Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональных свойств целлюлазных комплексов в широком температурном диапазоне

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональных свойств целлюлазных комплексов в широком температурном диапазоне"

казанский государственна технологический университет

ЦЫГАНКОВ Вячеслав Сергеевич

изучение структ9рно-оу"щюнальннх свойств целлвлазннх комплексов в нирокон температурной диапазоне

03.00.23 - биотехнология

(1 3 Т 0 р 5 о ! р 8 7 диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань 19ЭЗ

Работа выполнена в Казанском государственном технологическом университете

Научные руководители - кандидат химических наук, доцент В.И, Курашов.

кандидат сиз.-мат. наук, старший научный сотрудник В.Ф Зуев

Официальное оппоненты - доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник В.К. Рабин

кандидат технических наук. • доцент В.Б. Нагаев

Ведущая организация - Московский институт тонкой

химической технологии

Защита состоится _______1393 года

часов на заседании специализированного совета К. 063. 37. Об. в Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68 (зал заседаний Ученого совета).

С диссертацией «окно ознакомится в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан __________1Э93 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат технических наук

З.В. Килеев.

общая'характеристика работы

Актуальность работы.

Целлюлоза - самое "крупнотоннанное" из возобновляемых идов сырья на нааей планте. Енегодный естественный прирост еллюлоэы в мире составляет около 100 млрд. т.. Использование ase части этого сырья приводит к накоплении значительного оличества'целлплозосодеряацих отходов. Если да.»е aarja долю тих отходов превращать гидролитически» и/или микробиологи-еским путем в полезные продукты, это ноает быть весьма ощу-имь.| возобновляемый источник углеводов, в .том числе пищевых, аменителей нефтепродуктов, а такзе исходных продуктов для икробиологического синтеза. Именно поэтому данной проблемой последние годы упорно занимаются исследователи и технологи ольаинства стран мира, имевших соответствующий'научно-техни-еский потенциал.

В природе гидролитическая деградация целлюлозы до моно-ахаридов происходит, главным образом, под действием целлюло-итических ферментов зивых организмов. Однако это моает быть существленно такне обработкой целлюлозы с помощью ряда фиэи-еских или химических методов. Физические методы включают об-аботку целлюлозы острым паром или её гамма-облучение, но они ока не являются технологически привлекательными. Наиболее звестные химические методы включают .обработку целлюлозы ильными минеральными кислотами, такими, как серная, соляная т. п.. Наиболее обещающая альтернатива кислотному гидролизу это ферментативный гидролиз. Однако вполне возможно исполь-ование гибридного процесса, в котором разбавленная кислота спользуется для предобработки и отделения соответствующей ракции ( в основном гемицеллалозной ) древесины, а фермента-ивный гидролиз - для превращения оставшейся ( устойчивой ) еллюлозы в глюкозу.

Ферментативным гидролизом целлюлозы в настоящее время анимается в мире ''ольиое число исследовательских групп, ла-ораторий, фирм и т. д. Ежегодно по данной проблеме-публику-тся не менее двухсот научных сообщений в ведущих нурналах ира. Тем не менее, по имеющимся данным, пока ни одна страна ира не располагает промышленным процессом ферментативного идролкза целлюлозы. Решение данной лрактаческя* .задзчи ии-

мыслимо без исследования возмониоствй управления этим процессом. позтоку актуальным является комплексное исследование физико-химических и биохимических свойств целлюлазных комплексов.

Цель работы.

Настоящая диссертационная работа имеет своей целью изучение структурно-Функциональных свойств водных растворов некоторых целллюлазных ферментных комплексов для дальнейоегс более глубокого поникания принципов управления процессом промышленного ферментативного гидролиза целлюлозы.

Научная новизна.

Впервые для изучения структурно-функциональных свойств •целлилазных ферментных комплексов применены методы временной диэлектрической спектроскопии (ЙДС) и ядерно-магнитного резонанса с импульсным градиентом поля.

Предломена модель состояния целлилаз в водных растворах, как ввсокоупорядоченное структурное образование - мультиФер-ментный целлюлазный комплекс.

Выдвинуто предложение о роли липидной компонеты состава целлилаз в их термостабильности.

Научная и практи .еская ценность.

Результаты, представленные в диссертации, способствуют более широкому научному пониманию влияния структурной организации ферментов на их Функциональные свойства. Предлоаенная модель структурно-Функционального целлюлазного ферментного комплекса и определение роли липидов в его составе позволит разработать более эффективные методы управления процессами ферментативного гидролиза и повыиения термостабильности данных оермеитны" 'кокплексов при более высоких температурах гидролиза целлалозы.

