Роль растворимых белков CD95 и HLA I класса в альтерации гомеостаза человека на примере неоплазий

Тагиров, Олег Таликович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль растворимых белков CD95 и HLA I класса в альтерации гомеостаза человека на примере неоплазий
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль растворимых белков CD95 и HLA I класса в альтерации гомеостаза человека на примере неоплазий"

На правах рукописи

ТАГИРОВ Олег Таликович

РОЛЬ РАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ СБ95 И НЬАI КЛАССА В АЛЬТЕРАЦИИ ГОМЕОСТАЗА ЧЕЛОВЕКА НА ПРИМЕРЕ НЕОПЛАЗИЙ

03.00.13 - физиология 14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 2003

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии, иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Новиков В.В.

доктор биологических наук, проф. Конторщикова К.Н.

доктор медицинских наук, Литовская A.B.

Ведущая организация: Университет дружбы народов, г. Москва

Защита состоится " 7 " <^£¿^¿^2003 г в /С*на заседании диссертационного совета К212.166.02. Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Автореферат разослан 003 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук У*^/ И.Ф. Александрова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Физиологические механизмы сохранения гомеостаза включают в себя как важную составную часть сохранение динамического равновесия между двумя такими фундаментальными процессами как пролиферация и апоптоз. Значительную роль в поддержании гомеостатического равновесия играют молекулярные и клеточные механизмы иммунных реакций. Адекватный и полноценный иммунный ответ является необходимой реакцией органцзма на возникновение и развитие неопластических процессов. В молекулярных механизмах таких реакций принимает участие множество мембранных белков, в том числе молекулы главного комплекса системы гистосовместимости I класса и опосредующий апоптоз белок CD95 (Fas-антиген). Если мембранные молекулы HLA I класса обеспечивают презентацию фрагментов чужеродных, в том числе и опухолевых антигенов с последующей пролиферацией иммунокомпетентных клеток и выполнением ими эффекторных функций, то белок CD95 является клеточным рецептором, через который передается апоптотический сигнал (York I.A., Rock K.L., 1996, Рыжов C.B., Новиков В.В., 2002). Известно, что как молекулы HLA I класса, так и белок CD95 могут существовать в растворимой форме. В экспериментах in vitro продемонстрировано, что растворимая форма белка CD95 и молекул HLA I класса обладают выраженным действием на клетки иммунной системы. Растворимые молекулы HLA I класса способны вызывать апоптоз С08-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток (Zavazava N., 1998; Carbone Е., 1996). Именно эти клетки наиболее эффективны в реализации противоопухолевого иммунитета. Растворимый белок CD95 взаимодействует с Fas-лигандом на поверхности цитотоксических клеток, также вызывая их апоптоз (Wallach D, 1998). Это, в свою очередь, может приводить к дополнительному

подавлению клеточного звена иммунитета, направленного на защиту от развития неопластических процессов.

Цель работы. Изучение тканевого содержания и физиологического значения растворимых форм белков СЭ95 и НЬА 1 класса при альтерации гомеостаза неопластического генеза.

Задачи исследования

1. Определить сывороточный уровень растворимой формы опосредующего апопгоз С095 протеина и растворимых белков НЬА I класса в норме и при неоплазиях различного происхождения.

2. Исследовать динамику сывороточного содержания растворимого протеина и растворимых молекул НЬА I класса на разных стадиях развития опухолевого процесса на примере рака молочной железы.

3. Определить содержание растворимого белка С095 и растворимых молекул НЬА I класса в опухолевом очаге, околоопухолевой ткани и регионарных лимфатических узлах.

4. Провести иммунофенотипический анализ мононуклеарных клеток периферической крови на разных стадиях развития карциномы молочной железы.

5. Исследовать возможность наличия корреляционных взаимосвязей между между мембранной экспрессией молекул С095, НЬА I класса, и" сывороточным содержанием и сывороточной концентрацией олухрлеассоциированного антигена \1UC-1 и раково-эмбрионального антигена (РЭА).

Научная новизна. Впервые проведено одновременное исследование содержания растворимого белка С095 и молекул НЬА I класса в разных тканях при карциноме молочной железы, результаты которого свидетельствуют о том, что источником повышенного уровня этих белков в крови могут быть как клетки иммунной системы, так и опухолевые клетки. Максимальные сывороточные копцен грации растворимого белка СР95 и молекул НЬА 1 класса выявлены при

метастазах в костно-мозговую ткань и печень. Обнаружены корреляционные связи между выявляемым в реакции иммунофлуоресценции относительным содержанием мононуклеарных клеток, экспрессирующих на мембране молекулы НЬА I класса, и сывороточным уровнем растворимых молекул НЬА I класса, а также между сывороточным уровнем растворимого С095 протеина, молекул НЬА I класса, опухолеассоциированного М11С-1 антигена и раково-эмбрионального антигена, указывающие на возможность совместной модуляции данными белками иммунофизиологических механизмов. На основании полученных данных сделано заключение об участии растворимого белка С095 и растворимых молекул НЬА I класса в механизмах ухода опухоли от иммунологического надзора, что приводит к дополнительной альтерации гомеостатического равновесия в условиях пролиферации малигнизированных клеток.

Научно-практическая значимость. Представленные в работе результаты свидетельствует о вкладе растворимых форм С095 протеина и молекул НЬА I класса в альтерацию гомеостаза при развитии неоплазий. Продемонстрировано прогностическое значение сывороточного содержания белка С095 при полихимиотерапии карциномы молочной железы. Полученные результаты расширяют представления о картине изменения сывороточной концентрации растворимых белков С095 и молекул НЬА I класса при неоплазиях разного происхождения и могут быть использованы при разработке новых методов иммунофизиологического мониторинга.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При нарушениях гомеостаза опухолевого генеза происходят изменения сывороточного содержания растворимого белка С095 и молекул НЬА I класса.

2. Источником повышенного содержания растворимого белка СШ5 и молекул НЬА I класса в сыворотке крови могут быть как клетки иммунной системы, так и малигнизированные клетки.

3. Растворимые формы белка С095 и молекул НЬА I класса можно отнести к белкам, обеспечивающим формирование механизмов ухода опухолевых клеток от иммунологического надзора.

Апробация работы. Основные результаты представлены на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центральночерноземного научного центра РАМН (Курск, 2002), Международной конференции по биотехнологии, посвященной памяти академика И.Н.Блохиной (Москва, 2002}, VII Нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2002).

Публикации: по теме диссертации опубликованы 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Материал диссертации изложен на 128 страницах. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 18 рисунками. Библиографический указатель включает 162 отечественных и иностранных источника.

Материалы и методы исследований.

Для исследования сывороточного содержания растворимых форм- антигенов С095 и НЬА I класса использовали образцы сыворотки крови 120 здоровых доноров крови, 9 больных лимфоцитарной лимфомой, 14 больных множественной миеломой, 7 больных лимфогранулематозом, 5 больных хроническим лимфолейкозом, 14 больных раком желудка, 7 больных раком легкого и 129 образцов сыворотки крови не подвергавшихся терапии (первичных) больных с гистологически подтвержденным диагнозом рака молочной железы. Образцы крови больных лимфоцитарной лимфомой, миеломой, лифогранулематозом и хроническим лимфолейкозом были получены из МОНИКИ им. Герцена. Образцы кропи больных раком желудка, раком легкого и раком молочной железы был" предоставлены кафедрой онкологии Нижегородской государственной медицинской академии (А.В.Алясова). Образцы тканей, использованные для

получения тканевых экстрактов, получены в ходе плановых операций больных раком молочной железы и предоставлены кафедрой онкологии Нижегородской государственной медицинской академии.

Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови 132 женщин с гистологически подтвержденным диагнозом рака молочной железы и 30 сопоставимых по возрасту здоровых женщин-доноров проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител серии ИКО.

Содержание белка СЕ>95 в сыворотке крови и тканевых экстрактах определяли иммуноферментным методом с помощью поликлональных антител против поверхностных белков мононуклеарных клеток периферической крови человека и моноклональных антител (МКА) ИКО-160 против СЕ)95 протеина, меченых пероксидазой корня хрена.

Содержание гетеродимера "р2-микроглобулин-НЬА антигены I класса" в сыворотке крови и тканевых экстрактах определяли иммуноферментным методом с помощью моноклональных антител МКА ИКО-53 против тяжелой цепи молекул НЬА I класса и меченых пероксидазой хрена МКА ИКО-216 против р2-микроглобулина.

