Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа"

На правах рукописи УДК 575.11.1:599.323.4

Закеева Ирина Рафаиловна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НЕКАНОНИЧЕСКОЙ МОЛЕКУЛЫ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ЧЕЛОВЕКА НЬА-Е В РЕГУЛЯЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2006

Работа выполнена в лаборатории генной терапии Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Сергей Сергеевич Ларин Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лидия Павловна Сащенко доктор биологических наук, профессор Сергей Михайлович Деев

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУВПО РГМУ Росздрава)

Защита состоится « 22 » декабря 2006 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова 32

Автореферат разослан « ■ ноября 2006 года

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время наблюдается значительный рост числа онкологических заболеваний. Несмотря на разработку многочисленных современных подходов в терапии опухолей, раковые заболевания до сих пор занимают верхние строки в мировом списке причин смерти. Большинство нехирургических методов лечения, таких как лучевая и химиотерапия, направлены на уничтожение трансформированных клеток, однако при этом страдают нормальные клетки, что вызывает множество побочных эффектов и сильно ограничивает их применение в клинике. Использование возможностей иммунной системы для лечения онкологических заболеваний позволяет избежать потерь со стороны здоровых клеток.

За последнее десятилетие был совершен прорыв в области изучения молекулярной онкоиммунологии, который послужил толчком к разработке многочисленных иммунотерапевтических методов борьбы с трансформированными клетками. Однако иммунотерапия не всегда даёт положительные результаты при внедрении в клиническую практику. Одним из возможных объяснений данного феномена является ускользание опухолевых клеток от иммунного надзора или индукция трансформированными клетками толерантности опухолеспецифических лимфоцитов.

Описано несколько механизмов, благодаря которым опухоли могут избегать иммунологического надзора: возникновение вариантов раковых клеток с утерей антигенов (Urban J. et al., 1989), локальная экспрессия ингибиторных молекул, таких как трансформирующий фактор роста (TGF-ß) (Torre-Amione G. et al., 1990) и Fas лиганд (Hahne M. et al., 1996), снижение уровня процессинга и презентации антигенов (Restifo N. et al., 1991), а также потеря молекул МНС на клеточной поверхности (Haywood G. et al., 1971). Казалось бы, в случае снижения или полного исчезновения молекул МНС на поверхности, опухолевые клетки с одной стороны избегают лизиса цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), но с другой стороны становятся идеальными мишенями для естественных киллерных клеток (NK). Однако было показано, что большинство подобных клеток не чувствительны к NK клеточной цитотоксичности, то есть существует дополнительный, не выявленный ранее механизм ускользания опухолевых

клеток от иммунологического надзора. Возможно, что одним из механизмов может быть использование трансформированными клетками ингибиторных сигнальных путей ЫК и СТЬ клеток. Считается, что связывание ингибиторных рецепторов на поверхности СТЬ с соответствующими лигандами, представленными на поверхности клеток-мишеней, может подавлять эффекторные функции лимфоцитов (Ье1Ь80П Р. е1 а1., 2004). Ряд человеческих ингибиторных рецепторов, распознающих молекулы МЫС, включает в себя иммуноглобулиноподобные рецепторы киллерных клеток, узнающие классические молекулы МНС класса 1а (НЬА-А,-В,-С) и молекулу НЬА-в, а также рецепторы лектинового семейства N1(02, распознающие неканоническую молекулу НЬА-Е.

В 1998 году группа исследователей определила, что НЬА-Е является основным лигапдом гетеромерпой молекулы С094/ЫК02А - ингибиторного рецептора большинства ЫК клеток и уо Т-клеток, а также значительной части ар С08+ Т-лимфоцитов (Вгаис! V. е1 а1., 1998). А в работе М. ТЛЬгесМ и коллег было продемонстрировано использование цитомегаловирусом ингибиторной функции молекулы НЬА-Е для предотвращения лизиса инфицированных клеток ТЖ клетками, путём предоставления мимикрирующего лидерную последовательность НЬА-С нанопептида (1ЛЬгесЬ1 М. е1 а1., 2000). Таким образом, существует гипотеза о том, что раковые клетки со сниженным уровнем МНС класса 1а могут увеличивать выход на поверхность неканонических молекул МПС, чтобы избежать как СТЬ, так и МК клеточной цитотоксичности.

Цель и задачи исследования

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования являлось изучение возможной роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека НЬА-Е в регуляции противоопухолевого иммунного ответа. Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить уровень экспрессии молекулы НЬА-Е в клеточных линиях мелапомы человека.

2. Оценить уровень представления молекулы НЬА-Е на поверхности опухолевых клеток.

3. Исследовать влияние факторов опухолевого микроокружения на экспрессию и представленность на клеточной поверхности молекул HLA-E.

4. Изучить влияние экспрессии молекулы HLA-E на цитотоксичность NK клеток в отношении клеток меланомы.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящей работе с использованием методов ПЦР в реальном времени, иммуноблот-анализа и проточной цитометрии показана экспрессия неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости класса lb HLA-E в клетках меланомы человека. Продемонстрировано дозозависимое INF-у-индуцированное увеличение экспрессии белка HLA-E, приводящее к выходу молекулы на клеточную поверхность. Обнаружено, что стимулирование INF-y выхода на поверхность клеток неканонической молекулы HLA-E зависит от эффективного процесса генерирования пептидов клеточным аппаратом деградации белков — протеасомой. Впервые продемонстрировано, что присутствие неканонической молекулы HLA-E на поверхности клеток-мишеней приводит к защите последних от NK-клеточпой цитотоксичности, то есть, получено экспериментальное подтверждение функциональной значимости молекулы HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа. Полученные результаты могут быть использованы для улучшения эффективности иммунотерапевтических методов лечения опухолевых заболеваний.

Апробация работы

Работа была апробирована на совместном семинаре лаборатории генной терапии и лаборатории онкогенетики ИБГ РАН. Данные, представленные в работе, докладывались на конференциях: International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, 2006); Cancer immunotherapy (New York, USA, 2006).

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их

5

обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиография включает в себя 168 источников. Работа проиллюстрирована 9 рисунками и 3 таблицами.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в б печатных работах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспрессия мРНК молекулы HLA-E в клетках мела номы человека

С помощью ПЦР в реальном времени мы проанализировали уровень транскрипции мРНК молекулы HLA-E, а также генов тяжелой цепи молекул МНС 1а класса - HLA-A, HLA-B и IILA-C, по сравнению с контрольными генами: ß2-микроглобулином, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназой (GAPDH) и ß-актином - в образцах меланомных линий человека, полученных из биопсийного материала пациентов, и ряде широко используемых клеточных линий (Рис.1). Как видно, уровень р2-микроглобулииа был стабилен и в среднем превышал уровень суммарной мРНК генов тяжелых цепей МНС I класса в 2 раза во всех меланомных линиях, за исключением клеточной линии Mel Kor, в которой мРНК р2-микроглобулина обнаружено не было. Что касается гена HLA-E, то его мРНК присутствовала во всех исследуемых клеточных линиях в количестве сравнимом, а иногда даже превышающем, суммарный уровень экспрессии генов тяжелых цепей классических HLA-A, -В и -С. Таким образом, транскрипт молекулы HLA-E не только был обнаружен во всех исследуемых меланомных линиях, но и присутствует в клетках в достаточном количестве для синтеза белкового продукта.

До настоящего момента существовала гипотеза о конкуренции между тяжелыми цепями молекул MIIC 1а класса и HLA-E за свободный р2-микроглобулин (Marin R. et al., 2003). Однако в наших экспериментах мы обнаружили, что мРНК р2-микроглобулина в исследуемых образцах превалирует над общим количеством мРНК тяжйлых цепей HLA, то есть, если предположить одновременное связывание всех молекул главного комплекса гистосовместимости 1 класса с р2-микроглобулином, то 6

всегда будут оставаться свободные молекулы последнего. Таким образом, взаимодействие молекул семейства НЬА с (52-микроглобулином, скорее всего, не лимитирует синтез и мембранный трафик белка НЬА-Е.

j И HLA-C 1

^уявудрти

вва

г®

рп

1

вша

р

а

Г

квш

рил

Ошв

Ь

(S3

ta

j □ HLA-E [

0.5 0.0

Рис. 1. Сравнительный анализ экспрессии мРНК генов МНС I класса и р^-микроглобулина. Данные ПЦР в реальном времени нормированы по GAPDH. По оси абсцисс отложена относительная доля каждого из пяти исследуемых генов (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, ß2-микроглобулин), за единицу принята сумма этих генов. По оси ординат - клеточные линии.

Анализ присутствия белка HLA-E в клетках меланомы человека

Обнаружив на предыдущем этапе достаточный уровень транскрипта HLA-E, мы получили важные предпосылки для поиска белкового продукта гена HLA-E в клетках меланомы. С помощью иммуноблотинга мы проанализировали наличие белка HLA-E в лизатах клеток меланомы, а также широко используемых опухолевых линиях из коллекции АТСС (Рис. 2). Во всех анализируемых линиях нами был обнаружен белок, молекулярной массой в 43кДа, соответствующий полноразмерному белку HLA-E. Однако количество белка варьировало в клетках различных линий. Так, в клеточной линии Mel Kor было обнаружено крайне низкое, практически следовое количество белка, клеточные линии Mel 226, Mel R, Mel Cher и Mel 82 можно отнести к группе с небольшим уровнем экспрессии, тогда как в остальных линиях присутствовало значительное количество белка HLA-E.

Полученные нами результаты расходятся с данными, опубликованными ранее группой Ра1ш1запо в. е1 а1. (2005), в работе которых было показано крайне ограниченное присутствие белка НЬА-Е в клетках меланомы. Для того чтобы выяснить причину несоответствий, мы оценили уровень экспрессии молекулы НЬА-Е в известных линиях опухолевых клеток из коллекции АТСС, которые частично также были проанализированы в цитируемой работе. Белок был обнаружен во всех клеточных линиях, кроме К562 и МСР-7, включая линии С-ЗЗа и НеЬа, ранее считавшиеся негативными по НЬА-Е. Полученные данные указывают на то, что в наших экспериментах чувствительность метода иммуноблот-анализа была выше, что позволило нам получить более достоверные и точные результаты.

