Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение спонтанного и индуцированного опухолеобразования у табака NICOTIANA TABACUM L. и редиса RAPHANUS SATIVUS L.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение спонтанного и индуцированного опухолеобразования у табака NICOTIANA TABACUM L. и редиса RAPHANUS SATIVUS L."

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК: 575.1:581.143.6

ВОТКОВА Светлана Олеговна

ИЗУЧЕНИЕ СПОНТАННОГО И ЭДУЦИГОВА11НОГО ОПУХОЛЕОБРАЯОВАКИЯ У ТАНАКА М1СОТ1АМЛ ТАПАС11М I.. И РЕДИСА НЛРНАНиЭ ЗАТт!« I..

ш.ш.16 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

■Рагюта выполнена на кафедре генетики и селекции Ленинградского государственного университета.

Научные руководители: кандидат биологических наук

Л.А.Лутова,

доктор биологических наук, чл.-кор. АН СССР С.Г.Инге-Вечтомов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

З.Б.Шамина,

кандидат биологических наук А.А.Арояштомм.

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет'

Защита диссертации состоится

ся "(Ш.^ 1991 г. в 16 часов

60минут на заседании специализированного Совета Д.063.57.21.При Ленинградском государственном университета по адресу: 199034 г. Ленюп'рад, Университетская набережная, 7/9, ЛГУ, биолого-почвенный ф-т,кафедра генетики и селекции, аудитория I.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке ЛГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета

Л.А.Мамон

- I -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Опухоли выспнх растений издавна привлекают внимание биологов различных спешпльностой. Изучение опухслеобразования у растений тесно свлпано с проблемой диффе-ренцировгл и морфэгеназа. Опухоли состоят из дедиф£ерепцировая-ных клеток, к процессы морфогенеза и регенерация в культурах таких клеток часто затруднены или невозможны. Опухоли растений содержат повышенные концентрашга фитогормонов - вепеств, определяющих направление дпффаренцировки гслоток. Эксперимента m vitro свидетельствуют о том, что баланс экзо- и эндогенных фитогормонов является основным фактором, влияющим не тип развивающейся ткани - неорганизованный каллус или ткань, формирующая побеги или корни. Сильное увеличение содержания флтсгормонов в опухолевых тканях позволяет создавать модели, которые могут быть использованы для изучения механизмов действия фитогормонов, их взаимовлияния, биосинтеза и катаболизма, пнгибиторных эффектов сверхвысоких концентрация гормонов и механизмов адаптации клеток к таким концентрациям.

Значительный интерес опухоли растений представляют для фитопатологов. Многие организмы способны вызывать или усиливать реет опухолей у растений. Выяснение механизмов индукции опухолей и обнаружение генов, приводящих к устойчивости к фитопатогекам, может открыть пути к созданию более продуктивных форм сельскохозяйственных растений.

Особый интерес представляет исследование корончатых галлов, индуцированных почвенной бактерией Agrobacterlum tumefacienu. Способность агробактерий ковалвнтно встраивать фрагмент ДНК в геном растений широко используется для переноса чужеродных химерных генов и создания огромного разнообразия трансгеншх растений, что открывает широкие перспективы для детального исследования многих механизмов их развития' и взаимодействия с факторами окружающей среды или другими организмами.

Цель-и задачи исследования. Целью работа является сравнительное изучение инбредннх линий редиса, характеризукщихся различной частотой образования спонтанных опухолей, и индуцированных a.tumofaciепэ КОрОНЧЭТЫХ ГЭЛЛОВ ТабаКЭ И редиса in vitro.

В связи с этим в задачи навей работы входило:

- г -

1. Получение ;i анализ асептических корончатых галлов табака и редиса, юдацироватшх штаммами A.tumefaciena досого типа.

2. Трансформация тебака и редиса штаммами a.tumefeciens, содержащими отдельные онкогены из Т-ДНК, и изучение направления .вдцфзрвнцировки этих тканей на фони различных концентраций экзогенных фитогормонов.

3. Изучение направления диф£еренцировки in vitro эксплантов редиса инбредных линий, различающихся частотой спухолеобразова-ния на фоне различных концентраций экзогенных фитогормонов.

4. Ане-лиз возможной связи опухолей корнеплодов у инбредных ЛИНИЙ редиса С A tumafaciens.