Сывороточное содержание МиС-1 антигена и раковоэмбрионального антигена определяли с помощью иммуноферментных тест-систем производства ООО "Хема-Медика" (Москва) и фирмы "Вектор-Бест" (Новосибирск), соответственно.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, коэффициента Стьюдента (результаты иммунофенотипирования клеток) и с использованием непараметрических методов анализа: критерия Крускала-Уоллиса, Манна-Уитни, критерия Уилкоксона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и их обсуждение

С помощью иммуноферментного метода с применением моноклональных антител к CD95 протеину определен сывороточный уровень этого белка при опухолевых процессах разной этиологии. В норме сывороточное содержание растворимого CD95 равнялось 401,0±17,8 U/ml. При лимфоцитарной лимфоме сывороточное содержание sCD95 повышалось в среднем на 31 %, однако, в сравнении с нормой, различия не были статистически значимыми (Рис. 1). Множественная миелома характеризовалась более выраженным повышением сывороточной концентрации sCD95 протеина до 845,2±247,4 U/ml. Несмотря на повышение средней концентрации sCD95 более чем вдвое, различия с нормой оставались статистически недостоверными вследствие широкого разброса индивидуальных концентраций sCD95 протеина. Вероятно, это связано как с показанной ранее индивидуальной вариабельностью данного показателя (Вязьмина Е.С., 2002, Птицына Ю.С., 2003,), так и с гетерогенностью исследуемой группы больных, находящихся на разных стадиях прогрессирования неопластического процесса. При хроническом лимфолейкозе сывороточная концентрация sCD95 протеина увеличивалась по сравнению с контролем в 2,4 раза, достигая 952,0±222,1 U/ml (р<0,05). При лимфогранулематозе содержание sCD95 повышалось в 1,9 раза до 771,3±64,7 U/ml. При раке желудка уровень sCD95 возрастал до 682,0±53,0 U/ml, что в 1,7 раза выше нормы (р<0,05). Рак легкого сопровождался увеличением сывороточного содержания белка sCD95 в 1,4 раза. Значительное увеличение сывороточного уровня sCD95 протеина зарегистрировано также при раке молочной железы. В сравнении с нормой он увеличивался на 97 % и составил 788,9±167,3 U/ml.

Представленные результаты не отражают динамики изменения концентрации белка CD95 на разных стадиях опухолевого процесса. В связи с этим мы провели исследование сывороточного содержания белка sCD95 на разных стадиях

карциномы молочной железы..У впервые направленных в стационар (первичных) больных независимо от стадии заболевания средний сывороточный уровень sCD95 протеина достоверно превышал норму в 2,8 раза и соответствовал 1129,9±131,9 U/ml. На I стадии сывороточный уровень sCD95 статистически достоверно превышал контрольный уровень в 3 раза и достигал 1197,7±450,1 U/ml.

U/ml 1000т *

9001-——-

800-

700-

600-

500~

400~

300-

200-

100-

0 -г

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1. Уровень sCD95 протеина в сыворотке крови при опухолях различной этиологии. 1- здоровые доноры, 2 - лимфоцитарная лимфома, 3 - множественная миелома, 4 - хронический лимфолейкоз, 5 - лимфогранулематоз, 6 - рак желудка, 7

- рак легкого.

* - Статистически достоверные различия с нормой (р<0,05)

На II стадии неопластического процесса сывороточное содержание белка sCD95 был повышено в 2,1 раза (Рис. 2). Уровень растворимого CD95 протеина на III стадии рака молочной железы превышал норму более чем в 3 раза и составил

1221,5±195,7 U/ml (Р<0,05). На IV стадии сывороточное содержание белка sCD95 сохранялось на том же уровне и превышало контроль в 2,9 раза.

При метастазах в кости сывороточный уровень sCD95 достоверно превышал норму в 3,7 раза и достигал 1504,0+105,0 U/ml (р<0,05). При метастазах в печень он увеличивался в 3,2 раза (р<0,05). При метастатическом поражении легких и подключичных лимфатических узлов повышение сывороточного содержания sCD9S было менее выраженным. Больные с метастазами в мягкие ткани имели нормальное сывороточное содержание sCD95 протеина в пределах нормальных значений (403,6±74,0 U/ml).

Причины значительного повышения sCD95 при метастазах в костную ткань, вероятно, связаны с реакцией гемопоэтических клеток на вторжение метастатических опухоли в кость. Повышение sCD95 при метастазах в печень, легкие и лимфоузлы может быть связано с реализацией опухолевыми клетками защитных механизмов, позволяющих им уходить от иммунологического надзора и .связанных с продукцией клетками sCD95.

Поскольку источником повышенного уровня растворимой формы CD95 протеина в сыворотке крови больных раком молочной железы могут быть не только опухолевые клетки, но и иммунокомпетентные клетки мы провели анализ содержания растворимого CD95 протеина в тканевых экстрактах из различных областей опухоли и околоопухолевой ткани.

Как видно из рис. 3, наиболее высокие концентрации sCD95 протеина обнаруживались в участке опухолевого очага, соответствующем его центру, а также в регионарных лимфатических узлах. В экстрактах околоопухолевых тканей содержание sCD95 протеина было ниже, чем в клеточных экстрактах, полученных из центра опухоли или близлежащих лимфоузлов. Данные соответствуют результатам, полученным ранее для других солидных опухолей (Lee S.H., 1998).

U/ml 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

1 2 3 4 5 Стадии рака молочной железы

Рис. 2. Сывороточный уровень зС1>95 антигена у первичных больных на разных стадиях рака молочной железы.

1- здоровые доноры; 2-1 стадия; 3 - II стадия; 4 - III стадия; 5 - IV стадия

U/ml 150

100

Рис. 3. Концентрация растворимого яС1)95 белков в тканевых экстрактах опухоли и околоопухолевых ткаикей. I - центр опухоли, 2 - периферия опухоли (больше опухолевой ткани), 3 - периферия опухоли (больше околоопухолевой ткани), 4 - околоопухолевые ткани, 5 - лимфатические узлы.

Можно заключить, что как лимфоидные ткани и клетки, так и опухолевые клетки могут быть источником растворимого СЕ>95 протеина. Если лимфоидные клетки, и в первую очередь Т-лимфоциты, секрет'ируют этот белок, по-видимому, в результате чрезмерной активации, что приводит к ее самоограничению, то опухолевые клетки секретируют эСЕ>95 в целях самозащиты подобно гепатоцитам (ТоЛогеНа С. е1 а1., 2000). Известно, что сывороточный белок вСЕ)95 нарушает связывание мембранного СЕ>95 с его лигандом, вмешиваясь в образование функционально активного гомотримера и таким образом подавляет апоптоз клеток-мишеней. Повышенная продукция бС1)95 при карциноме молочной железы может рассматриваться как дополнительный механизм ухода раковых клеток от иммунологического надзора.

В отдельной серии наблюдений была прослежена динамика изменения сывороточного уровня белка бСЕШ в зависимости от успеха полихимиотерапии больных раком молочной железы. На старте полихимиотерапии среднее содержание $СЕ)95 в сыворотке крови практически не различалось как у больных, успешно ответивших на полихимиотерапию, так и у резистентных к полихимиотерапии больных (Рис. 4). При успешном проведении полихимиотерапии и последующем длительном безрецидивном течении заболевания сывороточное содержание белка вСШб уже на протяжении первых двух недель достигало нормы, а затем опускалось ниже нормы, сохраняясь на таком уровне в течение 14 недель. У больных с быстрым прогрессированием опухолевого процесса, коротким безрецидийным периодом уровень зСШ5 постепенно нарастал. Динамика зСЕ)95 в процессе цитостатической терапии носила маятникообразный характер. Полученные данные свидетельствуют о том, что сывороточная концентрация вСГ)95 может быть использована в качестве дополнительного критерия в мониторинге течения заболевания. Динамика изменения уровня растворимого СЕ)95 протеина у больных раком молочной

железы имеет прогностическое значение и может свидетельствовать об эффективности проводимой терапии.

Таким образом, развитие опухолевого процесса, независимо от его локализации, как правило, сопровождается повышением уровня сывороточного белка С1Э95. Успешная терапия сопровождается падением сывороточного содержания белка бСЕ)95 до нормы.

