Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональной организации геномного локуса Bacillus truringiensis подвида galleriae содержащего гены σ-эндотоксинов cryIX и cryIG

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональной организации геномного локуса Bacillus truringiensis подвида galleriae содержащего гены σ-эндотоксинов cryIX и cryIG"

94

ргз. ол

р ¡,у ВСЕГОССИИСКИЙ ИНСТИТУТ генетики и СЕЛЕКЦИИ ¿, Й Й“і1 ‘'

ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

' На правах рукописи

ШЕЕЕЛЕВ АЛЕКСЕЙ БОРИСОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРН0-4ОТІКЩ0НАЛЕ .ОЙ ОРГАНИЗАЦИИ геномного ЛОК.УСА ВасіПиа гьигітщіепзіа подвида ваіієгіое СОДЕРЖАЩЕГО ГЕНУ ¿-ЭНДОТОКСИНОВ СТ'уІХ И СГуЮ.

Специальность - ОЗ.ОО.ОЭ . Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ аа "оискагие ученой степени кандидата биологических тук

Ыосква !993

Москва 1993 ' •

Работа выполнена во Всесоюзном научно- исследовате-.оском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: доктор биологических наук Г.Г.Честухшш

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Н.К. Янковский; кандидат биологических наук А.С.Яненко

Ведущая организация: Институт Сельскохозяйственной биоте хко лог: Российской сельскохозяйственной акадешш ,

Защита состоитоя м______" января 1993 г. в час

на заседании специализированного совета Д 098.12.00 по 'иологическим наукам Всероссийского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВНИИгенетика

Автореферат разослан " ' " ____________ 1993 г.

Ученый секретарь • специализированного совета

В.И.Щербакова

Актуальность проблему. В настоящее время все большее при-менетгие находят биологические средства защиты растений на основе ¿-эндотоксинов Baclllxia thurtnglep^la, активные в отношении личинок более чем 300 видов насекомых отрядов Lepldoptera, Díptera и Coleóptera. Исключительно высокий уровень избирательности действия ¿-эндотоксинов требует испол. зования большого их разнообразия для эффективного поражения всего спектра насеко-мых-вредителей, в связи с этим значительные усилия многих исследователь :ких групп были направлены на поиск новых ¿-эндотоксинов, обладающих ране неизвестным типом специфичности. Таким образом, в настоящее время клонированы и секь-зш.рова-нц гены более чем 60 различных дельта-эндотоксинов. Тем не менее, поиск новых дельта-эндотоксинов и их генов остается актуальной задачей. Кроме того, несмо'гря на клонирование значительного числа генов ¿-эндотоксинов, механизмы их экспрессии, взаиморегуллции и происхождения изучены недостаточно. Вместе с тем, данная модель является перспективной с точки зрения регуляции экспрессии генов у грам-положителышх микроорганизмов в ходе споруляции и эволюции их генома. Изучение тонких механизмов экспрессии генов б-ондотоксинов может также служить базой при создании новых ЕысокоэфХективных штаммов-нродуцентов 5-эндотоксинов для сельского хозяйства.

Целью данной работы являлось клонирование и структурная характеристика генов 6-окдотоксинов • aclllua tbxxrlnglenaia подвида gollerías, в том числе - ¿-эндотоксина Сгу.ТС5 ■ ответственного за троявление уникальной специфичности кристаллов ьтого подвида‘по отн-шеншэ к личинкам Gallería welonella, и криптического reirá crylX, локализованного в геноме штамма-хозяина вблизи crylC. На основании данных секпенлрования геномного локуса расположения crylG предполагалось изучить молекулярный механизм экспрессии данного гена и причины нефункционально ста нового гена crylX. ‘

Научная новизна и практическая ценность работы.

3 данной работе впервые клонировали' и охарактеризованы

гены дву х <5-вндотоксинов подвида gallerías, в том числе: I. ген <5-эндотоксина crylG, значительно отличающегося от известных ранее по первичной структуре и специфичности энтом: одного действия; 2. критический ген crylX локализованный вблизи crylG. В ходе секвенирования геномного локуса, содержащего клонированные гены, определена последовательность 12 тысяч пар нуклеотидов. Проведен детальный компьютерный анализ полученной нуклеотидной последовательности, направленный на выявление потенциальных регуляторных элементов клонированных генов, установлена причина кринтичности гена crylX. На основании данных сравнения выведенных из нуклеотидной аминокислотных последовательностей с известными в литературе ¿-ендотоксинами были предсказаны свойства белковых молекул CrylG и CrylX. С применением те'шжи молекулярного клонирования проведена гетерологичная експрессия клонированных генов в клетках ¿’.coli, изучены физико-химические, иммунологические и токсические свойства гетеро--логичных белков. На основании сравнения нуклеотидных последовательностей crylG и сгуТХ впервые прямо показно участие процессов геномных престроек, не связанных непосредственно с общей рекомбинацией, в эволюции генов б-оадотоксююн. В результате анализа флаикируицих областей генов crylX и crylG впервые высказано пред положение об образовании иолицистронных мРНК, кодирующих одновременно два & - эндотоксина.

Клонированные в работе геїш использовались для изучения структурно-функциональной организации <5-ондотоксинов методами белковой инженерии. Они могут также применяться для создания трансгешшх растений, устойчивых к вредителям, и разработки новых инсектицидных препаратов на базе ó-эндотоксинов CrylX и ОгуIC¡. Данные о механизме регуляции экспрессии crylG имеют теоретический ингервс и могут применяться для оптимизации экспрессии в Васіїїиз ttiurlnglenaia.

Иубгаїкации и апробация работы. Материал! исследования потеме диссертации опубликованы а 3 статьях и представлены на Международном Биохимическом Конгрессе в Иерусалим« в 1901г.

Объем и структура работы. Диссертация состоит и: ішодения, обзора литературы, носвя’деїшс. о структурно-фуикидоца-пьной организации б-еодог ¿ссиноь и их генов в генсме Вас I Низ

thurínnicnela, обсуждения результатов, экспериментальной части,

F.Hг.одов «списка цитируемой литературы.

Диссертация содержит рисунков л таблиц.

Полный объем работы страниц.

!. Конструирование фазмидной библиот леи Бас Шиз tfmr'lnglena' і подвида gallerlae к клонирование гена crylG.

