Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS ИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS ИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ"



На правах рукописи

КАЛМЫКОВА ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА

БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS ИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.00.16-экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 2003

Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Института Систематики и Экологии Животных СО РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Бурцева Людмила Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.В.Дрюккер

кандидат биологических наук, доцент Г.Б.Талалаева

Ведущая организация; Государственный научный центр прикладной

микробиологии

Зашита состоится »¿дсд/Угл 2003 г. в /5 час. на заседани! диссертационного совета 2f2.074.07 в Иркутском государствен иол университете по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Биолого-почвенный факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутскогс государственного университета.

Автореферат разослан « ¿5 » 2003 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Е.С. Купчин екая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследовав ни. Бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) широко используются для регуляции численности насекомых отрядов Lepidoptera, Díptera, Coleóptera. Несомненным преимуществом их применения является безопасность для здоровья человека, животных и растений.

С 80-х годов для регулирования численности насекомых во всем мире применяются препараты на основе Bt ssp. kurstaki. Вероятно, их широкое использование может приводить к неконтролируемому распространению Bt ssp. kurstaki в экосистемах. Показано, что штаммы этого подвида являются одними из часто встречающихся в природе [Martín, Travers, 1989; Kaelin et al., 1994]. Основным фактором специфичности и эффективности действия Bt на насекомых является белковый кристаллический ¿-эндотоксин, который синтезируется во время спорообразования. Внимание большинства исследователей направлено на изучение свойств, регуляции синтеза и механизма действия этого токсина [Hofte, Whiteley, 1989; Gill et al., 1992; Rukminî et al., 2000). Во время вегетативного роста и на ранней стадии споруляции Bt продуцирует и другие биологически активные вещества: р-экзотоксин, гидролитические ферменты, вегетативные инсектицидные белки, антибиотические вещества, которые, как полагают, могут вносить вклад в вирулентность, а также способствовать адаптации бактерий к жизни в различных экосистемах [Нетыкса н др., 1979; Смирнова и др., 1991; Burgeron, de Baijac, 1967; Edlund et al., 1976; Smirnoff, Valero, 1977; Luthy, 1980; Favret, Yousten, 1989; Lovgren et al., 1990; Zhang et al., 1993; Donovan et al., 2001]. Важным условием приспособления к окружающей среде у прокариот является генетическое разнообразие внутри популяции. Однако вопросу гетерогенности культур Bt ssp. kurstaki, их способности продуцировать метаболиты, отличные от 5-эндотоксина, уделено необоснованно мало внимания. Кроме того, многочисленные скрининговые программы по Bt направлены на выделение штаммов с новой специфичностью и не затрагивают вопросов, связанных с разнообразием этих бактерий в природных экосистемах.

Цель исследования. Целью данной работы явилось изучение разнообразия вариантов внутри Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki по морфологическим и биохимическим свойствам и роли биологически активных веществ, синтезируемых ими, в энтом ©патогенной активности и сохранении в природе.

Задачи исследования.

1. Оценить морфологическую неоднородность и биохимическое разнообразие штаммов Bt ssp. kurstaki.

2. Выявить возможные связи между колониально-морфологическими признаками и рядом физиолого-биохимическнх, инсектицидных, антибиотических свойств и адгезивностью у культур £г $зр. кигшН.

3. Определить вклад спор, кристаллического 5-эндотоксина и других секретируемых белков в инсектицидную активность (на примере СкоП$Юпеига оссййжд/и (Т-'е^оргега: Тог4пс1(!ае)).

4. ' "Изучить колониально-морфологическое разнообразие штаммов В1, выделенных из природных экосистем, а также штаммов являющихся

" контаминантами питательных сред.

Научная новизна. Впервые в результате изучения колониально-морфологической неоднородности штаммов В( зхр.ки^аИ выявлено 6 ''морфологических вариантов (морфоваров). Фенотип ические различия, выраженные в характерном внешнем виде колоний на агаризованной среде, затрагивали и базисные особенности метаболической организации клеток; морфовары различались по синтезу метаболитов (5-эндотоксина, вегетативного инсектицидного белка, бактериощшов, адгезинов) и внеклеточных ферментов (уреазы", протеазы, лецитиназьг).

Впервые было показано, что из естественных экосистем, в том числе из мест, где использовали лепидоцид (биоинсектидад на основе В! 'ззр.кипшкз, кристовар К-1, морфовар К), преимущественно выделялись штаммы 5/ ззр.кигзКзк* кристовара К-73 морфоваров гит.

Практическая значимость. Выявленные особенности бактерий Вг БЗр.ЫтаЫ могут послужить основой для изучения роли Ы в окружающей среде.

Результаты, полученные в ходе исследований, убедительно доказывают необходимость включения спор в биопрепараты для регулирования численности СкагЫЮпеига оссЫегйаЧз (Ьер1Йор1ега: ТоЛпс1(1ае), поскольку в их присутствии активность кристаллов повышалось в 100 - 500 раз.

Предложен метод отбора штаммов В!, выделенных из естественных экосистем, для биотестирования, который позволяет значительно сократить количество проверок на насекомых.

