Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса PENICILLIUM VERRUCULOSUM

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса PENICILLIUM VERRUCULOSUM"

МЬбкоМсИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

1 П ФЕВ 1998_

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.152.3

ЗОРОВ Иван Никитич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ И ЦЕЛЛОБИАЗЫ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА PENICILLIUM VERRUCULOSUM

Специальность - 03.00.04 - биохимия 02.00.15 - химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1998

Работа выполнена на кафедре Химической этимологии Химического факультета Московского Государственного Университета

Научный руководитель: доктор химических наук, проф. А.П. Синицын

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф. И.А. Ямсков доктор биологических наук, проф. A.M. Безбородой

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пушино.

Защита диссертации состоится " " февраля 1998 г. в 16 часов на заседании диссертационного Ученого Совета Д 053.05.76 по химическим наукам при химическом факультете Московского Государственного Университета по адресу:

119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского Государственного Университета.

Автореферат разослан " " января 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного сове™

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современная физико-химическая энзимология имеет на наш взгляд следующие характерные особенности: а) с одной стороны происходит накопление фундаментальных знаний о механизме действия ферментов и ферментных систем, существующих в природных объектах; и б) с другой стороны прилагаются активные усилия, направленные на поиск возможностей использования ферментов как биокатализаторов в области технологии.

Во втором случае чрезвычайно важными, очевидно, являются два аспекта. Один из них связан с развитием и оптимизацией технологических процессов, для которых уже известна возможность применения ферментов (т.е. речь идет о традиционных областях применения ферментов и ферментных препаратов). Основной задачей исследователя здесь является отыскание максимально эффективных способов применения ферментов или ферментных систем в более или менее изученных биотехнологических процессах. Одним из ярких примеров ферментов такого рода является группа целлюлолитических ферментов под общим названием 'целлюлазы', входящая в состав целлюлазного комплекса. В общем случае результатом действия целлюлазного комплекса является деструкция целлюлозы и её производных до глюкозы (в ряде случаев - и до ди- и олигосахаридов). Целлюлазы традиционно используются для осахаривания возобновляемого целлюлозосодержащего растительного сырья и отходов его переработки. Этот процесс является альтернативой кислотному гидролизу растительного сырья и позволяет получить такие важные продукты как глюкозу и продукты ее последующей биологической трансформации (этанол, карбоновые и аминокислоты, антибиотики, витамины, полисахариды, белки и другие). Необходимо отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные требует значительно более мягких условий проведения процесса и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.

Второй аспект связан с поиском возможностей применения уже существующих ферментов по новому назначению, или же с поиском для этой цели новых ферментов (т.е. для исследователя речь здесь идет о поиске нетрадиционных областей применения ферментов и ферментных препаратов).

В последнее время, при исследовании свойств ферментов, входящих в состав целлюлазного комплекса, обнаружились следующие новые интересные возможности использования как комплекса в целом, так и его отдельных компонентов: это отбеливание целлюлозной массы в ходе её вторичной переработки (удаление следов чернил, тонеров и иных загрязнений с поверхности макулатуры), ферментативная депигментация текстильных (хлопчатобумажных) изделий с целью придания им более

з

привлекательных потребительских свойств, биополировка поверхности текстильных изделий, использование целлюлаз в моюших средствах и многое другое.

Создание подобных новых ферментативных процессов невозможно без поиска целлюлолитических ферментов с новыми свойствами или с высокой удельной активностью, выделения в гомогенном состоянии и исследования их свойств, поиска новых штаммов-продуцентов этих ферментов или получения мутантных штаммов при помощи методов классической генетики или генетической инженерии.

Одним из таких комплексов целлюлолитических ферментов является, на наш взгляд, комплекс ферментов, продуцируемых штаммом Рсп1аШит \>сггиси1охит.

Цель н задачи исследования. Целью этой работы являлось исследование биохимических и каталитических свойств целлюлолитических ферментов, входящих в состав целлюлазного комплекса, продуцируемого грибом Р. уеггиси1(тип, и определение причин его высокой активностью по отношению к кристаллической целлюлозе. Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:

• Исследовать возможность применения целлюлазного комплекса Р. Vеггиси1охыт для осахаривання целлюлозосодержащих материалов.

• Провести анализ качественного и количественного состава целлюлазных комплексов, полученных при различных условиях ферментации Р. усггиси1олит, и выбрать ферментные препараты для последующего фракционирования и очистки.

• Разработать (оптимизировать) способ выделения и очистки индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса Р. УеггисиЬхит.

• Изучить биохимические и каталитические свойства выделенных компонентов.

• Выбрать среди выделенных компонентов целлюлазного комплекса Р. меггисиккит ключевой (ключевые) с точки зрения активности по отношению к кристаллической целлюлозе.

•Разработать метод селективного определения активности целлобиогидролазы в присутствии других компонентов целлюлазного комплекса.

Научная новизна. Установлено, что целлюлазный комплекс Р. vemtculosltm обладает высокой способностью к осахаривашпо целлюлозосодержащих материалов, а также высокой активностью с точки зрения депигментации хлопчатобумажных текстильных изделий. Существенно усовершенствована традиционная схема выделения и очистки индивидуальных ферментов с использованием ионообменной хроамтографии, предложена схема выделения входящих в состав

4

препаратов целлюлазного комплекса Р. уеггисиктмп белков в одну стадию при помощи иммуноаффинной хроматографии, получен ряд гомогенных ферментов. Показано, что целлобиогидролаза обладает высокой активностью по отношению к микрокристаллической целлюлозе, проявляет высокую степень синергизма с эндоглюканазой при гидролизе кристаллической и аморфной целлюлозы, а также - в отличие от многих известных целлобиогидролаз - имеет низкую адсорбционную способность (низкое сродство к целлюлозе). Выделена и охарактеризована целлобназа Р. чеггисиЬ.чит, показано, что помимо высокой гидролитической активности она проявляет трансгликозилирующую активность.