Для создания клонотек использочали суммарную тотальную ДІІК Bacllltui th.uringten.3t3 подвида gaíZeríoe, неполностью расщепленную рестріпстапой EcoRI. В качестве векторной системы иеполь зопали фззмиду xpSLfj (Г'ію. І), и газонную культуру E. cali ОТ--14 (аирЕ, SupF.TonB). Фазмпдішй вектор содержит в составе одно Р. молекули полноразмерную плазмиду pUC19 и фрагмент фага /, дос таточіціЛ для поддержания .иітітчеекого развития фага. Еила разработана методика анализа фазмпднтіх библиотек с использованием ифтпю оччтчтшт. антител к ¿--эндотоксину CrylG. Выявление имму-неположительных клонов проводилось с использованием мет да вторичных антивидовнх антител, мечешшт персксидазой хрена. Схема хара тери-іики фазмі'дьих клочов, отобранная из библиотеки после повторного скрининга включала:

а) Вестерн-блот - SDS-електрофорез с последующим электропереносом белков на нитроцеллшгазнурз мембрану и иммунологическим проявлением по той же схеме, что и при иммунсскрининге . •

б' Определение биологической активности на личинках чуствк-тельных к данному ¿-эндотоксину насекомых Gallerlae ñelonella.

- З -

е) Анализ pecTpíiKiuiciiiiux фрагментов отобрашшх клонон с целью выявления области перекрывания its вставок. ■

При Ьесторн-блот анализе отобранных-из библиотеки клопов с использованием антисыиоротки CrylG било показано,что в них ¡экспрессируется белок, иммунологически родственный и совпадающий по размеру (Mr 130 kDa) с основним белковым компонентом кристаллов штамма II-67 подвида- gallarіає. Дна EcoRI- фрагмента клонов >р0010, АрОС11 и лр0С407 размером 3 тин и 5 тпн совпадали (Рис 2а), что далі.) основание отнести вставки данных клонов к одному геномному локу-гу штамма-хозпина и локализовать ген cryLG в пред« -ла. области, входящей в состав отих двух фрагментов. Для дальнейшего уточнения положения искомого гена во вставке был получен ряд делециошшх вариантов фазмидного клона лрОСЮ и иммунологи-чески проанолизировапны их белковые продукты. Геи crylG бил лока лизован ь рамках фрагмента KpnI-Xba'L (5 т.п.н. •• lY.e. 26). -Установление точного расположения и ориентации гена было проведено на основе частичного определения нуклеотидной последовательности. F; рамках секвенированного фрагмента Крп1-Коо47.111 (1,1 тлі.и.)

были обнаружены SD последовательность, инициагорный кодон и открытая рамка считывания, фрагмент которой.начинал с 24-ой аминокислоты соответствовал установленной ранее N-концевой последовательности белка Cr,yIG. Это позволило однозначно идентифицировать клонированный ген, э также определить N-концевой участок, отщепляемый трипсином (по связи Lyi.J3-l’yr24) ггри ггротеолитической активации соответствующего протоксина. Илтересио, что иа протяже -ніш более чем ЬОО п.н. в направлении 5’-конца от инициаторного колона не обнаруживается каких-либо отрукт’ф, сходных с їг-hjfn : нн ми бациллярными промоторами, в том числе, с промоторами тисгч BLI

и £111, абичім располагавшимися на расстсяшш -- ІОО-І^О п.и. от начала описанных в литература сгуI-генов. Это обстоятельство может служить указанием на возможность оперонной оргагшзании генов ¿-эндотоксинов подвида gallcrlae.

С целью секвенкрования структурной области гена cry 1C, был получен ряд делеционных вариантов на Пазе плазмндннх векторов типа pUC и фаговых вектороь М13, позволяющих получать клонированную ДНК в виде одной цепи. Для секвенирования crylG использовались уникальные и стандартные праймеры. Схема ^еквениііва-ния кодирующей области crylG приведена на Рис.З.

Анализ нуклеотидной последовательности crylG в не позволяет обнаружить существенной гомологии с каким-либо из известных генов ¿-эндотоксинов. Достоверный уровень сходстза удается выявить лишь при сопоставлении соответствующих аминокислотных последовательностей. Для совпадающих остатков в последовательности истинного токсина СгуЮ с другими токсинами класса СгуІ в среднем не превышает 1996, в то время как, большинство и? них (за исключением СгуІБ) совпадают примерно на 50%. Обнаруженный уровень сходства характерен для ¿-эндотоксинов, относящихся к разным классам, хотя по типу энтомоцидгтой специфичности СгуЮ однозначно долхен бать включен в класс OrВыравнивание аминокислотных последовательностей СгуЮ с представителями класса СгуІ приведено на рисунке 5. .

2. Клонирование и характеристика, гена cryIX.

В ходе изучения геномной организации локуса расположения гена crylQ было проведено субклонирозание и секвенированиэ ряда фрагментов из состава вставки фазмиды КрОСЮ. Анализ нуклеотидной

5’-концевой последовательности данной вставки (участок ЕсоШ Крп1 Ни:.’¿б) показал наличие в ней выраженной гомологии -с генами ¿-эндотоксинов, что послужило основанием Для секвестрования данного фрагмента генома длиной 4.4 тпн. Схема стратегии секвеииро-вания приведена на Рис.4.

В секвенированной области была обнаружена непрерывная рамка считывания длиной около 3500 нуклеотидных, пар (Рис. 6). Как нуклеотидная, так и аминокислотная последовательность данной рамки выявила достоверную гомологию с известными ¿-эндотоксинами. В пределах секвепированиых областей были обнаружены пять характер-ш для ¿-эндотоксинов консервативных блоков (Рис.6). Проведенное ■сопоставление К-концевой половины аминокислотной последовательности, закодированной в указанной рамке (1-620 остатки), с различными 6-ендотоксинами позволило отнести гипотетический белковый продукт к классу Сгу1 о присвоением ему временного рабочего названия Сгу1Х. Наибольшую степень сходства Сгу!X обнаруживает с белком 0гу1В, хотя и она оказывается несколько ниже той, что характерна для последовательностей 0гу1- класса. В то же время, различия между СгуМ и основной группой Сгу1 еще выше, чем между ней к ОгуХХ. Таким образом, данные сравнения аминокислотных последовательностей ггоззоляют включить СгуХХ в класс Сгу1, хоти такой вывод нельзя считать окончательным, поскольку сходство Сгу1Х с ОгуША лин/ь немногим ниже, чем с токсинами группы Сгу!. Однозначно вопрос о классификацк ином отнесении 0гу1Х можно решить лишь на основании дашшх биотестирования.