г—

£ = ^ £ <§ I £ ™ £

^аЗ $ СС <7 ^ ш О

Ь- 2 <С О Ш ^

Рис. 2. Анализ экспрессии белка НЬА-Е в лизатах клеточных линий меланомы человека методом иммуноблотинга

Наши результаты коррелируют с последними данными, опубликованными французскими коллегами, которым также удалось показать присутствие полноразмерной молекулы НЬА-Е в ряде клеточных линий меланомы человека (Оегге Ь. й а1., 2006). Таким образом, белок НЬА-Е присутствовал в исследуемых образцах, однако разброс в количестве белка в индивидуальных линиях указывает на вероятную регуляцию экспрессии молекулы на уровне белкового синтеза. 8

Поверхностная локализация молекул HLA-E в клетках меланомы человека

Поскольку молекула HLA-E может выполнять ингибиторную функцию только при её поверхностной локализации на клетке, то важно знать, что происходит с локализацией белка на поверхности клеток.

Методом проточной цитометрии мы проанализировали наличие белка HLA-E на клеточной поверхности 15 линий меланомы человека с использованием моноклональных антител 3D12 к нативному белку HLA-E (Рис, 3). Также нас интересовала суммарная презентация канонических молекул комплекса гистосовместимости на поверхности исследуемых клеток, так как мы пытались найти взаимосвязь между изменением уровня МНС класса 1а и локализацией молекулы HLA-E на поверхности. Для этого мы параллельно окрашивали образцы клеток антителами к суммарному HLA-ABC (клон ICO-53). Полученные данные позволили разделить тестируемые линии на три категории. К первой группе относятся линии, которые имеют на своей поверхности молекулы как МНС 1а класса, так и HLA-E - это Mel Si, Mel 82, Mel 263, Mel Kis. Ко второй, и наиболее многочисленной, группе относятся опухоли, экспрессирующие исключительно классические молекулы МНС (HLA-A, -В, -С) - Mel И, Mel Р, Mel 311, Mel 259, Mel Cher, Mel Ibr, Mel MTP, Mel 226, Mel E, Mel R. Единственным представителем третьей группы, к которым относятся линии на которых не было детектировано ни одной молекулы-представителя I класса комплекса гистосовместимости, была линия Mel Kor. Этот результат вполне объясним, так как клетки Mel Kor не содержат мРНК р2-микроглобулина, без которого не происходит сборки молекул HLA, а, следовательно, нарушается и их выход на поверхность клетки.

Несколько неожиданным результатом было отсутствие HLA-E на таких

меланомных клетках, как Mel II и Mel 311, так как по данным иммуноблот-анализа в них

был зафиксирован высокий уровень белка HLA-E, значительное преобладание

экспрессии гена р2-микроглобулина над суммарным уровнем тяжелых цепей МНС I

класса, а также достаточное количество HLA-A и HLA-C молекул, лидерные

последовательности которых необходимы HLA-E в качестве основных источников

антигенных нанопептидов. Другими словами, данные клеточные линии обладали всеми

необходимыми компонентами для выхода белка на поверхность. Мы предположили

существование аллельных вариаций в лидерных пептидах молекул МНС 1а класса в

9

исследуемых линиях, которые бы приводили к образованию неправильных, то есть неспособных к связыванию с HLA-E, пептидов. Однако, после скринирования человеческой базы данных молекул гистосовместимости (Robinson J. et al., 2003), мы не обнаружили аномальных вариаций в лидерных последовательностях HLA-A в анализируемых линиях. Таким образом, вероятно, существует какой-то неизвестный механизм, препятствующий транспорту белка HLA-E на поверхность клеток.

Рис. 3. Анализ локализации белка Ш-А-П на поверхности клеток меланомы человека методом проточной цитометрии. На рисунке представлены гистограммы количества клеток (ось ординат) в зависимости от интенсивности окрашивания (ось абсцисс). ___НЬА-АВС _1ГЬА-Е иДиотипиче(;кий контроль

С другой стороны, мы так и не обнаружили клеточных линий, в которых наблюдалось бы одновременное снижение уровня молекул МНС 1а класса на фоне увеличения белка HLA-E на поверхности. Возможно, это связано с тем, что в организме в момент контакта с лимфоцитами клетки опухоли находятся под воздействием многих факторов микроокружения, и в первую очередь цитокинов. Так, большинство процессов клеточной цитотоксичности сопровождается секрецией INF-y, то есть во время иммунного ответа клетки опухоли находятся под постоянным воздействием этого цитокина. Соответственно, следующим логическим шагом в нашем исследовании стало изучение влияния INF-y на экспрессию и локализацию молекул HLA-E.

Экспрессия HLA-E в клетках меланомы человека под действием INF-y

INF-y является одним из главных цитокинов, секретируемых цитотоксическими клетками в очагах лизиса клеток-мишеней. Известно, что INF-y вызывает индукцию молекул главного комплекса гистосовместимости человека как I, так и II класса, как часть защитного иммунного механизма, и его присутствие может влиять на статус клеток. Элементы, отвечающие на воздействие INF-y, были обнаружены в промоторной области гена HLA-E, а дистально от элементов также был идентифицирован энхансер к этим последовательностям (Barrett D. et al., 2004). Таким образом, для воссоздания условий, в которых находятся опухолевые клетки во время иммунного ответа, мы обрабатывали исследуемые образцы различными концентрациями INF-y.

Клеточные линии меланомы человека культивировали 48 часов в присутствии в среде различных доз INF-y. После чего анализировали уровень мРНК HLA-E с помощью ПЦР в реальном времени и количество полноразмерного белка методом иммуноблотинга (Рис. 4). На рисунке 4Б представлены средние значения изменения уровня мРНК в клеточных линиях меланомы человека под действием INF-y. Уровень мРНК генов, контролирующих гомеостаз, таких как GAPDH и ß-актин, оставался прежним после воздействия INF-y. Под влиянием цитокина мы наблюдали увеличение уровня мРНК р2-микроглобулина, а также тяжёлых цепей IILA I класса. Для молекул HLA-A и HLA-C увеличение было в среднем меньше такового значения для мРНК ß2-микроглобулина и составило в 2.2 и 3.5 раза соответственно, тогда как количество мРНК HLA-B выросло после воздействия цитокина в 5 раз. Однако наиболее

11

значительные изменения уровня экспрессии мы получили именно для мРНК неканонической молекулы первого класса гистосовместимости НЬА-Е. Во всех клеточных линиях наблюдали резкое увеличение, в среднем в 5.5 раз, в количестве мРНК НЬА-Е после воздействия на клетки ЮТ-у. Таким образом, мы подтвердили, что воздействие ШР-у на синтез матричной РНК человеческого лейкоцитарного антигена Е происходит именно на уровне транскрипции за счйт регуляторных элементов промоториой и дисталыюй промоторной зоны гена НЬА-Е.

Ме1 259 Ме1 Р Ме1 Е Ме11Ьг Ме! 311

1РЫ

+ - +

Ме! МТР

+ - +

Ме! Б)

1 10 100

^ -

1 10 100

<ЗАГОН Ь2-тсго Ь-асВп Н1А-А Н1А-В ША-С НА-Е

Рис. 4. Экспрессия НЬА-Е в клетках меланомы человека под действием ШИ-у. А. Иммуноблот-анализ клеточных лизатов меланом до и после добавления 1ЫР-у, влияние различных доз ЮТ-у на уровень белка НЬА-Е в клетках меланомы человека. Б. Изменение уровня экспрессии мРНК генов МНС I класса, Рг-микроглобулина, вАРОН и р-актииа под действием ЮТ-у. Данные ПЦР в реальном времени представлены в виде средних значений для пяти клеточных линий меланомы человека, за единицу приняты значения мРНК до индукции ЮТ-у, по оси абсцисс отложены исследуемые гены, по оси ординат — кратное изменение уровня мРНК соответствующих генов в клетках меланомы человека под действием ШР-у.

По результатам иммунноблот-анализа нами также было продемонстрировано изменение в количестве синтезируемого белка. Для большинства исследуемых клеточных линий меланомы человека было показано увеличение количества полноразмерной молекулы HLA-E под действием цитокина INF-y, и воздействие носило дозозависимый характер (Рис. 4, А). Из полученных данных можно вывести интересную закономерность: в клеточных линиях с изначально высоким уровнем базальной (т.е. до обработки клеток INF-y) экспрессии, как, например в меланомных клетках линий Mel Ibr, индукция цитокином не была ярко выраженной, а в клеточных линиях с низкой базальной экспрессией, как, например Mel 259 и Mel Р, индукция достигала соизмеримого с первой группой меланом уровня. Таким образом, можно сказать, что после воздействия INF-y происходило своеобразное выравнивание по количеству белка HLA-E в клетках меланомы человека.

Таким образом, можно предположить, что в реальных условиях in vivo уровень защиты опухолевых клеток молекулой HLA-E зависит от локального присутствия INF-y и процесс, скорее всего, является дозозависимым.

INF-y стимулирует транспорт молекул HLA-E на клеточную мембрану

Как уже говорилось выше, для регуляции противоопухолевого иммунного ответа и ингибирования функций лимфоцитов важна поверхностная локализация молекулы HLA-E. Особый интерес представляют клеточные линии, в которых данный белок имеется внутри клеток, но по каким-то причинам отсутствует на поверхности. Вероятно, что в условиях модуляции микроокружения может происходить выход молекул HLA-E на поверхность опухолевых клеток. Увеличение количества полноразмерного белка в клетках меланомы человека под воздействием INF-y является важной предпосылкой для INF-y индуцированного, HLA-E опосредованного механизма ускользания опухолевых клеток от иммунологического надзора, однако наибольший интерес к молекуле в нашем исследовании проистекает именно в области функционирования HLA-E на поверхности клеток в качестве лиганда к ингибиторным рецепторам цитотоксических клеток. Поэтому следующим этапом исследования было изучение выхода на клеточную поверхность комплекса HLA-E в присутствии INF-y.

