . ? '743 6%9 г 77.4 п №

4-0-р-0-маннопиранозил 101.6 71.5 72.9 77.9 78.2 76.5 62.0

4,6-ди-0-Р-0-маннопиранозил 101.4 71.1 72.5 78.2 78.4 74.9 68.0

* - даны для сравнения (Липкиндидр, 1987)

Таким образом, а-галактозные остатки полимера являются нередуцирующими и незамещенными, т.е. единичными звеньями.

Рассмотрим серию сигналов маннозных остатков в спектре. С-2 и С-3 имели по одному сигналу, С-1, С-5 и С-6 - по два, а С-4 - три сигнала. Конфигурация аномерного центра маннозных остатков была определена как в по величине химического сдвига С-5 (76.5 м.д.). Сравнивая положение сигналов атомов углерода маннозных остатков с положением сигналов свободной в-маннпиранозы (табл 1), можно видеть, что смещение в сторону слабого поля испытывали сигналы С-1 (+ 6.7), С-4 (+ 10.5) и второй сигнал С-6 (+ 6.0 м.д.). Это доказывает участие этих атомов в образовании ковалентных связей.

Положение пика С-6 свидетельствовало о существовании маннозных остатков полимера в пиранозной форме. Химический сдвиг второго сигнала С-6 указывал на его замещение а-аномером (т.е. галактозой). Этот факт в совокупности с участием С-1 галактозных остатков в образовании ковалентной связи является доказательством гетерополисахаридной природы изучаемого галактоманнана.

Химический сдвиг сигнала С-4 говорит о наличии в положении 4 заместителя, которым также является в-маннопираноза, так как галактоза присоединена по С-6. Расщепление сигнала С-4 на 3 линии (77.9, 78.2 и 78.4 м.д.) связано с наличием (или отсутствием) галактозилирования по С-6 у двух соседних остатков (Grasdalen, Painter, 1980). Первый сигнал принадлежит незамещенному галактозой «маннобиозному блоку» Ман-Ман, средний - сумме двух разных однозамещенных блоков (Гал)Ман-Ман и Ман-Ман(Гал) и третий - слабопольный сигнал - блоку с двумя галактозными заместителями - (Гал)-Ман-Ман(Гал). Соотношение интенсивностей этих сигналов, найдено как 0.37 : 0.47 : 0.16 соответственно (вся цепь принята за 1). Указанное соотношение характеризует вероятность встречаемости различных блоков в маннопиранозной цепи.

Из соотношения интегральных интенсивностей сигналов С-1 маннозы и галактозы получаем соотношение мономеров 2.55. Отношение интенсивности сигнала С-6 замещенного остатка маннозы к сумме обоих сигналов С-6

характеризует долю замещенных остатков маннозы в цепи - 0.38. Обе величины находились в хорошем соответствии с данными ГЖХ (2.54 и 0.39 соответственно).

Таким образом, данные "С-ЯМР спектроскопии свидетельствуют о том, что в галактоманнане О. ferox оба мономера находятся в пиранозной форме, соотношение Мап:ва1 равно 2.55, маннопиранозные остатки имеют Р-кон-фигурацию и соединены между собой связью 1-> 4, причем 47 % из них являются 4,6-ди-О-замещёнными. По С-6 они замещены а-галактопиранозными остатками, которые сами не имеют замещения, т.е. являются единичными концевыми остатками.

Применяя аналогичные рассуждения, было показано, что галактоманнаны О. МаеаШкоз/. тегт1$ и Ь. согтсыЫш имеют подобную структуру. Из их ЯМР-спектров следовало, что галактозные и маннозные остатки в обоих полисахаридах связаны ковалентно и существуют в пиранозной форме. В обоих полисахаридах Б-маннопиранозные звенья посредством 1,4-Р-связи образуют полимерную цепь, в которой часть маннозных остатков замещена по С-6 единичными остатками а-га-лактопиранозы. Определенное по интегральным интенсивностям сигналов С-1, соотношение мономеров для О. triacanthosf. Ыегт1$ составило 2.4:1, для Ь. сог-тсыШш - 1.2:1, что хорошо согласуется с данными ГЖХ (табл. 2). Интенсивность трех линий сигнала С-4 в спектре галактоманнана О. tгiacanthos f. ineгmis свидетельствовала, что встречаемость блоков Ман-Ман составила 34 %, (Гал)Ман-Ман и Ман-Ман(Гал) - 50 %, (Гал)Ман-Ман(Гал) - 16 %. В спектре галактоманнана Ь. согтсыЫш не удалось получить разрешение сигнала С-4.

Физико-химическихсвойстварастворов галактоманнанов. Вязкость. Измерение относительной вязкости проводили при низких концентрациях растворов галактоманнанов (менее 1%) в вискозиметре Оствальда. Все галактоманнаны обладали высоким инкрементом приведенной вязкости с резко выраженной зависимостью от концентрации и имели высокое значение характеристической вязкости (табл. 2), что характерно для жестких фибриллярных макромолекул.

Характеристика исследованных галактоманнанов

Галактоманнан Выход, % Man:Gal [ab,° Вязкость fob мл/г MM, кДа

L. corniculatus 1.65 1.22 + 84.1 559 640

G. triacanthosf. inermis 15.4 2.42 + 31.0 578 660

G.ferox 18.9 2.54 + 30.5 1430 1660

Величина характеристической вязкости использовалась для расчета молекулярной массы (табл. 2) по уравнению, предложенному Дублие и Лонэ для галактоманнанов (Doublier, Launay, 1977).

Растворы галактоманнанов обладали оптической активностью. Величины их удельного вращения приведены в табл. 2.

Таким образом, с помощью химических, хроматографических и спектроскопических методов установлено, что макромолекулы изученных галактоманнанов состоят из маннопиранозы и галактопиранозы с количественным преобладанием первого компонента. Остатки галактопиранозы имеют а-кон-фигурацию гликозидного центра, а маннопиранозы - Р-конфигурацию. Последние связаны между собой связью 1—>4, образуя главную цепь полимера. Часть маннопиранозных остатков имеет замещение в положении С-6 единичными остатками а-галактопиранозы, которые являются боковыми цепями минимальной длины. То есть, все изученные нами полисахариды имеют «гребенчатый» тип строения макромолекул.

2. Изучение галактоглюкоманнанов из семян Cercis canadensis L.

Для определения моносахаридного состава частей семени С. canadensis был проведен хроматографический анализ гидролизатов эндосперма, кожуры и зародыша. Наибольшее количество маннозы (72 %) содержалось в эндосперме. Значительное количество маннозы было найдено и в кожуре (45 %), поэтому было

принято решение о выделении полисахаридов, как из эндосперма, так и из кожуры.

Галактоглюкоманнан, выделенный из эндосперма. В водном экстракте эндосперма количество маннозосодержащих полисахаридов (после селективного осаждения) оказалось крайне низким и составило всего 0.06 %. Затем продолжали экстракцию 15 %-ным №ОИ. Выход полисахаридов в этом случае составил 18.0 %, из них маннозосодержащих — 9.6 %.

Моносахаридный состав галактоглюкоманнанов, выделенных из эндосперма, приведен в табл. 3. В обоих полисахаридах (водная и щелочная экстракция) мажорный сахар - манноза (83.4 % и 82.9 %), в обоих случаях содержится небольшая примесь арабинозы. Различия заключаются в соотношениях галактозы и глюкозы. В галактоглюкоманнане, полученном водной экстракцией, содержание галактозы превалирует над содержанием глюкозы. В полисахариде из щелочного экстракта это соотношение обратное.