Научная новизна и значимость работы. Впервые показана возможность заражения in vitro проростков редиса A.tumafaciens. Проведен сравнительный анализ морфогенеза трансформированных тканей табака, содержащих различный набор генов синтеза фитогормонов из Т-ДНК, на синтетических средах, отличающихся по количеству экзогенных ауксинов и цитокининов.

Получены длительно пассируемые культуры тканей инбредных линий редиса. Впервые выделена морфогенная ткань из длительно пассируемых каллусов редиса. Предложен способ регенерации почек из тканей редиса, индуцировашшх на эксплантах выросших на 2,4-Д проростков.

Спонташше опухоли на корнеплодах редиса проанализированы на содержание нопялина и октопина - соединений, характерных для корончатых галлов.

Показана принципиальная возможность введения в культуру тканей эксплантов с растений опухолевых и нвепухолевых линий редиса, выросших в полевых условиях. Предполагается наличие гомологичных Т-ДНК A.tumefaciene последовательностей в геноме редиса.

Практическая ценность работы. Различные морфогенетические свойства трансформированных тканей табака, содержащих различный набор генов синтеза фитогормонов ИЗ Т-ДНК A.tumefaciena, свидетельствуют о перспективности использования данного юдхода . для изучения дифференцировки и морфогенеза у высших растений. Полученные нами длительно пассируемые ткани редиса могут быть использованы в исследованиях дифференцировки клеток, морфогенных

свойств и изменчивости тканей m vitro. Асептические растения редиса, легко размножающиеся черэтпсоранием, показывают принципиальную возможность получения m vitro неограниченного 'гасла потомков от одного растения. Это может тлеть значение для возобновления некоторых высоконноредных линий редиса, отличающихся сильно пониженной плодовитостью и жизнеспособностью.

Апробация работы. Материал диссертации докладывался на Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре, (Звенигород, 1986); на v съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова ( Москва, 1987); на Республиканской конференции "Гаметная и зиготная селекция растений" (Кишинев, 1987); на Второй конференции моло-. дых ботаников Ленинграда (1988); на v международном молодежном симпозиуме "Регуляция метаболизма растений" (Варнз, 7990); на v зимней школе МГУ "Биология растительной клетки" (Пущино, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, четырех глав р. лульта-тов..обсуждения и выводов, содержит 7 таблиц и 22 рисунка. Список литературымключает 138 наименований, из них 120 - на английском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использована коллекция инбредных линий редиса, полученная на кафедре генетики Ленгосуниверйитета (Нарбут, 1966). В настоящее время в коллекции имеется более 30 инбредных линий с рядом константных морфологических, биохимических и физиологических признаков. Наиболее интересной для нас характеристикой инбредных линий являлась различная частота формирования спонтанных опухолей во время цветения. Инбредные линии, способные образовывать такие опухоли, мы относим к опухолевым; линии, не обрчзуотие опухолей (или образующие их редко) - к неопухолевым. Использовали также культуры in vitro табака сортов Юбилейный и Трапезонд 285.

Для индукции каллусов из эксплантов Ю- и 30-дневных асептических проростков редиса применяли среду Мурасиге-Скуга кз с добавками различных концентраций 2,4-Д, КУК, БАП, кияетина е

- <t -

разных сочетаниях.

Раститэльнне ткани трансформировали штаммами д.tumefscions ДИКОГО типа 058, Л277, A28I, А343 (Watson et al.. 1975, Garfin-kei et ai.. 1980), a также штаммами, несущики сконструированные на основе Ti-плазмид векторы с различите набором генов синтеза

фИТСГОрмОНОВ ИЗ Т-ДНК A.turaefaciena.

Зарязениэ асептических проростков и листовых дисков, табака и редиса Производили НОЧНЫМИ культурами A.tunrafaclens.

Штамм A.tumefaciens ДЛЯ ИНДУКЦИИ ТраНСГеННЫХ ТКВНвЙ, УСТОЙЧИВЫХ г. канамицину, получали мобилизацией гслазмиды рКвогз в ¡втамм a. tumefnciene gv ЗЮ1 (Лихтенштейн, Дрейцер, 1983). В штамм нв loi, содержащий плазмиду рнсогз, переносили плазмиды

R64drdll (tra-фунКЦИИ) И pGJ 28 (mob-фуНКЦИИ ). ДОНОрНЫЙ ШТЭММ E.coll. Содержащий три ПЛЭЗМЗДВ, скрещивали С A. tumefacions OV 3101, содержащей векторную Ti-плазмиду psv зеэо. Отбирали конъю-гаты с коинтегратами pGV 3B50:;pNeo23 я анализировали их с использованием блоттинг-гибридизадаи по Саузерну с последовательность») ДНК бактериального гене аминогликозид фосфотрансферазы в стандартных условиях (Ыаниатис и др., 1984).