О 2 6 10 14

недели

Рис. 4. Динамика изменения сывороточного уровня sCD95 при успешной терапии (А) и при прогрессировании опухолевого процесса (В)

Растворимая форма молекул HLA I класса, как и CD95, способны индуцировать апоптоз цитотоксических клеток. Исследование сывороточного содержания молекул HLA I класса обнаружило его значительное повышение при ряде неоплазий (Рис. 5). Если у здоровых доноров крови сывороточное содержание sHLA-I равнялось 1001,5±19,б U/ml, то у больных лимфоцитарной лимфомой оно составило 2502,3±643,3 U/ml (р<0,05). Сходные данные были получены ранее зарубежными исследователями (Nocito С. et al., 1997). Исследование

сывороточной концентрации sHLA-I при множественной миеломе также показало повышенный по сравнению с контролем уровень этих белков (2887,0±903,1 U/ml против 1001,S±19,6 U/ml р<0,05). При лимфогранулематозе содержание sHLA-I повышалось в 1,8 раза до 1752,8±490,0 U/ml. При хроническом лимфолейкозе установлено достоверное превышение контрольного уровня sHLA-I в 2,1 раза (р<0,05).

Рак желудка характеризовался достоверным повышением уровня sHLA-I в 2,7 раза до 2768,21506,6 U/ml (р<0,05). При раке молочной железы уровень sHLA-I был повышен в 1,3 раза в сравнении с нормой, однако различия были статистически не значимы и проявлялись лишь в виде тенденции к повышению. При раке легкого наблюдалось достоверное увеличение уровня sHLA-I в 2,0 раза (р<0,05).

U/ml ЗООО-i 2500-' 2000-' 1500-' 1000-' 500 ' 0+

Рис. 5. Уровень вНЬА-1 белка в сыворотке крови при опухолях различной

этиологии.

1 - здоровые доноры, 2 - лимфоцитарная лимфома, 3 - множественная миелома, 4 -лимфогранулематоз, 5 - рак желудка, 6 - рак легкого. * - Статистически достоверные различия с нормой (р<0,05)

Вероятным источником повышенных концентраций sHLA-I могут быть опухолевые клетки, с поверхности которых возможно протеолитическое отщепление (шеддинг) sHLA-I после контакта с эффекторной CD8+ Т-клеткой или NK-клеткой. Известно, что опухолевые клетки характеризуются пониженным уровнем мембранной экспрессии молекул гистосовместимости I класса. Можно предположить, что одним из механизмов понижения экспрессии мембранных j молекул HLA I класса является их повышенный шеддинг. В таком случае

увеличение количества опухолевых клеток или нарастание опухолевой массы i') должны быть ассоциированы с уровнем sHLA-I в сыворотке крови.

Для проверки данного предположения в совместных исследованиях с А.К. Голенковым и др. мы проанализировали при хроническом лимфолейкозе и множественной миеломе связь уровня sHLA-I с массой опухолевых клеток. Обнаружено, что увеличение опухолевой массы характеризовалось повышением сывороточного уровня sHLA-I как при хроническом лимфолейкозе, так и при множественной миеломе. Это является свидетельством того, что источником sHLA-I по крайней мере при таких неоплазиях, как хронический лимфолейкоз и множественная миелома, являются опухолевые клетки. Повышенная концентрация sHLA-I может 'в такой ситуации выступать в качестве фактора, позволяющего опухолевым клеткам уходить от иммунологического надзора со стороны цитотоксических Т-клеток и NK-клеток, поскольку растворимые молекулы гистосовместимости I класса в состоянии взаимодействовать с молекулами CD8 на поверхности цитотоксических Т-клеток и NK-клеток и * вызывать их апоптоз (Contini P. et ill., 2000). Повышенный уровень

апоптотических процессов в' популяциях этих клеток обеспечивает, таким It образом, условия для дальнейшего развития опухолевого процесса.

При анализе сывороточного содержания sHLA-I у первичных больных раком молочной железы, было установлено, что уровень растворимой формы HLA

молекул I класса статистически достоверно не отличался от нормы и составлял 1088,0±91,1 U/ml. Поскольку у таких больных неопластический процесс находился на разных стадиях развития, мы проанализировали сывороточный уровень sHLA-I на разных стадиях. На I и II стадиях уровень sHLA-I статистически достоверно не изменялся по отношению к норме. На III стадии рака молочной железы у первичных больных обнаружена тенденция к увеличению содержания sHLA-I в сыворотке крови (1160,0±153,2 U/ml). На IV стадии сывороточный уровень sHLA-I также стремился к повышению, превышая норму на 13%.

Уровень sHLA-I достоверно превышал норму при метастазах в кости и в печень в 1,6 и в 1,5 раза, соответственно. При метастазах в мягкие ткани, легкие, лимфатические узлы изменения сывороточного уровня sHLA-I в сравнении с нормой были статистически недостоверны. Однако, при метастазах в мягкие ткани и легкие уровень sHLA-I превышал норму на 60% и 14%, соответственно. Повышенный уровень sHLA-I на стадиях III и IV блокирует активность CD8+ Т-клеток и NK-клеток, что, с нашей точки зрения, является одним из факторов приводящих к формированию метастазов.

Проведен анализ сывороточного содержания sHLA-I у больных, имеющих единичные очаги поражения молочной железы и множественные очаги поражения. При наличии единичных очагов поражения молочной железы сывороточный уровень sHLA-I не отличался от нормы. В то же время мультицентричный рост опухоли сопровождался статистически достоверным повышением сывороточного содержания sHLA-I в 1,5 раза. Повышенный уровень sHLA-I при мультицентричном росте опухоли позволяет сделать предположение о его опухолевом происхождении.

С целью определения возможного источника повышенных уровней сывороточного sHLA-I мы оценили количественное содержание данного белка в тканевых экстрактах опухоли и околоопухолевых тканей. Как видно из рис. 6,

наиболее высокий уровень белков зНЬА-1 регистрировался в центре опухолевого очага. По мере удаления от центра малигнизации содержание эНЬА-! понижалось. Однако в регионарных лимфоузлах оно вновь поднималось, хотя и не достигало значений, характерных для центра опухоли. Полученные результаты не позволяют дать однозначный ответ о типе клеток, с которых сходит бНЬА-1. Повышенное содержание зНЬА-1 в центре опухоли свидетельствует в пользу малигнизированных клеток. Однако, сравнительно высокий уровень бНЬА-1 наблюдался и в лимфоузлах, где источником зНЬА-1 могут быть антигенпрезентирующие клетки. Вероятно, увеличенный уровень зНЬА-1 в ткани лимфоузлов отражает идущие здесь процессы активации лимфоцитов с превращением их в эффекторные клетки с сопутствующим этим процессам шеддингом зНЬА-1 с антигенпрезентирующих клеток. Повышенный уровень вНЬЛ-Г в центре опухоли, по-видимому, связан с прямым шеддингом этих белков с малигнизированных клеткок.

Таким образом, сывороточное содержание эПЬД-Г при развитии карциномы молочной железы может формироваться как за счет шеддинга с иммунокомпетентных клеток, так и за счет шеддинга с опухолевых клеток. По мере увеличения опухолевой массы сывороточный уровень зНЬА-1 может повышаться. Источником повышенной продукции вНЬА-! будут в таком случае опухолевые клетки, реализующие один из. возможных механизмов ухода от иммунологического надзора. .

Чтобы оценить вероятность шеддинга молекул НЬА I класса с поверхности иммунокомпетентных клеток мы провели иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови при карциноме молочной железы. Из таблицы видно, что на всех стадиях опухолевого роста снижено относительное содержание СЕМ-положительных клеток и повышено относительное количество С025- и СБ71 -положительных клеток. На всех стадиях опухолевого роста не менялось относительное содержание С1Э95-положительных клеток и

мононуклеарных клеток, на поверхности которых в реакции непрямой иммунофлуоресценции выявлялись молекулы НЬА I класса.

U/ml

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Рис. б. Концентрация растворимого 8НЬА-1 белков в тканевых экстрактах опухоли и околоопухолевых тканей. 1 - центр опухоли, 2 - периферия опухоли (больше опухолевой ткани), 3 - периферия опухоли (больше околоопухолевой ткани), 4 - околоопухолевые ткани, 5 - лимфатические узлы.