Для установления первичной структуры галактоглюкоманнанов бвша использована 13С-ЯМР-спектроскопия. Спектр (рис. 2) бвш снят в Б2О при рН ~ 11 для полисахарида, полученного щелочной экстракцией и затем подвергнутого

Таблица 3

Соотношение (весовое)моносахаридов в галактоглюкоманнанах, выделенных изэндосперма и кожуры

Эндосперм Кожура

Моносахариды Водная экстракция Щелочная экстракция Щелочная экстракция

Препарат 1 Препарат 2

Рамноза 0 0 0.08 ±0.02 0

Арабиноза 0.19 ±0.01 0.28 ±0.03 0.16 ±0.01 0.10 ±0.03

Ксилоза 0 0 0.07 ±0 0

Манноза 12.33 ±0.09 10.42 ±0.22 4.50 ±0.36 4.66 ±0.22

Галактоза 1.27 ±0.06 0.87 ±004 0.90 ±0.07 0.80 ±0.08

Глюкоза 1 1 1 1

частичной деполимеризации. Анализируя полученный спектр, мы можем сделать вывод о том, что в составе полимера нет фураноз, поскольку величины химических сдвигов сигналов С-1, С-4 и С-6 (табл. 4) каждого мономера характерны для пиранозных форм (Bock, Pedersen, 1983).

Рассмотрим сигналы атомов углерода галактопиранозных остатков. На их а-конфигурацию указывает химический сдвиг С-1 (99.5 м.д.). Положение всех сигналов галактозных остатков за исключением С-1 практически совпадает с аналогичными сигналами свободной галактопиранозы (табл. 1). Следовательно, остатки галактозы не имеют замещений, а значительный сдвиг сигнала С-1 в слабое поле (+ 6.0 м.д.) объясняется участием этого атома в образовании гликозидной связи.

Судя по величине химического сдвига сигнала С-1 остатков глюкозы в полимере, последние имеют Р-конфигурацию глюкозидного центра. Сравнивая

5М

4M

—1—1—■—■—■—1—>—>—■—■—I—>—■—>—■—I—■—■—-—>—I—■—>—■—■—t—•—>—-—•—I—>—>—'—1—I—1—<—>—'—г-1D0 95 ВО 89 ВО 73 70 65 60

Рис 2.13С-ЯМР-спектр галактоглюкоманнана из эндосперма С. canadensis. M-монозамещенный остаток D-маннопиранозы; М+ - дизамещенный остаток D-маннопиранозы; Gal - остаток D-галактопиранозы; Glc - остаток глюкопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридных остатках.

Положение и интерпретация сигналов в 13С-ЯМР-спекторе галактоглюкоманнана С. canadensis

Моносахари дн ы й остаток цепи полимера Химический сдвиг, м.д.

С1 С2 СЗ С4 С 5 С6

99.5 68.7 70.3 70.8 72.4 62.65

101.4 71.75 73.05 77.3 76.7 62.05

4,6-а«-0-Р-0-Мап/7 100.5 71.75 73.05 77.3 75.7 67.2

4-0-р-Т>-С1ср 1042 74.75 74.55 76.15 80.0 76.4 61.8

Р-1>-глк)ко1шраноза* , 97.1 70,9*" "712, 624

• •Дано для сравнения (ЫркШ е? а1,1988)

положение сигналов свободной Р-Б-глюкопиранозы и глюкозных звеньев полимера (табл. 4) приходим к выводу, что у последних атомы С-1 и С-4 участвуют в образовании гликозидных связей, о чем свидетельствуют сдвиги в слабое поле (+ 7.1 и + 9.1 м.д.). Остальные сигналы практически совпадают, указывая на отсутствие замещения в соответствующих позициях.

Анализ сигналов маннозных остатков полимера позволяет заключить, что они имеют реконфигурацию аномерного центра, о чем можно судить по химическому сдвигу С-5. В сильном поле маннозным остаткам принадлежали два сигнала С-6 (62.05 и 67.2 м.д.). Второй, менее интенсивный сигнал С-6 в более слабом поле (+5.15 м.д.) появился благодаря наличию замещения в этой позиции у части ман-нопиранозных звеньев. Химический сдвиг второго сигнала свидетельствовал о замещении а-аномером, т.е. в данном случае об а-галактозилировании по С-6 определенной доли остатков маннопиранозы. Сравнивая химические сдвиги сигналов свободной Р-Б-маннопиранозы и остатков Р-Б-маннопиранозы полимера (табл. 1 и 4), мы видим, что сигналы С-1 и С-4 последних значительно смещены в слабое поле (+ 7.5 и + 9.4 м.д.), указывая на участие этих атомов в образовании гликозидной связи 1,4.

Суммируя изложенное выше, можно сделать вывод, что макромолекула изученного полисахарида сочетает в себе элементы строения глюко- и галактоманнана. Имеется линейная цепь из 1,4-Р-связанных Б-глюко- и Б-манно-пиранозных остатков (структура глюкоманнана), причем к части последних по С-6 присоединены единичные остатки а-Б-галактопиранозы, образуя «гребень» (структура галактоманнана). Схематически это можно изобразить следующим образом:

Р-Мапр (1-4)-р-Мапр (1-4) -р-Мапр (1-4)-р-Ыср (1-4)-0-Мапр (1-4)

Галактоглюкоманнан, выделенный из кожуры. Для выделения полисахаридов использовали схему, описанную для получения полимеров из эндосперма. Выход их из водного экстракта составил 3.3 %, из щелочного (с последующим выделением маннозосодержаших полисахаридов) - 16.9 %.

Моносахаридный состав полисахаридов устанавливали с помощью хроматографического анализа. В препарате, экстрагированном водой, были найдены рамноза, арабиноза, манноза, галактоза и глюкоза в приблизительно равных количествах. Можно было предположить, что данный препарат содержит набор гемицеллюлоз.

Из щелочного экстракта кожуры был селективно выделен маннозосодержащий полисахарид - препарат 1 (табл. 3), в котором были обнаружены мажорные моносахариды - манноза, глюкоза и галактоза, небольшая примесь арабинозы, в следовых количествах идентифицировались рамноза и ксилоза. Отсюда следовало, что препарат 1 может являться галактоглюкоманнаном. Для подтверждения этого предположения, повторили осаждение ионами Си2+ - препарат 2. Потери при повторной очистке составили лишь 8.5 %. При сравнении состава препаратов 1 и 2 (табл. 3) оказалось, что содержание арабинозы уменьшилось, исчезли рамноза и ксилоза, а соотношение основных моносахаридов практически не изменилось. Этот факт свидетельствовал

в пользу того, что препарат, выделенный из кожуры, также представлял собой гетерополисахарид - галактоглюкоманнан.

Для сравнения полисахаридов, выделенных из эндосперма и кожуры, были сняты их ИК-спектры. В характеристической для углеводов области (700-1200 см"1) кривые поглощения были идентичны друг другу, а также спектрам исследованных нами ранее замещенных Р-маннанов.

Если состав галактоглюкоманнана, выделенного из кожуры (выход 16.9 %), сопоставить с таковым для полисахарида, полученного при щелочной экстракции из эндосперма (выход 9.6 %), то становится очевидным, что в этих галакто-глюкоманнанах молярные соотношения Глю : Гал совпадают, при этом резко различаются соотношения Ман : Гал (табл. 3). В два раза меньшее Ман : Гал в экстрагированном из кожуры полисахариде означает увеличение вдвое боковых ответвлений основной цепи, представленных единичными остатками галактопиранозы. При этом, как известно, повышается растворимость 1,4-р-ман-нанов и, как следствие, облегчается их экстракция. Это подтвердилось более высоким выходом препарата 1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что из разных частей семени С. canadensis мы извлекли аналогичные по составу галактоглюкоманнаны. Этот факт представляет большой интерес. Известно, что в кожуре семян подсемейства цезалыганиевых мажорными полисахаридами являются арабинаны различного состава и структуры, в то время как в эндосперме в качестве мажорных полисахаридов содержатся галактоманнаны. Арабинанам в составе гемицеллюлоз придается опорная функция, а галактоманнаны представляют собой резервные полисахариды. Т.к. и в кожуре и в эндосперме семян С. canadensis, принадлежащему этому же подсемейству, нами обнаружены галактоглюкоманнаны, можно предположить, что в данных семенах галактоглюкоманнаны могут иметь разные функции.