Практическая значимость работы. Предложен ряд новых перспективных препаратов целлюлазных комплексов, секретируемых продуцентом Р. чегтсиЬзит, пригодных для эффективного ферментативного осахаривання целлюлозосодержащих материалов. Разработан высокочувствительный и экспрессный микрометод определения концентрации восстанавливающих Сахаров, требующий крайне незначительного расхода ферментов и пригодный для быстрого измерения активности в большом количестве образцов ферментов. Предложен метод селективного определения активности целлобиогидролзы в присутствии других компонентов целлюлазного комплекса.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на международных конференциях "Биокатализ" (Суздаль, 1995), конференции молодых ученых "Ломоносов-96" (Москва, 1996) и 213-м совещании Американского Химического Общества (Сан-Франциско, 1997).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего ссылок. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы работы и определены общие задачи исследования.

В обзоре литературы приведены сведения о разных целлюлазах, их применении для осахаривання целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ) и для обработки текстильных изделий. Описаны различные микроорганизмы - продуценты целлюлаз. Рассмотрены методы фракционирования (очистки) компонентов целлюлазных комлексов. Отражены представления о классификации ферментов целлюлазного комплекса, проведено сравнение каталитических и биохимических свойств различных целлюлолитических ферментов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Исходные вещества.

Ферменты. В работе использованы целлюлазные ферментные препараты из P. verrticulosum (получены в Институте биотехнологии г. Лейпцига и в ИБФМ РАН, г. Пущино).

Субстраты. Для определения активности целлгалаз использовали: бумагу хроматографическую No. 1 "Whatman" (Англия); микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) "Chemapol" (Чехия); карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, средней вязкости), ксилан из древесины березы, ß-глюкан, 4-метилумбеллиферилцеллобиозид (МУФ-целлобиозид), D-целлобиозу, D-глюкозу и 5-глюконолактон, "Sigma" (США), о-дианнзидин (Донецкий завод химических реактивов), растворимый окрашенный субстрат РББ-КМЦ ("Megazyme", Австралия), окрашенный субстрат ОЦ-41 (НПО "Фермент", Литва).

Аналитические методы. Глюкозу определяли с помощью покозооксидазно-пероксидазного метода, восстанавливающие сахара (ВС) - модифицированным методом Шомоди-Нельсона (Синицын, 1983) и бицинхонинатным методом (Зоров, 1997).

Методы определения целлюлазных активностей. Активность по фильтровальной бумаге (АФБ) определяли по методу, описанному в работе (Клесов, 1980), эндоглюканазную активность - вискозиметрнческим методом при гидролизе КМЦ (Синицын, 1983), КМЦ-азную - по скорости образования ВС из КМЦ, целлобиазную аютшность определяли по скорости гидролиза целлобиозы до глюкозы, активность по МУФ-целлобиозиду - по скорости образования МУФ (Chernoglasov, 1989), ксиланазную активность - по скорости образования ВС из ксилана, ß-глюканазную - по скорости образования ВС из ß-глюкана, ß-глюкозидазную активность - по скорости образования п-нитрофенола из п-нитрофенилглюкозида (п-НФГ) (Синицын, 1983), активность по РББ-КМЦ и ОЦ-41 - по скорости образования окрашенных продуктов, растворимых в спирте. Все активности выражали в международных единицах (микромоль глюкозидных связей субстрата, гидролизуемых за 1 мин) в расчете на 1 г сухого ферментного препарата или на 1 мл жидкого препарата, или I мг белка фермента.

Выделение и очистка целлюлолитических ферментов.

Хроматографическое выделение ферментов проводили с помощью системы хроматографии низкого давления Есопо System, "Bio-Rad", и системы хроматографии среднего давления FPLC System, "Pharmacia". Обе системы состояли из автоматического контроллера процесса, насоса, ультрафиолетового проточного детектора и коллектора фракций. Кроме того, в комплекте Есопо System был проточный кондуктометр для контроля градиента. Ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Сфероне проводили

л

на колонке (2.6 х 35 см) в градиенте концентрации NaCI. Высокоэффективное хроматофокусирование (ионообменную хроматографию при низкой ионной силе с элюированием в градиенте pH) проводили на колонке Mono Р (0.5 х 20 см) в градиенте pH. Ионообменную хроматографию на Macro Prep Q и Mono S проводили на колонках 1 х 10 или 1 х 40 см элюировали в градиенте концентрации NaCI. Для обессоливания белков использовали биогель Р-6 "BioRad".

Определение биохимических характеристик очищенных Ферментов. Изоэлектрические точки белков определяли с помощью аналитического изоэлектрофокусирования на приборе Model 111 Cell, "BioRad". Гомогенность очищенных ферментов контролировали также с помощью электрофореза на приборе MiniProtean-II ("BioRad") в 12 % ПААГ. Общее содержание Сахаров определяли методом Дюбуа.

Исследование процесса трансгликозилирования

Для исследования эффекта трансгликозилирования использовали систему ВЭЖХ ("Bio-Rad") и колонку (4 х 250 мм) с носителем Днасорб-NH2 ("БиоХимМак", Россия) и соответствующей предколонкой. В качестве элюента использовали ацетонитрил и 0,05 М ацетатный буфер (pH 5,0) в соотношении 70:30 соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для лучшего понимания излагаемого ниже материала необходимо сделать некоторые предварительные замечания.