Таким образом, на фоне выраженных изменений содержания С1Э4-положительных клеток, С025, С071 и СЭ8-положительных клеток, относительное количество НЬА-Г клеток и С095+ клеток при карциноме молочной железы не претерпевает у первичных больных выраженных изменений.

Как показано выше, при раке молочной железы происходит изменение сывороточных уровней растворимых СЕ)95 и НЬА-1 белков. При этом относительное количество мононуклеарных клеток крови, экспрессирующих

данные молекулы на поверхности мембраны у первичных больных, статистически достоверно не изменялось. Повышение сывороточного содержания эСЕ)95 протеина может быть следствием повышенной продукции данного белка путем альтернативного сплайсинга мРНК иммунокомпетентными клетками или малигнизированными клетками. Причиной изменения уровня зНЬА-1 в сыворотке крови при карциноме молочной железы может быть шеддинг данных молекул как с поверхности мононуклеарных клеток крови, так и с поверхности клеток опухоли.

Таблица

Относительное содержание антиген-положительных мононуклеарных клеток (%) в периферической крови при раке молочной железы

Популяция антиген-клеток Здоровые доноры крови I стадия II стадия III стадия IV стадия

CD4 41,53±1,89 24,3811,944 27,8712,81*1 27,2211,054 29,1211,294

CD8 22,83+1,14 25,84±1„12 22,66+2,68 29.14+1,85'Т 24,9311,03

CD22 18,9±21,09 18,08+2,44 17,79±2,36 20,64+1,38 19,4011,22

CD25 12,73±2,60 24,34+1,88't 24,5112,88*Т 28,0511,85'Т 27,9011,73't

CD71 14,74±0,60 19,96+1,00't 25,61±2,65*Т 26,53+1,9ГТ 22,3711,53't

HLA-DR 23,71 ±0,96 28,44±3,48 21,80+2,59 25,7411,60*1 24,2111,46

HLA-I 45,78±3,40 38,04±8,72 45,96±3,67 46,9212,04 42,3812,66

CD95 24,12±3,50 22,3117,41 21,03+3,91 28.8412,03 26,2411,52

* - Статистически достоверные изменения в сравнении с нормой (р<0,5).

При исследовании взаимосвязи между содержанием циркулирующих форм белков С1>95 и вНЬЛ-Г в сыворотке крови первичных больных и относительным количеством клеток, несущих на поверхности их мембранную форму, была обнаружена прямая корреляционная взаимосвязь между сывороточным содержанием зНЬА-1 белков и относительным количеством мононуклеарных клеток крови, экспрессирующих данные молекулы на ПА (г5=0,125; р<0,05) и на НБ ( г5=0,7; р<0,05) подстадиях. Подобные корреляционные взаимосвязи между

■ е

сывороточным содержанием зНЬА-1 белков и относительным количеством мононуклеарных клеток, экспрессирующиих мембранные белки НЬА-1, могут говорить о повышении степени активации антигенпрезентирующих клеток, I

сбрасывающих данные белки во внеклеточное пространство. Отсутствие корреляционных отношений на последующих стадиях неопластического процесса можно объяснить резким повышением продукции зНЬА-1 опухолевыми клетками.

Поскольку сывороточный уровень бСШ5 уже на начальных стадиях рака молочной железы существенно превышает норму, а уровень зНЬА-1 протеина, зависимый от массы опухоли, не отличается от нормальных значений, то при исследовании взаимосвязи между сывороточными уровнями зНЬА-1 и зСЕ)95 закономерно обнаружена обратная как на I, так и на II стадиях корреляция (г5—0,9 и г5=-0,7, соответственно, р<0,05). Обратная корреляция между уровнями бНЬА-1 и бС095 свидетельствует о специфическом воздействии опухоли на иммунную систему на ранних стадиях .заболевания, заключающемся в одновременном нарушении активационных процессов Т-лимфоцитов и возможном запуске механизма апоптоза.

При исследовании взаимосвязи между концентрациями раково-эмбрионального антигена и циркулирующей формы белка С1Э95 в сыворотке крови больных раком молочной железы была обнаружена прямая корреляция на II •

стадии заболевания (коэффициент ранговой корреляции Спирмена г5 = 0,5; р > 0,05). При исследовании уровня антигена МиС-1 у первичных больных

выявлено, что сывороточный уровень данного антигена коррелирует с сывороточным уровнем sCD95 антигена на III стадии неопластического процесса и с уровнем sHLA-I антигена на И стадии.

Gimmi С. D. et al. (1996) считает, что MUC-1 может индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов и рассматривает данную функцию этого антигена как важный механизм ухода опухоли от иммунологического контроля. Одновременное изменение концентраций sHLA-I, sCD95 и MUC-1 свидетельствует о возможности совместной модуляции активационных процессов иммунной системы на разных стадиях карциномы молочной железы.

Можно заключить, что сывороточный уровень sCD95 и sHLA-I на разных стадиях рака молочной железы коррелирует с сывороточным уровнем опухолеассоциированных антигенов, нарушающих процессы межклеточной адгезии и модулирующих состояние иммунной системы. Растворимые формы молекул HLA I класса и CD95 можно отнести, таким образом, к группе белков, обеспечивающих при карциноме молочной железы формирование механизмов ухода опухолевых клеток от иммунологического надзора.

ВЫВОДЫ

]. При неопластических альтерациях растворимые белки CD95 и HLA 1 класса обеспечивают формирование механизмов ухода опухолевых клеток от иммунного надзора, что свидетельствует об их участии в модуляции гомеостаза человека.

2. На всех стадиях карциномы молочной железы, а также при других опухолях сывороточный уровень растворимого CD95 протеина возрастает, создавая условия для реализации антиапоптотических механизмов.

3. Повышенный сывороточный уровень растворимого белка CD9S снижается при

успешной полихимиотерапии карциномы молочной железы, но сохраняется на высоком уровне при резистентности к полихимиотерапии.

4. При неоплазиях различного происхождения происходит повышение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, которое связано с нарастанием опухолевой массы.

5. Анализ содержания растворимого белка CD95 и растворимых молекул HLA I класса в тканях больных раком молочной железы свидетельствует, что источником повышенного содержания этих белков могут быть как малигнизированные клетки, так и клетки иммунной системы.

6. Сывороточный уровень растворимого белка CD95 и молекул HLA I класса положительно коррелирует на II и III стадиях неопластического роста с концентрацией опухолеассоциированного антигена MUC-1 и раково-эмбрионального антигена, что указывает на возможность совместной модуляции этими протеинами иммунофизиологических реакций.

Список публикаций по теме диссертации

1. Таги ров О.Т., Козлов А.Ю., Новиков В.В., Алясова A.B., Варшавская JI.B., Барышников А.Ю. Растворимый Fas(CD95) антиген, ингибирующий апоптоз, как прогностический биомаркер течения рака молочной железы. // Вестник Нижегородскиого госуниверситета, Серия Биология. - 2001.- Выпуск 1(3).- С.21-25

2. Голенков А.К., Митина Т.А., Новиков В.В., Тагиров О.Т., Королева В.В., Крыжанова М.А., Луцкая Т.Д., Новиков Д.В., Барышников А.Ю. Клиническое значение растворимых молекул адгезии (sCD50 - ICAM-3), апоптоза (sCD95) и sMLA класса I при лимфопролиферативных заболеваниях. // Российский биотерапевтический журнал. - 2002, № 1, С. 60-64.

3. Тагиров О.Т., Алясова A.B., Козлов А.Ю., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Изменения уровня растворимого CD95 антигена в сыворотке крови больных раком молочной железы в процессе комплексной терапии. И В кн. Здоровье

sHLA класса I при лимфопролиферативных заболеваниях. II Российский биотерапевтический журнал. - 2002, № 1, С. 60-64.

3. Тагнров О.Т., Алясова A.B., Козлов А.Ю., Барышников А.Ю., Новиков В.В. Изменения уровня растворимого CD95 антигена в сыворотке крови больных раком молочной железы в процессе комплексной терапии. // В кн. Здоровье населения Нижегородской области. Сборник научных трудов, Изд-во ННГУ, Н.Новгород.- 2002.- С. 106-110.

3. Тагнров О.Т., Алясова A.B., Крыжанова М. А., Мартынова Т.Г., Новиков В.В. Сравнительное изучение содержания растворимого CD95 антигена и антигенов HLAI класса в сыворотке крови больных раком молочной железы. // Сб. работ 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН. Часть I. - Курск.- 2002.-С.121-122.