Анализ С-концевой части аминокислотной последовательности Сгу1Х выявляет ее крайне высокое сходство с соответствующей тс-ледовательнос’гьы Сгу10, хотя их Ы-концевые части различается

очень значительно. Такой характер сходства двух генов из подвида даіієгіае может Сыть объяснен, зли допустить акт геномной перестройки с участием предкового гена одного из них, имевшего отличающуюся С-концеву» часть или не имевшего ее, и С-концевой половины второго, оставшегося без изменений. Зона перехода различающихся ЇІ-концевнх последовательностей СгуІХ и СгуЮ в сходную С-концевую гаходится в районе четвертого консервативного ,лока. В данной зоне все ¿-эндотоксины и.’..еют значительную степень сходства, что могло послужить причиной предполагаемого а..га реког-Зина-ции. Последовательности пятого блока и С-концевых частей СгуІХ и сгг/ІО практически идентичны, на протяжении почти 2 тіш здесь обнаружена лишь одна нуклеотидная замена в третьем полозении кодона. Сходство нуклеотидных последовательностей сохраняется на протяжении 350 нуклеотидных пар б 3’-некодирувдих областях рассматриваемых генов.

Наличие протяженной открытой рамки считывания в секвениро-вакной области сгуIX позволяет считать кодирующую последовательность данного гена неповрежденной. В то. же время, анализ 5’-концевого фланга гена не обнаруживает характерных элементов точки инициации трансляции: последовательности Шайн- Л"гсьгарно и шгициаторного кодона АТС г ли ТТС 'Рис.6). Внутри секвенированной области имеющася рамка содержит на 5’ -фланге длиной 30 нуклеотидных пар два стоп-кодонас что не позволяет считать, что данные елементи находятся в неклокированной области. Таким образом, обнаруженная нами копия гена СГуїХ лишена, возможности еффэктавнс транслироваться л моавт считаться криптазескоа. ■

Лпя подтверэдензя излитая открыто», рамки .считывания в кодирующей области гена сгуТХ., а также с целья изучения ккуунологача-

ских и токсических свойств белкового продукта СгуІХ наші была сконструирована рекомбинантная плазмида pSIffll (Рис.7а) -на базе плазмидного вектора pUC119, позволявшая ..экспрессировать данный геи в составе транскрипционно-трансляциоштого слияния с геном а-пептида iî-галактозидазы под контролем промотора лактозного оперона. Клонирование фрагмента СгуІХ осуществлялось но сайтам рестриктаз Sph1 и ВатН1. При этом слияние рамок считывания о-пептида и à-вндотоксина происходило не только в 5'-, но и в 3*-фланге. Это обстоятельство приводило к наличию в рекомбинантном штамме Е.соII, несущем плазмиду pSHB1, tf-галактозидазной актг.ілюсти, выявляемой по цветной реакции с X-gal в присутствии IPTQ. Полученный рекомбинантный белок тестировался методами електрофорезе в акриламидном геле в присутствие SUS и Вестерн- блот-тинга с несколькими антисыворотками, полученными против белков Bacillus thurtngtcnsis. Электрофорез в присутствии SDS с последующей окраской геля СВВ G-250 позволил установить наличие рекомбинантного белка в составе биомассы клона Е.СОІІ, несущего плазмиду р5НВ1 (Рис.76), и определить его молекулярную массу, которая оказалось равной примерно 90кДа, что соответствует теоретически предсказанной на основании известной нуклеотидной последовательности молекулярной массе 91,949Да (при расчете учитывали вклад молекулярной массы альфа-пептида, находящегося в составе рекомбинантного белка). Проведенные вксперименты по иммуноблоттингу не выявили реакции белкового продукта СгуІХ с очищенными антителами против белков СгуІАа, СгуІІІА и истинного токсина СгуМ. В то же время достаточно четкая, но специфичная реакция была обнаружена о цельными сыворотками против кристаллов Bictllus thut'inglenalä . .даидов gallefiœ (Рис.76) и israelenata. Реакция с антисыворот-

кой против кристаллов подвида galleriae может Сыть обусловлена перекрестным взаимодействием ан'.ител к С-концевой части CrylG со сходной последовательностью CrylX (около 100 аминокислотных остатков). Сильная реакция с антителами против кристаллов подвида israelenal3 может быть обусловлена как наличием в данном подвиде CrylX-подобного белка, так и перекрестным взаимодействием антител к токсинам ■’ругшы CryIV несмотря на низкий уровень сходства аминокислотных последовательностей известных белков CryIV с CrylX.

Полученный рекомбинантный белковый продукт CrylX был -фО-тестирЕан на наличие токсической активности на личинках Galleria melonella, Limmtrta dts'rxr, Hellothla vtreacena и Manduca sexta. Эксперимент не выявил активности CrylX против использованных тест-объектов. С целью изучения спектра токсичности CrylX, необходимого для его окончательного классификационного отнесения, должны быть поставлены дополнительные опыты с использованием насекомых других групп, в том числе, вероятно, представители отрядов Coleoptsra и Díptera.

3.Предпологаемая молекулярная организация ■ локуса нахождения г^нов cryLí и crt/IG.

Отсутствие в ближнем 5'-кснц-вом фланге cryIG характерной промотороподобной структуры, обеспечивающей суперэкспрессию гена в период споруляцки микроорганизма-хозяина, ставит вопрос о принципиальной организации его транскрипции. Обнаружение гена cryTZ в 1.5т.п.н вше cry 10 в то® я» ориентаций может указывать на наличие сквозной транскрипции обоих генов о одного промотора, находящегося выше Гена cryiZ. Для подтверждения данного предположения необходимо осуществить клонирование более протя-

кешюго Ь'-концевого фланга cryIX, посколысу к составе доступних в настоящее время для анализа 30-35 нуклеотдшх пар слева от кодирующей области сгуїХ нахождение промоторов согласно литературным данным маловероятно.

