Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональных свойств целлюлозных комплексов в широком температурном диапазоне

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональных свойств целлюлозных комплексов в широком температурном диапазоне"



и 1 ?■«>•'"> С'-'^

\ ( м-1 > = '

казанский государственный

ТЕЧНОЛОГИЧЕСКИП УНИВЕРСИТЕТ

ЦЫГАНКОВ Вячеслав Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ СТРШНРНО-®3"КЦИОМЛЬШ СВОЙСТВ ЦЕШЛДЗННХ КОМПЛЕКСОВ а ВИРОХОЫ ТЕЫПЕРЙТУРНОМ ДИАПАЗОНЕ

03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание дченой степени кандидата химических наук

Казань 1993

Работа внлолнена в Казанской государственной технолог! ческой университете

Научные руководители - кандидат химических наук, доцент В.И, Курапов.

кандидат сшз.-кат. надк, старший научный сотрудник Ю.О Зуев

Официальные оппоненты - доктор хинических нар,

ведущий научный сотрудник Б.К. Рыбин

кандидат технических наук, • доцент В.В. Нагаев

Ведущая организация - Московский институт тонкой

химической технологии

Защита состоится ___У.^.'Р-______1993 года в_

часов ка заседании специализированного совета К. 083. 37. 08. в Казанской государственном технологическом университете лс адресу: 420015, г. Казань, р. К. Маркса, 69 (зал заседаний Ученого совета).

С диссертацией мо«но ознакомится в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Й87орефарат разослан _________ 1993 года.

Учений секретарь специализированного совета кандидат технических наук

3.1. Килеев<

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы,'

Целлюлоза - самое "крупнотоннаяное" из возобновляемых нов сырья на нашей планте. Ежегодный «стественний прирост ллвлозы в мире составляет около 100 млрд. т.. Использование se части этого сырья приводит к накоплению значительного личества'целлялозосодеряааих отходов. Если да^е кап в дола их отходов превращать гидролитическим и/или микробиологи-ским путем в полезные продукты, это мояет бнть весьма оау-иь.. возобновляемый источник углеводов, в том числе пищевых, менителей нефтепродуктов, а также исходных продуктов для кробиологического синтеза. Именно поэтому данной проблемой последние годы упорно занимаются исследователи и технологи 'Льиинства стран мира, имещих соответствующий'научно-техни-:ский потенциал.

В природе гидролитическая деградация целлюлоза до моно-(харидов пройсхо;чт, главным образом, под действием целлвло-[тических ферментов гивых организмов. Однако это мояет быть ¡уществленно такае обработкой целлюлозы с помощью ряда физи-гских или химических методов. Физические аетоди вклпчапт об-зботку целлюлозы острым паром или её гамма-облучение, но они жа не являются технологически привлекательными. Наиболее звестные химические методы включают .обработку целлюлозы 1 ильными минеральными кислотами, такими, как серная, соляная т. п.. Наиболее обещающая альтернатива кислотному гидролизу это ферментативный гидролиз. Однако вполне возможно исполь-ование гибридного процесса, в котором разбавленная кислота спользуется для предобработки и отделения соотзетствунщей ракции ( в основном геницеллплозной ) древесины, а фермента-ивный гидролиз - для превращения оставшейся ( устойчивой ) еллюлозы в глюкозу.

Ферментативным гидролизом целлвлозы в настояцее время анимается в' мире Ильное число исследовательских групп, ла-ораторий, фирм и т. д. Еяегодно по данной проблеме-публику-тся не менее дву^от научных сообщений в ведуцих журналах :ира. Тем не менее, по имевшимся данным, пока ни одна страна [ира не располагает промышленным процессом ферментативного . идролкза целлюлозы. Решение данной практически*» зздлчи se-

мыслимо без исследования возношгостей управления этим проце сок. поэтому актуальным является комплексное исследование с зико-химических и биохимических свойств целлвлаэных коыпле сов.