В культуральную среду к клеткам меланомы in vitro добавляли рекомбинантный человеческий INF-y до конечной концентрации 100 нг в мл. Также как и в экспериментах по локализации белка на клеточной поверхности в покоящихся клетках, клетки окрашивали моноклональными антителами 3D12 к нативному белку HLA-E, а также антителами к суммарному HLA-ABC, и проводили сравнительный анализ методом проточной цитометрии до и после обработки INF-y.

На рисунке 5 представлены результаты анализа методом проточной цитометрии присутствия молекул HLA-ABC и HLA-E на поверхности клеточных линий меланомы

- Н1_А-Е — Н1.А-АВС ---Н1_А-Е - Н1_А-АВС

ЖГ-у "+" ЮТ-у

Рис. 5. Анализ присутствия молекул НЬА-А,-В,-С и НЬА-Е на поверхности клеточных линий меланомы человека после воздействия ШБ-у методом проточной цитометрии. На рисунке представлены гистограммы количества клеток (ось ординат) в зависимости от интенсивности окрашивания (ось абсцисс).

человека после воздействия INF-y. Видно, что под действием цитокина не происходит существенного увеличения количества мембраноассоциированных молекул МНС 1а класса - единственной линией, в которой наблюдается небольшое повышение плотности HLA-ABC на поверхности, была линия Mel Ibr. На самом деле, мы скорее наблюдали обратный эффект - заметный сдвиг пика в сторону уменьшения поверхностной фракции молекул данного класса.

Наоборот, концентрация молекул HLA-E на клеточной поверхности всех исследуемых клеток меланомы человека увеличивалась, за исключением клеточной линии Mel Kor, особенности которой мы уже обсуждали ранее, а именно - отсутствие молекул р2-микроглобулина и, как следствие, отсутствие МНС экспрессии. Удивительно, что в клеточных линиях, в которых белок HLA-E отсутствовал на поверхности, но был в цитоплазме клеток в обычных условиях, после стимуляции цитокином обнаружилось значимое количество молекул HLA-E на поверхности клеток. Четыре клеточные линии, у которых изначально была обнаружена мембранная локализация HLA-E, после индукции INF-y увеличивали плотность HLA-E на поверхности в 3 раза.

Таким образом, под воздействием INF-y большинство клеток меланомных линий человека начинают презентовать на своей поверхности детектируемое количество неканонических молекул главного комплекса гистосовместимости HLA-E, что указывает на возможность последних защищать опухолевые клетки от лизиса цитотоксичсскими клетками путем взаимодействия с соответствующими ингибиторными рецепторами, например, HaNK клетках.

Участие протеасомной деградации белков в INF-y стимулированной презентации молекул HLA-E на поверхности клеток

Последние эксперименты выявили прямую связь между стимуляцией клеток INF-y и увеличением мРНК, зрелого белка, а также выходом на поверхность молекул HLA-E. Полученные результаты указывают на то, что физическое увеличение внутриклеточного белка могло стать причиной его появления на клеточной поверхности. Однако известно, что INF-y также может индуцировать транскрипцию ряда факторов, участвующих в протеасомной деградации белков.

Протеасома представляет собой большой многосубъединичный комплекс белков, который в ядре и в цитоплазме осуществляет селективную деградацию белков и является центральным компонентом в каскаде протеолитической обработки белков необходимых для формирования антигенных пептидов, презентируемых молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости на поверхности клеток (Рис. 6).

Рис. 6. Процессирование антигенов для презентации классическими молекулами главного комплекса гистосовместимости I класса. Большинство пептидов для классических молекул МНС I класса образуются из белков в цитоплазме клетки в процессе их деградации по убиквитин-протеасомному пути. Антигенные пептиды, образуемые протеасомой либо уже правильного размера, либо удлинённые с N-конца. Дальнейшая подгонка происходит с помощью дополнительной обработки аминопептидазами в цитоплазме или в просвете ЭПР. Пептиды транспортируются в просвет эндоплазматического ретикулума (ЭПР) с помощью белка, ассоциированного с транспортом антигенов (ТАР, от анг. Transport associated with antigen processing), и в конечном итоге загружаются во вновь синтезированные молекулы МНС I класса с последующим транспортом на клеточную поверхность.

Иногда, для обеспечения более эффективного процессинга антигенов, клетка может замещать некоторые из своих протеасомных субъединиц более подходящими субъединицами, образуя так называемую иммунопротеасому. Было показано образование иммунопротеасомы под воздействием INF-y во время вирусной инфекции. INF-y индуцирует замещение трёх каталитических р субъединиц - рь р2, ps - на соответствующие иммунопротеасомные субъединицы - р,„ p2l, Р*, более известные как белки LMP2 (от анг. low-molecular-weight protein 2), MECL1 (от анг. multicatalytic

цшцс I кенмпкп \/Х | | 1 гч пептидов р4—~\~ — 2ч— ______. к

шапероны

МНС I класса

endopeptidase complex-like-1) и LMP7, соответственно. Считается, что подобная замена 16

позволяет варьировать расщепление полипептидной цепи. Также, INF-y влияет на синтез ряда цитоплазматических аминопептидаз, участвующих в "подгонке" пептидов после 26S гидролиза для последующей загрузки их уже в ЭПР в пептидсвязывающие карманы тяжёлых цепей МНС.

Логично предположить, что существует связь между индукцией INF-y усиления протеасомной деградации белков, которая бы обеспечивала тяжёлую цепь HLA-E пептидами, стабилизирующими молекулу на клеточной поверхности. Для ответа на поставленный вопрос мы ингибировали протеасомную деградацию белков с применением традиционных ингибиторов протеасом. В качестве ингибитора протеасом мы использовали ингибитор калпаина I типа и лактацистина - ALLN. ALLN добавляли к обработанным и необработанным IFN-y культивируемым in vitro клеткам и инкубировали в течение 12 часов с последующим анализом клеток на предмет экспрессии молекул МНС I класса методом проточной цитометрии (Рис. 7).

- IFN + IFN

FL1-H FL1-H

Рис. 7. Анализ экспрессии молекул HLA-A,-B,-C и HLA-E на клеточной поверхности в присутствии INF-y и ингибитора протеасом ALLN на примере клеточной линии меланомы человека Mel Р. На рисунке представлены гистограммы количества клеток (ось ординат) в зависимости от интенсивности окрашивания (ось абсцисс). Жирной линией обозначено окрашивание антителами к суммарному HLA-ABC, тонкой линией — окраска антителами к IILA-E (3D 12), серый пик — идиотипический контроль.

Из полученных результатов видно, что добавление ALLN к кондиционной среде полностью отменяло способность IFN-y стимулировать выход HLA-E на клеточную поверхность, при этом внутриклеточная концентрация белка по результатам иммуноблот-анализа не менялась. Таким образом, усиление протеасомной деградации белков IFN-y приводит к генерированию пептидов для HLA-E, что, вероятно, стимулирует выход на поверхность неканонической молекулы HLA-E.

Ранее, группой исследователей во главе с Veronique Braud было продемонстрировано, что для формирования функционального пептида, способного связываться с молекулой HLA-E, необходимо сначала отщепление с помощью сигнальной пептидазы сигнальной последовательности классических молекул МНС I класса и неканонической молекулы HLA-G с последующим внутримембранным расщеплением аспарагиновой протеиназой, которая носит название пептидаза сигнального пептида (SSP, от анг. signa] peptide peptidase) (Lemberg et al., 2001). Участие же протеасомы в расщеплении сигнального пептида от классических молекул МНС I класса и молекулы HLA-G с одной стороны не очень понятно, так как было показано, что протсасома с больщим трудом расщепляет короткие пептиды и в основном специализируется на полноразмерных и удлинённых полипептидных цепях. С другой стороны, если вспомнить, что протеасома при генерировании антигенных пепетидов для классических молекул МНС I класса формирует как раз правильные С-концевые пептиды, но удлиненные на N-конце, тогда как сигнальная пептидаза и SSP формируют удлинённые именно с С-конца пептиды, то участие 26S протеасомы как раз объяснимо.

Таким образом, формирование правильного пептида для закладки в пептид-связывающую борозду HLÀ-E происходит, вероятно, в несколько стадий — сначала происходит формирование правильного N-конца с помощью сигнальных пептидаз, а на второй стадии с помощью протеасомы происходит подгонка пептида с С-конца. Возможно, что такой непростой механизм генерирования антигенного пептида для HLA-E прежде всего связан с несовершенством клеточной системы протеаз, которые в силу узнавания определённых аминокислотных последовательностей, т.е. своеобразной "специализации", не могут производить одновременное расщепление в случае несоответствия сайтов. Не стоит также забывать о нестабильности пептидов в цитоплазме клеток: возможно захват протеасомой сигнальных пептидов после 18

расщепления SSP носит не только функциональный характер в формировании правильного С-конца пептида, но также и защитную функцию. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные флуоресцентной микроскопии о локализации 26S протеасомы в цитоплазме клеток близко к поверхности эндоплазматического ретикулума (Reitz Е. et al., 1997). То есть в свете полученных исследователями результатов можно представить, что после расщепления лидерной последовательности SSP может происходить прямая поставка пептида протеасоме, в отсутствие воздействия цитоплазматических протеаз. Однако попытки найти белки, взаимодействующие с субъединицами 26S на поверхности ЭПР, пока не увенчались успехом, и гипотеза остаётся всего лишь предположением.