Длл определения наличия в трансформированных тканях нопали-на и октопина использовали метод высоковольтного электрофореза на бумаге (Otten, Sohilperoort, 1976).

Ядерную и тотальную ДНК растений выделяли по методам

(De 11 »porta et al.. 1904). И (Paazkoviski et al.. 1984).

При дот-гибридизации на жтроцеллнлозный фильтр наносили по 10, I и С,1 ыкг денатурированной ДНК каждой пробы и высушивали при ео° в Еакууме. Для Олоттииг-гибридизации ДНК по Саузерну в лунки 0,7 % агарозного геля наносили по 10 ;лкг каждой пробы и разделяли при напряженности поля около 2 В/см. Перенос ДНК растений нь нитроцеллидознкй фильтр, гибридизацию ДНК и отмывки фильтра осуществляли ПО (Klesaig et al.. 1984).

Б качестве проб для гибридизации использовали фрагменты

Т-ДНК BamIll-8 И Hintf XII-1 ИЗ ОКТОПИНОВОЙ ПЛаЗМИДЫ {TiAchi, КЛ')-

даровэккае в векторе рдоэ22 (psv oisa и pov 0201 соотвотствен-во). Трансформацию ё.соН и выделение плазмидной ДНК проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). ДНК-пробу фрагмент пэроваренной соответствушей рестриктазой плазмиды pGV

огзз или pGv 0201 - выделяли из агарозпого геля не ДЕАЕ-бумэгу (Bio-Rad) и метили с использованием методов рассеянной затравки или ник-траисляции до удельной радиоактивности I08 - IG9 распадов/мин на мкг ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение трансформированных тканей табака, содержащих вш гены биосинтеза НИТОГОрМЬНОВ Щ Т-ДНК Agroiacteriuro tumefacienn или часть §тах генов, g щ реакция на экзогенные Фитогормоиы. Развитие опухолевых тканей при заражении листовых дисков штаммами A.tumefaciens С58, А277, A28I дикого типа наблюдали по раневой поверхности на среде без фитогормонов на 10 - 20 день после заражения. Трансформированные штаммами дикого типа ткани не нуждались в добавках экзогенных фитогормонов и были способны к длительному культивирозанию на средах без ауксинов и цигскининов. То, что это были действительно трансформированные ткани, доказывалось наличием в них станов. Сверхпродукция фитогормонов в таких тканях приводит к некоторому угнетению роста и иногда к образованию некрозов при их росте нэ средах с добавками экзогенных ауксинов и цитокининов (табл.1).

Трансформированные ткани, содержащие отдельные гены биосинтеза фитогормонов из Т-ДНК, мы получаля при заражении листовых ДИСКОВ штаммами A.tumefaciens 1111]. 1107). 11101 И (791 И анализировали их способность к росту и тип морфогенеза на средах без фитогормонов и с добавками экзогенных ауксинов в цитокининов. Штамм tin) внутри переносимой в растительные клетки части ДНК содержит один из генов синтеза фитогормонов из Т-ДНК. - tmr. определящий путь биосинтеза цитокининов в трансформированных тканях. Полученные нами трансформированные штаммом [III] ткэни на среде без гормонов формировали почки и растения- регенеранты, на среде с ауксинами - неорганизованные ткани (Табл.1).

Штамм A.tumefaciens ио7)содерхит оба гена из Т-ДНК. необходимые для осуществления нового пути биосинтеза ауксинов в трансформированных тканях - tmai и tins 2. Из трансформированных им растительных тканой на средах с цитокинином формировался устойчивый к канамицину каллус, а на средах без фитогормонов -каллус, часто формирующий корни.

ШташЫ А^шг,е£ас1впз 1110! И [791 Внутри ГраНИЦ Т-ДНК ссдорхат по одному из двух генов агробг.ктериального пути биосинтеза ауксинов в трансформированных тканях: ген ипз1 и ген 1юз2. соответствзнно. Ткани, трансформированные этими двумя штаммами, ка синтезируют ни цитокикинов, ни достаточного для автономного роста количества ауксинов. Однако, из-за наличия одного из двух

Таблица С.