3. Сульфатированные галактоманнаны - потенциальные гепариноиды.

На основе известных принципов получения сульфатов полисахаридов (Pires et al., 2001; Huynh et al., 2001; Geresh et al., 2002) нами была разработана методика

сульфатирования галактоманнанов. Она содержит три этапа: 1 - подготовка полисахарида; 2 - реакция сульфатирования и 3 - очистка производного и получение натриевой соли сульфата галактоманнана.

1 этап. Сульфатирование чаще всего проводится в среде безводного диметилформамида (ДМФА), в котором галактоманнаны не растворяются. Для минимизации сложностей, возникающих вследствие проведения химического синтеза в гетерогенной фазе, галактоманнан был переосажден спиртом из водного раствора, а затем осадок полисахарида был последовательно промыт спиртом и ДМФА в 3-кратной повторности для каждого растворителя. Такая подготовка образца была необходима для лучшей сольватации ОН-групп полисахарида.

2 этап. Реакцию сульфатирования проводили в строго безводной среде в присутствии триэтиламина (ТЭА). Сульфатирование осуществлялось с помощью пиридин-8Оз комплекса, который всегда применяется в избытке по отношению к количеству свободных ОН-групп гексозных остатков в полисахариде. В наших экспериментах использовался трехкратный молярный избыток. Реакция проводилась в течение 4 ч при постоянном перемешивании и заданной температуре.

3 этап. Для остановки реакции сульфатирования добавляли ледяную воду и ТЭА. Полученную смесь диализовали. Затем раствор пропускали через ионообменную колонку (Н+-форма). Для получения Na-соли сульфата галактоманнана, его раствор нейтрализовали 1М CH3COONa и полисахарид осаждали.

Эксперименты по синтезу сульфатов галактоманнанов и испытанию их антикоагуляционной активности проводились на четырех галактоманнанах с различным соотношением Ман:Гал (табл. 5).

1 - Galega orienthalis; 2 - Cyamopsis tetragonoloba; 3 - Ceratonia siliqua; 4 — Sophora japonica. Эти полисахариды далее для краткости в тексте, таблицах и рисунках будут названы 1 - Галега; 2 - Гуар; 3 - Локуст бин; 4 - Софора.

Для всех галактоманнанов с помощью деполимеризации были получены фрагменты макромолекул с молекулярными массами в интервале 80-100 кДа, с неизмененной структурой, которая была подтверждена сохранением соотношения

мономеров и идентичностью ИК-спектров исходных и деполимеризованных полисахаридов.

Сульфатированные производные галактоманнанов были синтезированы в одинаковых условиях при Г = 60 °С. Для доказательства присутствия сульфогрупп в продуктах синтеза были записаны ИК-спектры. Для всех сульфатов галактоманнанов наблюдали интенсивную полосу поглощения при 1250 ± 3 см"1, которая принадлежит валентным колебаниям S=O. Этот факт свидетельствует о замещении части свободных гидроксилов БОз'"группами. В качестве примера приведены ИК-спектры Гуара до и после сульфатирования (рис. 3). Результаты количественного определения сульфогрупп в полученных производных представлены в табл. 5. Из приведенных данных следует, что достигнутая нами степень замещения (DS) не зависит от величины соотношения мономеров в данных галактоманнанах.

№у«лить«га (ст-1)

1.00' ' | | ( ! ! 1 1 ! 1

а^ 1 А 1 ! 1 1

1 1 ! ; • ! 1

1 ! 1 ' 1

1 ! | ! 1 1 ' '

! I 1 ! ! ! '

I I I 1 1 !

1 ] 9 1 1 ! 1 •

\ О ' ! 1 1

I ' ! 1 1 ; I

I | : ) | 1 1 | 1

| ! I 1 1

! ! 1 1

1 ! из

И Ьи \ \

X уд / 1 } / 1 \ I

Jl ■ №« | Л ■

^ | ■ 1 1 . ! 1 1

1500 1000 900

(ст-1)

Рис 3. ИК-спектры исходного (А) и сульфатированного (В) Гуара. Стрелкой отмечено положение полосы поглощения группы S-O.

Содержание сульфогрупп в синтезированных производных галактоманнанов

Галактоманнан Кол-во SO42-, % DS Ман:Гал до реакции Ман:Гал после реакции

Галега 52.30 1.85 1.07 1.13

Гуар 46.41 1.46 1.70 1.64

Локуст бин 45.70 1.42 2.80 2.88

Софора 52.28 1.85 5.30 5.21

Более высокая DS с крайними значениями Ман : Гал по сравнению с двумя промежуточными, возможно, объясняется тем, что сульфатирование в первую очередь проходит по первичным ОН-группам, т.е. группам находящимся при шестом атоме углерода (Manner et al., 2001). В часто- (Галега) и редкозамещенных (Софора) галактоманнанах большинство таких свободных групп, принадлежащих галактопиранозному остатку в первом случае и маннопиранозному во втором, оказываются одинаково доступными для реакции сульфатирования. Для 2-х других галактоманнанов с промежуточными величинами соотношения мономеров, видимо, возникают стерические затруднения для синтеза.

Чтобы убедиться в отсутствии деградации полисахаридов в процессе сульфатирования, для всех полученных производных определяли мономерный состав. Как видно из табл. 5, соотношение мономеров сохранилось для всех сульфатов галактоманнанов. Для полисахарида Гуара до и после сульфатирования была проведена гельпроникающая хроматография. Максимум пика сульфопроизводного имел меньшее время удерживания по сравнению с исходным полисахаридом, что свидетельствовало об увеличении молекулярной массы за счет сульфатирования. На хроматограмме сульфатированного полисахарида была выявлена низкомолекулярная фракция в количестве 3.1 %, которая, вероятно, могла принадлежать продуктам деградации. Поэтому можно полагать, что в процессе синтеза деградация галактоманнанов не происходит или наблюдается в очень слабой степени.

и

а

представлены результаты для галакто-маннана Гуара при разных температурах в интервале 19-60 °С. Как видим, зависимость - температура оказалась линейной с хорошим коэффициентом корреляции (г = 0.9995), что

Чтобы иметь возможность вводить заданное количество сульфогрупп, мы

решили выявить зависимость степени сульфатирования от температуры (при прочих равных условиях). На рис 4.

»

30

40

Я

60

Рис 4. Зависимость степени сульфа-тирования от температуры для га-лактоманнана Гуар

позволяет контролировать глубину сульфатирования.

Биологическая активность сульфатированных галактоманнанов. Из литературы известно (Alban, Franz, 2001), что многие сульфополисахариды проявляют антикоагуляционную активность. С целью выяснения, обладают ли полученные нами производные галактоманнанов этими свойствами, в их присутствии было проведено 2 анализа: определение тромбинового времени и степень агрегации тромбоцитов. Исследования были проведены в клинико-биологической лаборатории института хирургии им. А.В. Вишневского РАМН.