Апробация работы н публикации. Результаты исследований были представлены на IV Всесоюзной научной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Путцино, январь, 1992); на конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Москва, октябрь, 1993); на Всероссийском научно-производственном совещании «Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции» (Краснодар, август, 1994); на конференции «Интродукция микроорганязмов в окружающую среду» (Москва, май, 1994); на Х1П Международном конгрессе по защите растений (Нидерланды, июль, 1995); на Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы окружающей среды" (Томск, сентябрь, 1995); на Всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий" (Курган, март, 1998);

на XI Съезде Русского энтомологического общества (С.-Петербург, 1998); на Российской научно-практической конференции, посвященной- Юр-летию со дня рождения профессора Е.В. Талалаева "Оценка современного -состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе" (Иркутск, март, 2002), на отчетной сессии ИСиЭЖ СО РАН (апрель, 1994), на заседании микробиологического общества (декабрь, 2002). n -

По материалам диссертации опубликовано 18 работ. ■■,.,■

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста; состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 244 работы, из них 191 на иностранных языках. В приложении приведена подробная характеристика штаммов Bt, относящихся к различным подвидам.

Основные положения, выносимые на защиту;

1 .Штаммы Bt ssp.kurstaki гетерогенны по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам.

2. Из естественных экосистем чаще выделяются штаммы морфовзров Bt ssp.kurstaki^ которые не используются для производства биопрепаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были более 200 штаммов Bt, выделенных из природы и контаминанты питательных сред; 67 штаммов, представляющих 43 подвида Bt, из коллекции лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных (ИСиЭЖ) СО РАН. Кроме того, в работе использовали 12 штаммов Bt ssp.kurstaki и 96 клонов этого подвида, а также штаммы НЕМ н HD-73 Bt ssp.kurstaki из коллекции культур Лесного Центра на Великих Озерах (Канада) (Great Lakes Forestry Center, Canada).

Культурально-морфологические свойства бактерий изучали на плотных питательных средах различного состава, выращивая их до полней спорулящш в течение б суток при 28° С, Для оценки инсектицидной активности культуры выращивали на жидких средах [van Fraokenhuyzenet al., 1997].

Способность штаммов Bt продуцировать параспоровые включения, форму и размер кристаллов оценивали с помощью светового микроскопа в фиксированных, окрашенных карболовым эозином препаратах, а также с помощью фазово-контрастного и сканирующего электронного микроскопов. Для морфометрической оценки кристаллов использовали данные измерений 100 кристаллов. Объем кристаллов определяли, "основываясь на полученных результатах линейных размеров, условно считая, что 'кристаллы имеют бипирамидалькую форму, по формуле V = Ш2 х Дл /' 6 (мкм где Ш-ширина кристалла, мкм; Дл — длина кристалла, мкм.

Внутривидовую идентификацию бактерий Bt проводили по схеме де Баржах и Фраконе [de Barjac, Frachon, 1990].

- ■ Относительную гидрофобность спор бактериальных штаммов оценивали по методу Розенберга [Rosenberg М. et al., 1980]. Способность штаммов продуцировать бактеряоцины была проверена методом Кекеси и Пике [Kekessy, Piquet, 1970].

Препараты частично очищенных спор и кристаллов получали разделением в градиенте плотности Ludox HS-40 [Zhu et al., 1989]. Споры без кристаллов были получены, обработкой частично очищенных препаратов спор в 0,05% NaÖH (pH 12). Концентрацию спор определяли методом серийных разведений на среде «А» и подсчетом выросших на ней колоний через 24 ч при 28°С. Растворы кристаллического белка, свободные от спор, были получены инкубацией частично очищенных препаратов кристаллов в 0,2 М CAPS (pH 10,5). Оставшиеся споры удалялись фильтрацией через фильтр Syringe.

Препараты секретируемых белков были получены при выращивании культур Bt ssp.kurstaki до ранней стационарной фазы по Донован с соавторами [Donovan et al., 2001].

Белковый состав споро кристаллических смесей изучали методом электрофореза в 7,5% PAGE-SDS; очищенных кристаллов — в 12 % геле, а белков, секретируемых во время вегетативного роста - в 15 % геле [Laemmli, 1970]. Гель окрашивали 0,1% Кумаеси синим R-250. Количество белка измеряли с использованием белкового теста «Bio-Rad». Количество Vip3A белка (89 kDa) в препаратах секретируемых белков и количество протоксина в препаратах чистых кристаллов определяли денсиометрированием белковых полос, окрашенных Кумасси синим R.-250.

Качественное биотестирование штаммов Bt проводили методом свободного скармливания на лабораторных линиях насекомых 2-3 возраста: сверчках Grylius bimaculatus (Orthoptera: Gryllidae), кровососущих комарах Aedes aegypti L. (Díptera: Culicidae), большой пчелиной огневке Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae), луговом мотыльке Pyrausta sticticalis L. (Lepidoptera: pyralidae), непарном шелкопряде Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Orgyidae), еловой листовертке-почкоеде (4-го возраста) Choristoneura occidentals (Lepidoptera: Tortricidae).

Гусениц С. octidentalis заражали методом принудительного скармливания дозы препарата, как описано ван Франкенхьюзеном с соавторами [van Fmikenbuyzen et al., 1997J.

Для определения 50% летальной дозы (LD30) или 50% летальной концентрации (LKjo) готовили шесть 3-кратных разведений для каждого препарата. Данные смертности были проанализированы с помощью программы PO-LO-PC [Rassell et al., 1977].