Трансляция й—эндотоксинов с полицистронных мРНК известна для генов cryllA, cryllС и crytt. В первые двух случаях кодирующая область ¿-эндотоксина- является дистальным, а в третьем - проксимальным компонентом полицистроішой.мРНК. Во всех случаях дополнительные пептида, закодированные на одной мРНК с ¿-эндотоксином, не обнаруживается в составе кристаллов, функция их неизучена. Ті «од образом, случаи трансляции двух различит. ¿-эндотоксинов с ■одной мРНК неизвестны. В то же время, дополнительные открыто рамки считывания на полицистронных мРНК cryllA, cryllC, crylF ¡weкт каноническую точку инициации трансляции, отсутствующую у cryIX.

Неизвестным остается также 'происхождение и функциональная значимость сходных 3'-концевых, в том числе, и некодируыщих частей генов crylX и cryIG при существовании глубоких различий в ш; 5'- кошевых частях. Возмояаю, пролить свет на данную проблему удастся в результате обнарукения дополнительных копий сгу'ХХ- или crylQ-подобиях генов в подвиде sailerlae или других подвидах.

Выводы.

I. Проведен иммуноскрининг геномного банка генов Bacillus thuringtenala aap gallerias антисывороткой против 5--эндотоксина CrylG, изолировано Э независимых клона, несущих перекрывающиеся вставки. С использованием полученных в результате скрининга фазкидных конструкций определена нуклеотидная последс ^атг-льаость Фрагмента генома йасіїїиа t<*artngtena із вар galler ’as длиной

' 11753 пар оснований. -

3. В пределах секвенированной области впервые локализован гон £ -овдотоксина crylG (4156 пар нуклеотидов). Анализ нер-гичной структуры нового гена обнаружил линь ограниченную степень сходства (не более 28%) с известными представителями класса Cryl, что коррэлировало с его уникальной специфичностью на личинках Galleria, melonella. Показана идентичность продукта гетеро,логичной экспрессии клонированного гена с природным б-ондотоксином.

4. В 1.5 тпн выше гена cryIX обнаружена дополнительная непрерывная pat.(ко считывания длиной 4058 пар нуклеотидов, идентифициро -паннам как новый кршттическиП ген ¿-эндотоксина cryIX. М-концеьчя половина (1-600 остатки) гипотетического белкового продукта OrylX имела сходство с известными представителями <5-андотоксшгов, не превышающее 25%.

Гены crylX и crylG имеют идентичные З’-концеЕые части, включающие кодирующую и некодирующую области, общей длиной I.8тин при глубоких различиях их 5’-концевых частей. Такой характер сходства данных генов свидетельствует об участии геномных перестроек в происхождении данных генов.

»«. Путем трансляционного слияния с л-петидом /з-галактоьидгпн оперт« достигнута гетерологичная экспрессия природою нефункционального гена cryIX. Подтверждено соответствие молекулярной наосы белконаго продукта Cry Г.Х теоретически предсказанной, обнаружена его перекрестная иммунологическая реакция с антителами против ‘-эндотоксина OryiG. Установлено отсутствие токсичности CrylX на рнцз насекомых-тест оо-Ь'”-тов: Galleria melonella, Lywan.trlu

¡Jpüilopteru twlfçxi, Uanduca next a.

7. H 5 ' - iinaïu^ipv! .:n je- il ‘ти гена crylG ne обнаружено капегп-п i.u".

для генов 6-эндотоксинов споруляционных промоторов. На основании ото. j сделано предгголг :ение о транскрипции crylG и crylX в виде 'Зихщстронной иРНК с общего проыотора, находящегося вше cryIX.

Результаты работы отражены в следующих публикациях:

I. S.Y.Smulevitoh, A.L.Osterman, A.B.Shevolev, S.Y.Kaluger, A.I.Karauin, R.M.Kadyrov, O.P.Zagnitko, G.G.Chestukhina,

V.M.Stepanov "Nucleotide Sequence oi a Novel deltaEndotoxin Gene cryIQ oi Bacillus tTvuringiensis ssp. gzllerlae" (1991). PEBS Letts, v.293, p. 25-28.

£>, A.I.Karaein, A.I.Osterman, R.M.Kadyrov, S.Y.Smulevitoh, A.B.Shevelev, G.G.Chestukhina, Y.U.Stepanov "Structure and host range diversity of entoraooidal proteins of Baoillus tliuringiensis ssp. galleriae" (1991) in: the ABSTRACTf of the 15th International Congress of Biochemistry,Jerusalem, Israel, August 4-8 1991. p.59

3. Шевелев А.Б., Карасин А.К., Сваринский М.А., Кадыров P.M., Коган Я.Н., Честухина Г.Г. и Степанов В.М.

Шгокествегашэ гены дельта-ондотоксинов Bacillus

tfwringten3i3 подвида gallertae. .

■ ■ .. ■ ■ . - -'t , • Молекулярная биология, в печати. ‘ . •

4^ Shevelev А.В., li.A.Svarinsky, A.I.Karaain, Ya.N.Kogan,

G.G.Chestukhina and V.U.Stepanov.

Primary structure of oryX - the novel d lta-cndotoxin . related sequence from Bacillus tfturinglenata ssp. gallericts. PEBS letters in press.

Рис.1. ОСлзл схзяа кеквтэуиэг:?ехг.а и еиа.т.-:ля ¿.з=.-:гі5;ггл: 6‘-.ór.>.Q~Е. thurin¿i^.'.¡'.ií,

Фалькпигя бгСлиоггха

xrjÄbHocvi »13* клоноа

2 .ToTzstbiiùji I¡IK В. thurinçiensis. Наиолиая рестрнхдкя

EcoJU.

H-.-:Vrîi)Ci Miwhiir Ч Ç ІГїІ^ОЛ ■ U^'MO Ні ЬП7^С.;. ТІЗ/ІОЗ-Них flUIbT*. ' д .

7 . Яоьтопі-:*- скри-нчнг ( ■¡с.'Г.огн-

*іегк*:й и.-'і:..-' гнЛ-ридызациол. -й і: OTfiofí ^аз.і KJic:*oa wocv.^riX

WCtfC.rJ*A Г»4»» j

в.Трзнедукцкя вТїеоіі: отбор по А}»1 при J 0°С -

• . LWlftJ'.OKHH 6НДОМЭ

о

10 .T|3pMOH>iavKiiMe.

акагиа »‘г'лясеых продугго»

a. Crpyi.rypa вставок клоне на ба^е фазмидиого вектора xpSL5 , «полированных из геномного банка генов Dactllus thuringten3l3 подвида gal lerlae с помощью иммуноскринннга сывороткой против дельта-опдотоксина CrylG.