Цель работы.

Настоящая диссертационная работа имеет своей целью И31 чение структурно-Функциональных свойств водных растворов не которых целллвлазных ферментных комплексов для дальнейиег более глубокого поникания принципов управления процессом про каменного ферментативного гидролиза целлюлозн.

Научная новизна.

Впервые для изучения структурно-функциональных свойст •целлялазнык ферментных комплексов применены методы временно, диэлектрической спектроскопии (ЙДС) и ядерно-магнитного резонанса с импульсным градиентом поля.

Предлокена модель состояния целлалаз в водних растворах, как высокоупорядоченное структурное образование - нультифер-меитный целлилаэный комплекс.

Выдвинуто предложение о роли липидной компонегн состава целлялаз в их термостабильности.

Научная и практи.еская ценность.

Результат«, представленные в диссертации, способствуют более сшрокому научному понимании влияния структурной организации оериентов на их Функциональные свойства. Предлоненная модель структурно-функционального целлвлаэного Ферментного коаплекса и определение роли липидов в его составе позволит разработать более эффективные методы управления процессами Ферментативного гидролиза и повышения термостабильности данных фериентнн" 'комплексов при более высоких температурах гидролиза целлюлозы.

йпробация работы.

По материалам диссертации было опубликовано 2 печатные работы, 3 статьи находится в печати, сделаны доклади: на 1Ш Всесоюзной симпозиуме "Иняенерная знэимология" (Москва, 1991 Г.); «на отчетной научно-иетодической конференции (Казань, 1993 г.), на отменой научно--технической конференции (Казань,

193 г.).

Основные полонения, выносимые на зациту

1. Предлояена структурно-функциональная недель суцество-1ния целлвлаз в водных растворах.

2. Выявлены корреляции неаду структурными и биохимически свойствами целлвлаз в широком интервале температур гид-злиэа целлюлоза.

3. Показана роль липидов в термостабильности целлвлаз.

Объем и структура работы.

Диссертация иэлоаана на //2 страницах ыазинописного тек-га. вкличая^У рисунков. Состоит из введения, четырех глав, аключения и выводов, списка цитируемой литературы, вклвчао-его^-?ссылки на отечественные и зарубеяные работы.

В первой главе приведен краткий обзор достиаений в об-асти физики белка и белковых комплексов.

Во второй главе приведены краткие сведения об объекте сследования. его физико-химические характеристики, структура т.д.

В третьей главе работы приведено краткое описание мето-ов изучения, используемых в данной работе.

В четвертой главе приведены экспериментально полученные езультаты с их обсуядением и построением соответствующей мо-ели изучаемого объекта. В данной главе проводиться последо-ательный анализ:

1. Структурных изменений бактериальной целлюлазы Поэ^Шии "ШегаосеПип, для которой достаточно хорошо изучена структура.

2. На отдельно выделенном ферменте целлобиогидролазе из-целлюлаэного комплекса ТПсЬос^гва 1Иг1<1е изучена корреляция структурных и релаксационных параметров.

3. Аналогичные исследования проведены для более слоаных систем - целлвлазных комплексов Тг1с1юйегва У1г1<3е и Рэп1с1111иш иеггоси1о5Ш1.

4. Исследована корреляция структурных и релаксационных параметров для целлюлазы Реп1с11Ииа Чеггоси1о5ига после выделения иэ неё липидной компоненты.

ОСНОВНОЕ СОДЕРШИЕ РАБОТЫ

1. Изучение температурных зависимостей структурных ха рактеристик целлюлаэ Clostridium Thernocellua

Целлвлаэи термофильных бактерий осуществлявт в природ биодеградацив нерастворимых субстратов либо за счет индивиду алъннх ферментов, либо за счет действия слокноорганизованни: иультвдерментных комплексов, инеягаих определенную надмолекулярную структуру и получивших название целлвлосом. Целлюлосо-ни представляют собой плотноупакованнце частицы в состав ко-торих входит примерно 20 полилептидов.