Препараты чистых спор и кристаллов, препараты секретируемых белков Bt ssp.kurstaki были получены, охарактеризованы и протестированы на гусеницах С occidentals в лаборатории Лесного Центра на Великих Озерах (Канада).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ~ ' *

1. Характеристика биологических особенностей штаммов BJhuringiensis

67 музейных штаммов Bs, относящихся к 43 подвидам, были охарактеризованы серологическими, биохимическими, микроскопическими и электрофоре™ческимн методами, а также биотестами на насекомых„■ ~ представителях трех отрядов Ortboptera (Grillus bimaculatus), Dipiera (Aedes aegypit), Lepidoptera (Galleriae melloneüa). В результате работы было установлено, что наиболее изменчивыми свойствами внутри штаммов одного подвида были продукция лецитин азы, образование кислоты из Сахаров, гидролиз эскулина, способность синтезировать кристаллы, специфичность их действия. Эти характеристики и были выбраны для оценки разнообразия штаммов Bt, изолированных из естественных экосистем.

2. Характеристика штаммов Bt ssp,kurstaki

В 1978 г. в этом подвиде на основе серологии кристаллических белков и специфичности токсинов было обнаружено два кристоаара, обозначенные как К-1 и К-73 [Krywienczyk et al., 1978].

Для изучения гетерогенности штаммов Bt ssp.kurstaki мы выбрали 12 модельных культур, которые различались по световой микроскопии и морфологии колоний на ряде сред. Модельные штаммы были подробно охарактеризованы по морфологии, размерам и белковому составу кристаллов, по физиолого-биохимическим свойствам, антибактериальной активности, адгезивной способности, культурально-морфологическим и инсектицидным свойствам.

2.1. Кристаллы дсльта-эндотоксннов штаммов Bt ssp.kurstaki

По световой микроскопии штаммы разделили на две группы: штаммы первой группы продуцировали вытянутые ромбовидные с заостренными концами, крупные по сравнению со спорой кристаллы и с дополнительными бесформенными включениями; штаммы второй группы - правильные ромбовидные кристаллы, по величине равные споре без включений; штамм 1БХЗ был без кристаллов. Это разделение было подтверждено сканирующей микроскопией (рис. 1а, б, в).

Морфом етрическиЙ анализ четырех штаммов, относящихся к двум кристоварам - $м, Зк (кристовар К-1) и БИ-17, 8к (кристовар К-73), выявил, что средний объем кристаллов К-73 типа примерно в три раза меньше объема К-1 кристаллов.

Электрофорез спорокрисгаллических смесей штаммов Bt ssp.kurstaki показал, что штаммы кристовара К-1нмели два главных белковых компонента с молекулярной массой 130 и 68 кДа, У штаммов кристовара К-73 присутствовал только один основной белковый компонент с молекулярной массой 130 кДа. Белковые профили штаммов кристовара К-73 полностью совпадали даже по минорным компонентам. ,

І

б

Рис.1. Вид а сканирующем электронном микроскопе кристаллов Ві ззр.кигхіакі: а - кристовар К-1; б - кристовар К-73; в - акристаллофорньш вариант

в

2.2. Физио лого-ои ох н м и чески е свойства культур Ві х$р.кигМакі

Проверка ф изио лого-б и охим и ч ескнх свойств выбранных штаммов Вг язр.кигзіакі показала, - что все исследованные культуры продуцировали ацетилметил карбинол, проявляли уреаз нуто, ДНКазную, амилазную, протеазную активности; на кровяном агаре давали нечеткую зону частично разрушенных эритроцитов; не сбраживали маннозу, сахарозу с образованием кислоты; не давали пленку на бульоне и не продуцировали пигмент на желтковых средах. Все штаммы, кроме п17, давали положительную лецито-вителлиновую реакцию. При росте штамма л17 на плотной желтковой среде просветления вокруг колонии не наблюдали. Ни один из штаммов не продуцировал /3-зкзотоксіш.

Штаммы различались отношением к салицину, эс кули ну, по уреазной активности. Многократная проверка этих свойств показала, что для штаммов кристовара К-1 характерна высокая уреазная активность, выражена способность сбраживать салицин и гндролизовать эскулнн. У штаммов, относящихся к кристовару К-73, отмечена пониженная по сравнению с К-1 культурами активность уреазы, они не гидролизовали эскулин и не сбраживали салицин с образованием кислоты.

■-'-'. Сравнительное изучение ферментативных активностей kurstaki при росте бактерий на плотных средах позволило выявить различия штаммов по интенсивности синтеза лецитиназ (фосфолипаз) я протеаз.

Среди штаммов с высокой гидролитической активностью преобладали культуры кристовара К-73. В эту же группу входил и акри стал лофорный мутант. У него была зарегистрирована самая высокая лецитиназная активность. Штамм п17 кристовара К-1 не проявлял лецито-вите.тоновую реакцию.

Рис. 2. Динамика синтеза экзолротеазы на дрожжеполисахаридной среде различными штаммами Bt ssp.btrstaki: 1-шта\гм 5м; 2-штамм 4о; 3 - штамм 273; 4 - штамм 1БХЗ; ..» 5 - штамм 532. -v...-.-..- „

Динамика синтеза нейтральных протеаз штаммами Bt ssp.kurstaki была оценена на дрожжеполисахаридной среде (рис.2). К началу' споруляиии (на 4S ч роста) культуралъные жидкости штаммов 273, ІБХЗ, 532 .«мели высокую лротеолитлч еек)іо активность. Установлено, что мутант 5м. отличался низким уровнем синтеза прЬтеазы на всех стадиях роста. Другой исследованный штамм 4о в проти вал сложность остальным штаммам снижал проективность "Синтеза фермента при переходе культуры к спорообразованию. Этот же мутант терял способность синтезировать не только кристаллы, но и споры на среде с высоким содержанием амин ного азота (120 мг %), что могло быть связано с синтезом на богатой аминным азотом среде фактора, подавляющего собственную споруляцню [Шамшина и др., 1994].