Первый тест - определение тромбинового времени - позволил установить зависимость времени коагуляции плазмы от концентрации сульфатов галактоманнанов. Как видно из рис. 5, в пределах использованных концентраций зависимости линейны, кроме того, угол наклона зависит от соотношения моносахаридов в галактоманнане. Наибольший угол, а, следовательно, наивысшая активность наблюдалась для галактоманнана Галеги, соотношение Ман:Гал в котором составляет 1.13. Наименьшая активность была отмечена для галактоманнана Софоры, которая имеет наибольшее соотношение Ман:Гал 5.21. Таким образом, антикоагулянтные свойства сульфатированных производных зависят от содержания галактозы в исходном полисахариде. Для подтверждения этого положения была построена зависимость увеличения времени образования

Рис 5. Зависимость времени коагуляции плазмы от концентрации сульфатов галактоманнанов: 1 -Галега, 2 - Гуар, 3 -Локуст бин, 4- Софора

Рис 6. Зависимость увеличения тром-бинового времени в присутствии сульфатов галактоманнанов (с=10-1%) от содержания в них галактозы: 1 - Галега, 2 - Гуар, 3 -Локуст бин, 4 - Софора

тромбоцитарного сгустка в присутствии сульфатов галактоманнанов (по сравнению с чистой плазмой) от содержания галактозы в полисахаридах. Из рис. 6 видно, что зависимость является линейной. Поэтому очевидно, что существует прямая корреляция между антикоагуляционной активностью сульфатов галактоманнанов и степенью замещения Р-маннанов в интервале соотношений Ман:Гал1.1-5.2.

Второй тест - измерение агрегационной активности тромбоцитов -проводили на агрегометре в присутствии индуктора АДФ. Результат, т.е. величина активности выражается отношением предельного процента оптического пропускания в эксперименте по сравнению с таковым в донорской плазме, принимаемым за 100 %. Иначе говоря, чем меньше пропускание, тем больше ингибирование процесса агрегации тромбоцитов. Результаты представлены на рис. 7. Как видно, наименьшее пропускание наблюдается в присутствии галактоманнана Галега, наибольшее - галактоманнана Софоры. Таким образом,

Рис. 7. Коагулограммы донорской плазмы в присутствии сульфа-тированных галактоманнанов (с = 10 "3 %):

1 - Галега, 2 - Гуар, 3 - Локуст бин, 4 - Софора, 5 - донор

мы наблюдаем ту же тенденцию - прямую зависимость проявляемого эффекта от содержания галактозы в полисахариде.

Проведенные исследования безусловно свидетельствуют, что сульфатированные галактоманнаны обладают антитромботической активностью, что проявилось в прямом антикоагуляционном эффекте при определении тромбинового времени и снижении функциональной активности тромбоцитов. Дальнейшее развитие работы предполагает определение активности полученных производных в других общепринятых тестах, а также установление величины эффектов в зависимости от физико-химических параметров макромолекул полисахаридов. Это необходимо для выяснения механизма взаимодействия сульфатов галактоманнанов с компонентами системы свертывания крови и направленного синтеза активных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Из семян Gleditsia ferox Desf., Gleditsia triacanthos f. inermis L., Lotus corniculatus L. выделены галактоманнаны с различным молярным соотношением мономеров (Ман:Гал) 2.54, 2.42 и 1.22 соответственно. С помощью химических, физико-химических методов и спектроскопии (ИК- и 13С-ЯМР) установлено строение полисахаридов. Их макромолекулы представляют собой основную цепь из 1,4-р-Б-маннопиранозных звеньев,

определенная часть которых в положении С-6 замещена единичными остатками а-галактопиранозы. Для двух первых галактоманнанов установлена тонкая структура, т.е. распределение галактозы вдоль основной цепи.

2. Галактоманнаны обладали оптической активностью: положительное удельное

вращение [а]о находилось в интервале 30.5 - 84.1°. Водные растворы полисахаридов отличались высокой вязкостью ([т|] = 559 - 1430 мл/г), свойственной фибриллярным макромолекулам. На основе значений характеристической вязкости рассчитаны величины их молекулярной массы: 600-1660кДа.

3. Из эндосперма и кожуры семян Cercis canadensis L. впервые выделены

галактоглюкоманнаны, определен их мономерный состав. Для одного из них с помощью 13С-ЯМР-спектроскопии установлена первичная структура: его главная цепь представлена 1,4-р-Б-глюко- и маннопиранозными остатками, последние замещены по С-6 единичными остатками а-галактопиранозы. Впервые обнаружено, что аналогичные по составу и строению полисахариды локализованы в разных частях семени (эндосперм и кожура) и имеют, по-видимому, разные функции - запасную и структурную.

4. Найдены условия синтеза, контролирующие степень сульфатирования

галактоманнанов и установлено, что существует прямая корреляция между количеством инкорпорированных сульфогрупп и температурой проведения реакции.

5. Получены сульфатированные производные 4-х галактоманнанов с разным

соотношением Ман:Гал (1.1 - 5.2). Установлено, что степень замещения в разработанных условиях реакции не зависит от содержания галактозы в полисахаридах.

6. В двух анализах in vitro показано, что полученные сульфаты галактоманнанов

обладают антикоагуляционной активностью. Они увеличивают тромбиновое время и снижают функциональную активность тромбоцитов. При этом установлено, что величины обоих эффектов зависят от содержания галактозы в галактоманнанах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Анулов О.В., Пономаренко С.Ф., Егоров А.В. Галактоманнаны семян

некоторых видов сем. Fabaceae II Растительные ресурсы. 2003. Т. 39. № 1. С. 80-83.

2. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Установление первичной и

тонкой структуры галактоманнана семян Gleditsia triacanthos f. inermis L. // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 4. С. 452-456.

3. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Пленник Р.Я., Щербухин В.Д.

Водорастворимый галактоманнан семян Lotus corniculatus L.: строение и свойства // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 5. С. 577-580.

4. Егоров А.В., Анулов О.В., Щербухин В.Д. Гледичия как источник

галактоманнанов - растворимых пищевых волокон // Труды V Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Москва. 2003. Т. 3. С 333-335.

5. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Состав и структура

макромолекулы галактоманнана семян Gleditsiaferox II Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 3. С. 370-375.

6. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Сульфатированные

галактоманнаны бобовых - как потенциальные гепариноиды // Материалы Ш Всероссийской школы-конференции «Химия и биохимия углеводов». Саратов. 2004. С. 30.

7. Местечкина Н.М., Егоров А.В., Анулов О.В., Щербухин В.Д. Изучение

галактоглюкоманнанов из семян Cercis canadensis L. // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. (в печати).

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 01.10.2004 г. Формат 60x90 1/16. Печ.лист 1,5. Тираж 120 экз. Заказ 1013. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

^24 8 4 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егоров, Александр Владимирович

ф Введение.

Раздел I. Обзор литературы.

Глава 1. Запасные галактоманнаны семян бобовых.

1.1. Запасные полисахариды семян бобовых.

1.2. Галактоглюкоманнаны семян бобовых.

1.3. Общая характеристика галактоманнанов семян бобовых.

1.4. Строение галактоманнанов.

1.4.1. Моносахаридный состав.

1.4.2. Структура макромолекул. ф 1.5. Физико-химические свойства водных растворов галактоманнанов.

1.6. Функции галактоманнанов. с 1.7. Промышленное получение галактоманнанов.

I 1.8. Применение галактоманнанов.

Глава 2. Сульфатированные галактоманнаны бобовых потенциальные гепариноиды.

Раздел II. Экспериментальная часть.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Растительный материал.

3.2. Методы выделения и очистки галактоманнанов.

3.3. Выделение и очистка галактоглюкоманнанов.

3.4. Методы установления состава и структуры полисахаридов.

3.4.1. Химические методы.

3.4.2. Хроматографические методы.

3.4.3. Спектральные методы.

3.5. Методы исследования физико-химических свойств растворов галактоманнанов.

3.6. Методика сульфатирования галактоманнанов.

3.7. Методика определения сульфогрупп в ф полисахаридах.

Глава 4. Изучение галактоманнанов семян Lotus corniculatus L.,

Gleditsia triacanthos f. inermis L., Gleditsia ferox Desf. ч 4.1. Выделение и очистка галактоманнанов.

4.2. Моносахаридный состав галактоманнанов.

4.3. Установление структуры галактоманнанов.