Характеристика трансформированных тканей табака.

Штамм ,Селект. С р е д ы

A. tum. маркер Ces горм. ИУН КАП НУК+БАП

С58 (II) Aux+ Каллус Некрозы (Некрозы) Некрозы

А277(0) А28Х(С) cyt+ Каллус Каллус Каллус

[Ш) Kmr Почки Каллус Почки Каллус

(tmr) Cyt* (Каллус ; (Почки) (Почки)

fI07j (tmsl tma2) Kmr 7kux+ Каллус (Корни) Некрозы (Каллус) Каллус Кяллус Корни

¡П0| (tmsl) Kmr Некрозы Некрозы Почки Каллус

179) (tmn; ; Kmr Некрозы Некрозы (Каллус) Почки ;Некрозы) Каллус

3050 x Kmr Некрозы Корни ■ Почки Каллус

neo23 (Каллус)

иих+ - прототрофность трансформированных гханей

по ауксинвм Суь+ - прототрофность по цитокининам ктг - устойчивость к канамицину В скобках указан менее характерный тип ткани.

генов пути биосинтеза' пуксина количество этого гормона в таких тканях может бить несколько повышенным, и трансформированные этими штаммами ткани формировали хорошо растущие каллусы на средах с ауксинам и цитокининами, и были способны расти на средах, содержащих пониженное количество ауксинов.

Ткани, полученные при трансформагли листовых дисков агро-бактерией с конструкцией Т-ДНК, включающей только химерный ген устойчивости к канамипдау и не содержащей генов синтеза фитогор-монов, нуждались в больших количествах ауксинов, чем ткани, трансформированные штаммами [110) и [79]. Штамм A-tumefacíen? для индукции трансформированных тканей, содержащий химерный гея. устойчивости к каламицину и не ссдержапзй генов синтеза фитогор-монов, получали путем межвидового скрвп;ивания е. coi i и A.tumef.i-ciena, как описано в разделе "Материал л метода". На средах без фитогормонов и с добавками ауксиноз и цитокиганов такие трансформированные ткани вели себя подобно нетрансфорюфованным: ски были неспособны развиваться на средах без фитогормонсв, на средах с цитокининами формировали почки, с ауксинами - корни, на средах с ауксинами и датогашинама - неорганизованные ткшш.

Тагам образом, анализируя поведение трансформированных тканей, различающихся составом эндогенных ауксинов и цитокииноп, на средах с различным содержанием ¡шогенных фитогормонов, мы убедились в том, что направление дифференигировки тэких тканей определяется соотношением как эндогенных, так и экзогенных фито-гормонов. •

Поведение первичных и пассированных тканей инбредннх линкЯ редиса. Растения редиса инбредных лигой, как было показано ранее на кафедре генетики и селекции ЛГУ, по-видимому, характеризуются различным содержанием фитогормонов (Фадеева и др., 1975). Следовательно, если для табака ткани, характеризующиеся различными концентрациями эндогенных фитогормонов, мы получали путем трансформации, тс для растения редиса подобные' ткани yace существуют у разных инбредных линий. Мы проверили поведение эксштнтов асептических проростков ряда опухолевых и паопухолевых инбредннх линий редиса на средах с различным концентрациями ауксинов И цитэкининов.

Эксплантирование семядолей и гмкжотилей 10-дновшх асепти-

ческих проростков, а также листьев, черешков и стеблей 30-даепных проростков редиса проводили на среды с различными сочетаниями фитогормонов. Использовали 20 вариантов сред с синтетическими ауксинами 2,4-Д (в концентрации 1-2 мг/л), НУК (0,1 -4 мг/л), ИУК (0,1 - Б мг/л) и цитокшпшами БАП (0,1 - 2 мг/л), зэатип (0,04 - I мг/л) или кинетин (0,1 - 0,5 мг/л). В табл.2 представлены результаты для 4 из этих вариантов сред: I. 2,4-Д -1 мг/л; 2. 2,4-Д - I мг/л, кинетин - 0,2 мг/л; 3. НУК - 2 мг/л, БАП - 0,5 мг/л; 4. НУК - 0,5 мг/л, БАП - 2 мг/л;

В целом для линий можно отметить следующие закономерности:

1). Интенсивность каллусообразования различается для разных вксплантов проростка. Хуже всего образуется каллус на эксплантах семядолей, несколько лучше - гипокоодлей Ю-днэвяых проростков. Лучке всего образуется каллус из эксплантов черешков и листьев 30-даевных растения..