Структурные характеристики целлюлосом в водной растворг изучались на примере бактериальной целлвлазы Clostridia Thernocellum (СТ), Целлилазный препарат СТ был фракционировав с образованием двух основных полидисперсных, высокомолекулярных белковнх Фракций I и II. Колекуларно-массовое распределение в фракции I (<}pl) находится в диапазоне 10 ООО - 50 ООО Да, и в Фракции II (фрИ) 500 - 10 ООО Да.

Исследование структурных изменений проводилось методой ВДС, подробно рассиот); jhhoh в главе 3. Спектр диэлектрической проницаемости такого многокомпанентного объекта, как исследуемые раствори полиферкентнах целлэлаэных комплексов достаточно слохен для анализа. Он включает в себя релаксационные параметры различных компонент. Это вклады от ферментов, воды, различные эффекты поверхностной и объемной проводимостей. Здесь на останавливаемся только на анализе релаксационных параметров ферментов, как основного предмета нашего внимания.

На рис, i привегны температурные зависимости времени диэлектрической релаксации для двух фракций бактериальной целлгалазц СТ, Этот параметр позволяет оценить враодательнув подвизность ••акромолекул в растворе. Предполагая, что Фориа исслецуеных объектов не сильно отличается от сферической и принимая оо внимание, что измерения выполнены для разбавленных водных растворов iC-2'Al. достаточно просто оценить эффективный объ5м иэфф кинетических единиц используя для этого со-отновение Стокса-Эйнвтейна :

€

о

X

ю.

¿¿о......Лоо......з!4о"1' 'Зла......».'¿о

ЮОО/Т, к

рис. I

Температурные зависимости Т целлвлазн СТ (1 Фр1; 2 - ФрП: 1Т - теоретически рассчитанные X для фр* при иэфф=сопзЬ (100 нм ): 2Т- теоретически рассчитанные Т для фрП при иэфф=соп51 (110 нм ))

г г

(Ь 9-

40-1чтт» | ТГ1 1| II I »111 I I |-т>т«1 ч «О 20 30 40 40 «О

Т'.с

рис. 2

Температурные зависимости Цэфф целлилази ст (1 - фр I: : - фр ii)

чУ^ф/кТ (1)

где ^ -вязкость растворителя; Т-абсолатная температура; % -времена релаксации, полученные из эксперимента.

Графики температурных зависимостей Уэфф для СТ приведены на рис. 2. Проведенные рассчеты показывают, что величина Ь/эфгр для обеих фракций СТ имеет сильную зависимость от температуры. Очевидно, что при изменении температуры СТ претерпевает ряд структурных изменений. Какого рода эти изменения, помогают понять литературные данные, приведенные . на рис. 3. Для глобулярных белков, чья форма близка к сферической, зависимость объема глобулы от молекулярного веса в инте-рисувщем нас диапазоне весов близка к линейной. И даае, если для некоторых других белков вследствие некоторого отклонения их формы от сферической значения 1)=ПМ.в.) не лягут точно на эту прямую, есть все основания предполагать, что это отклонение будет незначительный. Возвращаясь к анализу данных по объемам, полученным э наэеы эксперименте, моано сделать следующие оценки, Уве при температуре 20 С объем структурных единиц превкиает оценочные теоретические значения для целлюлазы СТ фракции I в 2 - 10 раз, а для фракции II в 10 и более раз. Таким образок даяе при температурах, для которых наши данные дают минимальные значения объемов ыоано говорить об образовании ассоциатов макромолекул, в которых могут участвовать от нескольких единиц до десятков мономерных ферментов. Вспомнив, что целлшлосокы СТ ии~зт мультнферментнуа структуру, полученные результаты являются достаточно правдоподобными.