2.3. А итн бактериальна я активность штаммов BI ssp.kursiaki

Известно, что штаммы Bt проявляют антагонизм ко многим грамиоложительным бактериям [Favret, Yousfen, 1909 ], Антибактериальные вещества, которые имеют спектр активности ограниченный штаммами родственных видов, принято называть бартериоцинами [Jack et al„ 1995].

Проверка штаммов Bt ssp.kurstaki на продукцию б актериоцин ©подобных вешеств показала, что штаммы кристовара К-73 не проявлял» антагонизма в отношении культур своего подвида. Штаммы кристовара К-Ї различались по антибактериальной активности. Штамм 532, как и культуры кристовара К- 73, не проявлял антибактериальной активности. Спектры активности акристаллофорного штамма !БХЗ и штаммов пі 7 и Зк кристовара К-J совпадали; они подавляли рост штаммов кристовара К-73. Культура 5м обладала самым широким спектром бартери ощшоген ного действия, задерживая рост штаммов обоих кристоваров.

2.4. Морфологическая неоднородность штаммов .Й/ £^р.кип1ак{

На средах, отличающихся по содержанию аминного азота, выявлена морфологическая неоднородность штаммов В( вьр^аНеггае и Bt ¡зр. 1$гае1еп$и [Бурцева и др., 1973; Бурлак и др., 1995].

На эмпирически подобранной дифференциальной среде с добавкой дрожжевого экстракта и глюкозы (ЛАГ) штаммы В( ир, кигхтМ отчетливо различались по морфологии колоний. При рассеве этих культур было обнаружено 6 морфологических типов или вариантов. Их внешний вид представлен на рисунках 3 а,б,в,г,д,е.

в

Рис- 3. Внешний вид морфологических вариантов Яг1 ssp.kurst.aki, Морфовары: а - Я; б-А; в-М\ г-/-; Д-/я; е-т/.

2.4.1. Некоторые особенности морфологических вариантов В> ssp.fiитак)

Проверка 96 клонов различных морфоваров Вг $$р, кигИак: выявила, что для морфовариантов г, ш, ш1 было характерно образование правильных ромбовидных параспоровых включений, до величине равных споре, т.е. кристаллов типа К-73. Но клетки г И ш - вариантов образовывали много мелких бесформенных кристаллов. Кроме того, культуры ш - варианта на рыбном агаре (среда с высоким содержанием аминного азота) не

спорулирулировали и не образовывали кристаллы.. . Потерю кристаллообразования у морфовариантов г, т и т1 мы не наблюдали. ,...-

Штаммы морфовара X и Я продуцировали кристаллы К-1 типа; .штаммы морфовара М были акристаллофорными. Исследования показали, что культуры морфовара К часто теряли способность продуцировать кристаллы, но их морфология сохранялась.

Проверка физжмгого-биохнмическнх свойств показала, что морфоварианты различались отношением к салицину, эскулину, по протеолитической активности. Дифференциальные свойства морфоваров представлены в таблице I. Для культур морфологических ариантов И, X, М отмечалась способность гидролизовать эскулин, сбраживать салицин, что было не характерно для морфоваров г, ш, ш1. Пониженной протеолитической активностью характеризовались типы X, М. У морфовара ш1 эта активность зависела от концентрации молока в среде. На среде с низким содержанием молока протеолиз не отмечался, с увеличением концентрации молока протеолитическая активность появлялась. Остальные морфоварианты проявляли высокую протеазную активность.

Таблица I. Дифференциальные свойства морфологических' вариантов Bt ххр.кигхшЫ

Морфо-вар Кристо-вар Количество проверенных клонов Гидролиз эскулина Образование кислоты из салицина Протеолиз

К К-1 Сгу- 34 + + +

X К-] 17 + +

м Сгу- 5 + +

г К-73 17 +

ш К-73 17 +

ті К-73 б _ ±

Примечание: - отсутствие реакции; и+" - положительная реакция; "±" -проявление реакции зависит от концентрации субстрата

Результаты проверки антагонистических отношений между морфологическими вариантами показала, что самым широким спектром

активности характеризовались культуры морфовара X. Не продуцировали бактериоцины и были чувствительны к антибиотическим веществам культур морфологических вариантов X и R культуры морфоваров г, m, ml, М.

2.4.2. Гидрофильно-гидрофобные свойства морфологических вариантов Bt ssp.kurstald

Гидрофобные свойства микроорганизмов связаны с различными составными компонентами их оболочек. Считается, что у морфологических мутантов бактерий это проявляется особенно наглядно.

Результаты сравнения гидрофильно-гидрофобных свойств основных морфологических вариантов показали, что гидрофильными были культуры с мордщнистой, сухой по консистенции поверхностью варианта R, образующие и нёоб{№зующие кристаллы. Несколько большей гидрофобностью обладали культуры типа X. Индекс гидрофобности выше 50 % показали культуры морфоваров г и т.