2). Образование крупного каллуса без образования корней обычно наблюдается на средах с синтетическим ауксином 2,4-Д с добавлением или без добавления цитокининов (табл.2). Ка средах с различными концентрациями ауксина НУК с цитокининами или без них каллус осли и образуется, то это обычно сопровождается образованием корней. При определенных сочетаниях НУК и БАП наблюдается образование корней различной длины и различной опушенности. Такие экспланты с каллусами и корнями обычно гибнут при дальнейшем пассировании на средах с НУК и БАП. Однако, если их перенести на среды с 2,4-Д, Можно наблюдать формирование каллусов из корней. Образующиеся каллусы способны к дальнейшему пассированию на средах с атин ауксином.

< 3). Для всех линийнабладали образование каллуса не средах только с ?,4-Д (исключение составляли семядоли к гипокотили линии ЯВ-М2). При втом.олнако, линии могли незначительно отли-чатьоя по отковвни» к цитоккшшам. Если для некоторых линий каллус лучвв формировался на средах без добавления . цитокининов, илидобашюию цитоюшанов не оказывало видимого влияния на способность обрезояшать тмрвичннв каллус (линия ЛВ-53), то для других лгиаЯ (хятя Щ-277> добаалениэ цитокининов в среды поло« «ягель»»влияло ю» чфодасс каллу »образования.

Пассируемые каллусы разных линий нами были получены только

Таблица 2.

Эксшшнтированио органов редиса на среди с различным содержанием фитогормонов

Среда 2,4-Д 2,4-Д + НУК-2 мг/л НУК-0.5

Линии I мг/л кинотин ЕАП-0,6мг/Л БАП-2

ЛВ-40 С Г X К н н К К н н К Кр н

ЛВ-41 С Г К К к н Н К Кр Н К Кр н н

ЛИ-42 С Г н н к к н н Н К Кр Н К Кр к н к н

ЛВ-53 С Г к к н к к н Кр 8 к К Кр К Кр

ЛВ-260кр С Г к к к к 9 н н Кр к. Кр

ЛВ-2606 С Г к к к к Кр кр К? К

ЛВ-269 С г к к к к Кр к кр К кр н к 'кр

ЛВ-342 с г я н кр н к к кр кр н н К кр н К Кр н

ЛВ-274 с г к к к к н н Кр Кр К Кр Кр к

ЛВ-277 п г к к к к к н К Кр н

ДО—25 с г к к н к к Кр кр Кр кр

ЛС-76 с г к к н н к к н н н н к Н

ЛО-24 с г к к н к к к к? 8

ЛО-359 С г к . к н ч "■ к • и

К - каллус, Кр - корня, Н - некрозы.

на средах с добавками ауксина 2,4-Д без цитокшвшов или с добавками кинетина, зватина, БАП. Независимо от жизнеспособности самих эксплантов на средах с 2,4-Д практически для любой линии можно получить каллусные культуры, способные к дальнейшему пассированию. Для каядой из линий можно было получить пассируемый каллус как на средах с 2,4-Д без цятокининов, так к с цитокгеш-нами. Оптимальной концентрацией 2,4-Д для большинства линий является I иг/л. По свойствам и.морфологии пассированные каллусы разных линий очень похожи. Следовательно, пассируемый каллус на средах с 2,4-Д можно получать от практически любых генетических форм редиса, хотя первичные экспланты растений редиса с разным генотипами по-разному реагируют ка высокие концентрация 2,4-Д (у некоторых нкбредаых линий практически'все клетки первичных эксплантов додифференцируются и дают каллус, для других же наблюдается гибель эксплантов и лишь отдельные клетки долятся и дают начало пассируемому каллусу).

Ни для. одной из использованных линий нам не удалось получить пассируемые каллусы на средах с ауксином НУК (1-4 мг/л), как с добавками цитокининов, так и без них.

Для линии ЛВ-359 мы получили длительно культивируемые ткани, формирующие листья, почки и аномальные побеги, а также корни и корношюдоподобнне образования. Способность к морфогенезу этой линии оказалась.столь велика, что образование листьев и аномальных побегов наблюдали дажа в культурах, более 1,5 лет пассировавшихся на средах г. 2,4-Д (I мг/л) и затем помещенных на среду без фитогормонов. Это особенно интересно в связи о тем, что задача регенерации побегов из каллусных тканей редиса до сих пор не решена. Морфогенные культуры тканей линий ЛВ-2606, лс-24, ЛС-25 и сорта Вировский белый формировались из первичных эксплантов проростков, выращенных на среде с ауксином 2,4-Д.