5. Алясова A.B., Тагнров О.Т., Варшавская Л.В., Копылова Г.Е., Новиков В.В., Барышников А.Ю. К вопросу об иммунологическом мониторинге рака молочной железы. II Российский биотерапетический журнал. - 2003. - № 1. - С.4-4.

6. Тагнров О.Т., Птицына Ю.С. Роль растворимого Fas антигенна в механизмах ухода опухоли от иммунного ответа на примере рака молочной железы // Седьмая нижегородская сессия молодых ученых. Тезисы докладов. - С. 219-220.

(

Формат 60x90 1/8. Усл. печ. л. 1. Бумага офсетная. Печать офсетная. Заказ 1510. Тираж 100.

Типография Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского Лицензия № 18-0099 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

\ >

■» 1 8 О 5 в

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тагиров, Олег Таликович

Основные сокращения и обозначения

Введение

1. Обзор литературы 9 1.1. Мембранные белки клеток иммунной системы

1.1.1. Мембранная форма CD4 протеина

1.1.2. Мембранная форма CD8 протеина

1.1.3. Мембранная форма CD22 протеина

1.1.4. Мембранная форма CD25 протеина

1.1.5. Мембранная форма CD71 протеина

1.1.6. Мембранная форма молекулы HLA II класса

1.1.7. Мембранная форма молекулы HLA I класса

1.1.8. Мембранная форма белка CD95 16 * 1.2. Противоопухолевый иммунитет

1.2.1. Опухолевые антигены

1.2.2. Механизмы ухода опухоли от иммунологического надзора

1.3. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы

1.3.1. Растворимая форма молекулы HLA I класса

1.3.2. Растворимая форма Fas (CD95) протеина

1.4. Роль CD95 протеина в механизме программируемой клеточной гибели

2. Материалы и методы

3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование сывороточного содержания белка sCD95 при неопластических процессах различной этиологии

3.2. Оценка уровня sCD95 протеина на разных стадиях опухолевого процесса при карциноме молочной железы

3.3. Уровень sCD95 протеина в сыворотке крови больных раком молочной железы при противоопухолевой терапии

3.4. Оценка уровня sHLA-I протеинов при опухолевых процессах различной этиологии

3.5. Оценка уровня sHLA-I при карциноме молочной железы

3.6. Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови на разных стадиях карциномы молочной железы

3.7. Анализ взаимосвязи между мембранной, сывороточной экспрессией молекул CD95, HLA-I и уровнем опухолеспецифических белков при раке молочной железы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль растворимых белков CD95 и HLA I класса в альтерации гомеостаза человека на примере неоплазий"

Физиологические механизмы сохранения гомеостаза включают в себя как важную составную часть сохранение динамического равновесия между двумя такими фундаментальными процессами как пролиферация и апоптоз. Значительную роль в поддержании гомеостатического равновесия играют молекулярные и клеточные механизмы иммунных реакций. Адекватный и полноценный иммунный ответ является необходимой реакцией организма на возникновение и развитие неопластических процессов.

В молекулярных механизмах таких реакций принимает участие множество мембранных белков, в том числе молекулы главного комплекса системы гистосовместимости I класса и опосредующий апоптоз белок CD95 (Fas-антиген). Если мембранные молекулы HLA I класса обеспечивают презентацию фрагментов чужеродных, в том числе и опухолевых антигенов с последующей пролиферацией иммунокомпетентных клеток и выполнением ими эффекторных функций, то белок CD95 является клеточным рецептором, через который передается апоптотический сигнал [33; 158]. Известно, что как молекулы HLA I класса, так и белок CD95 могут существовать в растворимой форме. В экспериментах in vitro продемонстрировано, что растворимая форма белка CD95 и молекул HLA I класса обладают выраженным действием на клетки иммунной системы. Растворимые молекулы HLA I класса способны вызывать апоптоз С08-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток [58; 160]. Именно эти клетки наиболее эффективны в реализации противоопухолевого иммунитета. Растворимый белок CD95 взаимодействует с Fas-лигандом на поверхности цитотоксических клеток, также вызывая их апоптоз [151]. Это, в свою очередь, может приводить к дополнительному подавлению клеточного звена иммунитета, направленного на защиту от развития неопластических процессов.

Цель работы. Изучение тканевого содержания и физиологического значения растворимых форм белков CD95 и HLA Т класса при альтерации гомеостаза неопластического генеза.

Задачи исследования

1. Определить сывороточный уровень растворимой формы опосредующего апоптоз CD95 протеина и растворимых белков HLA I класса в норме и при неоплазиях различного происхождения.

2. Исследовать динамику сывороточного содержания растворимого CD95 протеина и растворимых молекул HLA I класса на разных стадиях развития опухолевого процесса на примере рака молочной железы.

3. Определить содержание растворимого белка CD95 и растворимых молекул HLA I класса в опухолевом очаге, околоопухолевой ткани и регионарных лимфатических узлах.

5. Исследовать возможность наличия корреляционных взаимосвязей между мембранной экспрессией молекул CD95, HLA I класса, их сывороточным содержанием и сывороточной концентрацией опухолеассоциированного антигена MUC-1 и раково-эмбрионального антигена (РЭА).

Научная новизна. Впервые проведено одновременное исследование содержания растворимого белка CD95 и молекул HLA I класса в разных тканях при карциноме молочной железы, результаты которого свидетельствуют о том, что источником повышенного уровня этих белков в крови могут быть как клетки иммунной системы, так и опухолевые клетки. Максимальные сывороточные концентрации растворимого белка CD95 и молекул HLA I класса выявлены при метастазах в костно-мозговую ткань и печень. Обнаружены корреляционные связи между выявляемым в реакции иммунофлуоресценции относительным содержанием мононуклеарных клеток, экспрессирующих на мембране молекулы HLA I класса, и сывороточным уровнем растворимых молекул HLA I класса, а также между сывороточным уровнем растворимого CD95 протеина, молекул HLA I класса, опухолеассоциированного MUC-1 антигена и раково-эмбрионального антигена, указывающие на возможность совместной модуляции данными белками иммунофизиологических механизмов. На основании полученных данных сделано заключение об участии растворимого белка CD95 и растворимых молекул HLA I класса в механизмах ухода опухоли от иммунологического надзора, что приводит к дополнительной альтерации гомеостатического равновесия в условиях пролиферации малигнизированных клеток.

Научно-практическая значимость. Представленные в работе результаты свидетельствует о вкладе растворимых форм CD95 протеина и молекул HLA I класса в альтерацию гомеостаза при развитии неоплазий. Продемонстрировано прогностическое значение сывороточного содержания белка CD95 при полихимиотерапии карциномы молочной железы. Полученные результаты расширяют представления о картине изменения сывороточной концентрации растворимых белков CD95 и молекул HLA I класса при неоплазиях разного происхождения и могут быть использованы при разработке новых методов иммунофизиологического мониторинга.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При нарушениях гомеостаза опухолевого генеза происходят изменения сывороточного содержания растворимого белка CD95 и молекул HLA I класса.

2. Источником повышенного содержания растворимого белка CD95 и молекул HLA I класса в сыворотке крови могут быть как клетки иммунной системы, так и малигнизированные клетки.

3. Растворимые формы белка CD95 и молекул HLA I класса можно отнести к белкам, обеспечивающим формирование механизмов ухода опухолевых клеток от иммунологического надзора.

Апробация работы. Основные результаты представлены на 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центральночерноземного научного центра РАМН (Курск, 2002), Международной конференции по биотехнологии, посвященной памяти академика И.Н.Блохиной (Москва, 2002), VII Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2002).

1. Обзор литературы 1.1. Мембранные белки клеток иммунной системы

Многочисленные функциональные свойства различных субпопуляций лимфоцитов, как основные (распознавание антигенных эпитопов и обмен сигналов с другими клетками иммунной системы), так и вторичные (участие в различных типах межорганных взаимодействий) сводятся к единому, базисному процессу - активации. Именно на основе этого феномена происходят практически все иммунологические реакции [48].