В результате выполнения совместного проекта между ИБФМ РАН и кафедрой химической энзимологии МГУ была осуществлена программа оптимизации условий культивирования штамма P. verruculosum (оптимизация состава питательной среды, поиск индуктора(ов), и т.д.), в результате которой был получен ряд ферментных препаратов целлюлазного комплекса Р.verruculosum, обладающих различным качественным и количественным составом, и, следовательно, потенциально способных к разным видам практического применения. В том числе был получен препарат целлюлазного комплекса Р. verruculosum №3 (приведена кодировка прапарата, принятая в ИБФМ РАН), характеризующийся весьма высокой осахарившощей активностью, т.е. способностью к глубокой деструкции ЦСМ с получением в качестве конечного продукта глюкозы. Именно этот ферментный прапарат был использован нами для исследований в области осахариваиия ЦСМ.

1. ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА Pcnicillium verruculosum.

1.1 Оптимизация схемы выделения методом ионообменной хроматографии

Для понимания механизма действия целлюлазного комплекса и роли его компонентов, а также для изучения свойств индивидуальных компонентов необходимо выделить их в гомогенном состоянии. За основу метода выделения были взяты разработанные ранее методики получения очищенных компонентов целлголазных комплексов Trichoderma reseei, Т. longibrachiatiiDi, MiceHiaphtora ihermophüa, а также P. verniciiIo.su»] с использованием ионообменном хроматографии. В процессе выполнения этой части работы проводили оптимизацию существующих методик, подбирали условия для наилучшего разделения компонентов целлюлазного комплекса, получения наибольшего выхода индивидуальных компонентов и повышения эффективности всего процесса очистки.

В процессе оптимизации схемы выделения индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса P. vermculosttm были проведены несколько туров очистки индивидуальных компонентов. Каждый тур включал в себя первичную стадию очистки (растворение ферментного препарата, центрифурирование, осаждение белка сульфатом аммония, обессоливание); стадию групповой очистки с использованием ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Сферон в градиенте NaCI; а также последующие стадии глубокого фракционирования с использованием ионообменной хроамтографии на Macro Prep Q, методов высокоэффективных хроматофокусирования на Mono Р (ионообменной хроматографии при низкой ионной силе в градиенте pH) и гель-проникающей хроматографии на Superóse 12 (см. рис 1а) . В полученных после каждой стадии очистки фракциях определяли содержание белка, АФБ, эндоглюканазную (вискозиметрическую), КМЦ-азную, МУФ-целлобиазную, целлобиазную, ß-глюкозидазную и ксиланазную активности. В результате этой работы были сформулированы несколько рекомендаций для успешного выделения целлюлаз из комплекса Р. vemwulosum: 1. pH стартового буфера на стадии выделения белков с помощью ДЭАЭ-Сферон должно находиться в пределах от 7 до 7,5; 2. целесообразно обеспечить приблизительно 50% загрузку колонки белком от ее максимальной паспортной емкости; 3. скорость элюента должна быть такой, чтобы линейная скорость движения фронта не превышала 0,4 см/мин; 4. промывание колонки следует осуществлять 4-5 объемами стартового буфера после окончания нанесения образца; 5. для создания стабильного градиента ионной силы следует использовать буферный раствор в количестве не менее 15 общих объемов колонки (использование более 20 объемов буферного раствора не влияло на разрешение, а приводило к излишнему разбавлению элюируемых белков).

Эти рекомендации были использованы в дальнейшем для выделения гомогенных компонентов целлюлазного комплекса - эндоглгаканаз, целлобногидролаз и целлобпазы. Однако, следует отметить, что сочетание условий, предложенных в пп. 3 и 5 приводило к увеличению времени,

я

затрачиваемому на выделение белков на каждой стадии очистки, поэтому в дальнейшем нами была предпринята попытка ускорить процесс выделения белков с помощью иммуноаффинной хроматографии.

а. б

РвпаЯкт vemjciJosun растеор ЮЖт/мп

804M»M(NH.hSOi

Хроматография» D^AE-Spheron pH 5»; Градиент Nsd СИМ

rxs-CT

уЫ. i

Просто*. «t^aa*« прояаляк*дая Фракии проявляющие

бе/w высокую эпдогпк*энаэ*^о целпобигхмдрогаэ^ую. цеппобиаэную

акпвюстъ и кеилаюэную активности

Хроматофокуо^юва^е. pH 6-3.5

Л П Ц il

pl в-5.2 pl в-4,7 pl 5.2-4.5 pl 5.2-4.0 pl 4.5-3.8 pl 4.0-3,7

^юматнрафий на Macro Prep Q pH 5Д градиент NaCl 0-1М

Фрап**я, спдер*а*цая с примесью друпте Certcoe

Эчоогт<жаназаС52 fAtcpHue рМ,2;ММбэооосв бот

PenKtlium vgnvaJosum. раствор 5 мг/мл

804 р-ром (ИН4)ДО

Иммуноаффитая хроиатофафия

Белковый "проскок

Эндоглкжаназа р| 4,2 ММ 68000 Да

Рис. 1. Схемы выделения целлюлаз методами ионообменной (а) и иммуноаффинной хроматографии на примере эндоглюканазы-С52 .

1.2. Получение поликлональных антител против целлюлаз Р. увгтси/оьит

Для успешного осуществления иммуноаффинной хроматографии необходимо было получить антитела, обладающие высокой специфичностью против индивидуальных ферментов Р. уеггиси/ояит. В качестве антигенов для получения поликлональных кроличьих антител в рамках данной работы были использованы целлобногидролаза-В213 и эндоглкжаназа-С52, выделенные с использованием ионообменной хроматографии, как описано выше. Антитела были выделены из сыворотки крови и хроматографически очищены на белке А, иммобилизованном на сефарозе. Чистота выделенных антител была подтверждена методом ВЭЖХ. Активность антител против целлобиогидролазы (АЬцбг) оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа исходя из разбавления исходного раствора антител, при котором достигалось максимальное значение оптической плотности при длине волны 492 им (рис. 2а). Определение специфичности АЬцбг проводили с использованием твердофазного иммуноферментного анализа, используя библиотеку очищенных ферментов целлюлазного комлекса Р. \'еггиси1охит (рис. 26). Аиалигичные результаты были получены и для антител против эндоглюканазы. Несмотря на невысокую активность, верятно связанную с

недостаточным количеством антигена на стадии иммунизации, полученные антитела проявили высокую специфичность, что позволило перейти к следующей стадии - получению иммуносорбента, специфичного по отношению лишь к одному ферменту из состава целлюлазного комплекса Р. уегтсШозит.