" 'Значительные различия в гидрофобное™ могли. быть связаны с различиями в строении споровых оболочек культур разных морфоваров. Хачисука с соавторами разделил споры видов Bacillus на 4 группы на основе присутствия или отсутствия экзоспориума и выростов на спорах [Hachisuka et al., 1984]. Согласно их классификации споры морфоваров гит могли иметь либо экзоспориум, либо выросты, а возможно и то, в другое, Скорее всего, экзоспорнум и выросты отсутствуют на спорах морфовара R.

2.5. Инсектициды ость штаммов Bt ssp.kurstaki

Штаммы Bt sap. kurstaki разделились во специфичности к личинкам комаров Aedes aegypti: только культуры К-1 кристовара были токсичны дщя этих насекомых. Чешуекрылые насекомые были чувствительны к культурам обоих кристоваров. Однако восприимчивость гусениц лугового мотылька была ниже, чем восприимчивость гусениц непарного шелкопряда. Концентрация спорокристаллического комплекса в культуральной жидкости, необходимая для 50%-ной смертности тест-насекомых, варьировала у разных штаммов Bt ssp.kurstaki в 7 раз для непарного шелкопряда и в 15 раз - для лугового мотылька. А кристалл офорный штамм 1БХЗ не проявлял инсектицидной активности ни к одному из тест-насекомых.

3. Вирулентность спор Bt ssp.kurstaki

Предположения о том, что кроме дельта-эндотоксина, другие вещества* синтезируемые Bt, вносят свой вклад в инсектидидность, высказывались в целом ряде работ {Ививскене, 1987; Иванов и др., 1990; Dalhamraar, Sterner , 1984; Favret, Youisten, 1989]. Хемпель и Ангус еще в 1959 г. показали, что споры могут играть важную роль в инсектицидной активности для некоторых видов чешуекрылых [Heimpel, Angus, 1959].

Протоксяны (20 п^личинку) различных штаммов кристовара К-1 (НЕМ, и17, 5м) в отсутствии спор вызывали гибель не более 20% насекомых. Однако, уже в первые дни после заражения отмечалось нарушение питавия,. )Кромё того, протоксиыы значительно задерживали рост оставшихся в живых гусениц и почти полностью ингибировапи окукливание через 10 дней после заражения. Напротив, споры тех же самых штаммов, а также споры штамма Н1>-73 (кристовара К-73) в акристаллофорного мутанта 1ЕХЗ были нетоксичны и не влияли на рост и окукливание гусениц.

3.1, Синергизм между спорами и дельти-эидотоксином

Добавление спор приводило к уменьшению ЬО30 в 100 и более раз, в зависимости от спор, которые добавляли к протоксину (табл.2).

4. Влияние биологически активных веществ В( »р.&доА№ на нисектнцндвость

Считается, что синергетическое действие спор на токсичность кристаллических белков-может происходить за счет синтеза других, отличных от ^-эндотоксина, вирулентных факторов.

Таблица 2. Инсектицидная активность очищс®ных кристаллов спор и

кристаллов для гусениц СНогШопеига оссШе»1аШ. , . .....

3 1 а и ■ споры 95% довери- , тельный интервал пробит £ А И' 1" споры 95% довери- .... тельный интервал | пробит

НЕМ - 170 и17 . - 568

НЕМ 3.24 1.2-10.6 1.89 НО-1 3.78 1.6-15.5 1.65

□17 1.31 0,6-2.8 1.61 п17 1.94 1.4-2.7 1.40

5м 2.37 1.8-3,2 1.84 5м 2.33 1.8-3.0 2.07

1БХЗ 6.61 2.9-28.8 1.80 1БХЗ 5.66 2.8-15.4 1.14

нг>- 73 1.18 0.6-2.5 1.55 НЕ>-73 0.64 0.3-1.2 1.80

Примечание:- споры к протоксину не добавлялись

4.1. Инсектнцндность культуральных жидкостей В< зэр.кшЫакI

В результате оценки инсектицидности было установлено, что культуральная жидкость, содержащая споры, кристаллы и другие метаболиты, продуцируемые во время вегетативного роста, была более активна, чем смесь очищенных спор и кристаллов. Спорулирукште культуры кристовара К-1 содержали (0,5~4,5)х103 спор на нг кристаллического белка,', что

соответствовало соотношению спор и протоксина в смеси очищенных спор и кристаллов. Поэтому мы заключили, что различия в инсектицидной активности культуральной жидкости и смеси очищенных спор и кристаллов могли быть из-за .секретируемых вегетативных белков, находящихся в культур альной жидкости.

4Х Инсектицидная активность штаммов В(, несвязанная с дельта-эндотокснном н спорами

4.2.1. Характеристика секретируемых белков штаммов В( юр.кшыакг

В препаратах секретируемых белков был определен общий белок, фосфолнпазная, прсггеолитическая активности, а также наличие вегетативного инсектицидного белка Угр$А (-89-90 кДа) (табл. 3).