4.3.1. Анализ восстановленных фрагментов галактоманнанов

L. corniculatus и G. triacanthos f inermis.

4.3.2. Ферментативный гидролиз галактоманнанов ф L. corniculatus и G. triacanthos f inermis.

4.3.3. ИК-спектроскопия галактоманнанов.

4.3.4. Положительный знак оптического вращения растворов галактоманнанов.

4.3.5. С-ЯМР-спектроскопия галактоманнанов.

4.3.6. Первичное строение молекулы галактоманнана G. ferox.

4.3.7. Тонкая структура галактоманнана G. ferox.

4.3.8. ,3С-ЯМР

-спектроскопия галактоманнанов G. triacanthos f inermis и L. corniculatus.

4.4. Изучение физико-химических свойств растворов галактоманнанов.

4.4.1. Вязкость и молекулярная масса галактоманнанов.

4.4.2. Оптическая активность.

Глава 5. Изучение галактоглюкоманнанов из семян Cercis canadensis L.

5.1. Моносахаридный состав семян С. canadensis.

5.2. Галактоглюкоманнан, выделенный из эндосперма семян С. canadensis.

5.3. Галактоглюкоманнан, выделенный из кожуры семян С. canadensis.

Глава 6. Сульфатированные галактоманнаны.

6.1. Синтез сульфатированных галактоманнанов.

6.2. Биологическая активность сульфатированных галактоманнанов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структуры замещенных β-маннанов семян бобовых и синтез их биологически активных сульфатированных производных"

Актуальность проблемы. Гетерополисахариды — замещенные 0-ман-наны бобовых - относятся к группе запасных полисахаридов. Они локализованы в клеточных стенках эндосперма и являются углеводным энергетическим резервом семян. Замещенные маннаны способны удерживать значительное количество воды и, благодаря этому, служат регулятором водного баланса семени при прорастании. У бобовых эта группа полисахаридов представлена исключительно галактоманнанами. Наличие близких им по структуре галактоглюкоманнанов, распространенных в семенах других семейств, например, ирисовых и лилейных, для бобовых оказалось уникальным, и к началу нашей работы такой полисахарид был изолирован из семян только одного вида. Помимо академического интереса эта группа полисахаридов имеет важное прикладное значение. По масштабу использования в различных отраслях промышленности галактоманнаны и их производные уступают только целлюлозе и крахмалу. Уникальные реологические свойства галактоманнанов в совокупности с отсутствием токсичности и наличием биологической активности позволяют применять их в пищевой, фармацевтической, медицинской промышленности, косметике и др. Следует отметить, что наряду с природными галактоманнанами используются и полусинтетические производные — например, этил-, карбоксиметил-, карбокси-, оксипропилгалактоманнаны (Cheng et al., 2002) и ряд других.

Особый интерес представляют сульфатированные галактоманнаны. К началу нашей работы исследования их не носили систематического характера. Известно, что три полученных деривата проявляли антикоагуляционную активность (Bode, Franz, 1989; Lima et al, 1996; Pires et al., 2001). Между тем, поиски и создание альтернативы гепарину признано в мировой науке важной областью исследования (Gunay, Linhardt, 1999; Yoshida, 2001). Причиной этого являются серьезные недостатки препаратов гепарина - естественного антикоагулянта прямого действия, используемого в клинике. Одним из путей создания т.н. «гепариноидов» является сульфатирование полисахаридов растительного происхождения. Для построения обоснованных выводов относительно биологической (в том числе, антикоагуляционной) активности сульфатов галактоманнанов необходимо получение и исследование серии препаратов, различающихся своими характеристиками. Это необходимо для выявления корреляции структура - функция и направленного синтеза активных препаратов.

Изложенное выше определяет актуальность изучения новых замещенных Р-маннанов, а также получение сульфатированных производных, обладающих антикоагуляционной активностью.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование новых замещенных р-маннанов семян бобовых и синтез сульфатов галактоманнанов, обладающих антикоагуляционной активностью.

Эта цель в рамках диссертационной работы диктовала следующие задачи:

Изолирование и исследование структуры галактоманнанов, представляющих научный и практический интерес. ф ■ Выделение и характеристика новых галактоглюкоманнанов из разных частей семени Cercis canadensis L. (багрянника канадского).

Разработка условий синтеза сульфатированных галактоманнанов с разными параметрами структуры. Тестирование их биологической активности.

Научная новизна работы. Выделены и изучены состав и структура галактоманнанов Gleditsia ferox Desf., Gleditsia triacanthos f. inermis L., Lotus corniculatus L. У первых двух галактоманнанов охарактеризовано тонкое % строение, т.е. распределение остатков а-галактозы вдоль главной цепи.

Определены параметры структуры макромолекул и их физико-химические свойства. Выделены и охарактеризованы галактоглюкоманнаны из эндосперма и кожуры семян Cercis canadensis L. Впервые обнаружено, что замещенные Р-маннаны аналогичного строения и близкого состава могут иметь различную локализацию в семени (эндосперм и кожура) и, соответственно, выполнять две разные функции — запасную и структурную. Проведено сульфатирование 4-х галактоманнанов с разным соотношением Ман:Гал (1.1-5.2) и примерно равной молекулярной массой (ок. 100 кДа). Полученная высокая степень замещения не зависит от структурных параметров полисахаридов. В двух тестах in vitro — определение тромбинового времени и ингибирование агрегации тромбоцитов — установлено, что полученные производные обладают антикоагуляционной активностью. Найдено, что величина эффекта находится в прямой зависимости от содержания галактозы в галактоманнане.

Практическая ценность работы. Получены новые сведения о строении и свойствах замещенных Р-маннанов - полисахаридов с широкими возможностями применения.

Разработаны условия и осуществлен синтез сульфатированных ф производных галактоманнанов.

Положительный результат тестирования биологической активности синтезированных сульфатов галактоманнанов дает основание для расширения работ по созданию активных гепариноидов.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на V Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, Россия, 2003) и на III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» ф (Саратов, Россия, 2004).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Егоров, Александр Владимирович

выводы

Из семян Gleditsia ferox Desf., Gleditsia triacanthos f. inermis L., Lotus corniculatus L. выделены галактоманнаны с различным молярным соотношением мономеров (Ман:Гал) 2.54, 2.42 и 1.22 соответственно.

С помощью химических, физико-химических методов и

11 спектроскопии (ИК- и С-ЯМР) установлено строение полисахаридов. Их макромолекулы представляют собой основную цепь из 1,4-fi-D-маннопиранозных звеньев, определенная часть которых в положении С-6 замещена единичными остатками а-галактопиранозы. Для двух первых галактоманнанов установлена тонкая структура, т.е. распределение галактозы вдоль основной цепи.

Галактоманнаны обладали оптической активностью: положительное удельное вращение [a]D находилось в интервале 30.5 - 84.1°. Водные растворы полисахаридов отличались высокой вязкостью ([rj] = 559 — 1430 мл/г), свойственной фибриллярным макромолекулам. На основе значений характеристической вязкости рассчитаны величины их молекулярной массы: 600 — 1660кДа.

Из эндосперма и кожуры семян Cercis canadensis L. впервые выделены галактоглюкоманнаны, определен их мономерный состав. Для одного из них с помощью ,3С-ЯМР-спектроскопии установлена первичная структура: его главная цепь представлена l,4-P-D-niK)KO- и маннопиранозными остатками, последние замещены по С-6 единичными остатками a-галактопиранозы. Впервые обнаружено, что аналогичные по составу и строению полисахариды локализованы в разных частях семени (эндосперм и кожура) и имеют, по-видимому, разные функции - запасную и структурную.

Найдены условия синтеза, контролирующие степень сульфатирования галактоманнанов и установлено, что существует прямая корреляция между количеством инкорпорированных сульфогрупп и температурой проведения реакции.