хрОСЮ

RI RI, RI г RI ~ RI

3 тпн 5 тпн j тпн

XXXXXX-j—|-PÜC19

crylG

хрОС11

-j-------|х>оооо<

p'JC19

>росло?

~¡>cocoo<

pUC19

Показана локал.зация только сайтов EcoRI (RI). Ориентация . в, rat относительно вектора- у ХрОСЮ обратна хрОС11 к ХрОС407. Фрагмент дл;п 3 тпн и 5 тпн, несущие ген crylG, идентичны во свех трех клонах.

б. Физическая карта локуса расположения генов CrylX и сrylG (секвенированная.область).

IU

'Si

Идентичная область генов сгуТ.Х и crylG, соответствующая С-концевоЯ че пептидов и 3’-некодируотему флангу, заштрихована.

(Миньте.'

: ? •. •-

:Н !|

Г' ** * '1 " 1

;|!||2Ц|ШШШ\ £

г,^ % г.* ~.

1Г§

1;

\Ч *

• -т' %л ст- • • • *т|т "*1 г*4»«

I III! ШИ I I?

а.

г-*»« ! I

?|§1 - Гй? ? -££§ §55

г 15§ 5 552 й ££25 ^s.L I;

з ? • \

;!

: ^

: г-

гг £ &г

:!*!■'!

;1 !_' ■Г | *

М \т-

1.*^‘ | 1 кГ?!' йГНг!? г гг

ЬКрп 1 :

-Есо 47.3 !

- Есо К5 1

п г Есо Я5 •—<

3 •

!

с “&ес 1 |

!- ХЬа 1

¡-Ват Н1 !

V г- Есо Я.1 ! ‘ ! 1

' *1 1- Есо 47.3 ;

!Г_ ............

!|!Щ |ррш

-Хва 1

;?* 11 №

1 исуцок .5.

Схема установления нуклеотидной последовательности гена сгуЫ по двум цепям. Отмечены сайты рестрикции, суш*ствевиые для еу<"кл .’ни рования отдельных фрагментов.

tkb

.2

З -

■ ■ н ті

0 йОООО О- 0-0 3 с - - О С £

u aouuu я-ло'ли*5аіл и о« Ь

ід zwк^

--^Єшц ** V“1,

. • . йу»

(В**»

ШкМ» Шя

JH01 (рог ■ОЙІ

Да.

м* (Ер» Г®- .

Конструяэдаот, использованные для секвенирования гена сгуІХ.

Название Размер , вставки.

рОКЮ

рОНЬ

RH1

Ш2

ННЗ

RH4

RH5

RH6

RH7

тв

RH9

RH10

ШИ

R51

PREXI

RS6

рШ2 .

рЮИ

pNN19

pPHl

pPN6

pBHl

pSHBÍ

pHUCl

тли

12.5

5.1 О. "2

1.2 2.1

4.7

4.1

4.1

1.7 0.4 0.4 С.58 0.51

1.17 0.85

1.17

3.8 0.5 0.58 1.0 0.59 1.6 2.25 0,52

Вектор

pUC19

pUC19

BÜC19

PÜC19

pUC19

S«C19

PÜC19

PÜC19

pUC19

pUGEM

BUGEH

pUGEM

pOGEM

jpUGEM

PÜC19

pü32!

pOC118

CÜC118

pOGEM

BÜC118

PÜC118

PUCHO

PÜC119

pBSke*

Ориеіггааия Источник в векторе вставки

Способ получения

обратная рОСЮ делеция ХЬаХ

обратная рОКЮ недорестр.HindiII

обратная рОН5 делеция HindiII

обратная 'еОНЬ делешхя ЕсоШ

обратная рС>Н5 деяеши Xbal

обратная рОКЮ делеция Kpnl-F3tl

прямая RH4 инверсия HindiII

обратная RH4 недорестр-HindJ. XI

обратная КНЗ делеция EcoRl

прямая . ННЗ EcoRI-фрагмент

обратная КНЗ EcoRI-фрагмент

обратная КЕ1 делеция МрЬАЮЗ

обратная RH3 EooRV-Фраг-мент

обратная RH5 i Есо47.131-Фрагиент обратная • КНЗ * ■ далвши* Есо.47.111 прямая ■ RH5 ! Всо47 .¿И-Фрагмвнт

прямая RH4 ; . Hindll1-Фрагмент

прямая ■ RH4 - Hindi1I—фрагмент

обратная НЕ1 делеция Mphl103-PstI

прямая RH6 НрМЮЗ-Фрагмент

обратная НЕв НрлИОЗ-Фрагиент

прямая : рШ2 делеция EamHl

прямая RH4 Sphl ВапШ-фрагмент

обретиая pBHl Clal-Snal-Фрагмент

3

. Рисунок 5.

Выравнивание аминокислотной последовательности СгуГС с дельта-эндотокашаии класса Сгу1.

сгу1А(<) -шшмтушмилсожтсу....триьтшг—иот-мита— \оп«!ги5—о,ютииЕс (К)

спы ятшяем: |[ыш;4Ш1тед»1шс1Д11М11»пз»5!\'11тс1н1ас811си.сур«5!11А5П5Г1*дгн>да1:11 (ко

с.г»!с та«~кшто1«ш1)шн5тга....551»-151314*-1уда-касгт—нтдаз-- даисн« 1ег>

ст»|с ншй11Ы5нсайштын--р«55и.111ссо.,б5111(и1К|.юшкеак 1Сш1Ты>5--1 та. 1 &1 утсн. 1Ш1си&зс.та-- (ымкми (юл

13 221 г з г 11 1 з гг г

Сг»и(»! 11масадм15С(.Е!15иго1Угг5Шйа!’!№Д1бгш(огн'1«15Л1Н1а-------1«шот5то»ы1Н1шоя>га;«/рлА11№« изо

Сг»1В и1мниш14К1»1.аасаягиУ!юаш11№1\'М1и^У1отщавпч!М1.............Г4[гаог<РШ«1#оддии11ий»‘Л'г,йГ131!1)Яо«туЕ !?и)

Сгу1С I £аи«1»и«й!ГОРМ«ТИ11»1Ш!1(1а10!81Р5.........Г»15СГШ.1$ИКШа»11Ш1ГИИО П1М>Ш1 (194)