4.2.2. Действие декретируемых белков на СЬогШопеига оссикпягНз

В ходе данных исследований было выявлено, что все личинки, зараженные препаратами секретируемых белков из штаммов К-73 кристовара, оставались живыми, однако их масса была в среднем на 20% ниже, и окукливание личинок наступало позднее, чем в контроле. Все проверенные штаммы кристовара К-73, а также акристаллофорный штамм 1БХЗ имели сходное влияние на. гусениц. Как видно из таблицы 3, все препарата этих штаммов имели фосфолипаэную и протеазную активности. Результаты биотестов показали, что эти ферменты способны вносить вклад в установлении инфекционного процесса у гусениц С.оссШепЫ&

Таблица 3. Состав белков, секретируемых штаммами Et ssp. kurstaki

Штамм Кристо- Морфо- Общий Л Гемо- Протеолити- Наличие

вар вар белок, В лиз ческая акт., белка с

mg/ml р ед.акт.трют- Мм 90 кДа

сина

НЕМ К-1 3.304 + + 0.747 +

PI? К-1 R 0.906 - + 0.469 +

Зк К-1 R 0.504 + н.о. 0.500 +

5м К-1 X 1.356 + + 0.402 +

HD-73 К-73 0.959 + - 0.598 -

273 К-73 г 2.243 + - 0.652 -

4о К-73 m 2.139 + - 0.685 -

1БХЗ Сгу- R 0.511 + + 1.055 -

.Примечание: - реакция отсутствовала,* "+" - положительная реакция; "н.о."—свойство не определяли

Препарат штамма КО-1 кристовара К-1 вызывал; гибель более 60% гусениц, значительно ингибировал рост оставшихся в живых гусениц и полностью ингибировал окукливание. Сегрегируемые белки других штаммов

крнстовара К-1 имели похожее (штамм Зк) или несколько меньшее (штаммы п17? 5м) влияние на ннсектицидность. Относительно высокая токсичность препаратов штаммов крнстовара К-i скорее всего определялась способностью штаммов только этого крнстовара продуцировать вегетативный инсектицидный белок Vip ЗА (табл.3). При биотестированпн количество белка Vip ЗА в препаратах штаммов HD-1 и п17 было примерно равным (3,8 нг/личинку), но несмотря на это штамм HD-I вызывал в 2 раза большую смертность, чем препарат штамма п17 (68% гибели против 31,7%). Это могло быть связано с отсутствием фосфолипазноЙ активности и невысокой протеолитической активностью в последнем препарате (табл. 3).

Добавление к препаратам секретнруемых белков одинакового количества протокснна HD-1 в разной степени повышало их активность.

5. Оценка колониально-морфологического разнообразия природных популяций Bt ssp.kurstakt

В 1987 - 1990 г.г. на предмет встречаемости бактерий группы Bac.cereus - Вас. thuringiertsis было исследовано 760 проб (почва, насекомые, места их обитания), собранных в Новосибирской области, Алтайском (фае и на о-ве Кунашир, и выделено более 200 изолятов Bt. В этот же период в лаборатории была собрана коллекция штаммов Bt, являющихся контамн пантами питательных сред.

В результате идентификации полученных изолятов было установлено, что более 50 % природных образцов и контамннантов содержали культуры подвида kurstaki. Возможно, столь широкое распространение штаммов этого подвида было связано с применением биоинсектицидов на основе Bt ssp.kursíaki для регулирования численности чешуекрылых насекомых.

Мы оценили качественный состав популяции Bt ssp. kurstaki по кристо- и морфоварам (табл. 4). Предварительно мы определили, что продуцентом коммерческого бионнсектицида лепидоцида являются культуры крнстовара К-1 морфовара R. Однако изоляты крнстовара К - J, выделенные из насекомых и

Таблица 4. Распределение контамннантов и природных изолятов Bt ssp.kurstaki по кристо- и морфоварам

Источник выделения Количество проб/ клонов % клонов крнстовара % клонов морфовара

К-1 -* ¡K-73 R X г ш

Контаминанты 28/28 100 0 100 0 0 0

Насекомые J1/17 12 88 12 0 0 88

Р.Шигаркз і 4/22 22,5 77.5 10,5 12 38,5 39

Пастбище 4/5 20 80 20 0 60 20

Скотный двор 3/8 , 50 50 37,5 12,5 20 30

мест их обитания, присутствовали в небольшом количестве проб. Большинство же природных изолятов относилось к крнстовару К - 73 (табл.4). Аналогичные результаты были получены Келин с соавторами [КаеЗш е1 а1., 1994] при исследовании сухих остатков табака и мертвых табачных жуков, собранных в 15 страна^ мира.

Повсеместное распространение штаммов В<¿яр.кигзюк! кристовара К - 73, даже в тех местах, где никогда не использовались биоинсектициды (во всех пробах с острова Кунашир мы обнаружили штаммы В( язр.китакг только кристовара К - 73), указывало на их адаптацию к жизни в микробных сообществах из-за высокой гидролитической активности, повышенной гндрофобности спор, способствующей прикреплению к питательному субстрату. При работе с модельными штаммами нами была замечена разница в скорости прорастания спор двух кристоваров. Споры кристовара К - 73 прорастали на среде с дрожжевым экстрактом и глюкозой на сутки раньше, чем споры кристовара К - 1. Выживание спор кристовара К -73 в условиях окружающей среды могло определяться способностью этих спор к быстрому прорастанию.

Результаты изучения морфологии колоний природных изолятов ¿7 я!р.кигх!акг показали, что из насекомых культуры морфовара И (продуцента лепидоцида) выделялись редко (один образец - погибшая гусеница). Изоляты кристовара К- 1 морфовара К чаще выделялись из почвы; культуры морфовара X кристовара К - 1 были обнаружены только в образцах, взятых у реки Шигаркн (Новосибирской области), (табл.4).

Из таблицы 3 видно, что все. изоляты кристовара К - 73, выделенные из насекомых, относятся к морфовару т. Как отмечалось выше, штаммы этого морфовара (гл.2.4.1.) не дают спор и кристаллов на средах, богатых аминным азотом. Возможно, содержимое кишечника насекомого при благоприятных условиях является той средой, на которой эти культуры не образуют спор и кристаллов и способны размножаться, находясь в симбиозе с насекомым -хозяином.