Получены сульфатированные производные 4-х галактоманнанов с разным соотношением Ман:Гал (1.1 - 5.2). Установлено, что степень замещения в разработанных условиях реакции не зависит от содержания галактозы в полисахаридах.

В двух анализах in vitro показано, что полученные сульфаты галактоманнанов обладают антикоагуляционной активностью. Они увеличивают тромбиновое время и снижают функциональную активность тромбоцитов. При этом установлено, что величины обоих эффектов зависят от содержания галактозы в галактоманнанах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егоров, Александр Владимирович, Москва

1. Липкинд Г.М., Шашков А.С., Кочетков Н.К. Структурный анализ полисахаридов с линейным повторяющимся звеном на ЭВМ по данным спектров 13С-ЯМР // Биоорганическая химия. 1987.Т.13. № 6. С. 833-841.

2. Местечкина Н.М., Анулов О.В., Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Изучение галактоманнана семян Ttifolium hybridum L. // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 6. С. 656-659.

3. Местечкина Н.М., Анулов О.В., Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Состав и структура макромолекулы галактоманнана семян Astragalus lehmannianus Bunge // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 5. С. 582-587.

4. Методы химии углеводов / Ред. Кочетков Н.К. Москва: изд-во «Мир», 1967а. С. 286-288.

5. Методы химии углеводов / Ред. Кочетков Н.К. Москва: изд-во «Мир», 1967в. С. 261-262.

6. Методы химии углеводов / Ред. Кочетков Н.К. Москва: изд-во «Мир», 1967с. С. 466-467.ф 7. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органическихсоединений. Москва: изд-во «Мир». 1965. С. 66-67.

7. Пономаренко С.Ф. Порядок 86. Fabales. Семейство Fabaceae // Сравнительная анатомия семян. Т. 5. СПб. 1996. С. 264-298.

8. Попцов А.В. Биология твердосемянности. М.: Наука, 1976. 156 с.

9. Рапопорт С.М. Медицинская биохимия. Москва: изд-во «Медицина». 1966. С. 548-549.

10. Смирнова Н.И., Щербухин В.Д. Структура и ,3С-ЯМР-спектроскопия галактоманнана семян Indigofera tinctoria II Прикладная биохимия иф микробиология. 1989. Т. 25. № 2. С. 226-231.

11. Степаненко Б.Н. Резервные галактоманнаны и глюкоманнаны семян, луковиц и корневищ // Успехи химии. 1961. Т. 30. № 5. С. 626-644.

12. Титова М.И., Никулин В.И., Самыкин П.М. Изменения системы гемостаза при ожогах и пути ее коррекции. Москва: изд-во Центрального ордена Ленина института усовершенствования врачей. 1989. С. 3-10.

13. Чижов О.С., Шашков А.С. Прогресс химии углеводов / Ред. Торгов И.В. Москва: изд-во «Наука». 1985. С. 30-54.

14. Щербухин В.Д. Галактоманнаны отечественной флоры // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. № 6. С. 803-813.

15. Щербухин В.Д. Галактоманнаны семян некоторых видов порядка Fabales, произрастающих в СССР // Растительные ресурсы. 1991. Т. 27. №2. С. 1-8.

16. Щербухин В.Д. Применение инфракрасной спектроскопии к изучению углеводов // Успехи биологической химии. 1968. Т. 9. С. 198-219.

17. Щербухин В.Д., Анулов О.В. Галактоманнаны семян бобовых (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 3. С. 257274.

18. Щербухин В.Д., Местечкина Н.М., Шиманова Н.И. Способ получения препарата галактоманнана. Патент 2077224. Изобретения. 1997. №11.

19. Щербухин В.Д., Смирнова Н.И., Довлетмурадов К. Изучение структуры и свойств галактоманнана семян Lagonychium farctum И Прикладная биохимия и микробиология. 1987. Т. 23. № 4. С. 467-471.

20. Abatangelo G., Barbucci R., Brun P., Lamponi S. Biocompatibility and enzymatic degradation studies on sulfated hyaluronic acid derivatives // Biomaterials. 1997. V. 18. P. 1411-1415.

21. Akashi M., Sakamoto N., Suzuki K., Kishida A. Synthesis and anticoagulant activity of sulfated glucoside-bearing polymer // Bioconjug. Chem. 1996. V. 7. № 4. P. 393-395.

22. Alban S., Franz G. Characterization of the Anticoagulant Actions of a Semisynthetic Curdlan Sulfate // Thrombosis Research. 2000. V. 99. P. 377-388.

23. Alban S., Franz G. Gas liquid chromatographymass spectrometry analysis of anticoagulant active curdlan sulfates // Semin. Thromb. Hemost. 1994. V. 20. P. 152-158.

24. Alban S., Franz G. Partial synthetic glucan sulfates as potential new antithrombotics: a review // Biomacromolecules. 2001. V. 2. № 2. P. 354361.

25. Alban S., Kraus J., Franz G. Synthesis of laminarin sulfates with anticoagulant activity // Arzneimittelforschung. 1992. V. 42. № 8. P. 10051008.

26. Alban S., Schauerte A., Franz G. Anticoagulant sulfated polysaccharides: Part I. Synthesis and structure-activity relationships of new pullulan sulfates // Carbohydrate Polymers. 2002 V. 47. P. 267-276.

27. Al-Kaisey M.T., Wilkie C.B. The polysaccharides of agricultural lupin seeds//Carbohydrate Research. 1992. V. 227. P. 147-161.

28. Ben-Zion O., Nussinovitch A. Adhesion-strength characteristics of double-layered // Food Hydrocolloids. 1997. V. 11. № 4. P. 373-384.

29. Bjorndal H., Lindberg В., Svensson S. Gas-liquid chromatography of partially methylated alditols as their acetates. // Acta Chem. Scand. 1967. V. 21. № 7. P. 1801.

30. Blumencrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids. // Analyt. Biochem. 1973. V. 54. № 2. P. 484-489.

31. Воск К., Pederson Ch. 13C-NMR spectroscopy of Monosaccharides // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1983. V. 41. P. 27-66.

32. Bock K., Pederson Ch., Pederson H. Carbon-13 nuclear magnetic resonance data for oligosaccharides // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1984. V. 42. P. 193-225.

33. Bode V., Franz G. Physiological activity of new heparinoids derived from plant polysaccharides // Arch. Pharm. 1991. V. 324. № 6. P. 363-365.

34. Bode V.V., Franz G. Heparinoide — ihre antikoagulierende Wirkung // Deutsche Apotheker Zeitung. 1989. V. 129. № 14. P. 672-675.

35. Boziek S., Izzard M., Morrison A. The 13C-n.m.r. spectra of (1—>6)-a-D-galactosyl-(l—»4)-J3-D-mannans. // Carbohydrate Research. 1981. V. 93. № 2. P.279-283.

36. Bresolin Т. M., Sander P.C., Reicher F., Sierakowski M.R., Rinaudo M., Ganter J. L. M. S. Viscometric studies on xanthan and galactomannan systems // Carbohydrate Polymers. 1997. T.33. № 2-3. C. 131-138.

37. Brillouet J.M., Riochet D. Cell Wall polysaccharides and lignin in cotyledons and hulls of seeds of various lupin (Lupinus L.) species // J. Sci. Food Agric. 1983. V. 34. P. 861-868.

38. Buckeridge M.S., Reid J.S.G. Major cell wall storage polysaccharides in legume seeds: Structure, catabolism and biological functions // Ciencia e Cultura. 1996. V. 48. № 3. P. 153- 162.

39. Buckeridge M.S., Rosha D.C., Reid J.S.G., Dietrich S.M.C. Xyloglucan structure and post-germinative metabolism in seeds of Copaifera langsdorfii from savanna and forest population // Physiologia Plantarum. 1992. V. 86. P. 145-151.