Выход молекулы HLA-E на поверхность клеток под действием INF-y защищает клетки меланомы человека от цитотоксического действия лимфоцитов

Нам удалось показать наличие белка HLA-E в клетках линий меланомы человека, его поверхностную локализацию и индукцию экспрессии IFN-y. Однако до момента демонстрации функциональной значимости молекулы HLA-E в противоопухолевом иммунном ответе наша гипотеза остается всего лишь гипотезой. Соответственно, следующим этапом исследования стало выявление функциональной активности молекул HLA-E на поверхности опухолевых клеток. Ранее Michaelsson J. с коллегами показали, что положительные по NKG2 рецепторам и отрицательные по KIR рецепторам NK-клетки клеточной линии NKL способны лизировать только клетки не несущие молекулу HLA-E на своей поверхности, а клетки с молекулой HLA-E были не чувствительны к цитотоксическому действию NKL клеток (Michaelsson J et al., 2002).

В нашем случае, мы протестировали клетки линии Mel Si, которые постоянно экспрессируют HLA-E на клеточной поверхности, Mel Р, которые экспрессируют молекулу HLA-E на клеточной поверхности только в условиях индукции IFN-y, а также клеточную линию Mel Ког, у которой полностью отсутствуют молекулы МНС I класса на поверхности (Рис. 8).

соотношение клетки-мишени : цитотоксические клетки

Рис. 8. Анализ уровня цитотоксичности NKL клеток в отношении клеток меланомы человека, экспрессирующих различное количество молекул HLA-E на клеточной поверхности. По оси абсцисс отложены используемые соотношения NKL клеток к клеткам-мишеням, по оси ординат — процент специфически лизированных клеток. Графики с белыми кружками - данные без обработки INF-y, графики с чёрными кружками - после обработки клеток INF-y.

При анализе клеток линии Mel Si мы обнаружили, что они обладают устойчивостью к лизису NK.L даже в условиях высокого соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням. И наоборот, клеточная линия Mel Kor была чувствительна к NK-клеточному лизису независимо от обработки IFN-y.

Интересные результаты мы получили при тестировании клеточной линии Mel Р, клетки которой в покоящемся состоянии не экспрессируют HLA-E на поверхности и, соответственно, были чувствительны к лизису NKL клеткам - мы получили 45% специфически лизированных клеток при соотношении 20:1 эффекторных клеток и клеток-мишеней. Прединкубация клеток Mel Р с INF-y делала клетки устойчивыми к NK клеточному лизису, именно за счёт презентации неканонической молекулы HLA-E на поверхность клеток.

Таким образом, присутствие в норме неканонической молекулы HLA-E на клеточной поверхности, также как и индукция INF-y мембранной локализации молекулы HLA-E на поверхности опухолевых клеток, защищает клетки меланомы человека от цитотоксичности NKL клеток, несущих на своей поверхности исключительно CD94/NKG2A рецепторы. Так как большинство Т и NK клеток in vivo экспрессируют этот рецептор на своей поверхности, то очень вероятно, что опухолевые

клетки могут использовать молекулу HLA-E путём представления её на клеточной поверхности во время иммунного ответа в качестве механизма защиты от клеточно-опосредованной цитотоксичности и тем самым избегать иммунологического отторжения in vivo.

выводы

1. Показана экспрессия мРНК неканонической молекулы HLA-E во всех покоящихся клетках меланомы человека, соизмеримая с экспрессией классических молекул главного комплекса гистосовместимости человека 1а класса, а также наличие полноразмерного белкового продукта гена HLA-E в большинстве исследуемых клеточных линий меланомы человека.

2. Выход белка HLA-E на клеточную поверхность в покое происходит в 25% исследуемых линий меланомы человека.

3. Продемонстрирована дозозависимая индукция экспрессии INF-y молекул HLA-E в опухолевых клетках.

4. Показано, что выход на поверхность клеток меланомы человека молекул HLA-E увеличивается под действием INF-y и характерен для всех клеточных линий, имеющих молекулы МНС 1а касса и функциональный ß2-микроглобулин.

5. Впервые показано, что стимулирование INF-y выхода на поверхность клеток молекулы HLA-E зависит от эффективного процесса генерирования пептидов протеасомой.

6. Впервые продемонстрировано, что присутствие неканонической молекулы HLA-E на поверхности клеток-мишеней приводит к защите последних от NK-клеточной цитотоксичности, то есть, получено экспериментальное подтверждение предполагаемого механизма HLA-E опосредованного ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Бережной А.Е., Закеева И.Р., Кибардин А.В., Чернышева А.Д., Моисеенко В.М., Данилов А.О., Демидов Л.В., Барышников А.Ю., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. (2006) Анализ экспрессии молекул HLA-E в клетках меланомы человека. Российский Биотерапевтический Журнал, № 3, с. 27-35.

2. Бережной А.Е., Закеева И.Р., Кибардин А.В., Чернышева А.Д., Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. (2006) Новые мишени для противоопухолевой иммунотерапии. International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine", p. 27.

3. Berezhnoy A., Zakeyeva I., Kibardin A., Chernysheva A., Moiseyenko V., Demidov L., Danilov A., Baryshnikov A., Gnuchev N., Georgiev G., Larin S. (2006) HLA-E expression in tumor cells in context of tumor immune rejection. International Cancer Immunotherapy Symposia, p. P-07.

4. Прыжкова M.B., Закеева И.P., Кибардин А.В., Георгиев Г.П., Киселев С.Л. (2004) Использование генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток для создания трансгенных мышей. Генетика, т.40, № 3,

5. Кибардин А.В., Миркина И.И., Баранова Е.В., Закеева И.Р., Георгиев Г.П., Киселев С.Л. (2003) Анализ экспрессии белков кодируемых генами семейства tag7/tagL (PGRP-S,L) в периферических клетках крови человека. Генетика, т.39, № 2, с.244-249.

6. Kibardin AV, Mirkina II, Baranova EV, Zakeyeva IR, Georgiev GP, Kiselev SL. (2003) The differentially spliced mouse tagL gene, homolog of tag7/PGRP gene family in mammals and Drosophila, can recognize Gram-positive and Gramnegative bacterial cell wall independently of T phage lysozyme homology domain. J. Mol Biol. 326(2): p.467-474.

c.311-315.

Заказ №129/11/06 Подписано в печать 14.11.2006 Тираж 80 экз. Усл. пл. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 чО-'/1 www.cfr.ru ; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Закеева, Ирина Рафаиловна

Страница

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их роль в противоопухолевом иммунитете

1.1. Иммунотерапия онкологических заболеваний

1.1.1 Роль иммунной системы в противоопухолевой защите.

1.1.2 Использование моноклональных антител в иммунотерапии

1.1.3 Использование иммуномодуляторов для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа.

1.1.4 Противоопухолевая вакцинация.

1.2. Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их лиганды.

1.2.1. Ингибиторные рецепторы, распознающие константную

часть молекул иммуноглобулинов.

1.2.2. Ингибиторные рецепторы, распознающие молекулы главного комплекса гистосовместимости.

Иммуноглобулипоподобные рецепторы киллерпых клеток.

Рецепторы CD94/NKG2.

Рецепторы семейства Ly49.

1.2.3. Ингибиторные рецепторы, распознающие молекулы

В7 семейства.

Молекула CTLA-4.

Молекула PD-1.

Молекула BTLA

1.3. Роль ингибиторных рецепторов и их лигандов в противоопухолевом иммунитете.

1.4. Неканоническая молекула МНС lb класса HLA-E.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Ферменты и реактивы „

2.2. Клеточные линии

2.3. Электрофорез в ДСН-ПААГ и иммуноблот-анализ

2.4. Выделение тотальной РНК из клеток меланомы человека.

2.5. ПЦР в реальном времени

2.6. Проточная цитометрия

2.7. Анализ клеточной цитотоксичности.

2.8. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ экспрессии мРНК молекулы HLA-E в клетках меланомы человека

3.2. Анализ присутствия белка HLA-E в клетках меланомы человека.,

3.3. Поверхностная локализация молекул HLA-E в клетках меланомны человека.

3.4. Экспрессия HLA-E в клетках меланомы человека под действием INF-y

3.5. INF-y стимулирует транспорт молекул HLA-E на клеточную мембрану.

3.6. Участие протеасомной деградации белков в INF-y стимулированной презентации молекул HLA-E на поверхности клеток.

3.7. Выход молекулы HLA-E на поверхность клеток под действием INF-y защищает клетки меланомы от цитотоксического действия лимфоцитов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа"

В настоящее время наблюдается значительный рост числа онкологических заболеваний. Несмотря на разработку многочисленных современных подходов к терапии опухолей, раковые заболевания до сих пор занимают верхние строки в списке причин смерти в большинстве развитых стран. Большинство нехирургических методов лечения, таких как лучевая и химиотерапия, направлены на уничтожение трансформированных клеток, однако при этом страдают нормальные клетки, что вызывает множество побочных эффектов. Использование возможностей иммунной системы для лечения онкологических заболеваний позволяет избежать данных побочных эффектов.

За последнее десятилетие был совершён прорыв в области молекулярной онкоиммунологии, который послужил толчком к разработке многочисленных иммунотерапевтических методов борьбы с трансформированными клетками. Однако и иммунотерапия при внедрении в клиническую практику не всегда даёт положительных результатов [81; 128]. Одним из возможных объяснений недостаточной эффективности различных методов иммунотерапии является ускользание опухолевых клеток от иммунного надзора или индукция трансформированными клетками толерантности опухолеспецифических лимфоцитов.

Описано несколько механизмов, благодаря которым опухоли могут избегать иммунологического надзора: возникновение вариантов раковых клеток с утерей антигенов [155], локальная экспрессия ингибиторных молекул, таких как трансформирующий фактор роста (TGF-P) [151] и Fas лиганд [52], снижение уровня процессинга и презентации антигенов [123], а также потеря молекул МНС на клеточной поверхности [54]. Казалось бы, в случае снижения или полного исчезновения молекул МНС на поверхности, опухолевые клетки с одной стороны избегают лизиса цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), но с другой стороны становятся идеальными мишенями для естественных киллерных клеток (NK). Однако было показано, что подобные клетоки часто не чувствительны к NK клеточной цитотоксичности, то есть существует дополнительный, не выявленный ранее механизм ускользания опухолевых клеток от иммунологического надзора. Возможно, что одним из механизмов может быть использование трансформированными клетками ингибиторных сигнальных путей CTL и NK клеток. Считается, что связывание ингибиторных рецепторов на поверхности CTL с соответствующими лигандами представленными на поверхности клеток-мишеней может подавлять эффекторные функции лимфоцитов [86]. Ряд человеческих ингибиторных рецепторов, распознающих молекулы МНС, включает в себя иммуноглобулиноподобные рецепторы киллерных клеток, узнающие классические молекулы МНС класса la (HLA-A, HLA-B, HLA-C) и молекулу HLA-G [165], а также рецепторы лектинового семейства NKG2, распознающие неканоническую молекулу главного комплекса гистосовместимости HLA-E [16].