Было установлено, что в одном образце могли присутствовать клоны разных морфоваров. Это указывало на то, что в природных условиях, вероятно, происходит расщепление популяции В/ на варианты. Возможно, при расщеплении популяции В{ 5хр.киг$1аИ кристовара К - 73 возникли морфовары X и Я кристовара К - 1 с более токсичными кристаллами 6-эндотоксина и со свойствами, затрудняющими их адаптацию к жизни в микробных сообществах Вероятно поэтому, изоляты кристовара К-1, а особенно морфовара X, довольно редко встречались в верхних слоях почвы.

Таким образом, в результате исследований выявилось, что природные популяции Вг х$р.киг$1а1а разделяются на несколько основных морфологических групп. Хотя во всем мире и давно применяются препараты на основе В: ззр.киШаИ кристовара К - 1, из природных источников выделяется большое количество культур кристовара К - 73.

6. Отбор штаммов для бнотестнроваиия

Результаты биохимических и серологических исследований показали, что кроме культур В( ¡¡р. кипшИ в природных популяциях и контаминантах присутствовали изоляты В( $хр.!3гае!епзй, в природных популяциях

встречались штаммы Вг ¡¡р^аИггше, а в контаминантах -

штаммы В{ Бзр. ег}[отос1с1и5.

Споро кристаллические смеси штаммов с крупными и средними по сравнению со спорой кристаллами были проанализированы электрофорезом в БОБ-РАвЕ. Было обнаружено большое число полипептидных соединений для разных штаммов. Изоляты с идентичными полипептидными профилями объединялись в одну группу. Таким образом, 67 изолятов разделились на 15 групп или 15 электрофореваров.

Штаммы, входящие в один электрофоревар продуцировали сходные по форме и размеру кристаллы, обладали одинаковыми физиолого-биохимическими свойствами, имели одинаковое строение жгутикового антигена. Штаммы одного подвида могли относиться к разным электрофореварам. Проверка изолятов на выбранных тест-насекомых показала, штаммы одного электрофоревара имеют одинаковый спектр чувствительных к ним насекомых. При определении москитоцидалъной активности штаммов трех электрофореваров было установлено, что. изоляты, входящие в одни электрофоревар, обладают близкими значениями биологической активности. Не было корреляции между полипептидным профилем и местом сбора образцов.

Таким образом, изучение изолятов из почвы, насекомых, контаминантов по фкзиолого-биохимическим свойствам, по морфологическим свойствам кристаллов, по их белковому составу, по инсектицидной активности показало, что из природы часто выделяются одинаковые штаммы. Электрофорез спорокристаллических смесей В/ в ЗОЭ-РАОЕ наряду с биохимической и морфологической характеристикой позволяет быстро дифференцировать большое число изолятов по белковому составу и сократить в несколько раз количество штаммов для биотестирования. Предварительный отбор штаммов для биотестов с помощью электрофореза исключает проверку одинаковых изолятов на насекомых, что значительно упрощает сложный и длительный процесс биотестирования.

ВЫВОДЫ

1, Обнаружена гетерогенность штаммов В! кигнакл по кулътурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам. Выделено 6 групп морфовариантов: Я, X, М, г, т, т1. Выявлены связи между морфологическими особенностями (характер роста колоний на агаризованной среде) и фнзиолого-бнохимическими характеристиками (синтез параспоровых включений,

IS

продукция протеаз, лецитиназы, уреазы, вегетативного инсектицидного белка, антибиотических веществ) в популяции штаммов Bt ssp.htrstaki.

2. Наработаны препараты секретируемых белков штаммов различных морфоваров, которые были проверены на гусеницах Choristoneura occidental is (Lepidoptera: Tortricidae), Установлено, что секретируемие белки различались по энтомопатогенному эффекту: вызывали гибель гусениц, ингибированпе роста оставшихся в живых личинок, задержку окукливания. Показан синергетический эффект между дельта-эндотоксином и белками, секретируемыми штаммами Bt ssp. kurstaki.

3. При изучении влияния спор штаммов Bt ssp.kurstaki разных морфоваров на инсекитшщность было обнаружено, что в присутствии бактериальных спор любого морфовара инсектицидная активность кристаллических белков Bt ssp,kurstaki к еловой л исто верт ке-поч коеду Choristoneura occidentals увеличивается в 100-500 раз.

4. Проведена оценка адгезивных свойств спор различных морфоваров Bt ssp. kurstaki по индексу гидрофобности. Выявлено, что споры морфовара R обладают гидрофильными свойствами (индекс гдрофобности равен 0); споры морфоваров гит- гндрофобны (индекс гидрофобности > 50%).

5. Изучение колониально-морфологического разнообразия природных популяций Bt показало, что в основном из естественных экосистем выделяются штаммы Bt ssp. kurstaki кристовара К-73 морфоваров mur, обладающие повышенной метаболической активностью и гидрофобностью спор. Из насекомых преимущественно были изолированы культуры морфовара т, неспособные спору пировать и образовывать кристаллы на богатых аминным азотом средах.