Трансформация редиса in vitro. Асептические проростки редиса сортов Сакса и Вировский белый заражали штаммам A.tumefaciens C5B. несущим нопалиновую Ti-плазмиду. Появление опухолей наблюдали на 10 - 20 лень после нанесения ночной культуры агробакте-ри на раневую поверхность. Опухоли были в основном неограгогао-ватпюго типа, но отличались по морфологии на растениях разных сортов: все опухоли, образовавшиеся на растениях сорта Сакса,

содержали антоциан, в то время как опухоли на растениях сорта Вировский белый были пеокрашены и давали измененные побеги с листьями (тератомн).

При пассирорашш часть образовавшихся опухолей отдаляли от растения полностью, а часть оставляли на фрагменте стеоля с побегом или соковой почкой. Корончатые галлы редиса оказались неспособными к дальнейшему пассированию и погибали. Мы пытались получить культивируема опухоли редиса и путем модификации метода трансформации листовых дисков и применения его для заражения редиса. Диски из семядолей, листьев и сегментов гипокотилей от растений четырех иябредкых линий, различающихся по чувствительности к фктогормонам, трансформировали двумя способами, один из которых включал прекультивирование семядолей на средах с добавками фитогормонов.

Кроме штаммов А.сите<ас1еп8 дикого типа С58 И А377, в ятих эксперимента:: использовали также штаммы с ганноинжекерннми конструкциям на основе -п-плазкидн - описанные выше шг 'ммы А.ъип»гас1епз [107], ню). 1111). Благодаря наличию в Т-ДНК этих плаямид химерного гена устойчивости к канаиицкну трансформированные ткани № могли отбирать на средах с гормонами, необходимыми для образования каллуса, а добавки в среды канамицииа позволит бы отселектировать клетки, содержащие чуя»родную ДНК, . Однако, несмотря на предпринятые модификации метода, трансформация оказалась безуспешной во всех вариантах. Образования трансформированных тканей на .листовых дисках не наблюдали.

Определение наличия ощщоп в спонтанных опухолях корпенло^ Д5Й ¡Ш328£!Ш линий редиса. С целью выяснить, не являются ли опухоли на корнеплодах инброднкх линий редиса корончатыми галлами, индуцированными д.ситвгас1впз, на содержание октошша и нопалина нами была проанализирована 21 опухоль шести инбрадных линий (табл.3). В этих опухолях (а также в листьях, стеблях и каллусах редиса инбредннх линий) нам не удалось обнаружить окто-пин или нспалин, в то время как в контрольных образцах из корончатых галллов редиса и табака октопин или нопалин присутствовал. Тагам образом, проанализированные спонтанные опухоли на корнеплодах редиса возникли не в результате заражения растений инбро-ДННХ ЛИНИЙ ОКТОПИНОВЫМИ ИЛИ нояалиновыми штаммами А.».игав£ас1ег.з.

• Поиски гомологии с Т-ДНК в геноме редиса. Мн предположили, что опухолеобразование у инбредных линий редиса может быть связано с наличием последовательностей, гомологичных онкогенам Т-ДНК, и экспрессией содержащихся в них генов. На первом этапе ПОИСКОВ ГОМОЛОГИИ ДНК редиса С Т-ДНК А.Ытм>Гас1епв использовали метод дот-гибридизации ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах. На фильтры наносили по 0,1; I и 10 мкг ДНК различных инбредных

ЛИНИЙ И ГИбрИДИЗОВВЛИ С фрагментом Т-ДНК 1111x1111-1 ИЛИ ВагоН1-8

(рис.1). В качестве положительного контроля .использовали ДНК корончатых галлов редиса и капанхое, отрицательного - ДНК из спермы лосося (вогуа). Результаты нескольких экспериментов по дот-гиСридазацвд ДНК свидетельствовали о наличии гомологии ДНК

Таблица 3.

Анализ наличия в опухолях на корнеплодах инбредных линий редиса октопина и копалина.