Апробация работы.

По материалам диссертации было опубликовано 2 печатные работы, 3 статьи находятся в печати, сделаны доклады: на VII Всесовзном симпозиуме "Инвенерная энэимология" (Москва, 1991 г.); «на отчетной научно-методической конференции (Казань. 1993 г.), на 0ТЧ61Н0Й научно-технической конференции (Казань,

33 г.).

Основные полонения, выносимые на защиту

1. Предлояена структурно-функциональная модель суцество-1ия целлвлаз в водных растворах.

2. Выявлены корреляции между структурными и биохимически свойствами целлюлаз в широком интервале температур гид-пиза целлюлозы.

3. Показана роль липидов в термостабнльности целлплаз.

Объем и структура работы.

Диссертация изловена на /'2 страницах машинописного тек-а. включая 2^ рисунков. Состоит из введения, четырех глав, клпчения и выводов, списка цитируемой литературы, вклвчао-го<?? ссылки на отечественные и зарубеаные работы.

В первой главе приведен краткий обзор достиаениП в об-сти физики белка и белковых комплексов.

Во второй главе приведены краткие сведения об объекте следования, его физико-химические характеристики, структура т.д.

В третьей главе работы приведено краткое описание мето-в изучения, используемых в данной работе.

В четвертой главе приведены экспериментально полученные зультаты с их обсуяденивм и построением соответствующей моли изучаемого объекта. В данной главе проводиться последо-тельный анализ:

1. Структурных изменений бактериальной целлюлазы С1оз1;г1сНип ТЬегпосе1'иа, для которой достаточно хо-роио изучена структура.

2. На отдельно выделенном ферменте целлобиогидролазе иэ-целлюлаэного комплекса Тг1с1юс1егва 1Иг1 йа изучена корреляция структурных и релаксационных параметров.

3. Аналогичные исследования проведены для более слояных систем - целлилазных комплексов Тг1сЬос1егпа и1г1()е и Р8п1сП11ия иеггоси1о5иш.

4. Исследована корреляция структурных и релаксационных параметров для целлалэзи Рвп1с!111иа иаггоси1о$ип после выделения иэ неё липидной компоненты.

основное содершие рйботы

1. Изучение температурных зависимостей структурных х рактеристик целлюлаз Clostridlun ТЬегиосеПив

Целлвлази термофильных бактерий осуществляют в приро биодеградацив нерастворимых субстратов либо за счет индивид альных ферментов, либо за счет действия слояноорганизованн мультиферментных комплексов, имевших определенную надмолек лярнуы структуру и получивших название целлвлосом. Целлилос мы представляют собой плотноупакованнце частицы в состав ю торых входит примерно 20 полипептидов.

' Структурные характеристики целлюлосом в водном раство| изучались на примере бактериальной целлилазы Clostrldli •Thernocellun (СТ>. Целлялазный препарат СТ был фракциониров« с образованием двух основных полидисперсных, високомолекуля! ных белковнх фракций I и 1!. Молекуларно-массоэое распредел« ние в Фракции I topi) находится в диапазоне 10 ООО - 50 0( Да, и в фракции II СфрП) 500 - 10 000 Да.

Исследование структурных изменений проводилось методе 8ДС, подробно paccMoti.jhhom в главе 3. Спектр диэлектрическс проницаемости такого многокомпанентного объекта, как исследи емые раствори полифераентнах целлвлазных комплексов достаток но слокек для анализа. Он включает в себя релаксационные па раиетры различных компонент. Это вклады от ферментов, водь различные эффекты поверхностной и объемной проводимостей Здесь мы останавливаемся только на анализе релаксационных па раметров ферментов, как основного предмета нашего внимания.

На рис. 1 привег на температурные зависимости времен диэлектрической релаксации Т* для двух фракций бактериально целлюлазы СТ, Зтот параметр позволяет оценить врацательну подвианость "акромолекул в растворе. Предполагая, что форм исследуеных объектов не сильно отличается от сферической принимая оо внимание, что измерения выполнены для разбавлен ных водных растворов (С=2'/.). достаточно просто оценить эффек тивный объём Изфф кинетических одиниц используя для этого со отношение Стокса-Зйнвтейна :

о

а:

' '¿!ёо' ' з!оо......з!4о......з!«о......£¿0

100о/т, к

рис. I

Температурные зависимости Т целлвлазы СТ (1'-фр1: 2 - фрН: 1Т - теоретически рассчитанные X для фр* при иэфф=сопэЬ С100 на ); 2Т- теоретически рассчитанные "С для орП при УэСФ^сог^ (110 нм ))

40 £0

Т'.с

рис. 2

Температурные зависимости Уэфф целлплазь

ст (1 - фр I: : - фр т

(п

где ^ -вязкость растворителя: Т-абсолютная температура £ -времена релаксации, полученные из эксперимента.