........j ■——■//-

too 1000 10000 100000

Разбавление раствора At^sr

а.

««ssSr

10 100 1000 Фермент, нг/мл

б.

Рис. 2. Проверка активности антител против целлобиогидролазы-В213 (а), и их специфичности (б), по отношению к белкам, выделенным из комплекса Р. чеггисиЬйит №3\ I - целлобиогидролаза-В213; 2 - ксиланаза; 3 - эндоглюканаза-В211,4- эндоглюканаза-С52; 5 - эндоглюканаза-И; 6 -целлобиаза.

1.3. Выделение компонентов целлюлазного комплекса P. verruculosum в одну стадию методом иммуноаффинной хроматографии

Полученные антитела были иммобилизованы на BrCN-активированной Сефарозе, выбранной в качестве носителя. В процессе выделения целлобиогидролазы из целлюлазного комплекса P. verruculosum №3 исходный препарат подвергали осаждению сульфатом аммония с последующем растворением осадка в ацетатном буфере и удалением (NH4)2S04 с помощью гель-фильтрации на колонке с Bio-Gel Р2. Эта часть схемы очистки полностью повторяла аналогичные стадии в схеме выделения белка с использованием ионообменной хроматографии. После этих операций образец наносили на иммуносорбент.

Проведенная иммуноаффинная хроматография (рис. 3) позволил; получить гомогенный белок с молекулярной массой 110 кДа i изоэлектрческой точкой 4,2 (по данным электрофореза в денатурирующи: условиях и аналитического изоэлектрофокусирования соответственно). Об этих параметра оказались идентичны таковым для целлобиогидролазы

В213, выделенной с помощью ионобменнон хроматографии и использованной нами в качестве антигена.

рн

кмц

Е/мг

0,75

0.50

0,25

25

белок, мг/мл 0,150,10.

•■ 0.05-

50 75 100

Объем элюента, мл

Рис. 3. Выделение целпобиогидролазы из комплекса Р. verruculosum методом иммуноаффинной хроматографии. I - профиль элюции белка; 2 -изменение рН; 3 - профиль КМЦ-азной активности.

Удельная активность по отношению к разным субстратам для фермента, полученного методом иммуноаффинной хроматографии, по сравнению с характеристиками антигена, представлены в табл. 1. Как можно видеть, по всем измеренным видам активностей, за исключением ксиланазной, оба фермента аналогичны друг другу. Повышение удельной ксиланазной активности в иммунологически выделенном белке по сравнению с активностью антигена можно, вероятно, объяснить некоторой перекрестной специфичностью анти-целлобиогидролазных антител.

Таблица 1. Характеристики целлобиогидролаз, полученных методами

Целлобногидролаза, выделенная методом

ионооС хроматогра( ¡меннои >ии (антиген) иммуноаффинной хроматографии

Активность Ед/мг белка % от АФБ Ед/мг белка % от АФБ

по КМЦ (вискозим.) 0,01 6,7 0,01 10

по ФБ 0,15 100 0,12 100

по МУФ-02 0,19 125 0,14 117

по КМЦ (ВС) 0,22 145 0,16 135

по ксилану 0,021 14 0,06 50

В эксперименте с использованием иммуносорбента против эндоглкжаназы был получен белок с молекулярной массой 68 кДа и изоэлектрческой точкой 4,2 (по данным электрофореза в денатурирующих условиях и аналитического изоэлектрофокусирования соответственно). Эти характеристики идентичны таковым для эндоглкжаназы, использованной в качестве антигена. Сравнительные кинетические характеристики эндоглюканаз представлены в табл. 2.

Таблица 2. Сравнение характеристик выделенных эндоглюканаз

Эндоглюканаза, выделенная методом

ионообменной иммуноаффинной

хроматографии (антиген) хроматографии

Активность Ед/мг белка % от вискозим. Ед/мг белка % от вискози

по КМЦ (вискозим.) 3,64 100 2,25 100

по ФБ 0,51 14 0,34 15

по МУФ-02 0,001 0,03 0 0

по КМЦ (ВС) 1,98 53 0,96 44

по ксилану 0,11 3 0,06 3

Следует отметить, что значения соответствующих удельных специфических активностей выделенного с помощью иммуносорбшш фермента были несколько ниже, чем у эндоглкжаназы С-52 (антигена). Вероятно, это связано с тем, что происходит частичная инактивация эндоглюканазы Р. \>егтси1озит при значениях рН выше 7, неоходимых для создания условий селективной сорбции этого фермента из целлюлазного комплекса на иммуносорбенте, и при значениях рН менее 3, применняемых при элюции связавшегося белка с иммуноаффинной колонки. Однако соотношение различных активностей (например, вискозиметрическая активность/КМЦ-азная активность, вискозиметричес-кая активность/АФБ, КМЦ-азная активность/АФБ) у выделенного с помощью имуносорбции фермента идентичны таковым (табл.2) для эндоглюканазы С-52 (антигена).

Следует подчеркнуть, что процедура выделения гомогенного белка из исходного ферментного препарата методом иммоаффинной хроматографии занимала лишь 1-2 дня. Для сравнения отметим, что для получения гомогенной эндоглюканазы с использованием ионобменнои хроматографии потребовалось более месяца непрерывной работы.