6. Установлено, что анализ с помощью электрофореза в SDS-PAGE спорокристаллических смесей штаммов Bacillus thurmgiensis, выделенных из естественных экосистем, значительно облегчает отбор энтомопатогенных штаммов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Калмыкова Г.В. Экологическая оценка морфологических мутантов Bacillus thuringiensis subsp.kursiaki / Л.И.Бурцева, Г.В.Калмыкова, Т.Ф.Ломовская, Н.И.Шашкина // Тез. докл. IV Всесоюзной научной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве», Пущино, 20-24 января, 1992. - С.22-23.

2.Калмыкова Г.В. Изучение гидрофильно-гидрофобных свойств морфологических мутантов Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki / Г.В.Калмыкова, Л.И.Бурцева// Там же - С.80.

3.Калмыкова Г.В, Протеолитич ее кая активность мутантов Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki ! Г.В.Калмыкова, Л.И.Бурцева, Н.А.Громова, Т.Ф.Ломовская

// Тез. докл. конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами». Москва, 26-27 октября, 1993.-С.71.

4,Калмыкова Г.В. Критерии отбора эффективных штаммов для производства энтомопатогеиного препарата «Лепидоцид» / Л.И.Бурцева, Г-В.Калмыкова // Материалы Всероссийского научно-производственного совещания «Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции». Краснодар, 24-26 августа, 1994. - Пущино, 1994. -С.202-204.

5.Калмыкова Г.В. Экология и распространение бактерий группы Bacillus cereus-BaciUm thuringiensis / Л.И.Бурцева, Г.В.Калмыкова И Тез. докл. конференции «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду». Москва, 17-19 мая, 1994.-С.19.

fi.Kalmikova G.V. Bacillus thuringiensis novosibirsk (serovar H24a24c), a new subspecies from the West Siberian Plain / L.I.Burtseva, VA.Burlak, G.VJCalmikova, H. de Baijac, M.-M. Lecadet // J. Invert. Pathol. -1995. - V.66. - P.92-93. 7.Калмыкова Г.В. Сравнительная характеристика мутантов Bacillus thuringiensis subspecies kurstah / Г.В .Калмыкова, Л.И.Бурцева, Т.Г.Юдина I! Микробиология. - 1995. - Т. 64. - № 4. - С.461-468.

S.Kalmikova G.V. Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki as a microbial biocootrol agent / L.LBurtzeva, G.VJCalmikova // European Journal of Plant Pathology. - Abstracts, ХШ International Plant Protection Congress, The Hague — The Netherlands, 2-7 July, 1995. - N.583.

9.Kalmikova G.V. Bacteri ocinogeny and hydrophobic^ of Bacillus thuringiensis moiphovariants as protective factors in nature I G.V.Kalmikova, L.I.Burtzeva //IbiL-N.584,

10.Kalmikova G.V, Ecologically safe methods for plant protection / N.I.Ermakova,

G.V.Kalmikova, L.I.Burtzeva II Book of Abstracts, International conference " Fundamental and applied problems of environmental protection". Tomsk, September 12-16,1995.-P.17I.

H.Калмыкова Г.В. Колониально-морфологическое разнообразие природных популяций Bacillus thuringiensis I Г.В .Калмыкова, Л.ИЗурцева // Сб.науч.тр. «Регуляция численности беспозвоночных и фитопато генов». Новосибирск, 1997. - С.52-59.

12.Калмыкова Г.В.К вопросу о специфичности действия энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis/ Г.В.Калмыкова, Л.ШБурцева, И.Н.Наумова,

B.В.Глупов // Материалы всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий". Курган, 1998. -

C. 172-174.

13.Калмыкова Г.В. Новый подход к селекции штаммов энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis / Л.И.Бурдева, Г.В.Калмыкова, В.ВГлупов, А.МЛысенко // Сб .науч.гр.'ТГроблемы энтомологии в России". С.Петербург, 1998. - С.54-55.

14.Калмыкова Г.В. Чувствительность гусениц лугового мотылька Loxostega slicticalis L.(Lepidoptera, Pyralidae) к морфологическим мутантам Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki // Там же, - C.176-177.

15. Калмыкова Г.В .Идентификация и паспортизация штаммов Bacillus thuringiensis методом геномной дактилоскопии с использованием биотинилированной ДНК фага М13/ С.ФОрешкова, Л.И.Бурцевз, О.В.Манохина, Д.И.Пучкова, Г.В.Калмыкова, В.М.Михайлова, В.Е.Репин, АЛ,Ильичев И Генетика. - 1999. - Т.35. - № б. - С.751-755.

16.Кацмыкова Г.В, Бактериальные болезни насекомых. / Л.И-Бурцева, М.В.Штерншис, Г.В.Калмыкова // Патогены насекомых: структурно-функциональные аспекты (Под ред. В.В.Глупова) - М.: Круглый год, 2001. -С. 189-245.

17.Калмыкова Г.В .Систематика бактерий Bacillus thuringiensis I Л.И.Бурцева, Г.В.Калмыкова, А.МЛысенко, Т.Г.Юдина // Материалы российской научно-прахтической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Талалаева "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе". Иркутск, 11-13 марта, 2002. - С.47-48.

18 .Калмыкова Г.В .Дифференциация штаммов энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis по продукции вторичных метаболитов / Г.В.Калмыкова, И.В.Наумова, Я.Л.Лозинская, Л.И.Бурцева, В.В.Глупов// Там же. - С.59-61.

Подписано в печать 11.11.2003 Формат 60*84 1/16 Печл. 1

3*№.М*193 Бумага офсетам, 80 гр/м1 Тираж 100

Отпечатано иа полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борее кова СО РАН £30090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5