Графики температурных зависимостей Уэфф для СТ приведем на рис. 2. Проведенные рассчеты показывают, что величин изфф для обеих фракций СТ имеет сильную зависимость от темпе ратуры. Очевидно, что при изменении температуры СТ претерпе вает ряд структурных изменений. Какого рода эти изменения помогают понять литературные данные, приведенные . на рис 3. Для глобулярных белков, чья форма близка к сферичес кой, зависимость объема глобулы от молекулярного веса в инте рисующем нас диапазоне весов близка к линейной. И даае, есл для некоторых других белков вследствие некоторого отклонена их формы от сферической значения У=ПМ.в.) не лягут точно а эту прямую, есть все основания предполагать, что это отклоне ние будет незначительным. Возвращаясь к анализу данных по объемам, полученным в навем эксперименте, моано сделать следующие оценки. Уве при температуре 20 С объем структурных едини| превыиает оценочные теоретические значения для целлалази С' фракции I в 2 - 10 раз, а для фракции II в 10 и более раз, Таким образом дане при температурах, для которых наии дашш давт минимальные значения объемов мозно говорить об образовании ассоциатов макромолекул, в которых могут участвовать о: нескольких единиц до десятков мономерных ферментов. Вспомнив, что целлалосомы СТ имгат иультифериентную структуру, полученные результаты являются достаточно правдоподобными.

Естественно предполоЕить, что способность СТ к образовании иультиферментных структур долнна зависить от внешних ус-лопй. В качестве возмущаваего фактора была выбрана температура. Ми не знаем детально молекулярные механизма компдексо-образования при воздействии температуры и анализируем лииь результат этого воздействия. Оказывается .существуют области теиперагур, где объем ассоциатов моает увеличиваться в 2 -2.5 раза от исходного объема (Т=20вС>. 0 при температуре 80 С мы снова наблюдаем "развал" ассоциатов. Возмояно. что таким образом можно объяснить и наличие достаточно вирокого молеку-лярно-иассового распределения исходных образцов в пределах выделенных фракций.

в

Л

X

1>~

О- »тптптггм

МЛ

рис. 3

Зависимость объема белковых макромолекул от иол. веса (1-лизоции; 2-ииоглобин: 3-овальбу-иин; 4-гемоглобин)

< = .0«

т", с

рис. 4

Температурная зависимость иэфф фермента ЦБГ

2. Молекулярно-динамические характеристики целлобиогид-ролаэы - фермента целлвлаэной системы

Известно, что грибные целлялазные системы имеют в своем •составе как минимум четыре типа Ферментов. Каядый Фермент мо-«ет входить в данную систему вместе со своими изоформаии, которые могут несколько отличаться от него по молекулярным весам и изозлектрическим точкам. Количество, как самих ферментов, так и их изоформ в кавдой целлюлазной системе различно.

Из целллюлазной системы Тг1с}юс1егиа 111г1<1е (ТУ), с помощью метопа колоночной . хроматографии, был выделен Фермент целлобиогидролаза (ЦБГ). Идентификация методом УФ-спектроско-пии и аналитического электрофореза позволяет сказать, что выделенный фермент гомогенен с М.в. 60 кД;\

Теоретически рассчитанный коэффициент относительной полярности р Фермента ЦБР позволил сделать предполонение.. что данный Фермент в водном растворе стремиться к организации четвертичной структуры. Для проверки данного предположения был проведен анализ структурных характеристик с помоаьв метода ВДС.

На рис. 4 представления температурная зависимость значений иэфф для ЦБГ. Видно, что полученные в нашем эксперименте значения объема молекулы ЦБГ претерпевают резкие изменения.