Естественно предполояить. что способность С7 к образовании нультиферментных структур долина зависить от внешних ус-лог 1й. В качестве возмучаюцего фактора была выбрана температура. Мы не знаем детально молекулярные механизма комплексо-обраэования при воздействии температуры и анализируем лишь результат этого воздействия. Оказывается .существуют области температур, где объем ассоциатов моиет увеличиваться в 2 -2.5 раза ог исходного-объема (Т=20*С). А при температуре 80 С мы снова наблюдаем "развал" ассоциатов. Бозмоано, что таким образом ыохно объяснить и наличие достаточно иирокого молеку-лярно-массового распределения исходных образцов в пределах выделенных фракций.

IOO-Э

1ЧП1П|1»Ц1И111ИЦИН1И1Ч

40 90 U 7»

МЛ

рис. 3

Зависимость объема белковых макромолекул от иол. веса (1-лизоцим; 2-миоглобин: 3-оваЛьбу-мин; 4-геиоглобин)

I ||Н1 II nt| II ll|III*)'

а з « « и

Т°,с

рис. 4

Температурная зависимость 17эфф фермента 1|БГ

2. Нолекулярно-динамические характеристики целлобиогид-ролазы - фермента целлюлазной системы

Известно, что грибные целлвлазные системы имеют в своем •составе как минимум четыре типа Ферментов. Какдый Фермент мо-вет входить в данную систему вместе со своими иэоформами. которые могут несколько отличаться от него по молекулярным весам и изозлектрическим точкам. Количество, как самих ферментов, так и их изофори в какдой целлюлазной системе различно.

Из цвлллюлазной системы Тг1сЬойегиа 1Иг1<1е (ТЦ). с помощью метода колоночной . хроматографии, бал выделен Фермент целлобиогидролаза СЦ5Г). Идентификация методом ЙФ-спектроско-пии и аналитического электрофореза позволяет сказать, что выделенный фермент гомогенен с М.в. 60 кЯ;ч

Теоретически рассчитанный коэффициент относительной полярности р Фермента ЦБР позволил сделать предполовение. что данный Фермент в водной растворе стремиться к организации четвертичной структуры. Для проверки данного предположения был проведен анализ структурных характеристик с помощью метода ВДС.

На рис. 4 представление температурная зависимость значений иэфф для ЦБГ. Видно, что полученные в нашем эксперименте значения объема молекулы ЦБГ претерпевают резкие изменения.

Представляет больной интерес следующий факт. Известно, что технологическим интервалом температур гидролиза целлюлозы целлюлазой ТУ. из котпгой был выделен фермент Щ5Г, являются температуры Т=50..,60"С. Нани исследования показали, что объем кинетической'единицы в растворе при этих температурах практически постоянен, при этом превышает в 2 раза объем на-тимого фермента (Т=20'С). Коано сделать предположение. что Фермент ЦБГ существует в этом случае в виде димера, что вероятно обеспечивает его наиболее эффективную сорбцию на субстрате и. следовательно, более эффективный гидролиз целлюлоза. График, приведенный на рис. 4 показывает, что фермент ЦБГ проходит через такое состояние и при других температурах и эти температуры такге могли бы быть достаточно эффективными для гидролиза. Однако температурные интервалы этих состояний очень узки (вблизи 30*С и 3?®С).

3. Взаимосвязь температурных зависимостей биохимических и структурных характеристик целлюлаз TгIchodeгиa у1г!йе и Реп1с11Ииа Уеггоси1озиа

Целлюлазные ферментные системы Тг1сЬойегпа У1г1(1е (ТУ) и РегНсППип Уеггоси1озип (Р11) являются грибными целлюлаза-ми. До сегодняшнего дня в литературе по грибным целлшшам нет сколь-нибудь ясного понимания о том, в каком структурном состоянии данные целлюлаза находятся в растворе. Так яе нет четкого понимания механизма синергизма в действии ферментов этих целлюлаз на природную нерастворимуп целлюлозу. В настоящем разделе диссертационной работы сделана попытка связать биохимические характеристики водных растворов целлюлаз ТУ и РУ с их структурными параметрами в широком интервале температур.