Процесс активации сопровождается появлением, а чаще увеличением количества на внешней мембране лимфоцитов определенного набора эссенциальных, т.е. обязательных для данного функционального состояния клетки молекул. Это так называемые маркеры активации или активационные антигены. Активационные рецепторы при этом по своей функциональной принадлежности могут относиться к самым различным группам. Например, рецепторы цитокинов (CD25), молекулы адгезии (ICAM-1 и ICAM-3), продукты главного комплекса гистосовместимости (HLA 1 и II класса), ферменты (CD26, CD38) и т.д.[53].

Иммунная система характеризуется большим разнообразием поверхностных антигенов, экспрессирующихся на разных стадиях дифференцировки клеток. Каждой стадии дифференцировки свойственен собственный набор антигенов, которые чаще всего являются белками. Различают антигены, специфические для отдельных ростков гемопоэза и отдельных стадий дифференцировки клеток, а также антигены, экспрессирующиеся на клетках, принадлежащих различным росткам гемопоэза [5].

Отдельные маркеры клеток иммунной системы были обнаружены еще в 60-х годах [6]. Однако, серьезный прогресс в этом направлении был достигнут только после появления гибридомной технологии, позволяющей получать моноклональные антитела, выявляющие отдельные эпитопы мембранных протеинов [20].

В настоящее время насчитывается более 230 классифицированных мембранных антигенов системы гемопоэза, впервые выявленных с помощью МКА (CD-классификация). Введение унифицированных наименований антигенов путем сравнения специфичности выявляющих их МКА позволяет избежать разночтений и несоответствий в работе с дифференцировочными антигенами и выявляющими их МКА [17].

Группа клеточных рецепторов (антигенов), выявление которых было связано с изучением иммунного ответа, получила свое название в соответствии с их участием в процессе иммунологического распознавания (LFA - lymphocyte function associated molecule) или в формировании иммунологической памяти (VLA very late antigen). Название рецепторов, целенаправленно охарактеризованных как молекулы контактного взаимодействия, в большинстве случаев строится из сочетаний окончания САМ (cell adhesion molecules) с первыми буквами, обозначающими или тип клеток, на котором обнаружены данные рецепторы (V - vascular, BL - B-lymphocyte, I - intercellular, N - nerve, L - liver), или два типа клеток, взаимодействие между которыми они обеспечивают (РЕ - plateled-endotelium, LE - leucocyte-endotelium) [3].

В настоящее время основой для классификации служит структурное сходство рецепторов с определенными семействами белковых молекул. По структурным характеристикам выделяют не менее семи семейств поверхностных белков клеток иммунной систмы: 1) суперсемейство иммуноглобулинов, 2) семейство интегринов, 3) семейство селектинов, 4) семейство муцинов, 5) семейство кадхеринов, 6) семейство молекул, аналогичных рецепторам фактора некроза опухолей и фактора роста нервов, 7) семейство мембраноассоциированных экстраферментов и компонентов экстраклеточного матрикса [18].

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Тагиров, Олег Таликович

выводы

1. При неопластических альтерациях растворимые белки CD95 и HLA I класса обеспечивают формирование механизмов ухода опухолевых клеток от иммунного надзора, что свидетельствует об их участии в модуляции гомеостаза человека.

3. Повышенный сывороточный уровень растворимого белка CD95 снижается при успешной полихимиотерапии карциномы молочной железы, но сохраняется на высоком уровне при резистентности к полихимиотерапии.

Заключение

Одним из актуальных направлений современных иммуно-физиологических исследований является изучение механизмов взаимоотношения иммунной системы и опухолевых клеток. Хорошо известно, что жизнь и смерть клеток четко контролируется мембранными белками и их лигандами, которые активируют или ингибируют процессы пролиферации и апоптоза. Апоптоз - это физиологический процесс саморазрушения клеток, вызываемый включением внутриклеточного молекулярного механизма запрограммированной гибели. В последнее время исследованиями ряда авторов показано существование взаимосвязи между нарушениями регуляции процесса апоптоза и развитием онкологических, аутоиммунных и других заболеваний, сопровождаемое снижением эффективности иммунологического надзора. В рамках концепции программированной клеточной гибели пытаются объяснить многие ключевые события канцерогенеза [42]. Считается, что опухолевый рост является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом [1]. В механизмах апоптоза нормальных и измененных тканей активное участие принимает ряд факторов, среди которых выделяют ключевой рецептор апоптоза белок CD95. Взаимодействуя с Fas-лигандом, экспрессируемым, в частности, активированными цитотоксическими Т-лимфоцитами, он индуцирует программу гибели клетки. Менее изучена значимость растворимых форм белка CD95, которые преимущественно образуются за счет альтернативного сплайсинга мРНК, приводящего к образованию транскрипта, соответствующего растворимой форме [33; 98]. Повышенная продукция sCD95 различными типами клеток, наблюдаемая при ряде патологических состояний, может быть причиной устойчивости этих клеток к Fas-зависимому апоптозу.

Еще одним растворимым белком, вызывающим апоптоз клеток, являются растворимая форма молекул гистосовместимости I класса. В экспериментах in vitro продемонстрировано, что sHLA-I, взаимодействуя с белком CD8 на поверхности цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, вызывают их апоптоз. Таким образом может понижаться противоопухолевый потенциал этих двух важных типов клеток при повышении концентрации sHLA-I в межклеточном пространстве тканей. Поскольку как sCD95, так и sHLA-I способны вызывать апоптоз иммунокомпетентных клеток мы исследовали их содержание в межклеточном пространстве ряда тканей с целью определения функциональной роли этих белков в механизмах взаимоотношений опухолей и иммунной системы на молекулярном уровне.

С помощью иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител, было исследовано содержание растворимого белка CD95 и молекул HLA I класса в сыворотке крови при неоплазиях различного генеза. В норме сывороточное содержание растворимого CD95 белка, ингибирующего апоптоз, равнялось 401,0+17,8 U/ml. При неоплазиях различного происхождения сывороточный уровень CD95 протеина менялся в сторону увеличения. При опухолях гематологического происхождения выявлено статистически достоверное его повышение при лимфогранулематозе и хроническом лимфолейкозе, что соответствует данным других авторов [113; 81]. При лимфоцитарной лимфоме и множественной миеломе сывороточный уровень растворимого CD95 белка имел тенденцию к нарастанию.

При опухолях солидного характера (рак легкого, рак желудка, рак молочной железы) также обнаруживалось увеличение сывороточного уровня растворимого белка CD95. Наиболее выраженным это повышение было при раке молочной железы.

В связи с этим мы провели более детальное изучение характера изменений в содержании этого белка в тканях больных карциномой молочной железы. На всех стадиях развития карциномы сывороточный уровень белка CD95 был статистически достоверно повышен в сравнении с нормой. Максимальный его уровень был выявлен на III стадии опухолевого процесса. У больных, имеющих отдаленные метастазы в различные органы и ткани, наиболее высокий уровень белка CD95 наблюдался при метастатическом поражении костей скелета и метастатическом поражении печени. Наличие множественных очагов поражения молочной железы у первичных больных не влияло на сывороточный уровень белка CD95. Таким же образом на содержание белка CD95 не влиял гистологический тип опухоли.

Причины повышения sCD95 при метастазах в костную ткань, вероятно, связаны с реакцией гемопоэтических клеток на вторжение метастатических очагов опухоли в кость. Повышение sCD95 при метастазах в печень может быть связано с реализацией опухолью защитных механизмов, позволяющих ей уходить от иммунологического надзора.

Наиболее вероятным представляется существование двух источников формирования повышенных количеств sCD95 протеина: активированные Т-лимфоциты и опухолевые клетки. Чтобы определить возможные источники формирования повышенных сывороточных уровней растворимого белка CD95 мы провели анализ его содержания в тканевых экстрактах из различных участков опухоли и околоопухолевой ткани.

Наиболее высокие концентрации sCD95 протеина обнаруживались в участке опухолевой ткани, соответствующем ее центру, а также в регионарных лимфатических узлах. В экстрактах околоопухолевых тканей содержание sCD95 протеина было ниже, чем в экстрактах, полученных из центра опухоли или близлежащих лимфоузлов.

Основываясь на полученных данных, можно заключить, что как лимфоидные ткани и клетки, так и опухолевые клетки могут быть источником растворимого CD95 протеина. Если лимфоидные клетки, и, в первую очередь, Т-лимфоциты, продуцируют этот белок, по-видимому, в результате чрезмерной активации, что приводит к ее самоограничению, то опухолевые клетки секретируют sCD95 в целях самозащиты.