линия кол-во растений опухоль на корн. кор. галл пол. контр. отриц. контроль

ЛВ-265 2 + лист: -

корк.: -

ЛВ-269 3 - + лист: -

корн.: -

.»В-350 4 - + лист: -

ЛС-24 2 _ + лист: -

корн.: -

ЛВ-269 3 - +* корн.: -

ЛВ 342 I - +* корн.: -

ЛС-24 3 - корн.: -

ЛС-76 3 - - +* корн.: -

- отсутствие на электрофореграмме нопзлина и октопина + наличие нопалина или октопина » в качестве положительного контроля использовали корончатые галлн табака

7 2

За бь ссз - Ляп 7-ДНК

!3ат Н1

10с

22ч

НтаШ

0153.

0201

Рис.1. Схема Т-ДНК октопиновой п-плагмлда рПЛсм. Фрагмент Шпаны клонироаан з шгаямзда о;:с1, ваыи-а -• в ром о^з. Стрелками почазаны направления считыветш генов Т-ДНК.

0,1 мкг

I мкг :

■т

10 мхг % ДНК

€1 -■■ей*

I

3

«ж

4

1 - Тимус теленка

(отрицательный контроль)

2 - опухоль, индуцированная ШТАММОМ л.сигшз1'ас1епз 058.

3 - инбреднан линия ЛС-24.

4 - инбредаая линия ЛВ-2606

5 - инбрвднан линия ЛВ-274;

Рис.2. Дот-гибридазация ДНК инбредоых линий редиса фрагментом Т-ДНК шпаШ-1.

4

в

1

редиса с ДНК пробы, причем степень гомологии различалась для разных линий (рис.2).

Наличке положительного ответа в дот-гибридизации позволило перейти я более точному методу выявления гомологичных последовательностей - гибридизации ДНК по Саузерну. При гибридизации ДНК' редиса с фрагментом н1п<ии-1 мы обнаружили отдельные фрагменты для ДНК сортов и некоторых линий редиса. Дпя других линий гибри-дачациоигай ответ нэ наблюдали (рис.З). Однако, при использовании как зонда другого фрагмента Т-ДНК - н1п<Ш1-22а (рис.1), оказалось, что и с ним гяоридизуются тэ же фрагменты ДНК редиса, что и с шпс1111-1. В качество одного из объяснений этого № предположили, что данные фрапленты ДНК редиса была гомологичны нэ Т-ДНК, а векторной плазмиди рВЯЭ22, от которой не удаятся

"" I - опухолевая линия JIB-269,

2 - безопух. линия ЛС-43/51,

3 - контроль - асептические опухоли, индуцированные на проростках редиса,

, 4 - сорт Сакса, . 5 - сорт Сакса, I. б - сорт Вировский белый. 'I - 3, 5, 6 - переваривание рестриктазой Pst i. 4 - Hind III.

С фрагментом Т-ДИК Hindlll-l.

полностью освободиться при выделении рестрицированных фрагментов нлазмиды после разделения в агарозном геле.

Чтобы дать более четкий ответ на вопрос о наличии в геноме редиса последовательностей, гомологичных ргшзпг. и отличить кх от последовательностей, гомологичных Т-ДНК (если таковые имеются), мы рестрицировали не по 10 мкг каждой пробы, а по 20 мкг. Пробу делили на две аликвоты и в половину лунок в голе наносили по 10 мкг ДНК каждой пробы, а затем, во вторую половину лунок, еще по 10 мкг ДНК в том же порядке. Таким образом, после разделения ДНК на одном геле мы получали две одинаковых картины форе-за и затем переносили их на два фильтра. Один из этих фильтров гибридизоввли с pBR322, а другой - с участками Т-ДНК.

В таком варианте гибридизации нам удалось показать, что геном редиса действительно включает последовательности, гомологичные пль миде pBR322 (рис.4а). Более того, при использовании в качестве пробы фрагмента nindiii-г оказалось, что, креме фрагментов, гибридазуицихся с рвнэгг. в ДНК двух из трех инбредных линий редиса имеется крупный фрагмент, гибридизугацийся только с этой пробой (рис.46). Следовательно, мы можем сделать предположение, что геном по крайней мере некоторых инбредных линий редиса содержит последовательности, гомологичные pbr322 и Т-ДНК л.tumefaciene. Окончательное доказательство наличия последовательностей в геноме, гомологичных определенным фрагментам, можно

г к-

4 А. 1 ■,

ТПО

2,3

ТПО

i

' Г 2 " Ü 4 5 6 Рис.3. Гибридизация ДНК редиса

тпо

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис.4. Гибридизация ДНК инбредных линий редиса с последовательностями рвпз22 (слева) и фрагментом Т-ДИК ншйпм (справа).