40. Burgermeister J., Paper D.H., Vogl H., Linhardt R.J., Franz G. LaPSvSl, a (1—>3)-p-galactan sulfate and its effect on angiogenesis in vivo and in vitro // Carbohydrate Research. 2002. V. 337. P. 1459-1466.

41. Сарек P., Alfoldi J., Liskova D. An acetylated galactoglucomannan from Picea abies L. Karst. II Carbohydrate Research. 2002. V. 337. P. 10331037.

42. Chaidedgumjorn A., Toyoda H., Woo E.R., Lee K.B., Kim Y.S., Toida Т., Imanari T. Effect of (1—>3)- and (1—>4)-linkages of fully sulfated polysaccharides on their anticoagulant activity // Carbohydrate Research. 2002. V. 337. № 10. P. 925-933.

43. Cheng Y., Brown K.M., Prud'homme R.K. Preparation and characterization of molecular weight fractions of guar galactomannans using acid and enzymatic hydrolysis // J. Biol. Macromol. 2002. V. 31. P. 29-35.

44. Courtois J.E., Le Dizet P Recherches sur les galactomannanes. III. — Sur quelques proprietes des galactomannanes des graines de Gleditschia ferox II Bull. Soc. Chim. Biol. 1963a. V. 45. № 7-8. P.731-741.

45. Courtois J.E., Le Dizet P. Recherches sur les galactomannanes. IV. — Action de quelques preparations enzymatiques sur les galactomannanes de Trefle et Gleditschia // Bull. Soc. Chim. Biol. 1963в. V. 45. №7-8. P. 743747.

46. Courtois J.E., Le Dizet P. Recherches sur les galactomannananes. V. — Etude de Taction d'une preparation commerciale d'hemicellulase // Bull. Soc. Chim. Biol. 1968. V. 50. № 10. P. 1695-1710.

47. Daas P.J.H., Schols H.A., Jongh H.H.J. On the galactosyl distribution of commercial galactomannans // Carbohydrate Research. 2000. V. 329. P. 609-619.

48. Dace R., McBride E., Brooks K., Gander J., Buszko M., Doctor V.M. Comparison of the anticoagulant action of sulfated and phosphorylated polysaccharides //Thrombosis Research. 1997. V. 87. № 1. P. 113-121.

49. Davis A.L., Hoffmann R.A., Russell A.L., Debet M. 'H and l3C-NMR characterization of the digalactosylmannopentaose liberated from legumeseed galactomannan by P-mannanase action // Carbohydrate Research. 1995. V. 271. № 1. P. 43-54.

50. Dea I.C.M., Morrison A. Chemistry and interaction of seed galactomannans //Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1975. V. 31. P. 241-312.

51. Dey P. Biochemistry of plant galactomannanas // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1978. V. 35. P. 341-376.

52. Dey P. Biochemistry of a-D-dalactosidic linkages in the plant kingdom // Advances Carbohydr. Chem. and Biochem. 1980. V. 37. P. 283-372.

53. Dodgson B.K.S. Determination of Inorganic Sulfate in Studies on the Enzymic and Non-Enzymic Hydrolysis of Carbohydrate and Other Sulphate Esters // Biochem. J. 1961. V. 78. P. 312-319.

54. Dodgson B.K.S., Price R.G. A Note on the Determination of the Ester Sulphate Content of Sulphated Polysaccharides // Biochem. J. 1962. V. 84. P. 106-110.

55. Doublier J.L., Launay B. Proprietes rheologiques des solutions aqueuses de galactomannanes: role de la masse moleculaire mayenne et de la concentration // Cahiers Croupe Franc. Rheol. 1977. V. 4 № 5. P. 191-198.

56. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. // Analyt. Chem. 1956. V 28. № 3. P. 350-356.

57. Franz G., Alban S. Structure activity relationship of antithrombotic polysaccharide derivatives // Int. J. Biol. Macromol. 1995. V. 17. № 6. P. 311-314.

58. Garti N., Pinthus E.J. Fenugreek gum. The magic fiber for an improved glucose response and cholesterol reduction // NutraCos. 2002. V. 1. № 3. P. 1-10.

59. Geresh S., Mamontov A., Weinstein J. Sulfation of extracellular polysaccharides of red microalgae: preparation, characterization, and properties //J. Biochem. Biophys. Methods. 2002. V. 50. P. 179-187.

60. Gidley M. J., McArtur A., Underwood D. R. ,3C NMR characterization of molecular structures in powder, hydrates and gels of galactomannans and glucomannans // Food Hydrocolloids. 1991. V. 5. № 1-2. P. 129-140.

61. Glicksman M. Gum Technology in the Food Industry. N.Y.: Acad. Press, 1969. P. 144-183.

62. Grasdalen H., Painter T. N.M.R. studies of composition and sequence in legume-seed galactomannans // Carbohydrate Research. 1980. V. 81. № 1. P. 59-66.

63. Gunay N.S., Linhardt R.J. Heparinoids: structure, biological activities and therareutic applications // Planta Med. 1999. V. 65. № 4. P. 301-306.

64. Gupta A.K, BeMiller J.N. A galactomannan from Crotalaria medicaginea seeds // Phytochemistry. 1990. V. 29. № 3. P. 853-855.

65. Gupta A.K., Bose S. Structure of the D-galacto-D-mannan isolated from the seeds of Melilotus indica All // Carbohydrate Research. 1986. V. 153. № 1. P. 69-77.

66. Hegnauer R., Grayer-Barkmeijer R.J. Relevance of seed polysaccharides and flavonoids for the classification of the leguminosae: a chemotaxonomic approach // Phytochemistry. 1993. V. 34. № 1. P. 3-16.

67. Huynh R. Chaubet F., Jozefonvicz J. Anticoagulant properties of dextranmethylcarboxylate benzylamide sulfate (DMCBSu); a new generation of bioactive functionalized dextran // Carbohydrate Research. 2001. V. 332. №1. P. 75-83.

68. Kapoor V.P., Taravel F.R., Joseleau M.M., Chanzy H., Rinaudo M. Cassia spectabilis DC seed galactomannan: Structural, crystallographical and rheological studies // Carbohydrate Research. 1998. V. 306. P. 231-241.

69. Kato K., Nitta M., Mizuno T. Infrared spectroscopy of some mannas // Agric. Biol. Chem. 1973. V. 37. № 2. P. 433-435.

70. Kawanaka S., Nakai M., Naito N., Wada S. Galactomannan-based sheet wound dressings and their manufacture dressings // Pat. JP. 2002. № 2002052077.

71. Kim H.J., Choi S.J., Shin W.S., Moon T.W. Emulsifying properties of bovine serum albumin-galactomannan conjugates // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51. № 4. P. 1049-1056.

72. Kooiman P. On the occurrence of amyloids in plant seeds // Acta Bot. Neeland. 1960. V. 9. № 2. P. 208-219.

73. Kooiman P. The relation between monosaccharide composition and specific optical rotation of galactomannans from plant seeds // Carbohydrate Research. 1972. V. 25. P. 1-9.

74. Lima M.M.S., Ono L., Reicher F., Sierakowski M.-R. Natural and sulfated polysaccharides from Caesalpiniaceae seeds // Lat. Am. Appl. Res. 1996. V. 26. P. 1-3.

75. Lipkind G.M., Shaskov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computer assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of ,3C-NMR date // Carbohydrate Research. 1988. V. 175. № 1. P. 59-76.

76. Mahner G., Lechner M.D., Nordmeier E. Synthesis and characterization of dextran and pullulan sulphate // Carbohydrate Research. 2001. V. 331. P. 203-208.

77. Mallet I., McCleary B.V., Matheson N.K. Galactomannan changes in developing Gleditsia triacantos seeds // Phytochemistry. 1987. V. 26. № 7. P. 1889-1894.