На рис. 5 представлены зависимости биокаталитической активности (БД) целлюлаз ТУ и РУ от температуры гидролиза субстрата. Видно, что для обеих целлюлаз в диапазоне температур 30...50 С наблюдается рост значений БД. При температурах вывч 80*С значения Бй резко падают.

На рис. 8 представлены температурные зависимости Уэфф целлюлаз Ти и РУ.

Исследование изменений обгеиов этих образцов показывает, что процесс достинения максимальных значений Вй сопровоадает-ся увеличением эффективных объемов целлилаз РУ и ТУ. Причем при температуре максимума Бй (Т=50...60*С> УзФФ увеличивайте« для РУ почти в 2 раза, а для ТУ в 3-4 раза, таким образом мы моаем предполоаить, что в данном диапазоне температур ми наблюдаем ассоциат ферментов входящих в целлилазные комплексы РУ и Ти, которому мы дали название - иультифериентный целлалаэ-ный комплекс СИФЦК). Очевидно при таких размерах ИФЦК соэда-в ся оптимальные условия для максимальной продуктивности процесса гидролиза [1,2,3]. При более вцеокич температурах мы наблюдаем резкое разрушение комплексов. При этой Бй так«е резко падает. Конечно в температурном поведении комплексооб-разования у РУ и ТУ имеются сбои особенности, однако налицо совпадение по обиеиу характеру изменений.

Дополнительное подтверждение корреляции меяду структурой комплекса (НФЦК) и М дают данные по саммодифузии Рз для цел-

32 DO'

<

u?

2100'

ae 0 1MD;

E

s 1000'

o

<1

T'.C

phc. 5

TeanepaTypH«e 3aBncnMccTH Bfi uejuinjiaa PU H TU (1 - PU; 2 - TU)

PHC. 6

TeMneparypHue 9aBncnuocTn tfs{ic» usA^DJias PU h TU (1 - PV; 2 - TV)

1в*«з

ШШГИПТИП1 ЛТМ17Т<Т1ТГ11МПТГГ1ИМИИН1ТТТН'>

».¿О ¿¿3 з.6о ».4® "

ЮОО/Т, 1<

рис. 7

Температурная зависимость Оз целлплозы РУ (1- зависимость для Ри; 2- зависимость для воды)

юигэчомвзтогаео

Т\ с

рис. 8

Температурная зависимость Уафф цаллплаэы Р1) после выделения липидов

лплазн РЧ (рис. ? ), полученные методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Резкое увеличение коффициента ламо-диффузии Оз в интервале температур 50...?0*С такне свидетельствует об уменыаении размеров диффундирующих единиц, т.е. •разрушение структуры НФЦК сопровондающееся уменьшением БД.

На основании предлоаенной модели существования целлилаз в водном растворе иовно предполовить. что механизм синергизма в действии целлвлолитических ферментов, как совокупность механизмов последовательно-параллельного действия ферментов, когда продукт действия одного Фермента является субстратом для другого, снимая одновременно при этом ингибируведее действие промежуточных продуктов гидролиза целлюлозы, основан на структурно-функциональном взаимодействии мевду ферментами в образуемом.ими МФЦК [4,51.

4. Влияние присутствия липидов в целлгазах на их термостабильность

Какие Ее силы и причины определяют стабильность столь крупных образований как КФЦК или целлюлосом грибных и бактериальных целлюлаз? Недавно в литературе появились данные, что в состав целлюлосоиных структур бактериальных целлюлаз входят липиды, играющие определенную роль в термостабильности данных целлюлаз.