1 - Асептическая ткань корончатого галла табака.

2 - илбредная линия ЛВ-342.

3 - инбреднзя лития ЛВ-269.

4 - инбредная лишм ЛВ-53.

получить после их клонирования, секвенирования и сравнения нуклеотидных последовательностей.

ВЫВОВД

1. Получены опухолевые культуры тканей табака, а такие трансгенные культуры тканей и растений табака, различающиеся содержанием онкогенов Т-ДНК и, следовательно, уровнем эндогенных ауксинов и цитокининов.

2. Показано, что направление диффоренцировки траисгенных тканей зависит от сочетания эндогенных и экзогенных фато-гормонов.

3. Изучена изменчивость опухолевых и неопухолевых линий редиса при эксплантировании органов асептических растений на 20 вариантов сред с различным содержанием фитогормонов. Показано, что длительно кассируемые ткани редиса можно получить только на средах, содержащих синтетический ауксин 2,4- Д. Обнаружен эффект ослабления действия цитокининов на фоне высоких концентрация 2,4-Д.

4. Проанализировано содержание нопалина и октопина в 21

спонтанной опухоли шести инбредных линий редиса. Показано, что такие опухоли возника'от не за счет заражения редиса нопалиповыми ИЛИ ОКТОПИНЭШМИ штаммами A. '.umef aciens.

5. Изучена возможность получения агробактериальных опухолей in vitro Iis прорсстнвх, оргачех и тканях редиса. Опухоли на асептических проростках редиса, возникающие вследствие заражения, не способны к дальнейшему культивированию in vitro. С использованием 7 модификаций метода трансформации эксплактиро-ванных органов родаса не удалось получить .трансформированные ткани редиса, растущие in vitro.

6. Проведана молекулярная гибридизация ДНК различных инбредных л/цпй редиса с фрагментами Т-ДНК Ti-плазмиды A.tumefaciens, Предполагается наличке в генома редиса нуклеотид-ннх последовательностей, гомологичных Т-ДН1С.

7. Показано, что геном редиса и табака включает последовз-тельности, гибридизуюдаэся с широко используемой векторной плззмидой рзкззг.

СПИСОК РАБОТ. ОЛУШКОВАтт ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Лутоеа Л.Л., ¡йшкова С.О., Бузовкипа И.С. Зависимость роста клеточных штаммов редиса от гормонального статуса исходных генотипов // Есесоизная конференция по генетике соматических клеток в кульгуре, Звенигород, 19-22 октября IS86 г.: Тез. докл.

- Москва, 1986, С.28-29.

Лутова Л.А., Верзина и.И., Бузовкина И.О., Шишкова С.О. Регенерация почек из тканей инбредных линий редиса // Респ. конференция Томатная и зиготная селекция растений" : Тез. докл.

- Кишинев : Штиница, 1987, C.I67-I68.

3. Шишкова С.О. Изучение природы опухолесбразования у инбредных линий редиса // У съезд ВОГиС им. Н.И.Вавилова : Тез. докл. - М., 1937. - Т.4, 4.4. - С.ЗОЗ.

4. Шишкова С.О., Лутова Л.А. Нухлеотидаые посследователь-НОСТИ, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium tumeiacieri:3. В Геноме редиса // Доклад АН СССР. - 1988. - Т.ЗОЗ. - С. 226-228.

б.Шишкова С.О. Изучение природы опухолеобразования у инбредных линий редиса: Опухоли не содержат нопалин или октопин // Вторая конференция молодых ботаников Ленинграда. - Ленинград,

1988. - С. 74-83.

6. Lutova L.A.. Busovkina 1.3., Shishkova S.O. The rela-; tionehip between tumor formation and in vitro differentiation type of radiBh inbred lines // EtJCARPIA Cruciferae Newsletters. -1988. - N 13. - P.97.

7. Шишкова C.O. Корончатогалловые опухоли растений и их возбудители: теоретические и прикладные аспекты проблемы экспрессии чужеродных генов в растительных клэтках (обзор) // Сельскохозяйственная биология. - 1989. - к I. - С.42-50.

8. Shishkova 8.0. Root-crop tumors of inbred radish plants // Plant metabolism regulation. Proceedings of the Vth international youth sympoolum. Varna. Bulgaria, В-1Э Oct. 1990 : -Sofia. 1991. - P. 172-175.