В 1998 году группа исследователей определила, что HLA-E является основным лигандом гетеромерной молекулы CD94/NKG2A - ингибиторного рецептора большинства NK клеток и у8 Т-клеток, а также значительной части ар Т-лимфоцитов [16; 18]. А в работе М. Ulbrecht и коллег было продемонстрировано использование цитомегаловирусом ингибиторной функции молекулы HLA-E для избежания лизиса заражённых клеток NK клетками, путём предоставления мимикрирующего лидерную последовательность HLA-C нанопептида [154]. Таким образом, существует гипотеза о том, что опухолевые клетки со сниженным уровнем МНС класса

Ia могут взамен увеличивать выход на поверхность неканонических молекул МНС, чтобы избежать как CTL, так и NK клеточной цитотоксичности [105; 134].

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования являлось изучение возможной роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи.

1. Определить уровень экспрессии молекулы HLA-E в клеточных линиях меланомы человека.

2. Оценить уровень представления молекулы на поверхности опухолевых клеток.

3. Исследовать влияние факторов опухолевого микроокружения на экспрессию и представленность на клеточной поверхности молекул HLA-E.

4. Изучить влияние экспрессии молекул HLA-E на цитотоксичность NK клеток в отношении клеток меланомы человека.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Закеева, Ирина Рафаиловна

выводы

1. Показана экспрессия мРНК неканонической молекулы HLA-E во всех покоящихся клетках меланомы человека, соизмеримая с экспрессией классических молекул главного комплекса гистосовместимости человека 1а класса, а также наличие полноразмерного белкового продукта гена HLA-E в большинстве исследуемых клеточных линий меланомы человека.

2. Выход белка HLA-E на клеточную поверхность в покое происходит в 25% исследуемых линий меланомы человека.

3. Продемонстрирована дозозависимая индукция экспрессии INF-y молекул HLA-E в опухолевых клетках.

4. Показано, что выход на поверхность клеток меланомы человека молекул HLA-E увеличивается под действием INF-y и характерен для всех клеточных линий, имеющих молекулы МНС 1а касса и функциональный Рг-микроглобулин.

5. Впервые показано, что стимулирование INF-y выхода на поверхность клеток молекулы HLA-E зависит от эффективного процесса генерирования пептидов протеасомой.

6. Впервые продемонстрировано, что присутствие неканонической молекулы HLA-E на поверхности клеток-мишеней приводит к защите последних от NK-клеточной цитотоксичности, то есть, получено экспериментальное подтверждение предполагаемого механизма HLA-E опосредованного ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе была проанализирована экспрессия неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости lb класса HLA-E в клетках меланомы человека. Было обнаружено, что мРНК гена HLA-E присутствовал во всех покоящихся клетках меланомы в количестве сопоставимом с количеством мРНК классических молекул МНС I класса. Также было обнаружено, что происходит синтез полноразмерной молекулы HLA-E в клетках меланомы. Однако в разных клеточных линиях были выявлены вариации в количестве белка. Полученные результаты указывали на возможное существование регуляции экспрессии на посттранскрипционном уровне. Ранее, в работах по изучению стабильности молекул главного комплекса гистосовместимости было продемонстрировано, что неканонические молекулы обладают более коротким временем жизни в клетках, особенно, если в клетках отсутствуют молекулы р2-микроглобулина и/или необходимые для загрузки в тяжелую цепь молекулы нанопептиды, то есть в отсутствие необходимых условий для выхода молекулы на поверхность клетки. Поскольку нарушения вышеуказанных условий мы наблюдали лишь в одной клеточной линии (Mel Ког), у которой нарушен ген р2-микроглобулина, то мы предположили присутствие молекулы на клеточной поверхности.

При исследовании локализации молекулы HLA-E на поверхности покоящихся клеток меланомы человека методом проточной цитометрии белок был обнаружен на клеточной мембране в 25% клеточных линий. Таким образом, выход на поверхность белка даже при наличии в клетке всех участников формирования мембраносвязанного комплекса HLA-E по какой-то причине не происходило. Для выявления причин подобного нарушения процесса выхода на поверхность клеток, мы решили проверить влияние микроокружения, в котором клетки опухоли находятся во время активации иммунного ответа. Нами был выбран наиболее важный участник регуляции иммунного ответа на трансформированные клетки - это цитокин INF-y. Важной предпосылкой в выборе послужило открытие ранее INF-y-регулируемых элементов в промоторной области гена HLA-E.

Анализ экспрессии и транспорта на клеточную поверхность под действием INF-y подтвердил существование регуляции экспрессии гена на уровне транскрипции - было выявлено увеличение количества мРНК HLA-E в среднем в 5.5 раз по сравнению с нестимулируемыми клетками, что приводило к выравниваю внутриклеточного белка и сопровождалось выходом молекул на поверхность клеток меланомы. Таким образом, можно было бы предположить, что улучшение транспорта белка HLA-E на поверхность происходит из-за увеличения количества тяжёлых цепей. Однако, наличие таких клеточных линий как, например, Mel МТР, в которой было обнаружено большое количество полноразмерной молекулы HLA-E при отсутствии окрашивания белка мАТ анти-HLA-E на поверхности, указывало на существование дополнительного механизма, стимулируемого присутствием рекомбинантного человеческого INF-y в культуральной среде.

Поскольку большое количество биохимических работ о свойствах белка HLA-E указывало на стабилизацию молекулы за счёт пептидов из сигнальных последовательностей классических молекул МНС I класса и неканонической молекулы HLA-G, то мы решили исследовать возможное участие INF-y в этом процессе. Известно, что большинство пептидов для классических молекул МНС 1а класса образуется из белков в цитоплазме клетки в процессе их деградации по убиквитин-протеасомному пути. При этом было показано, что INF-y способен менять качественный состав протеасомы, заменяя несколько субъединиц на INF-у-индуцибельные белки, а также индуцировать ряд протеасом-ассоциированных регуляторов. Роль индукции INF-y в протеасомном расщеплении белков до конца не изучена. Одни исследователи считают, что подобная замена приводит к формированию специфических антигенных пептидов для классических МНС, однако чёткого доказательства данного утверждения получено не было. Альтернативный механизм воздействия INF-y на формирование иммунопротеасом был предложен Peter Kloetz с коллегами в опытах по инфицированию HeLa клеток вирусом коровьей оспы со вставленным главным антигеном вируса гепатита В (HBVcAgni.isi) [136]. Авторами было показано, что для эффективного высвобождения и презентации эпитопов HBVcAgi41.15I необходима стимуляция HeLa клеток INF-y. При этом с помощью масс-спектрометрии было показано, что конститутивная 26 S протеасома также способна экспрессировать HBVcAgi4i.i51 эпитоп, однако с меньшей (на порядок) эффективностью. Таким образом, авторам удалось показать, что формирование под воздействием INF-y иммунопротеасом может быть важно не столько в плане изменения профиля получаемых пепетидов, сколько в скорости, а, соответственно, в количестве генерированных пептидов.

В данной работе нам впервые удалось показать, что в индуции INF-y транспорта на клеточную поверхность молекул HLA-E задействован механизм расщепления сигнального пептида протеасомой. При применении ингибитора протеасомной деградации белка ALLN происходило блокирование выхода на клеточную поверхность молекулы HLA-E даже в условиях стимуляции INF-y. Значит, INF-y стимулирует выход белка HLA-E на поверхность клетки не только путём увеличения количества молекул HLA-E в клетке, но также способен действовать на уровне обеспечения необходимыми пептидами, то есть стабилизации молекулы на клеточной поверхности.

Итак, в наших экспериментах было обнаружено, что поверхностная фракция молекул HLA-E в покоящихся клетках меланомы представлена у 25% клеточных линий, при этом индукция и выход на поверхность молекул в оставшихся клеточных линиях происходит под действием INF-y, то есть в условиях имитации микроокружения опухолевых клеток in vivo. Однако, самым важным в изучении роли молекулы HLA-E явилось проведение функционального теста на выявление способности клеток защищать опухолевые клетки от цитолитического воздействия клеток NKL.

Клетки линии NKL, которые являются производными NK клеток, были выбраны нами из-за присутствия на их поверхности исключительно рецепторов лектинового семейства NKG2, единственным лигандом которых является молекула HLA-E. В экспериментах с NKL клетками в качестве цитотоксических и исследуемых клеток меланомы человека в качестве клеток-мишеней было продемонстрировано, что присутствие белка HLA-E на поверхности опухолевых клеток способно вызывать устойчивость к лизису со стороны цитотоксических клеток. При этом эффект защиты клеток-мишеней зависел напрямую от плотности белка на клеточной мембране, то есть при стимулировании INF-y мы наблюдали максимальную защиту от цитотоксического лизиса NKL клетками.

Таким образом, нам удалось не только продемонстрировать экспрессию молекулы HLA-E в клетках меланомы человека, показать индукцию экспрессии под действием INF-y и зависимость этого процесса от презентации пепетидов протеасомой, но также выявить непосредственную роль молекулы HLA-E в защите опухолевых клеток от лизиса со стороны цитотоксических клеток.

Полученные данные, несомненно, имеют важное значение в понимании процессов формирования толерантности опухолевыми клетками к иммунному воздействию со стороны организма. Поиск путей ингибирования показанного в данной работе механизма ускользания трансформированных клеток или блокирование мАТ как рецепторов, так и самой молекулы HLA-E, может значительно улучшить эффективность имеющихся протоколов иммунотерапии злокачественных новообразований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Закеева, Ирина Рафаиловна, Москва

1. Бачдуева И.А. Противоопухолевые вакцины // Практ. Онкол. 2003. - Т. 4, № 3. -С. 157-166.