Таким образом удалось разработать простой и быстрый метод выделения гомогенных ферментов из культуральной среды гриба Р. уегтси/ошп с помощью иммуносорбции. Однако этот метод не свободен от недостатков: для его осуществления необходимо предварительное выделение гомогенного антигена, кроме того наблюдается некоторое

снижение удельных активностей ферментов, вероятно связанное с воздействием pH.

2. ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗА ИЗ P. verruculosum

2.1. Выделение и свойства целлобиогидролазы За основу схемы выделения целлобиогидролазы была принята приведенная в разделе 1.1 оптимизированная методика получения очищенных компонентов целлюлазного комплекса. После стадий первичной очистки для выделения белков исполльзовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-Сферон и Macro Prep Q с элюнроваиием в градиенте NaCI и высокоэффективную гель-проникающую хроматографию на Superóse 12 HR. В результате был получен гомогенный белок, который обладал молекулярной массой 20 кДа и изоточкой 5,4. Активность выделенного белка по отоншениго к различным субстратам приведена в табл. 3.

Таблица 3. Субстратная специфичность и другие свойства целлобиогидро-

лазы-Н22

Биохимические параметры

Изоэлектрическая точка 5,4

Молекулярная масса ~20кДа

Активность (Ед/мг) по отношению к:

фильтровальной бумаге (ФБ) 0.18

КМЦ (вискозиметрия) 0.014

КМЦ (ВС) 0.52

КМЦ (ВС, микрометод) 0.46

МУФ-вз 2.15

МУФ-Ог в присутствии глюконолактона, 4 мг/мл 1.98

целлобиозе 0.095

МКЦ (авицелу) 0.56

кснлану 0.21

РББ-КМЦ 0.25

ОЦ-41 0.045

Кр, авицел 0.018

Содержание Сахаров 4,13%

рН оптимум 4.5-5.5

температурный оптимум 50+5°С

На основе анализа соотношения активностей (низкая вискозиметрическая активность, высокая АФБ и авицелазная активности) было сделано предположение, что выделенный белок является целлобиогидролазой. Обычно целлобиогидролазы гидролизуют целлюлозу по концевому

механизму, при этом основным продуктом реакции является целлобиоза. Кроме того, в силу геометрии активного центра, целлобиогидролазы проявляют невысокую активность по отношению к замещенным производным целлюлозы. Поэтому для подтверждения принадлежности выделенного фермента к целлобиогидролазам были проведены эксперименты по определнению состава продуктов гидролиза авицела, как кристаллического субстрата с повышенным содержанием концевых групп. На рис. 4 представлены данные анализа состава продуктов гидролиза авицела методом ВЭЖХ, свидетельствующие, что фермент предпочтительно отщепляет целлобиозу, глюкоза же является минорным продуктом.

Рис. 4 Образование продуктов гидролиза

. авицела под действием

,.--"* целлобиогидролазы

(определение методом ВЭЖХ с

рефрактометрическим детектором)

0.5

с

2

5 0.4

О.

к

га 0.3

О

0.2

0.1

Глюкоза — Целлобиоза

О 50 100 150 200 250

-/А-

1400 1440

Время, мин

Была также

исследована активность фермента по отношению к различным растворимым замещенным производным целлюлозы (КМЦ, РББ-КМЦ и ОЦ-41). Целлобиогидролаза гидролизовапа КМЦ и РББ-КМЦ, была неактивна по отношению к ОЦ-41 (табл. 3). Эти данные позволяют предположить, что существует критический размер заместителя, выше которого ферменту становятся недоступны внутренние глюкозидные связи полимерного субстрата.

Определен коэффициент распределения целлобиогидролазы на поверхности авицела при 40°С (при различных концентрациях субстрата). Полученное значение Кр равное 0,018л/г позволяет отнести этот фермент к слабосорбирующнмся. Такой результат косвенно свидетельствует об отсутствии целлголозосвязывающего домена в молекуле целлобиогидролазы.

Наибольшую удельную активность целлобиогидролазапроявляла по отношению к КМЦ и МУФ-вг (табл. 3). Кинетические константы для целлобиогидролазы при гидролизе КМЦ и МУФ-Ог составили, соответственно, Ут=0.55 мкМ/мин, Кт=0.287 мг/мл; Ут=4.0 мкМ/мин, К,„=0.037 мМ.

Синергизм между целлобиогидролазой-Н22 и эндопиоканазой-25 из Р. verructdosum.

Синергизм при взаимодействии компонентов является характерным признаком функционирования

целлюлазного комплекса. Он проявляется во взаимном увеличении эффективности действия компонентов комплекса на целлюлозные субстраты при их совместном присутствии в реакционной смеси. Нами было проведено изучение синергизма при гидролизе КМЦ в системе, содержавшей эндоглюканазу-25, которая

характеризовалась высокой КМЦ-азной активностью, и целлобиогидролазу Н-22. За меру синергизма принимали коэффициент синергизма, который представлял собой отношение экспериментально определяемой начальной скорости гидролиза КМЦ в смеси ферментов, к теоретической сумме начальных скоростей гидролиза КМЦ при индивидуальном действии ферментов. Результаты представлены на рис. 5. Максимальное значение коэффициента синергизма составило около 3 (при соотношении эндоглюканазы к целлобиогидролазе 4:6).

3. ЦЕЛЛОБИАЗА ИЗ P. vermculosum

3.1. Выделение и свойства целлобиазы

Схема выделения целлобиазы включала первичную стадию очистки, хроматографию на ДЭАЭ-Сферон, гель-проникающую хроматографию и хроматофокуенрование на Mono Р (после оптимизации условий выделения, как описано выше см. раздел 1.1).