Гг)1с 11ат1тиоЕ1Ш№шт1Еи.1151«и1Р'1и5д-т.111И'1(1Н1ага11Ж51Т1К'а11Ш№11ат5«грли1Штш№'(1Л!И1тв иг»

1 г 3 22 3 111 3 211 3 121 1 и 1211 111 12 12 1 33 2 3 3 33113331 3 232 11 13

С—..В!«* 1.............1

сг»»(а) -н1И1ц«тшн1а--[рши>1)5вжут1'£1ато1У111г$1)гктР181тт№1П№---лЕмгос5....гмиштчийтнэнй йог)

айв 1)0№1г!1:оуЖ1Ы!Лй--1ае1:тозж113гка.пслй.У41ГРзус11г1ТР1К15Л11!СЕя[В4[ь41№«5и,"-ж»1дР5Е5а1Сдм:су1игГ1.го шо) Пгу1С -Й!М|ОНДаШГУ№а--1№Р»^1™и1ТУ?К1К!ХПТИС1Ш:1тггауР1СР«а,.Г1ЕУУ!СР----11№№0;.0У«!11Р[1.,|УН:'5^!1(«т|1№ (306) СГ)1£ 5тИ1агТО»С«МгШ;ПЛ(!И1Ы5АШШ1к'|Р»Нтм.В1т5Г5а1т*УР1Е111Г(!1!;|(У1У[«'1СГ»Н1(ЗаИ:[51Г5Ш#115НЕМ»«5»1М (.И?)

21112 313222 23313 1 121 1 3 1 331 33 333223 311 3 1333 2 33 3 1332211 I 11 I

е--------------------вюсх г........—................-—1

сг*14й) шумр-—СЕНУ^мпаФЮ-гиРЕгтгмйдрр-лузиасктз^уВк'тсдашниос^далт-...................••■'„■шсшу пса)

и(1в и^шм^пгшишшза'Рю;—анггшг-кть'итсгидатв^з- уд^шьчукрпшглгнггнлошдагику^ру^'иик (и?)

и»1с 1пгш^---\ям|ру1сс1и|5и.1ми1--115р1ут:мрр--р5ппв>и111э(рг1викркргрргм1(1м:сш1р1к5.-пукм--!» и«)

Са!£ М$!(а-иРтШ!ШШ1;ОТ^-Р1ОТ1Та15ШШ7ШЕ®<1Е№иАМШга№т№ШЖУУШ11!..........................МийТОО !Г >.

3 11 12 1 и 1 11 123 3 1 1 1 1 1

:г».Ч(а) 0Ь1СУ1Р^даГ/РРР('да1!!1а1У!ЧЯ»---«г.Ш[1ИР1Н1Й»5Иг,'«11РЗЯ1Г0!Р1.;й!18.ЕСГ5¥И!СРьЕт1Ш15РМ15аСУ1111^1..........................Й (УН)

'.■»18 шшгатпвкишап...........<к;1«---1гашзадш1в»1101т>тмттюетса)]1й1ктЕсгЕГ1И1»А —а 1м<)

:г»1С сягаррЕИ'ЛРтсуЕнисттЕУ«- - - 5С7рп. т та^^иговйлатнт I про?! ид нн те^пг^-шсть л тсрсп г,гл 11 теят гсс? V”!. в'лс 1 зр I.то и-.- >

:п1с мшЕРьшо^иштизнштадмЕйишм&шщгатш^ттсузудашсшоштас^сы«..........................................................................й (гл

2 23 2 3 2 2 3 32 1 1 1 322 3 11323 2 232333213 1 3 2 2 333 33 3 3 3 1 223 2 3

Е--------------------ИОСК 3........]

лкНЫ ИШШШМГИ...............................................1Ь!М»11Ю?5Д1НГ,КМ(151Д1111«а'Г1РПГЖ5';Г115тТН.5£К-ГУУ!М'1ЕГУРАЕУШ1У[)1Е"ИИ ;Г,’1:

1Я*Т.................ЛРС£11»1М'С111!1.,1(И1|||:УС(ШШТРПП0—ЮОНИЗИ—ИЗОЙЛЮНЕПРЯДШЕУШЕИШЕ |6У)

3312 3333211 1 2 11 33 3 13 12131 1 3 2 11 I 11 1 323 31331221 3 33 333 3 2

Е В10СК 41 I—М.0СК 5-1 •

гу1Лл - Ь',|).ЯК!Л>;1 1<)-1 1)1РЩ Пп^( ,!. Й1 ,1 , ).в1оШц|, Жв, 6Л4-Б2721

гу’В - 5'-р. №||СЦ»К!5 НО .» Ь>,’ЛгЗ Ь !<«: Ц->Ы« Н., 1И, №с1.в{1№ 8(5., 1В, 4168 - 4169

1г1Г - у.р. ЕМ'Ьля те, (.с (, ,1. ,1 Г)33, Ииа.Ди* Рва., 16, 6240 •”

тг: и:.!м 4е^1*г! пн» лл.. и И Сг»К г*Ц4иа 1п и* ц«сМ (И р..«Мм\ оГ 11« «Ицптй.

SuoJU 31 «1 91

і^ГІЧГСЇСТАГТТСАГАТАСАТСАТТТСТСТТАГГССАССАГГТТСГПТТСАТСТТТТССААТТСААААСАЇСТАТТТСССЛТССТТТГ «FLLLEBPLFHVffffLKTCIWBAF 121 15 L 181

ttcctaactaacctcactagttacaaagattatttcaaaatctccgaaggagactatatagactcgtatataaatcctggaaatgttaga

FLTKbSSYXDYLKMSBGDYtDSYlNPGliVR 211 241 271

AdV-CACTACAAACTGGAArTGATATTGTTGCAGTAGTAGTAGGTGCTTTACGTGGACCAGTTGGTGGCATACTCACTGGTTTTCTTTCT rCLQTG IDIV AVVVGALCGPVGGlLTGFLS 301 331 361

ACTCTTTTTGCTTTTCTTTGGCCATCTAATGATCAACCACrATCCCAAGCrTTTATACAACAAVrfaSAAGAACTGArfCAACAAAGGArA rbrOFLVPSNDQ AVWXAFIIQHEELI R Q R I 391 421 451