2. Михайлова КН., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Меланомные клеточные линии как основа противоопухолевых вакцин // Вестн. Росс. Акад. Мед. Наук. -2005.-Т. 7.-С. 37-40.

3. Моисеенко В.М. Возможности вакцинации меланомы кожи // Практ. Онкол. 2001. -Т. 8, №4.-С. 58-64.

4. Моисеенко В.М. Моноклональные антитела в лечении злокачественных опухолей // Практ.Онкол. 2003. - Т. 4, № 3.- С. 148-156.

5. Adam J.K., Odhav В., Bhoola K.D. Immune responses in cancer // Pharm. Therapeut. -2003.-Vol. 99.-P. 113-132.

6. Adams G.P., Weiner L.M. Monoclonal antibody therapy of cancer // Nat. Biotechnol. -2005.-Vol. 23, №9.-P. 1147-1157.

7. Ansari M.J.I., SalamaA.D., Chitnis T. et al. The programmed death-1 (PD-1) pathway regulates autoimmune diabetes in nonobese4 diabetic (NOD) mice // J. Exp. Med. -2003.-Vol. 198.-P. 63-69.

8. Atzpodien J., Hoffmann R., Franzke M. et al. Thirteen-year, long-term efficacy of interferon 2 alpha and interleukin 2-based home therapy in patients with advanced renal cell carcinoma // Cancer. 2002. - Vol. 95. - P. 1045-1050.

9. Banchereau J., Palucka A.K., Dhodapkar M. et al. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34+ progenitor-derived dendritic cell vaccine //Cancer Res.-2001.-Vol. 61.-P. 6451 6458.

10. Barrett D.M., Gustafson K.S., Wang J. et al. A GATA factor mediates cell type-restricted induction of HLA-E gene transcription by gamma interferon // Mol. Cel. Biol. 2004. - Vol. 24, № 14. - P. 6194-6204.

11. Banco Z, Bene L., Damjanovich L., Damjanovich S. INF-gamma rearranges membrane topography of MHC-I and ICAM-1 in colon carcinoma cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - Vol. 290. - P. 635-640.

12. Belli F., Testori A., Rivoltini L. et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous tumor derived heat shock protein gp96-peptide complexes: clinical and immunologic findings // J. Clin. Oncol. 2002. - Vol. 20. - P. 4169 4180.

13. Blattman J.N., Greenberg P.D. PD-1 blockade: rescue from a near-death experience // Nat. Immunol. 2006. - Vol. 7. - P. 227-228.

14. Braud V., Jones E.Y., McMichael A. The human major histocompatibility complex class lb molecule HLA-E binds signal sequencederived peptides with primary anchor residues at positions 2 and 9 // Eur. J. Immunol. 1997. - Vol. 27. - P. 1164 1169.

15. Braud V.M., Allan D.S., O'Callaghan C.A. et al. HLA-E binds to natural killer cell receptors CD94/NKG2A, В and С // Nature. 1998. - Vol. 391. - P. 795-799.

16. Burowski R., Ernstoff M.S. Gore M.E. et al. Regulated interferon alfa-2b treatment for patients with solid tumours: a phasel/II study // J. Clin. Oncol. 2002. - Vol. 20. - P. 3841-3849.

17. Cebon J., Jager E., Shackleton M.J. et al. Two phase I studies of low dose recombinant human IL-12 with Melan-A and influenza peptides in subjects with advanced malignant melanoma // Cancer Immun. 2003. - Vol. 3. - P. 3.

18. Cerboni C., Mousavi-Jazi M., Wakiguchi H. et al. Synergistic effect of IFN-gamma and human cytomegalovirus protein UL40 in the HLA-E-dependent protection from NK cell-mediated cytotoxicity // Eur. J. Immunol. 2001. - Vol. 31. - P. 2926-2935.

19. Cerudolo V., Kelly A., Elliott Т., Trowsdale J., Townsend A. Genes encoded in the major histocompatibility complex affecting the generation of peptides for TAP transport // Eur. J. Immunol. 1995. - Vol. 25. - P. 554-562.

20. Chen E., Karr R.W., GinderGD. Negative and positive regulation of human leukocyte antigen class I gene transcription in K562 leukemia cells // Mol. Cell Biol. 1987. -Vol. 7, № 12.-P. 4572-4575.

21. Chen L. Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity // Nat. Rev. Immunol. 2004. - Vol. 4. - P. 336-346.

22. Choi I.H., Zhu G., Sica G.L. et al. Genomic organization and expression analysis of B7-H4: an immune inhibitory molecule of the B7 family // J. Immunol. -2003. Vol. 171. - P. 4650-4654.

23. Coley W.B. Treatment of inoperable malignant tumors with the toxins of erysipelas and the Bacillus prodigiosus // Trans. Amer. Surg. Assn. 1894. - Vol. 12. - P. 183-212.

24. Collins A.V., Brodie D.W., Gilbert R.J.C. et al. The interaction properties of costimulatory molecules revisited// Immunity. -2002. Vol. 17. - P. 201-210.

25. Cruz M„ Eienich L.A., Smolarek T.A. et al. DNA sequence, chromosomal localization and tissue expression of the mouse proteasome subunits LMP10 (Psm 10) gene // Genomics. 1997. - Vol. 45. - P. 618-622.

26. Curiel T.J., Wei S., Dong H. et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity // Nat. Med. 2003. - Vol. 9. - P. 562-567.

27. Daeron M, Latour S., Malbec O. et al. The same tyrosine-based inhibition motif, in the intracytoplasmic domain of Fc gamma RIIB, regulates negatively BCR-, TCR-, and FcR-dependent cell activation // Immunity. 1995. - Vol. 5. - P. 635-646.

28. DeLeo A.B., Jay G., Appella E. et al. Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other transfromed cells of the mouse // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 5. - P. 2420-2424.

29. Derre L„ Corvaisier M., Charreau B. et al. Expression and release of HLA-E by melanoma cells and melanocytes: potential impact on the response of cytotoxic effector cells // J. Immunol. 2006. - Vol. 177, № 5. - P. 3100-3107.

30. Dohring C., Scheidegger D., Samaridis J. et al. A human killer inhibitory receptor specific for HLA-A // J. immunol. 1996. - Vol. 156. - P. 3098-3101.

31. Dong H„ Strome S.E., Salomao D.R. et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion // Nat. Med. 2002. - Vol. 8. - P. 793-800.

32. Dong H., Zhu G., Tamada K., Chen L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion // Nat. Med. 1999. - Vol. 5. -P. 1365-1369.

33. Dorval Т., Palangie Т., Jouve M. et al. Treatment of metastatic melanoma with recombinant interferon alfa-2b // Invest. New Drugs. 1087. - Vol. 5. - P. S61-S63.

34. Driscoll J., Brown M.G., Finley D., Monaco J.J. МНС-linked LMP gene products specially after peptidase activities of the proteasome // Nature. 1993. - Vol. 365. - P. 262-264.

35. Dudley M.E., Wunderlich J.R., Robbins P.F. et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes // Science. 2002. -Vol. 298.- P. 850-854.

36. Dutta N., Gupta A., Mazumber D., Banerjee S. Down-regulation of locus-soecific human lymphocyte antigen class I expression in Epstein-Barr virus-associated cancer // Cancer.-2006.-Vol. 106.-P. 1685-1693.

37. Eder J.P., Kantoff P.W., Roper K. et al. A phase I trial of a recombinant vaccinia virus expressing prostate-specific antigen in advanced prostate cancer // Clin. Cance Res.2000.-Vol. 6.-P. 1632-1638.

38. Egen J.G., Juhns M.S., Allison J.P. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy//Nat. Immunol.-2002. Vol. 3.-P. 611-618.

39. Ehrlich P. Ueber den jetzigen stand der Karzinomforschung // Ned. Tijdschr. Geneeskd. -1909.-Vol. 5.-P. 273-290.

40. Espinoza-Delgano I. Cancer vaccines // Oncologist. 2002. - Vol. 7, № 2. - P. 20-33.

41. Fong L., Hou Y., Rivas A. et al. Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2001.-Vol. 98.-P.8809 8814.

42. Garrido F., Ruiz-Cabello F., Cabrera T. et al. Implications for immunosurveillance of altered HLA class I phenotypes in human tumors // Immunol. Today. 1997. - Vol. 18. - P. 89-95.

43. GeigerJ.D., Hutchinson R.J., Hohenkirk L.F. et al. Vaccination of pediatric solid tumor patients with tumor lysate pulsed dendritic cells can expand specific T cells and mediate tumor regression // Cancer Res. 2001. - Vol. 61. - P. 8513 8519.

44. Glynne Я, Powis S., Beck S. et al. A proteasome related gene between the two abc transporter loci in the calls II region of the human MHC // Nature. 1991. - Vol. 353. -P. 357-360.

45. Gulley J., Chen A.P., Dahut W. et al. Phase I study of a vaccine using recombinant vaccinia virus expressing PSA (rV-PSA) in patients with metastatic androgen-independent prostate cancer // Prostate. 2002. - Vol. 53. - P. 109-117.

46. Hahne M., Rimoldi D., Schroter M. et al. Melanoma cell expression of Fas (Apo-1/CD95) ligand: implications for tumor immune escape // Science. 1996. - Vol. 274, №5291.-P. 1363-1366.

47. Hanson H.L., Donermeyer D.L., Ikeda H. et al. Eradication of established tumors by CD8+ T cell adoptive immunotherapy // Immunity. 2000. - Vol. 13. - P. 265-277.

48. Haywood G.R., McKhann C.F. Antigenic specificities on murine sarcoma cells. Reciprocal relationship between normal transplantation antigens (H-2) and tumor-specific immunogenicity // J. Exp. Med. 1971. - Vol. 133, № 6. - P. 1171-1187.