Таблица 4. Субстратная специфичность и кинетические характеристики целлобиазы P. verniculosum

Субстрат Кт, мМ Vtn, мкМ/мин'

целлобиоза МУФ-G, н-НФГ 0,36+0,04 0,039+0,0037 1,6+0,16 71+5,0 86+6,7 390+4,6

Гентиобиоза Софороза 0,50+0,04 1,05+0,08 5,2+0,6 2,6+0,10

Рнс 5 Синергизм между целлобиогндролатой п зндоглнжанлзон-25

* при концентрации фермента I мг/мл

В результате был выделен гомогенный белок, который имел массу около 100 кДа, изоэлектрическую точку 5,2 и по совокупности присущих ему специфических активностей (высокая активность по отношению к целлобиозе, л-НФГ, МУФ-в) и МУФ-вг, табл. 4) был классифицирован как целлобиаза. Отметим, что фермент не проявлял активности по отношению к КМЦ, МКЦ, ФБ и ксилану.

3.2. Ингибирование целлобиазы

Изучение ингибирования глюкозой проводили определяя зависимость начальной скорости гидролиза МУФ-глюкозида от концентрации ингибитора при различных концентрациях субстрата. Начальная скорость определялась спектрофотометрически по накоплению метилумбел-лиферона, исходя из разностного коэффициента молярного поглощения, который равен 1600 М^см"'. Полученные данные обрабатывались в координатах Лайнуивера-Берка и в координатах Диксона. Было установлено, что целлобиаза ингибируется глюкозой по конкурентному механизму с константой ингибирования (КО 190 мкМ. Относительно низкое значение константы ингибирования (по сравнению с литературными данными), тем не менее, вполне соотносится с невысоким (39 мкМ) значением константы Михаэлнса, т.е. наблюдается закономерная корреляция между связыванием субстрата и продукта реакции с ферментом.

Ингибирование целлобиазы глюконолактоном изучали по аналигичной методике. Полученные данные позволили установить конкурентный тип ингибирования глюконолактоном с К( равной 17+1,8 мкМ при гидролизе целлобиозы и 16+1,1 мкМ при гидролизе МУФ-глюкозида. Видно, что глюконолактон обладает более сильной ингибирующей способностью, чем глюкоза. Практически идеальное совпадение констант ингибирования глюконолактоном, определенное по скоростям гидролиза целлобиозы и МУФ-глюкозида моет объясняться тем, что в гидролизе этих субстратов участвует один активный центр фермента.

3.3. Механизм гидролиза целлобиазой МУФ-целлобиозида Как отмечалось выше, целлобиаза обладала активностью по отношению к МУФ-целлобиозиду. Если реакция гидролиза идет через последовательное отщепление остатков глюкозы от молекулы МУФ-Ог по схеме:

МУФ

+ 2(; <3

^целлобиаза) ([целлобиаза)

то, учитывая, что коэффициенты молярного поглощения МУФ<11 и МУФ-Сг равны, можно ожидать появления лаг-периода на кривой накопления

МУФ. Лаг-период действительно нами наблюдался, причем при увеличении начальных концентраций субстрата наблюдалось возрастание времени лаг-периода (табл. 5). Образование МУФ-О) в качестве промежуточного продукта при гидролизе МУФ-вг было подтверждено при анализе продуктов реакции методом ВЭЖХ (рис. 6): в начальный момент времени происходит накопление МУФ-глкжозида, а затем, после прохождения через максимум, его концентрация в реакционной смеси снижается.

Таблица 5. Изменение лаг-периода при гидролизе МУФ-вг целлобиазой из

Концентрация МУФ-С2, мМ 0,167 0,25 0,33 0,5 1,0 2,0 5,0

Лаг-период, с 52,5 55 65 80 160 260 310

Рис. 6 Изучение динамики изменения состава реакционной смеси при гидролизе МУФ-вг под действием целлобназы из Р. \vrriiciilo.\um. 1. - МУФ; 2. - МУФ-Оь 3. -МУФ-в,.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что на первой стадии фермент атакует субстрат по ппокозндной связи, а образование свободного метилумбеллиферона происходит на второй стадии при разрыве связи МУФ - глюкоза.

3.4. Трансгликознлирование под действием целлобназы Для целлобиаз характерно проявление трансферазной активности, т.е. переноса остатка глюкозы на различные акцепторы. Простейшая кинетическая схема процесса отщепления одного остатка глюкозы от

дисахарида, сопровождаемая трансгликозилированием, представлена в следующем виде:

может быть

€G2X-VeG^f^E + G (схема!) GX 1 • Е + XG3

где

Ks =

_ [EKGiX] [EG2XI >

G2Х - целлобиоза или замещенная молекула целлобиозида

Было проведено исследование способности целлобиазы Р. verruculosum к трансгликозилированию с помощью хроматографического анализа продуктов двух реакционных систем: 1) при использовании в качестве субстрата целлобиозы и 2) в системе МУФ-Gi - целлобиоза (двухсубстратная система).

В первом случае проводили исследование состава продуктов реакции гидролиза, используя ВЭЖХ с рефрактометрическим детектором. Было обнаружено образование трисахарида, концентрация которого увеличивалась и, достигнув максимума, плавно снижалась. Образования олигосахаридов с большим количеством мономерных звеньев обнаружить не удалось, возможно вследствие низкой чувствительности рефрактометрического детектора.

Экспериментально было определено отношение начальных скоростей образования трисахарида и глюкозы при различных начальных концентрациях целлобиозы (50, 100 и 150 мМ), что позволило установить, что отношение kVk j = 590+17, т.е. эффективная константа скорости реакции трансгликозилирования почти в 600 раз превышает константу скорости на стадии гидролиза. Этот эффект объясняется тем, что гидроксильная группа в молекуле углевода является более сильным, по сравнению с водой, нуклеофилом на стадии нуклеофильной атаки глюкозного остатка в гликозилферменте. Другим фактором, который может вносить вклад в столь высокое значение отношения констант скоростей трансгликозилирования и гидролиза может быть увеличение локальной концентрации акцептора вблизи активного центра фермента вследствие его возможного связывания с ферментом.