'ICAÍÍATCAAGTAGTAACGACTGCACTCGATGACTTAACTGGAATTCAAAATTATTATAATCAATATCTAATACíCATTAAAGGAATGCGAG SDQVVRTALDDLTCIQIIÏTlfQïLIALKKW ' 481 511 Ь4І

GAAAGACCAAACGCCGTAAGAGCAAACTTAGTTTTCCAAAGATTTCAAATCTTCCACGCGCTATTTCTAAGTAGTArCCCAAÜTTTTCCT RRPUGVRAMLVLQRFBJLHALPVSSMPSFG 571 block 1 . 601 631

AGTGGCCCTCCAAGTCAAAGGTTTCAGGCACAATTCTrCGTTGTTTATGCGCAAGCAGCAAATCTTCATTTACTATTATTAGCTCATCCT

block 1 661 691 721

CAAAACrATGGGGCAAGATGGGGACTCCGTGAATCCCAGATAGGAAATTTATATTrTAATGAACTACAAACTCGTACTCÜAGATTACACJ g К Г Д _JL GLRSSQZGHLTVHBLQTRTRDYT

751 7*1 UH

AAeCATTGTGTAAACCCGTATAATAACGGGTTAGCCGGCTTACGAGCAACGACCGCTGAAAGTTOGrrAAACTACCATCAATTCCCCÀCA KaCVMATUHGX.AG.LRCTSABSKLKYHQFRk 841 Я71 901

CAAGCAACCTTAATGGCAATGGATTTCATAGCITTATTTCCATAÎTATAACACCCGGCGATATCCAATCüCAGTAAATCXTCAGCTTACA 8ATLMAHDL I A L F P I 1 Ы T R R IP I A V H P <J L T

block 2 931 961 991

CCTCAGGÎTATATACAGATCCATTAGCCCTTCCTTCTGAAGAATCAAGTTTATTTCCAGAATTGAGATGCTTAACATGGCAAGAGACTTCT

1021 1051 Ыэск2 10Я1

CCCATGACTTTTTCAAATTTCGAAAATGCAATAATTTCGTCACCACATCf ATTTCACACAATAAACAATTTAATÛAITTATACCGGTTCC

-1 n r r a_____g и X T T fl s У____________g.—і*...у d t t. h _m ______I r. т о s

1111 1141 1171

TrrTCCGTTCACCTAACCAATCAATTAATTGAAGGGTGGATTGGACATTCTGTAAClAGTACTTTGTTGGCCAGTGGACCAACAACAGTA rSVBLTHQLIFGMIÜHSVTeSLLASGPTTV

1201 1231 1261

CTGAGAAGAAATTACCGTAGCACGACATCTATTGTAAACTATTTTAGTTTrAAT'iATCGTGATr-rrTATCACATTAATACGACATCACAT LRRMYCSTrsiVHYFSFNDRDVTQlUTRSH 1291 ‘ 1321 1351

ACTGGCTTCGGATTCCAGAACGCACCTXTATTTGCAATCACTAGAGCTCAArrrTACCCAGGTÜGGACTTATlCAGTAACTCAACGAAAT IGLGFQÎJAPIiFGITRAQFTPCGTTSVXÜRN 1381 1411 1 44 і

GCATTAACATCTGA^CAAAATTA'TAATTCAATTCATCAGTTACCGAGCCTAGACCCAAATGAACCTATCAGTAGAAGTTATAGTCATAGA ALTCBQHTMSIDRLPSLOPVSPISRSYSUR 1471 1501 ЫоскЗ 1531

TTATCTCATATTACCTCCTATTTCCATCGTGTATTGACTATTGUlTCCTATTAATATArATTCAGGAAATCTCCCTACTTATGrATCGACC I» Я H I TSYLBRVLTI DGIMIYS'GHLP T Ц _X

ЫоскЗ 1561 1591 ‘ 1621

CATCGCGATGTGGACCTTACA?ACACGATTACCGCAGATAGAATTACACAACTACCAXTGGTAAAGTCATTTi;AAATArCTGCCG3rACT

■ 1651 ЫоскЗ 1661 1711

ACTGTCCTAACAGGACCAGCTTTTACAGCAGGGCATATACTCCGAAGAACACGGGTTGGTACATTTGCAACAATAAGCGTAAr^ACTAeT -* T V M О » С a a n_ T LRRTGVGTFGTIRVRTT

. block4 17Л1 1771 1801

GCCCCCTTAACACAAAGATATCGCATAAGArTCCGTTTCGCTTCTACCACAAArrTGTtCATTGGTATArtGAGTTGGTGATACACAAGTA

A P is T Q ataitrift____________________g TTÄLFICIRVGDRQV

* 1831 1861 1691

AATTATTTTGACTTCGGAAGAACAATCAACAGAGGAGATGAATTAACGTACGAATCTTTTGCTACAAGGGAGTTTACTACTGATl'TrAAT KTFDFGRTKKRGDS&eTESFATRBPrTDFtf

- ia -

1921 1951 blocKS 1911

TTTACACXACCTOAGAATTAATCTCACrCTTTGCAAATGCATTTACCCXTCCTCAACAACTTTATTTTGATAGAATTGAGArTATCCrr FRQPQBblSVFAMAFSAGQ І

• 2011 2041 7071

CTTAATCCCGCACCACAGGCCAAACAGGATCTAGAACCAGCAAACAAACCGCTGCCCAGCTTCTTTACACCCACAAGGGACGGATTACAA , V к 7'ARBAAEDI*SAAKXAVASL?TRTRDGLQ 2101 21Э1 2161

GTAAATGTGAAACA'rTATCAACTCGATCAACCCCCAAATTYAGTCTCATCCTTATCACATGAACAATATGGGTATCACAAAAAGATGTTA VMVXbïQVD0AAHLVSCb3DSQtGTDRRHL

2191 2221 2251

TTCGAAGCGCTACGCCCGCCAAAACGCCTCACCCCAGAACGTAACTTACTTCAGGATCCAGATiTTAATACAATCAATAGrACAGAAGAA LBAVRAAKRLSÄBRHLLQDPDFUTIMSTBB 2281 1311 2341

AATCGATGCAAACCAAGTAACCGCGrTACrArrACTGAGGGCCGTCCATTCTATAAAGGCCGTCCACTTCAGCTAGCAACTGCACGACAA HG*KA3NCVTISBGG*FYXGRALQIiASARÍ 2371 2401 2431