Повышенный уровень sCD95 белка при раке молочной железы свидетельствует о его существенной роли в механизме воздействия опухоли на иммунную систему. Известно, что сывороточный белок sCD95 нарушает связывание мембранного CD95 с его лигандом, вмешиваясь в образование функционально активного гомотримера и таким образом подавляет апоптоз клеток-мишеней. Повышенная продукция sCD95 при раке молочной железы может рассматриваться как дополнительный механизм ухода раковых клеток от иммунологического надзора.

В связи с этим мы предположили, что в случае успешного проведения химиотерапии сывороточный уровень растворимого CD95 должен снижаться. Наблюдение за больными, находящимися на лечении в Нижегородском областном онкодиспансере и получавшими стандартную противоопухолевую терапию, подтвердило такое предположение. При успешной химиотерапии уровень растворимого CD95 снижался до уровня нормы в течение 10-14 дней, выполняя при этом роль прогностического показателя, свидетельствующего об эффективности проводимой терапии. У больных, резистентных к полихимиотерапии, сывороточный уровень оставался повышенным, создавая тем самым дополнительные условия для опухолевого роста.

Растворимые молекулы HLA I класса, как и CD95, способны индуцировать апоптоз цитотоксических Т-клеток. В наших исследованиях сывороточное содержание молекул HLA I класса в норме составило 1001,5±19,6 U/ml.

Определение сывороточного содержания молекул HLA I класса обнаружило его значительное повышение при ряде неоплазий.

Так, оно было статистически достоверно повышено при лимфоме, миеломе, раке желудка, раке легкого. При миеломной болезни и раке легкого данные о повышении сывороточного содержания молекул НТА I класса получены впервые. При карциноме молочной железы обнаруживался статистически недостоверный подъем сывороточного уровня растворимых молекул HLA I класса в 1,3 раза. На разных стадиях развития опухолевого процесса сывороточное содержание растворимых молекул HLA I класса также статистически достоверно не менялось. Не отличался от нормы сывороточный уровень sHLA-I и при разных гистологических вариантах опухоли. Однако, на стадиях, характеризующихся наличием отдаленных метастазов, был выявлен статистически достоверно повышенный уровень растворимых молекул HLA I класса при метастатическом поражении костей скелета и поражении печени. Кроме того, было обнаружено, что при мультицентричном росте опухоли сывороточное содержание sHLA-I статистически достоверно повышалось в 1,47 раза.

Средний уровень sHLA-I в тканевых экстрактах различных областей опухоли, околоопухолевой ткани, а также околоопухолевых лимфатических узлов различался. Наиболее высокий уровень белков sHLA-I регистрировался в центре опухолевой ткани. По мере удаления от центра малигнизации содержание sHLA-I понижалось. Однако в регионарных лимфоузлах он вновь поднимался, хотя и не достигал значений характерных для центра опухоли. Полученные результаты не позволяют дать однозначный ответ о типе клеток, с которых сходит sHLA-I. Повышенное содержание sHLA-I в центре опухоли свидетельствует в пользу малигнизированных клеток. Однако, сравнительно высокий уровень sHLA-I наблюдался и в лимфоузлах, где источником sHLA-I могут быть антигенпрезентирующие клетки. Вероятно, увеличенный уровень sHLA-I в ткани лимфоузлов отражает идущие здесь процессы активации лимфоцитов с превращением их в эффекторные клетки с сопутствующим этим процессам шеддингом sHLA-I с антигенпрезентирующих клеток. Повышенный уровень sHLA-I в центре опухоли, по-видимому, связан с шеддингом этих белков с малигнизированных клеток, с защитой опухолевых клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток, а также с повышением концентрации sHLA-I в кровотоке.

Таким образом, сывороточное содержание sHLA-1 при развитии карциномы молочной железы может формироваться как за счет шеддинга с иммунокомпетентных клеток, так и за счет шеддинга с опухолевых клеток. По мере увеличения опухолевой массы сывороточный уровень sHLA-I может повышаться, что подтверждается увеличением сывороточного содержания sHLA-I при мультицентричном росте опухоли, а также результатами, полученными при оценке сывороточного уровня sHLA-I при множественной миеломе и хроническом лимфолейкозе. В совместных исследованиях с А.К.Голенковым нами было продемонстрировано увеличение сывороточного уровня молекул HLA I класса при множественной миеломе и хроническом лимфолейкозе по мере возрастания опухолевой массы. Наиболее вероятным источником повышенной продукции sHLA-I в таком случае являются опухолевые клетки, реализующие один из возможных механизмов ухода от иммунологического надзора.

Чтобы оценить вероятность формирования повышенных концентраций растворимых молекул CD95 и HLA I класса путем шеддинга с поверхности иммунокомпетентных клеток, мы провели при карциноме молочной железы иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови. Наряду с оценкой относительного количества CD954 и HLA-I положительных клеток оценивали содержание CD4, CD8, CD22, CD25, CD71 и HLA-DR положительных клеток. На всех стадиях опухолевого роста выявлено снижение относительного содержания С04-положительных клеток, являющихся Т-хелперами, и повышение относительного количества активированных CD25 и CD71 положительных клеток, а также цитотоксических Т-лимфоцитов. Выявленные изменения соответствуют литературным данным [77; 38]. Увеличение субпопуляции цитотоксических лимфоцитов на III стадии заболевания при снижении относительного количества С04-клеток свидетельствует о выраженных изменениях популяционного состава клеток крови, что отражает сложные механизмы иммунных реакций в ответ на онкогенную трансформацию клеток организма. Если повышение относительного количества CD25+-, CD71+-, СЭ8+-клеток можно рассматривать как признак мобилизации противоопухолевых механизмов иммунной системы, то снижение относительного числа CD4+ отражает механизмы иммуносупрессии.

На всех стадиях опухолевого роста не менялось относительное содержание С1Э95-положительных клеток и мононуклеарных клеток, на поверхности которых в реакции непрямой иммунофлуоресценции выявлялись молекулы HLA I класса. Тем не менее, при наличии метастазов в костях скелета относительное содержание HLA-I+ клеток статистически достоверно понижалось, а при метастазах в мягкие ткани наблюдалась тенденция к повышению содержания таких клеток. Полученные данные свидетельствуют о возможности изменения сывороточной концентрации sHLA-I при метастазах в костную ткань за счет шеддинга с поверхности иммунокомпетентных клеток.

Корреляционный анализ выявил на II стадии опухолевого роста достоверную прямую связь между сывороточным содержанием молекул HLA I класса и относительным количеством мононуклеарных клеток, экспрессирующих данные молекулы. Подобные корреляционные взаимосвязи могут свидетельствовать о повышении степени активации антигенпрезентирующих клеток, которые могут сбрасывать данные белки во внеклеточное пространство. Отсутствие корреляционных взаимоотношений на последующих стадиях неопластического процесса можно объяснить резким повышением продукции sHLA-I опухолевыми клетками.

Хорошо известны такие антигены как MUC-1 и раково-эмбриональный антиген. Их сывороточный уровень повышается при карциноме молочной железы. Они играют важную роль в нарушении гомеостаза при неоплазиях, индуцируя апоптоз иммунокомпетентных клеток и ингибируя клеточную адгезию Считается, что они принимают участие в реализации механизмов ухода опухоли от иммунологического контроля. [62; 74]. Мы провели сравнительное изучение сывороточного уровня MUC-1, РЭА, sCD95 и sHLA-I при карциноме молочной железы.

При исследовании взаимосвязи между концентрациями раково-эмбрионального антигена и циркулирующей формы белка CD95 в сыворотке крови больных раком молочной железы была обнаружена прямая корреляция на II стадии заболевания. При исследовании сывороточного содержания антигена MUC-1 у первичных больных обнаружено, что концентрация данного антигена коррелирует с сывороточным уровнем sCD95 антигена на III стадии неопластического процесса и с уровнем sHLA-I антигена на II стадии. Одновременное изменение концентраций sHLA-I, sCD95 и MUC-1 свидетельствует о возможности совместной модуляции активационных процессов иммунной системы на разных стадиях карциномы молочной железы.