Для определения возможного образования олигосахаридов с количеством звеньев > 3 анализировали продукты реакционной системы, в состав которой входили МУФ-G: и целлобиоза. Исследование проводили методом ВЭЖХ со спекгрофотометрическим детектором, который обеспечивал более высокую чувствительность, чем рефрактометрический (минимально определяемая концентрация МУФ-производных составляла менее 1 мкМ, тогда как предел обнаружения рефрактометрического метода детекции Сахаров - 0,5 мМ по глюкозе). На рис. 7 представлены

кинетические кривые изменения концентраций продуктов реакции при начальной концентрациях в реакционной смеси целлобиозы и МУФ-вг - 75 и 0,2 мМ соответственно. В реакционной смеси были обнаружены продукты трансгликозилироваиия со степенью полимеризации > 3. Кривая накопления МУФ-вз проходила через максимум. Концентрация МУФ-вд постепенно нарастала, а затем (после 60 мин реакции), оставалась практически на постоянном уровне. Накопление МУФ-Сз происходило на протяжении всего процесса протекания реакции, однако даже через 21 ч его концентрация была относительно невелика и не превышала 3 мкМ.

Время,мим

Рис. 7 Кииетическпе кривые изменения концентраций продуктов в реакционной системе, содержащей МУФ-целлобпозид, целлобиозу и целлобиазу. 1 метилумбеллиферон; 2 - МУФ-глюкозид; 3 - МУФ-целлобиознд; 4 - МУФ-03, 5 -МУФ-О^б-МУФ-О,.

4. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ В ПРИСУТСТВИИ ДРУГИХ КОМПОНЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА

4.1. Высокочувствительный однореагентиый метод детектирования восстанавливающих Сахаров на основе бицинхонииопой кислоты

Для определения концентрации ВС обычно используют метод Шомоди-Нельсона, а также метод с дннитросалициловой кислотой. Они имеют большой линейный диапазон, однако невысокая чувствительность, большая продолжительность времени анализа, необходимость применения последовательно нескольких реагентов снижают их прилекательность. Для того, чтобы преодолеть эти недостатки предложено использование комплексов бицинхониновой кислоты (или ее натриевой соли) в качестве индикаторной реакции при определении ВС. При этом окислителем является нон меди (И) в комплексе с аминокислотой. Восстановленная при

окислении альдоз в альдоновые кислоты медь (I) образует с 2,2'-бицинхониновой кислотой комплекс фиолетового цвета. Коэффициент молярного поглощения для комплекса бицинхониновой кислоты с медыо(1) при определении глюкозы составлял 63000, что позволяло при определении концентраций ВС добиться высокой чувствительности на уровне единиц наномоль. Наблюдались строгие линейные зависимости между оптической плотностью раствора и концентрацией Сахаров (в интервале от 0,5 до 10 мкг/мл). Погрешность метода не превышала 5%. Бицинхонинатный метод обеспечивал более высокую чувствительность, чем метод Шомоди-Нельсона (в 8 раз по глюкозе и в 7,7 раза по целлобиозе и почти на два порядка по сравнению с методом с использованием динитросалициловой кислоты). Нами была проведена миниатюризация этого метода определения ВС и разработана методика высокочувствительного определения КМЦ-азной активности целлюлаз в микрообъеме с использованием микроплашечного ридера, что позволило регистрировать начальные скорости гидролиза КМЦ одновременно в 96 пробах.

4.2. Оптимизация условий прямого определения активности целлобиогидролазы при помощи иммуносорбции на поверхности полистирольных планшетов

Как отмечалось выше (раздел 1.2.), антитела, полученные против целлобиогидролазы обладали высокой специфичностью, поэтому мы применили их для селективного определения активности целлобиогидролазы в составе целлюлазного комплекса.

4.2.1. Определение концентрации целлобиогидролазы в растворе ферментного препарата проводили методом иммуноферментного сэндвич-анализа. Строили градуировочный график зависимости аналитического сигнала от концентрации антигена (целлобиогидролазы) в растворе. Было установлено, что количественно определять целлобиогидролазу можно в интервале ее концентраций 2-30 иг/мл. Поэтому далее для определения концентрации целлобиогидролазы подбирали разбавление целлюлазного комплекса так, чтобы ответ, полученный в результате иммуноферментного анализа лежал в пределах градуировочной кривой.

4.2.2. Определение активности целлобиогидролазы проводили следующим образом: на поверхности планшета сорбировали специфические антитела, затем наносили раствор исследуемого целлюлазного комплекса и после окончания сорбции и отмывки планшета от несвязавшихся компонентов прибавляли раствор субстрата (КМЦ). Планшет инкубировали 30 мин при 50°С, после чего определяли концентрацию образовавшихся ВС бицинхонинатным методом. Значение аналитического сигнала было слишком мало из-за низкой концентрации целлобиогидролазы в исследуемом растворе. Для ее повышения использо-

201

' акГ

сорбцич биотинилировэнны* антител на поверхности планшета, модифицированной стрептавидином

3 О ман«ение -сес^еитов ивплолаэиого «омппвкса

сорбция антигена

•г?

Л

смыв е*та 5 антшел. рн < 3.2

" Э добделенир субстрэтз

V

Схема 2. Определение активности целлобиогидролазы, используя планшет, модифицированный стрептавидином.

татов, получаемых в целлобиогидролазы.

4.2.1.