AATTATCCAACATACATTTATCAAAAACTAGATGCATCCCACrTAAAAeCTTATACACCTTATACATCAGATGGCTTCGTGAACACTAGr MYÍTYIT0XVDA3BLXP.1TRYRSDGPVKSS

2461 2491 2521

саасаггтасалагтсатстсаттсассатсаталаґїтссатстгстслалаатстассаслтлагттастатстслтастгасссасат OOLKIDLIHaaXVHT, VK1VPDKLVSDTTPD 2551 2581 2SII

GATTCTTGTACTGGAATCAATCGATGTCAGCAACAACAGATGGTAAATGCCCAACTGGAAACAGAGOATCATOATCCGATGCATTCCTCT

DSCSGlHRCQEQQMVHAQLBTBHHUfrKDCC 2641 2671 2701

GAACC/iCCTCAAACACATGAGTTTTCTTCCTATATTGATACACGGCATTTAAArTCGAGTCTAGACCAGGGAATCTCGGCGATC7T,rAAA BAAQTHRFSflT IDTGDLKSSVDQC I * А I V К 2731 2761 27*1

GTTCGAACAACCGATGGTTATGCCACCTTAC^AAATCTTCAATTGGTACACCTCGGACCCTTATCGGGTGAATCTlTAGAACGTGAACAJi VRTTDGYAYLGffLHLVBVGPLSGESLBKBQ

■ 2821 2851 2881

AJSCCATAATACAAAATGGACTCCACACTACCAACAAACCGTCCAGAAACAGATCGCGTGTATCAACATCCCAAACAATCCATCAAÏf CAT ÄD rtTKVSAB LGRKRABTDRVYQDAKQ3I«fl 2911 2941 2971

rrATTTGTGGATTATCAAGATCAACAATTAAATCCAGAAATAGCGATGGCÄGATA.fTATGGACGCTCAAAArcrTCTCCCATCAATXTCA i.FVDYQDQQLWI'ÄIGHADlHlJAQHLVASIß 3001 3031 ■ 3061

САТСТАГАТАСССАТССССТАСГССАЛАТСССГССААГТЛАСТАТОАСАТТТАСАСАСАССТСТССААТОССТГАСААСААйСАТССТАГ • 0VÏSDAVLQZPGI)IYXIYYBL5NR I»QQ&SY 3091 3121 3151

CTGTATACGrCTCCAAAiyjCGGTGCAAAATGGGGACTTTAACAACGGGCTAi^TACCrCGAATGCAACACCGGüYCCATCC'/GTACAACAíS Lt?SRMAVQNGDFUHGt.DSWNATAGA$VQO Зіві 3211 J241

GATCGCAATACGCATXTCTTAGTTCTTTCTCArT<3GGATt»CACAAGTTTCTCAACAATT*TAGAGTCCAGCCC/lATTGTAAATATCTATTA DCIfTUPLVLSnWDAOVSQQFRVQPNCKYVL 3271 3301 3331

CGT'GTAACACCAGACAA-AGTAOGCGGCGCACACCGATACGTCACTATCCGGGATGGTGCTCA'FCATACACAAACCCTTACATTTAMrCCA ÄVTAIKVGGGDGlVYIÄDGAHHTBfL TPiiA 3361 3391 3421

TÜTGATTATGATATAAATGGCACGIACGTCACTGATAATACGTATCTAACAAAAÜAAGTGATATTCTATTCACATACAGAACACArGTGC CDY0IMGTIVVÚMTYLTÍKVIFT8BTSHMM 3451 3481 3511

CTAGAGCTAAATGAAACAGAACGTGCAÍTTCATATACArAGTATTGAATTCCTTGAAACAGAAAAGTAACGGGATGATGTTCCGAACATA VBVNE TKGAPB IOSIRPVBTSK *

1541 3571 3601

rAAGGTATAAGCACCATACGCCCTATAAAACATTCTCAAACAGAATGTCAAATAAATGAGGACCCCTCCGCf;TA0TCGTÍiCATCCAAA>.T 3631 3661 3691

ACACAGACTACCCGGAGGTArrmTATATAAAAAATGTGGTTTTTCACTACGGT&TATCGAAAGAÍ.YTACAGtTATGAÜCCAAYCAAAA 3721 3751 37S1

TGKATACAAAGCAGGATTCTGTACCTAACACATATAAAATAACAAGAGGGCGCATTGAAATAAGGATAGGAATAAATüTATTCTCATTTQ 3811 3841 38?1

AAAGTTTAGrCTGCAAGGGAAATATCTAAATTGCCrATTÜGAGGCAATGGGATACAAAAGAACTCTGCTACCTATACACAAGAATTTCAC 3901 3931 39<¡l

TAGGATAAATCTATGGArTTGAGGTAATAATAAAATGGTGGGACAAAAATCGTTArfTCATCCCACCGTTATATACAGGAATAAGClAATT 3991 Kin II

ATATrCGCAAAi'GAT’ITGTTAATATCTGn'CCTAAOCTT ,

В амипокнелс-ппГ пос.),едовательноста Йелк його продукта CV]¡FX r,uДг-характерные для ¿-андотокстюв консериативиые блоки. .

г< -

Рисунок 7.

Гете}. ^логичная экспрессия гені, сгу'ік в составе трансляционного слияния с »-пєптндои lacZ. а. Схема конструкции рБЕВІ на базе плазмадного вектора рисі 19 -Клонирование проведено по сайтам полилинкера БріїІ и ВатНІ. Инициация трансляции происходит на инициаторном кодоне І ас переходит на кодирующую область СГуІХ и затем восстанавливается считывание а-пептида, приводя к образованию слитого белка Ьас"-Сгу1Х-Ьг>"г (кодирующая области \clcZ заштрихована).

І

X—L

СіуіХ

У- *

2od Ловят

Ы дошт

плао?,г,гду pUC119 (отрицательный контроль). 2.Биомасса Е.СОІІ,

несущей плазмиду pSHB1 хгосле индукции IPTG. 3.Молекулярно-

б. Электрофореграмма белков в денатурирующем 10% полиакриламидном геле после окраски СВВ Q-250 . (справа), и реплика, полученная переносом разделении! белков на нитроцеллюлозшй фильтр с последующей окраской антисывороткой CryIO-антивидовой конъюгат (слева), I.Биомасса E.colt, несущей

весогой стандарт <66кДа, 45кДа, ЗбкДн, 29кДа).