Представляет большой интерес следующий оакт. Известно, что технологическим интервалом температур гидролиза целлюлозы целлюлазой Т1). из котопой был выделен фермент ЦБГ, являются температуры Т=50...60сС. Наии исследования показали, что объем кинетической'единицы в растворе при этих температурах практически постоянен, при этом превыиает в 2 раза объем на-тир"ого фермента (Т=20вС). Мо8Но сделать предположение, что Фермент ЦБГ существует в этом случае в виде димера, что вероятно обеспечивает его наиболее эффективную сорбцию на субстрате и, следовательно, более эффективный гидролиз целлюлозы. График, приведенный на рис. 4 показывает, что фермент ЦБГ проходит через такое состояние и при других температурах и эти температуры такие могли бы бить достаточно эффективными для гидролиза. Однако температурные интервалы этих состояний очень узки (вблизи 30*0 и Эд9С).

3. Взаимосвязь температурных зависимостей биохимических и структурных характеристик целлюлаз Тг1с1м(1егва 71г1(1е и Реп1с1111иа Уеггоси1о5иа

Целлвлазные ферментные системы Тг1сЬойегпа И1г1(1е (ТУ) и Реп1сШ1ип иеггоси1о$ип (Р11) являются грибными целлюлаза-ми. До сегодняанего дня в литературе по грибным целлюлазам нет сколь-нибудь ясного понимания о той, в какой структурном состоянии данные целлюлаз« находятся в растворе. Так ае нет четкого понимания механизма синергизма в действии ферментов этих целлюлаз на природную нерастворимую целлюлозу. В настоящем разделе диссертационной работы сделана попытка связать биохимические характеристики водных растворов целлюлаз ТУ и Ри с их структурными параметрами в пироком интервале температур.

На рис. 5 представлены зависимости биокаталитической активности (Бй) целлюлаз ТЧ и Ри от температуры гидролиза субстрата. Видно, что для обеих целлюлаз в диапазоне тенператур 30...50вС наблюдается рост значений Бй. При температурах выи 60вС значения Бй резко падают.

На рис. б представлены температурные зависимости Уэфф целлюлаз Ти и РУ.

Исследование измененнй объемов этих образцов показывает, что процесс достияения максимальных значений БЙ солровоздаат-ся увеличением эффективных объемов целлилаз РИ и ТУ. Прнчвы при температуре максимума БА (Т=50,..60*0; Уэфф увеличивайте^ для РУ почти в 2 раза, а для Т1) в 3-4 раза, таким образом мы мо®ен предполоаить, что в данном диапазоне температур иы наблюдаем ассоциат ферментов входящих в целлялазные комплексы РУ л Ти, которому мы дали название - мультиферментный целлнлаэ-1ый комплекс (НФЦК). Очевидно при таких размерах МФЦК созда-о ся оптимальные условия для максимальной продуктивности провеса гидролиза [1,2,311 При более вчеоких температурах мы 1аблядаем резкое разрушение комплексов. При этом Бй такяе >езко падает. Конечно в температурном поведении комплексооб-«азования у РО и ТУ имеются свои особенности, однако налицо '.овладение по облему характеру изменений,

Дополнительное подтвер|дение корреляции неяду структурой комплекса (МФЦК) и М дают данные по саимодифузии Оз для цел-

И

рис. 5

Температурные зависимости БА целлюлаз РУ и ТУ (1 - Ри; 2 - ТУ)

рис. 6

Температурные зависимости 1Гэфф целлюлаз Ри и Ти (1 - Ри; 2 - ТУ)

и

о

а

1000/Г, к

рис. ?

Температурная зависимость Оз цэллшюэи РУ (1- зависимость Оз для Ри; 2- зависимость Бз для воды)

ю

0 < ■ | I I | I * ■ М 1 1 1 ' I " ' I I " ' 1 I I ' ) | ' ' ' 1 I I

Т'.с

рис. 8

Температурная зависимость УзсЗ целлплазы РЧ после выделения липидов

лвлазы Ри (рис. 7 ), полученные методом ЯМР с импульсным гра диентом магнитного поля. Резкое увеличение коффициента -амо-диффузии Ов в интервале температур 50...70*С такве свидетельствует об уменьиении размеров диффундирующих единиц, т.е 'разрушение структуры ЫФЦК сопровождающееся уменьшением БА.

На основании предлояенной модели существования целлшла; в водном растворе моано предположить, что механизм синергизм) в действии целлшлолитических ферментов, как совокупность механизмов последовательно-параллельного действия ферментов когда продукт действия одного фермента является субстрате) для другого, снимая одновременно при этом ингибирувщее действие промежуточных продуктов гидролиза целлюлозы, основан не структурно-функциональном взаимодействии между ферментами I образуемом ими МФЦК [4,53.