валя схему 2: биотинилированные антитела наносили на планшет, модифицированный стрептавидином (с целыо повышения сорбционной емкости планшета), проводили сорбцию исследуемого препарата целлюлаз, отмывали несвязавшпеся компоненты и затем разрушали связь антиген-антитело добавлением кислого буфера, тем самым переводя специфически сорбированную целлобиогид-ролазу в раствор. На следующей стадии прибавляли раствор КМЦ и определяли начальную скорость накопления ВС (бицинхонинатным методом). Исходя из полученных данныхрассчитывали активность

целлобиогидролазы, а с учетом резуль-можно рассчитать удельную активность

4.3. Метод селективного определения активности целлобиогидролазы с помощью МУФ-целлобиозида

Как было показано, целлобиогидролазы проявляли активность по отношению к МУФ-производным дисахарпдов, которые являются "минимальными по длине" субстратами деполимераз, действующих по концевому механизму. В процессе гидролиза образуется свободный МУФ, обладающий высоким коэффициентом молярного поглощения.

Основными проблемами при использовании МУФ-вг для селективного определения целлобиогидролазной активности являются возможный гидролиз МУФ-Ог эндоглкжаназами и [3-глюкозндазами. Нами было установлено, что эндоглюканазы целлюлазного комплекса Р. уепжы/охшп не проявляют активности по отношению к МУФ-Сг, однако целлобиаза гидролизует этот субстрат. Поэтому селективное определение активности целлобиогидролазы комплекса Р. усггиси/охши по МУФ-Ог затруднено именно присутствием целлобиазы, поскольку оба этих фермента эффективно гидролизуют этот субстрат. Было показано (см. раздел З.2.), что глюконолактоп эффективно ннгнбпруст целлобиазу, но практически не препятствует гидролизу МУФ^ гомогенной целлобиогидролазой (табл. 3). Эти особенности были использованы для создания селективного количественного метода определения активности целлобиогидролазы в присутствии других компонентов целлюлазного комплекса. Суть метода заключалась в том, что предварительно подбирали

21

концентрацию глюконолактона, при которой достигается полное ингибирование целлобиазы (по гидролизу п-НФГ и целлобиозы), и далее -при этой концентрации глюконолактона - определяли активность по МУФ-02 (табл. 6).

Таблица 6. Активность целлюлазного комплекса Р. уеггисиЬяит №3

Активность, Ед/г без глюконолактона глюконолактон 4 мг/мл

по целлобиозе ПО ~0

по МУФ-С2 154 97'

' - целлобиогидролазная активность

ВЫВОДЫ.

[.Оптимизирована схема выделения индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса Р. чегтсиШит, которая заключалась в групповой очистке ферментов с последующим их тонким фракционированием методами высокоэффективной ионообменной, гель-проникающей хроматографии и высокоэффективного хроматофокусирования.

2. Получены специфические антитела против целлюбиогидролазы и эндоглюканазы целлюлазного комплекса Р. уеггисиЬбит, на их основе реализован метод иммуноаффинной хроматографии, позволивший выделять целлобиогидролазу и эндоглюканазу в гомогенном состоянии в одну стадию. Показано, что ферменты, полученные этим методом идентичны по свойствам соответствующим ферментам, использованным в качестве антигенов.

3. Выделены гомогенные по данным аналитического электрофореза и изоэлектрофокусирования эндоглюканаза, целлобиогидролаза и целло-биаза целлюлазного комплекса Р. уеггисиЬяит, определены их биохимические, физико-химические характеристики и субстратная специфичность. Установлено, что целлобиогидролаза играет ключевую роль в осахарнвании кристаллической целлюлозы.

4. Показано наличие эффекта взаимного усиления эффективности действия (синергизма) в действии между целлобиогидролазой и эндоглюканазон, а также между эндоглюканазон и целлобиазой целлюлазного комплекса Р. уегпсси1о5ит.

5. Исследован процесс трансгликозилирования под действием целлобиазы, установлено, что константа скорости трансгликозилирования почти в 600 раз превышает константу скорости гидролиза целлобиозы.

6. Разработан высокочувствительный микрометод определения восстанавливающих Сахаров с использованием бицинхонината натрия. На его основе предложена методика экспрессного и чувствительного определения КМЦ-азной активности целлюлаз.

7. Предложены методы определения целлобиогидролазной активности в присутствии других компонентов целлюлазного комплекса Р. уеггиси1о$ипг.

- с использованием специфических антител;

- на основе гидролиза МУФ-целлобиозида в присутствии специфического ингибитора целлобиаз - глюконолактона.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Сахаров И.Ю., Зоров И.Н., Синицы» А.П. Выделение эндоглюканазы Pénicillium verruculosum методом иммуноаффинной хроматографии. -Биохимия, 1996, Т. 61, вып. 9, с. 1658-1663.

2. Зоров И.Н., Дубасова М.Ю., Синицын А.П., Гусаков A.B., Митченко А.А, Баразненок В.А., Гутьеррес Б., Попова H.H. Применение бихинхонинатного метода анализа восстанавливающих Сахаров для определение КМЦ-азной активности целлюлаз с использованием микроплашечного ридера. - Биохимия, 1997, Т. 62, вып. 7, с. 826-832.

3. Баразненок В.А., Анкудимова Н.В., Синицын А.П., Попова H.H., Гутьеррес Б., Окунев О.Н., Зоров И.Н. Мониторинг целлюлаз: сравнительное исследование методов определения активности с помощью окрашенных и неокрашенных производных целлюлозы. -Биохимия, 1997, Т. 62, вып. 7, с. 687-692.

4. D.F. Tikhomirov, V.A. Baraznenok, T.G. Bekker, В. Gutierrez Rodriguez, N.N. Popova, I.N. Zorov, A.P. Sinitsyn. Novel enzymes and technologies in denim wash. - 213-th ACS National Meeting, San Francisco, CA, April 13-17, 1997.