49. Heinzel A.S., Grotzke J.E., Lines R.A. et al. HLA-E-dependent presentation of Mtb-derived antigen to human CD8+ T cells // J. Exp. Med. 2002. - Vol. 196, № 11. - P. 1473-1481.

50. Hersey P., Menzies S.W., Halliday G.M. et al. Phase I/II study of treatment with dendritic cell vaccines in patients with disseminated melanoma // Cancer Immunol. Immunother. 2003. - Vol. 53. - P. 125 134.

51. Hirano F„ Капеко К., Tamura H. et al. Blockade of B7-H1 and Pd-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity // Cancer Res. 2005. - Vol. 65, № 3.-P. 1089-1096.

52. Holtl L„ Zelle-Rieser C., Gander H. et al. Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysate pulsed autologous dendritic cells // Clin. Cancer Res. -2002.-Vol. 8.-P. 3369 3376.

53. Horig H., Lee D.S., Conkright W. et al. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule // Cancer Immunol. Immunother. 2000. - Vol. 49. - P. 504 514.

54. Humphrey M.B., Lanier L.L., Nakamura M.C. Role of ITAM-containing adapter proteins and their receptors in the immune system and bone // Immunol. Rev. 2005. -Vol. 208. - P. 50-65.

55. Iwai Y., Ishida M., Tanaka Y. et al. Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99. - P. 12293-12297.

56. Jager E., Gnjatic S„ Nagata Y. et al. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 12198-12203.

57. Janetzki S., Palla D., Rosenhauer V. et al. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat schock protein gp96 preparations: a pilot study // Int. J. Cancer.-2000.-Vol. 88.-P.232 238.

58. Juffs Я, Fowler N., Saal R et al. В cell chronic lymphocytic leukaemia cells have reduced capacity to upregulate expression of MHC class I in response to interferon-gamma // Pathology. 2004. - Vol. 36. - P. 69-76.

59. Kagari Т., Tanaka D., Doi H„ Shimozato T. Essential role of Fey receptors in anti-type II collagen antibody-induced arthritis//J. Immunol. -2003. Vol. 170. - P. 4318-4324.

60. Khakoo S.I., Rajalingam R, Shum B.P. et al. Rapid evolution of NK cell receptor systems demonstrated by comparison of chimpanzees and humans // Immunity. 2000. -Vol. 12.-P. 687-698.

61. Khakoo S.I., Thio C.L., Martin M.P. et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in revolving hepatitis С virus infection // Science. -2004. vol. 305. P. 872-874.

62. Khleif S.N., Abrams S.I., Hamilton J.M. et al. A phase I vaccine trial with pepetides reflecting ras oncogene mutations of solid tumors // J. Immunother. 1999. - Vol. 22. -P. 155-165.

63. Kikuchi-Maki A., Catina T.L., Campbell K.S. Cutting edge: KIR2DL4 transduces signals into human NK cells through association with the Fc receptor gamma protein // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - P. 3859-3863.

64. Kikuchi-Maki A., Yusa S., Catina T.L., Campbell K.S. KIR2DL4 is an IL-2 regulated NK cell receptor that exhibits limited expression in humans but trigger strong INF-gamma production // J. Immunol. 2003. - Vol. 171. - P. 3415-3425.

65. Klebanoff C.A., Gattinoni L., Torabi-Parizi P. et al Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102, № 27. - P. 9571-9576.

66. Klein G. Tumor antigens // Annu. Rev. Microbiol. 1966. - Vol. 20. - P. 223-252.

67. Knapp L.A., Cadavid L.F., Watkins D.I. The MHC locus is the most well conserved of all known primate class I histocompatibility genes // J. Immunol. 1998. - Vol. 160. -P. 189-196.

68. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 495-497.

69. Koller В., Geraghty D„ Shimizu Y. et al. HLA-E. A novel HLA class I gene expressed in resting T lymphocytes // J. Immunol. 1988. - Vol. 41. - P. 897-904.

70. Kryczek I., Zou L„ Rodriguez P. et al. B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma // J. Exp. Med. 2006. - Vol. 203, №4.-P. 817-820.

71. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. -1970. Vol. 227. - P. 680-685.

72. Lanier L.L. NK cell recognition // Annu. Rev. Immunol. 2005. - Vol. 23. - P. 225-274.

73. Lanier L.L., Corliss B.C., Wu J. et al. Immunoreceptor DAP12 bearing a tyrosine-based activation motif is involved in activating NK cells // Nature. 1998. - Vol. 391. - P. 703-707.

74. Larin S.S., Georgiev G.P., Kiselev S.L. Gene transfer approaches in cancer immunotherapy // Gene Ther. 2004. - Vol. 1. - P. S18-25.

75. Lee N„ Goodlett D„ IshitaniA. et al. HLA-E surface expression depends on binding of TAP-dependent peptides derived from certain HLA class I signal sequences // J. Immunol. 1988,-Vol. 160.-P. 4951 4960.

76. Lee N., Llano M., Carretero M. et al. HLA-E is a major ligand for the natural killer inhibitory receptor CD94/NKG2A // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 5199 5204.

77. Lee P., Wang F., KuniyoshiJ. et al. Effects of interleukin-12 on the immune response to a multipeptide vaccine for resected metastatic melanoma // J. Clin. Oncol. 2001. - Vol. 19.-P. 3836-3847.

78. Leibson P.J. The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptors // Curr. Opin. Immunol. 2004. - Vol. 16(3). - P. 328-336.

79. Leibson P.J. The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptors // Curr. Opin. Immunol.-2004.-Vol. 16.-P. 328 336.

80. Lemberg M.K., Bland F.A., Weihofen A. et al. Intramembrane proteolysis of signal peptides: as essential step in the generation of HLA-E epitop // J. Immunol. 2001. -Vol. 167.-P.-6441-6446.

81. Maker A. V., Attia P., Rosenberg S.A. Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA-4 blockade // J. Immunol. -2005. Vol. 175, № 11. - P. 7746-7754.

82. Malmberg K, Levitsky V., Norell H. et al. IFN-gamma protects short-term ovarian carcinoma cell lines from CTL lysis via a CD94/NKG2A-dependent mechanism // J. Clin. Invest.-2002.-Vol. 110.-P. 1515-1523.

83. Marin R., Ruiz-Cabello F., Pedrinaci S. Analysis of HLA-E expression in human tumors // Immunogenetics. 2003. - Vol. 54, № 11. - P. 767-75.

84. Marshall J.L., Hawkins M.J., Tsang K.Y. et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen Hi. Clin. Oncol. -1999. -Vol. 17.-P. 332 337.

85. Met 0., Wang M., Pedersen A.E. et al. The effect of a therapeutic dendritic cell-based cancer vaccination depends on the blockage of CTLA-4 signaling // Cancer Let. 2006. -Vol. 231, №2.-P. 247-256.

86. Michaelsson J., Teixeira de Matos C„ Achour A. et al. A signal peptide derived from hsp60 binds HLA-E and interferes with CD94/NKG2A recognition // J. Exp. Med. -2002.-Vol. 196, № 11.-P. 1403-1414.

87. Miller J.D., Weber D.A., Ibegbu C. et al. Analysis of HLA-E peptide-binding specificity and contract residues in bound peptide required for recognition by CD94/NKG2 // J. Immunol.-2003.-Vol. 171.-P. 1369-1375.

88. Mitchell M.S., Кап-Mitchell J., Morrow P.R. et al. Phase I trial of large multivalent immunogen derived from melanoma lysates in patients with disseminated melanoma // Clin. Cancer Res. 2004. - Vol. 10. - P. 76 83.

89. Mocellin S., Mandruzzato S., Bronte V., Marincola F.M. Cancer vaccines: pessimism in check//Nat. Med.-2004.-Vol. 10, № 12.-P. 1278-1279.

90. Muhlfeld A.S., Segerer S., Hudkins K. et al. Deletion of the Fey receptor lib in thymic stromal lymphopoietin transgenic mice aggravates memranoproliferative glomerulonephritis//Am. J. Pathol.-2003.-Vol. 163.-P. 1127-1136.

91. Muta Т., Kurosaki Т., Misolovin Z. et al. A 13 amino-acid motif in the cytoplasmic domain of Fc gamma RIIB modulates B-cell receptor signaling // Nature. 1994. - Vol. 368.-P. 70-73.

92. Nemunaitis J., Sterman D„ Jablons D. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene-modified autologous tumor vaccines in non-small-cell lung cancer // J. Natl. Cancer Inst. 2004. - Vol. 96. - P. 326 331.

93. Nestle F.O., Alijaqic S., Gilliet M. et al. Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysatepulsed dendritic cells // Nat. Med. 1998. - Vol. 4. - P. 328 332.

94. Nishimura H„ Nose M., Hiai H. et al. Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM-motif-carrying immunoreceptor // Immunity. 1999. - Vol. 11. - P. 141-151.

95. O'Callaghan C. Molecular basis of human natural killer cell recognition of HLA-E (human leukocyte antigen-E) and its relevance to clearance of pathogen-infected and tumour cells // Clin. Sci. 2000. - Vol. 99. - P. 9-17.

96. O'Callaghan C.A., Tormo J., Willcox B.E. et al. Structural features impose tight peptide binding specificity in the nonclassical MHC molecule HLA-E // Mol. Cell. 1998. -Vol. l.-P. 531-541.

97. Okazaki Т., Iwai Y., Honjo T. New regulatory co-receptors: inducible co-stumulator and PD-1 // Curr. Opin. Immunol. 2002. - Vol 14. - P. 779-782.

98. Old L., Boyse E.A. Immunology of experimental tumors // Annu. Rev. Med. 1964. -Vol. 15.-P. 167-186.

99. Ortiz-Narvarete V., Seelig A., Gernold M. et al. Subunits of the 20S proteasome (multicatalytic proteinase) encoded by major histocompatibility complex // Nature. -1991.-Vol. 353.-P. 662-762.