4. Влияние присутствия липидов в целлгазах на их термостабильность

Какие не силы и причины определяют стабильность столь крупных образований как МФЦК или целлюлосом грибных и бактериальных целлюлаз? Недавно в литературе появились данные, что в состав целлюлосомных структур бактериальных целлюлаз входят липиды, играющие определенную роль в термостабильности дашш целлюлаз.

Как хороио видн'"1 из температурной зависимости 1/эфф для целлюлосом СТ (рис. 2) в § 1, наиболее существенным отличием поведения иэфф является сдвиг на 10 С перегиба на графике зависимости иэфф=ПТ). Для фрI он происходит при 40° С, а для ФрН при 30°С. Известно, что количество липидов в целлюлосо-мах тем выше, чем выие их молекулярная масса. Такие известно, что выделение липидов- из целлюлосом СТ приводит к распаду последних и резкому уменьиению их ферментативной активности. Таким образом можно предположить. что липидная компонента структуры целлюлосом влияет на ее термостабильность и, следовательно. на эффективность гидролиза целлюлозы. .

Для изучения влияния липидов на термостабильность грибных МФЦН была взята целлюлазная система Ри и из неё били выделены липиды. Из представленной температурной зависимости Иэфф подготовленных таким образом образцов (рис. 8) видно,

го отсутствие липидов резко сказывается на способности образовать МФЦп. Дане небольшое изменение температуры приводит резкому уменьшении размеров комплексов, что особенно замет-з при температурах 20___40°С.

Сравнивая характер температурной зависимости иэфф для ?ЦК Ри, содеряацих липиднув компоненту приведенных в § 3 5ИС.0), с зависимостью иэфф^г<Т) для освобожденной от липи-)в целлюлазы РУ (рис.9) видно, что процессы диссоциации груктуры НФЦК приведенные в этом разделе, сдвинуты в область >лез низких температур. Зсе это позволяет сделать вывод, что шиды входящие в состав грибных целлилаз стабилизируют ■руктуру НФЦК. образуемую ими в водном растворе.

вывода

Применение физических методов ВДС и ЯНР с импульсным градиентом магнитного поля для изучения полиферментных бактериальных и грибных целлюлазных комплексов позволило получить в целом новую информацию об объекте.

Методом ЗДС подтверждены предполояения о том, что бактериальная целлгслаза С. ТЬегвосвПиа з водных растворах образует крупные структуры - цвллюлосояы. Показано, что целлобиогидролаза, фермент.цзллшлаэной системы, агрегируется в водном растворе образуя ассоциати, Выдвинута и экспериментально подтоер. дена гипотеза о том, что ферменты грибных целлюлазных систем в водных растворах находятся в вида структурно-функциональных образований -нультиформентных целлюлазных комплексов (НФЦК). С позиций суцествования целлюлазных ферментов 0 водном растворе в виде МФЦК представлен иариант синергизиа в действии цоллюлолитических ферментов.

Покатана роль липидов в термостабильности целлвлаэннх комплексов.

Основное' содерялнио диссертации излоаено в следующих публикациях:

1. Мурашов В.П.. Зуоа И.О., Цыганков В.С., Ягодин.'! /Ц, Победимский Д.Г. Температурная зави шосгь диэлектрн-

ческих свойств целлвлазных ферментов в связи с и: коиформацией// Тезисы докладов Uli Всесоизного симпозиума "Инвенерная энзиыолсгия", апрель 1991 г.. Иоск-ва - С.56-57

2. Цыганков B.C., Зуев D.O., Кураиов В.И., Сметаниш С.Е.. Победимский Д.Г., Синицын Й.П., Кирпичнико! П.А. Взаимосвязь температуных зависимостей диэлектрических и биохимических характеристик целлвлолитичес-кого комплекса из гриба Trictioderaa и1г1бе//Доклад1 АН СССР -1992 -Т.325 -No.4 -С.861-864.

3. Tsyagankov U.S., Zuev Ju.F., Kurashov Ü.I., Suetanlne SJe., Pobedloskll D.G. Interconnection of the teoperature dependences of the dielectric anc biocheaical characteristics of .he cellulases coupler from the fungus Trlchoderaa Ulrlde//3.Chen. and Blochen. Kinetics - 1993 -No.l - p. 31-35

• B.C. Цыганков

Заказ 44

Офоетная' лаборатория КГГУ 4Ü00I5, г.Казань, ул.К.Маркса,6ö

Д'ирая ьО экз.