78. Manzi A.E., Ancibor E., Cerezo A.S. Cell-Wall carbohydrates of the endosperm of the seed of Gleditsia triacanthos II Plant Physiol. 1990. V. 92. №4. P. 931-938.

79. Manzi A.E., Cerezo A.S., Shoolery J.N. High resolution ,3C-N.M.R. spectroscopy of legume-seed galactomannans // Carbohydrate Research. 1986. V. 148. № 2. P. 189-197.

80. McCleary B.V., Matheson N.K. Action patterns and substrate-binding requirements of P-D-mannanase with mannosaccharides and mannan-type polysaccharides // Carbohydrate Research. 1983. V. 119. P. 191-219.

81. McCleary B.V., Matheson N.K., Small D.M. Galactomannans and a galactoglucomannan in legume seed endosperms: structural, requirements for P-mannanase hydrolysis // Phytochemistry. 1976. V. 15. P. 1111-1117.

82. McCleary B.V., Nurten E., Taravel F.R., Joseleau J.-P. Characterisation of oligosaccharides prodused on hydrolysis of galactomannan with P-D-mannanase // Carbohydrate Research. 1983. V. 118. P. 91-109.

83. Merce A.L.R., Fernandes E., Mangrich A.S., Sierakowski M.-R. Szpoganicz B. Fe(III) galactomannan solid and aqueous compexes // Journal of the Brazilian Chemical Society. 2001. V. 12. № 6. P. 791-798.

84. Misra A.N., Baweja J.M. Modified guar gum as hydrophilic matrix for controlled release tablets // Indian Drugs. 1997. V. 34. № 4. P. 216-223.

85. Naito N., Kawanaka S., Nakai M., Wada S., Yoshino T. Biodegradable highly absorptive absorbents containing crosslinked galactomannan and their manufacture // Pat. JP. 2002. № 2002265672.

86. Nakamura S., Gohya Y., Losso J.N., Nakai S., Kato A. Protective effect of lysozyme-galactomannan or lysozyme-palmitic acid conjugates against Edwardsiella tarda infection in carp, Cyprirtus carpio L. // FEBS Letters. 1996. V. 383. P. 251-254.

87. Navarro D.A., Cerezo A.S., Stortz C.A. NMR spectroscopy and chemical studies of an arabinan-rich system from the endosperm of the seed of Gleditsia triacanthos II Carbohydrate Research. 2002. V. 337. P. 255-263.

88. Ouchi Т., Matsumoto M., Ihara K., Ohya Y. Synthesis and cytotoxic activity of oxidized galactomannan / adriamycin conjugate // J. Macromol. Sci., Pure Appl.Chem. 1997. V. 34(A). № 6. P. 975-989.

89. Parker M.L. Cell Wall storage polysaccharides in cotyledons of Lupinus angustifolius L. I. Deposition during seed development // Protoplasma. 1984. V. 120. № 3. P. 224-232.

90. Petkowicz C.L.O., Sierakowski M.-R., Ganter J.L.M.S. Reicher F. Galactomannans and arabinans from seeds of Caesalpiniaceae II Phytochemistry. 1998. V. 49. № 3. P. 737-743.

91. Pires L., Gorin P.A.J., Reicher F., Sierakowski M.-R. An active heparinoid obtained by sulphation of a galactomannan extracted from the endosperm of Senna macranthera seeds // Carbohydrate Polymers. 2001. V. 46. P. 165-169.

92. Rayment P., Ross-Murphy S.B., Ellis P.R. Rheological properties of guar galactomannan and rice starch mixtures. I. Steady shear measurements // Carbohydrate Polymers. 1996. V. 28. № 2. P. 121-130.

93. Rees D., Scott W. Conformational analysis of polysaccharides: stereochemical significance of different linkage positions in linked polysaccharides //J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1969. V. 18. P. 1037-1038.

94. Reid J.S.G., Bewley J.D. A dual role for the endosperm and its galactomannan reserves in the germinative physiology of fenugreek

95. Trigonella foenum-graecum L.), an endospermic leguminous seed // Planta. 1979. V. 147. № 2. P. 145-150.

96. Reid J.S.G., Edwards M. Galactomannans and other cell wall storage polysaccharides in seeds in book: Food Polysaccharides and their application (Ed. A. Stephen). N.Y.: Marcel Dekker, Inc., 1995. P. 155-185.

97. Reid J.S.G., Edwards M.E., Gidley M.J., Clark A.H. Mechanism and regulation of galactomannan biosynthesis in developing leguminous seeds //Biochemistry Soc. Transaction. 1992. V. 20. № 1. P. 23-26.

98. Reid J.S.G., Meier H. Chemotaxonomic aspects of the reserve galactomannans in leguminous seeds // Z. Pflanzenphysiol. 1970. V. 62. P. 89-92.

99. Schorsch C., Gamier C., Doublier J.-L. Microscopy of xanthan / galactomannan mixtures // Carbohydrate Polymers. 1996. V. 28. № 4. P. 319-323.

100. Shcherbukhin V.D. Galactomannans from seeds of the leguminous plants in the Soviet Union // Food Hydrocolloids. 1992. V. 6. № 1. P. 3-7.

101. Slavin J.L., Greenberg N.A. Partially hydrolyzed guar gum: clinical nutrition uses // Nutrition. 2003. V. 19. № 6. P. 549-552.

102. Soni S.K., Bose S. Seed galactomannans and their structure // J. Scientific Industrial Research. 1985. V. 44. № 10. P. 544-547.

103. Spyropoulos C.G., Reid J.S.G. Water stress and galactomannan breakdown in germinated fenugreek seeds. Stress affect the production and the activities in vivo of galactomannan-hydrolysing enzymes // Planta. 1988. V.174. № 4. P. 473-478.

104. Sudhakar V., Singhal R.S., Kulkarni P.R. Starch-galactomannan interactions: functionality and rheological // Food Chem. 1996. V. 55. № 3. P. 259-264.

105. Tanaka M., Thananunkul D., Lee T-C., Chichester C.O. A simplified method for the quantitative determination of sucrose, raffinose and stachyose in legume seeds // J. Food Science. 1975. V. 40. P. 1087-1088.

106. Tewary K., Khare N., Singh V., Gupta P.C. A non-ionic seed-gum from Cassia corymbosa II Carbohydrate Research. 1984. V. 135. № 1. P. 141146.

107. Unrau A.M., Chloy Y.M. Identification of linkages of a galactomannan isolated from seed of Caesalpinia pulcherima // Carbohydrate. Research. 1970. V. 14. P. 151-158.

108. Varma R., Wardi A.N., Varma R.S. Separation of aldononitryl acetates of neutral sugars by GLC and its application to polysaccharides. // J. Chrom. 1973. V. 77. № 1. P. 222.

109. Viebke C. A light scattering study of carrageenan / galactomannan interactions // Carbohydrate Polymers. 1996. V. 28. № 2. P. 101-105.

110. Viebke C., Piculell L. Adsorption of galactomannans onto agarose // Carbohydrate Polymers. 1996. V. 29. № 1. P. 1-5.

111. Whistler R.L. Solubility of polysaccharides and their behavior in solution // Advances Chem. Series. 1973. № 117. P. 242-254.

112. Whistler R.L., BeMiller J. Industrial Gums. N.Y.: Acad. Press, 1959. 642 p.

113. Yakimov-Barras N. Les polysaccharides des graines de quelques Liliacees et Iridacees II Phytochemistry. 1973. V. 12. P. 1331-1339.

114. Yang L., Chu J.S., Fix J.A. Colon-specific drug delivery: new approaches and in vitro / in vivo evaluation // International Journal of Pharmaceutics. 2002. V. 235. №1-2. P. 1-15.

115. Yoshida T. Synthesis of polysaccharides having specific biological activities // Progress in Polymer Science. 2001. V. 26. P. 379-441.