100. Overwijk W.W., Theoret MR., Finkelstein S.E. et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells // J. Exp. Med. 2003. - Vol. 198. - P. 569-580.

101. Pace J.L., Russell S.W., R.D. Schreiber et al. Macrophage activation: priming activity from a T-cell hybridoma is attributable to interferon-gamma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol. 12. - P. 3782-3786.

102. Palmisano G., Contardi E., MorabitoA. et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines // Hum. Immunol. 2005. - Vol. 66. - P. 1-12.

103. Peipp M., Valerius T. Bispecific antibodies targeting cancer cells // Biochem. Soc. Trans. 2002. - Vol. 30, № 4. - P. 507-511.

104. Pietra G„ Romagnani C., Mazzarino P. et al. HLA-E-restricted recognition of cytomegalovirus-derived peptides by human CD8+ cytolytic T lymphocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-Vol. 100, № 19.-P. 10896-10901.

105. Plunkett T.A., Miles D.W. New biological therapies for breast cancer // Int. J. Clin. Pract. 2002. - Vol. 56, № 4. - P. 261-266.

106. Poszepczynska-Guigne E., Schiavon V., D'Incan M. et al. CD158k/KIR3DL2 is a new phenotypic marker of Sezary cells: relevance for the diagnosis and follow-up of Sezary syndrome // J. Invest. Dermatol. 2004. - Vol. 122, № 3. - P. 820-823.

107. Rajagopalan S., Long E.O. A human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-G-specific receptor expressed on all natural killer cells // J. Exp. Med. 1999. - Vol. 189. -P. 1093-1100.

108. Ravetch J. V., BollandS. IgG Fc receptors // Annu. Rev. Immunol. 2001. - Vol. 19. - P. 275 290.

109. Ravetch J. V., Lanier L.L. Immune inhibitory receptors // Science. 2000. - Vol. 290. -P. 84-89.

110. Reits E.A., Benham A.M., Plougastel B. et al. Dynamics of proteasome distribution in living cells // EMBO J. 1997. - Vol. 16. - P. 6087-6094.

111. Restifo N.P., Esquivel F., Asher A.L. etal. Defective presentation of endogenous antigens by a murine sarcoma. Implications for the failure of an anti-tumor immune response//J. Immunol.-1991.-Vol. 147, №4.-P. 1453-1459.

112. Robbie-Ryan M., Tanzola M.B., Secor V.H., Brown M.A. Cutting Edge: Both activating and inhibitory Fc receptors expressed on mast cells regulate experimental allergic encephalomyelitis disease severity//J. Immunol.-2003.-Vol. 170.-P. 1630-1634.

113. Robinson J., Waller M, Par ham P. et al. IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex // Nucleic Acids Res.2003.-Vol.31.-P. 311-314.

114. Rosenberg S.A., Dudley M.E. Cancer regression in patients with metastatic melanoma after the transfer of autologous antitumor lymphocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.2004.-Vol. 101.-P. 14639-14645.

115. Rosenberg S.A., YangJ.C., Restifo N.P. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines // Nat. Med. 2004. - Vol. 9. - P. 909-915.

116. SambrookJ., Fritsch E„ Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edn) // Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. 1989. - P. 1847 1875.

117. Sato Y. et al. A phase I trial of cytotoxic T-lymphocyte precursor-oriented peptide vaccines for colorectal carcinoma patients // Br. J. Cancer. 2004. - Vol. 90. - P. 13341342.

118. Scheibenbogen C., Schmittel A., Keilholz U. et al. Phase 2 trial of vaccination with tyrosinase peptides and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in patients with metastatic melanoma//J. Immunother. -2000. Vol. 23. - P. 275-281.

119. Seliger В., Ritz U„ Ferrone S. Molecular mechanisms of HLA class I antigen abnormalities following viral infection and transformation // Int. J. Cancer. 2006. -Vol. 118.-P. 129-138.

120. Sica G.L., Choi I.-H., Zhu G. et al. B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity // Immunity. 2003. - Vol. 18. - P. 849-861.

121. Sijts A., Ruppert Т., Rehermann B. et al. Efficient generation of a Hepatitis В virus cytotoxic T lympjocyte epitote requires the structural features of immunoproteasomes // J. Exp. Med. -2000,- Vol. 191. P. 503-513.

122. Silverstein A.M. History of Immunology // Academic, San Diego,CA. 1989.

123. Srivastava P.K., Udono H. Heat-shock protein-peptide complexs in cancer immunotherapy // Curr. Opin. Immunol. 1994. - Vol. 6. - P. 728-732.

124. Stift A., Friedl J., Dubsky P. et al. Dendric cell-based vaccination in solid tumor // J. Clin. Oncol. 2003. - Vol. 21. - P. 135-142.

125. Strehl В., Seifert U., Kriiger E. et al. Interferon-y, the functional plasticity of the ubiquitin-proteasome system, and MHC class I antigen processing // Immunol. Rev. -2005.-Vol. 207.-P. 19-30.

126. Su Z, Dannull J., Heiser A. et al. Immunological and clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells // Cancer Res.-2003.-Vol. 63.-P.2128 2133.

127. Suto Y., Maenaka K., Yabe T. et al. Chromosomal localization of the human natural killer cell class I receptor family genes to 19ql3.4 by fluorescence in situ hybridization // Genomics. 1996. - Vol. 35. - P. 270-272.

128. Tanaka S., Harada M., Mine T. et al. Peptides vaccination for patients with melanoma and other types of cancer based on pre-existing peptide-specific cytotoxic T-lymphocyte precursors in the periphery // J. Immunother. 2003. - Vol. 26. - P. 357-366.

129. Taylor P.A., Lees C.J., Fournier S. et al. B7 expression on T cells down-regulates immune responses through CTLA-4 ligation via T-T interactions // J. Immunol. 2004. -Vol. 172.-P. 34-39.

130. Tivol E.A., Bordello F., Schweitzer A.N. et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multi-organ tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4 // Immunity. 1995. - Vol. 3. - P. 541-547.

131. Tomasec P., Braud V., Rickards C. et al. Surface expression of HLA-E, an inhibitor of natural killer cells, enhances by human cytomegalovirus gpUL40 // Science. 2000. -Vol. 287.-P. 1031-1033.

132. Torre-Amione G., Beauchamp R.D., Koeppen #., BHPark et al. A highly immunogenic tumor transfected with a murine transforming growth factor type B1 cDNA escapes immune surveillance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 1486-1490.

133. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M. et al. Monoclonal antibody-mediated tumour regression by induction of apoptosis // Science. 1989. - Vol. 245. - P. 301-305.

134. Veda H., Howson J.M.M., Esposito L. et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA-4 with susceptibility to autoimmune disease // Nature. 2003. - Vol. 423. - P. 506-511.

135. Ulbrecht M„ Martinozzi S., Grzeschik M. et al. Cutting edge: the human cytomegalovirus UL40 gene product contains a ligand for HLA-E and prevents NK cell-mediated lysis // J. Immunol. 2000. - Vol. 164. - P. 5019-5022.

136. Urban J.L., Burton R.C., Holland J.M. et al. Mechanisms of syngeneic tumor rejection. Susceptibility of host-selected progressor variants to various immunological effector cells // J. Exp. Med. 1982. - Vol. 155, № 2. - P.557-573.

137. Van Driel W.J., Ressing M.E., Kenter G.G. et al. Vaccination with HPV16 peptides of patients with advanced cervical carcinoma // Eur. J. Cancer. 1999. - Vol. 22. - P. 155156.

138. Vance R.E., Kraft J.R, Altman J.D. et al. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-l(b)//J. Exp. Med.-1998.-Vol. 188.-P. 1841-1848.

139. Verheyden S„ Bernier M., Demanet C. Identification of natural killer cell receptor phenotypes associated with leukemia // Leukemia. 2004. - Vol. 12. - P. - 2002-2007.

140. Vivier E., Anfossi N. Inhibitory NK-cell receptors on T-cells: witness of the past. Actors ofthe future//Nat. Reviews. Immunology. -2004. -Vol. 4. P. 190-198.

141. Vonderheide R.H., Domchek S.M., Schultze J.L. et al. Vaccination of cancer patients telomerase induces functional antitumor CD8+ T lymphocytes // Clin. Cancer Res. -2004.-Vol. 10.-P. 828-839.

142. Wagtmann N., Rajagopalan S., Winter C.C. et al. Killer cell inhibitory receptors specific for HLA-C and HLA-B identified by direct binding and by functional transfer // Immunity. 1995. - Vol. 3. - P. 801-809.

143. Watanabe N., Gavrieli M., Sedy J.R et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1 // Nat. Immunol. 2003. - Vol. 7. - P. 670-679.

144. Watanabe Т., Okano M., Hattori H. et al. Roles of FcyRIIb in nasal eosinophilia and IgE production in murine allergic rhinitis // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004. -Vol. 169.-P. 105-112.

145. Williams A.P., Bateman A.R., Khakoo S.I. KIR and their role in disease // Nature Immun. -2005.-Vol. 5(4).-P. 226-240.

146. Yajima K., Nakamura A., Sugahara A., Takai T. FcyRIIB deficiency with Fas mutation is sufficient for the development of systemic autoimmune disease // Eur. J. Immunol. -2003.-Vol. 33.-P. 1020-1029.

147. Yusa S.-I., Campbell K.S. Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP-2) can play s direct role in the inhibitory function of killer cell Ig-Like receptors in human NK cells // J. Immunol. 2003. - Vol. 170. - P. 4539-4547.

148. Zinzani P.L., Lauria F„ Salvucci M. et al. Hairy-cell leukemia and alfa-interferon treatment: long-term responders // Haematologica. 1997. - Vol. 82. - P. 152-155.1. Благодарности

149. Я выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Сергею Сергеевичу Ларину за предоставление возможности выполнения работы, за терпение и чуткое руководство, а также критическое чтение диссертации.

150. Спасибо всем сотрудникам различных подразделений ИБГ РАН, которые помогали решать технические вопросы обеспечения и проведения работ.