Как хороио видн'1 из температурной зависимости Узфф для целлюлосом СТ (рис. 2) в $ 1, наиболее существенным отличием поведения Оэфф является сдвиг на 10 С перегиба на графике зависимости Уэфф=Г(Т). Для фр1 он происходит при 40 С, а для ФрП при 30°С. Известно, что' количество липидов в целлилосо-мах тем выше, чем выие их молекулярная масса. Также-известно, что выделение липидов- из целлвлоссм СТ приводит к распаду последних и резкому уменьшению их ферментативной активности. Таким образом моано предполовить, что липидная компонента структуры целлплосом влияет на ее термостабильность и, следовательно. на эффективность гидролиза целлюлозы.

Для изучения влияния липидов на термостабильность грибных ИФЦК была взята целлюлазная система РУ и из неё были выделены липиды. Из представленной темпеглтурной зависимости Узфф подготовленных таким образом образцов (рис. 8) видно.

что отсутствие липидов резко сказывается на спосооности образовывать МФЦп. Даяе небольшое изменение температуры приводит к резкому уменьшению размеров комплексов, что особенно заметно при температурах 20...40*С.

Сравнивая характер температурной зависимости иэфф для МФЦК Ри. содержащих липидную компоненту приведенных в § 3 (рис.8), с зависимостью изФФ=ПТ) для освобожденной от липидов целлгалазы Ри (рис.8) видно, что процессы диссоциации структуры МФЦК приведенные в этом разделе, сдвинуты в область более низких температур. Все это позволяет сделать вывод, что липиды входящие в состав грибных целлплаз стабилизируют структуру МФЦК, образуемую ими в водном растворе.

внвода

Применение физических методов ВДС и ШР с импульсным градиентом магнитного поля для изучения полиферментных бактериальных и грибных целлюлаэных комплексов позволило получить в цолои новую информации об объекте.

1. Методом 3ДС лодтзерядены предположения о том, что бактериальная целлилаза С, Thernocal1ия в водных растворах образует крупные структуры - цвллгалосояа,

2. Показано, что целлобиогидролаза, фврмэнт.целлилаэноЯ системы, агрегируется в водном растворе образуя ассоциаты.

3. Выдвинута и экспериментально подтаер.дена гипотеза о том, что фирменты грибных целлвлазных систем в водных растворах находятся в вида структурно-функциональных образований -нультиферментник цяллюлаэних комплексов (МФЦК).

4. С позиций существования целлюлаэных Ферментов в водном растворе в виде МФЦК представлен иариант синергизма в действии цоллюлолитических ферментов.

5. Покачана роль липидов в термостабилыюсти целлвлазннх комплексов.

Основное содержания диссертации излояено в следувдмх публикациях:

1. Курзмов В.И., Зуаа Ю.Ф., Цыганков B.C., Ягодина

ПобедиискиП Л.Г. Тнмпературиая мви шость дм»лешри-

ческих свойств целлвлазных Серпентов в связи с их конфорыацией/7 Тезисы докладов U11 Всесоюзного симпозиума "Инненерная знзимология", апрель 1391 г., Иоск-ва - С.56-5?

2. Цыганков B.C., Зуев В.Ф., Курашов В.И., Сметанина С.Е., Победнмский Д.Г., Синицыи ft.П., Кирпичников П.ft. Взаимосвязь теиператуных зависимостей диэлектрических и биохимических характеристик целлюлолитичес-кого комплекса из гриба Trldioderma UlrideZ/Доклады АН СССР -1992 -Т.323 -Но.4 -С.881-864.

3. Tsyagankov U.S., Zuev 3u.F., Kurashov V.I.,. Siaetanlna SJo., Pobedluskll D.G. Interconnection of the temperature dependences of the dielectric and blocheulcal characteristics of ".he cellulases conplex froa the fungus Trlchoderma Ulrlde//J.Chen. and Bloches. Kinetics - 1993 -No.l - p. 31-35

B.C. Цыганков

Заказ 44

■Inpas .tiO экз.

Офсетная' лаборатория КПУ 4iiQ0I5, г .Казань, ул.К.йаркса.бв