Можно заключить, что сывороточный уровень sCD95 и sHLA-I на разных стадиях рака молочной железы коррелируют с сывороточным уровнем опухолеассоциированных антигенов, нарушающих процессы межклеточной адгезии и модулирующих состояние иммунной системы. Растворимые формы молекул HLA I класса и CD95 можно отнести, таким образом, к группе белков, обеспечивающих при карциноме молочной железы формирование механизмов ухода опухолевых клеток от иммунологического надзора.

Ill

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тагиров, Олег Таликович, Нижний Новгород

1. Аббасова С.Г., Кушлинский Н.Е., Мурашев А.Н. и др. Растворимый антиген в сыворотке крови онкологических больных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1999. -Т. 127. - № 3. - С. 328-331.

2. Алясова А.В., Королева В.В., Крыжанова М.А. Исследование содержания растворимых антигенов CD38, CD26, CD 18 у больных лимфогранулематозом // Клин. лаб. диагностика. 2000. - №9. - С. 40.

3. Александров А.В., Джексон A.M., Румянцев А.Г. Анализ механизма модуляции межклеточных молекул адгезии ICAM // Иммунология. 1997. -№1. - С. 4-10.

4. Балдуева И.А., Семиглазов В.Ф. Иммунологические показатели больных раком молочной желез (зависимость от возраста, репродуктивной функции, клинико-патологической формы заболевания и темпа роста опухоли) // Вопр. онкол. 1996. - Т. 42. - №3. - С. 31-34.

5. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. М. - 1997. - 222 с.

6. Брондз Б.Т. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании. М: Наука. - 1987. - 471 с.

7. Волянский Ю.Л., Клолтова Е.Ю., Васильев Н.В. Молекулярные механизмы программированной клеточной гибели // Успехи современной биологии. 1994. -Т. 114. - С. 670-692.

8. Возный Э.Л., Добровольская Н.М., Бехов М.Ю., Туров С.Н., Сотников Е.И. Варианты противоопухолевой терапии больных РМЖ с метастазами в печень // Палл. мед. и реабил. 1996. - 2000. - № 1-2. - с. 69.

9. Вязьмина Е.С. Особенности иммунного ответа организма на Treponema Pllidum: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. - 2002. - 22 с.

10. Говалло В.И. Иммунология против рака. М: Знание. -1987.-64 с.

11. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика. - 1999. - 450 с.

12. Глобенко Г.В., Канаев С.В. Современные проблемы радиационной онкологии // Вопросы онкологии. 1997. Т.34, № 5. - С. 15-22.

13. Гриневич Ю.А. Нарушения в системе иммунитета при раке молочной железы. // Эксперим. онкол. 1982. - Т. 4. - № 3, - С. 40-43,

14. Дреслер К. Иммунология. Словарь. Киев, 1988. С. 161-162.

15. Камптова-Полевая Е.Б., Огнерубов Н.А. Иммунология и иммунотерапия рака молочной железы. Воронеж. - 1994. - 346 с.

16. Кнапп В., Рисбер П., Деркен Б. На пути к более полной характеристике поверхностных молекул лейкоцитов человека // Гематол. и трансфузиол.- 1990. № 4. - С. 10-14.

17. Козлов И.Г., Горилина И.К., Чередеев А.И. Рецепторы контактного взаимодействия // Иммунология. 1995. - №4. - С.34-38.

18. Летягин В. П., Высоцкая И. В., Легков А. А., Погодина Е. М., Хайленко В.А. Лечение доброкачественных и злокачественных заболеваний молочной железы. -М. 1997.-232 с.

19. Манько В.М., Хаитов В.М. Иммунокомпетентные клетки. М: ВИНИТИ. -1987. - 247 с.

20. Маянский А.Н., Калашников С.П., Маянский Н.А., Заславская М.И., Овсянников В.Я., Абаджиди М.В. Апоптоз: новая концепция в медицине // Нижегородский медицинский журнал. -1997.- №5.- С.70-76.

21. Мельников С. Б., Дударенко О. И., Савицкий В. П., Барышников А. Ю. Экспрессия антигена АРО-1/Fas у дутей, больных раком щитовидной железы, проживающих на загрязненных радионуклеидами территориях // Иммунология. 1998.-№2.- С. 10-15.

22. Модников О.П., Новиков Г.А., Родионов В.П. Попытка объектизазии болевого синдрома и оценка эффективности лечения костных метастазов у больных раком молочной железы // Палл. мед. и реабил. 2000. - №3. - С. 9-10.

23. Низелин Р.С. Апоптоз // Молекулярная биология. 1996.- т.ЗО - с. 11

24. Новиков В.В. Растворимые формы дифференцировочных антигенов гемопоэтическких клеток // Гематология и трансфузиология, 1996. №6. с.40-43.

25. Олейник Е. К., Шибаев М. И. Особенности экспрессии CD95 на лимфоцитах приферической крови при онкологической и аутоиммунной патологиях // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2000. - № 9. - С. 324-326.

26. Пальцев М.А., Иванов А.А., Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина. - 1995. - С. 56-57.

27. Полосухина Е.Р., Заботина Т.Н., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю. Получение и характеристика моноклональных антител (МКА) ICO-160, направленных к молекуле FAS (АРО-1/ CD 95), опосредующей апоптоз // Материалы всероссийского съезда онкологов. 1997. - С. 176.

28. Птицына Ю.С и соавт. Растворимый и мембранный Fas/APO-1 (CD95)антиген в крови больных гепатитами В и С // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. - №10. - С. 10

29. Птицына Ю.С. Сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при вирусных гепатитах В, С и G: Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. -2003.- 164 с.

30. Ройт А. Основы иммунологии. М: Мир. - 1991. - 328 с.

31. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Рос. биотерапевт, журн. 2002. - Т 1. - № 3. - С. 27-34.

32. Савина Н.П., Медведев B.C. Иммунный статус после лучевой терапии прремиссии. прогрессировании и метастазировани // Вопр. онкол 1991. - Т. 37. - № 6. - С. 671-675.

33. Саламатов С.П. Иммунофенотипическая характеристика крови больных раком легкого: влияние иммунорегулирующей терапии: Автореф. дис. канд. мед. наук. М. 1992. - 25 с.

34. Сейц И.Ф., Князев П.Г. Молекулярная онкология. JI: Медицина. - 1986. -352 с.

35. Серебряная Н.Б., Кукушкин А.В., Петров С.Б. и др. Иммунологические параметры периферической крови и иммунологические маркеры у больных раком кожи // Иммунология. 1997. - № 5. - С. 53-56.

36. Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы. // Молекулярная биология.- 1996. -т.30 -с. 487-501.

37. Хаитов P.M., Алексеев Jl.П. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека // Иммунология. 2001. - № 3. - С. 4-12.

38. Халеев Д.В., Потапов Ю. Н., Маслова И. А., Крутова Т. В.,Содержание больших гранулярных лимфоцитов в периферической крови онкологических больных. Связь с эффективностью лечения // Иммунология . 1997. - № 3.- С. 58-62.

39. Хансон К.П. Роль апоптоза в канцерогенезе и терапии опухолей // Материалы всероссийского съезда онкологов. 1997. - С. 177-178.

40. Цой И.Г., Сапаров А.С., булегенова М.Г., Джумагулова А.Б., Сексенбаев Б.Д. Функциональная активность цитотоксических субпопуляций лимфоцитов локального и системного иммунитета при раке и язвенной болезни желудка // Иммунология. 1994. - №4. - С.43-45.

41. Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Клеточные аспекты иммунных процессов. -М: ВИНИТИ. 1985. - 238с.

42. Чердынцева И.В., Полушина О.А., Кусимарцев С.Л., Васильев И.В. Сравнительная характеристика цитостатической и мембраностатической активности опухолеассоциированных лимфоцитов // Иммунология. 1997. - № З.-С. 55-58.

43. Шабашова И.В. Лекции по клинической иммунологии. Спб., - 1998. - 113 с.

44. Якубовская Р.И. Современные представления о молекулярных механизмах канцерогенеза и опухолевой прогрессии как основа для разработки новых методов терапии злокачественных новообразований // Российский онкологический журнал. 2000. - № 5.- С. 45-49.

45. Ярилин А.А., Основы иммунологии.- М: Медицина. 1999. - 608 с.

46. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. -1996. -№ 4. С. 10-21.

47. Alderson M.R. et al., 1995 Alderson M.R.,Tough T.W., Davis-Sminh T. et al. FAS ligand mediates activation induced cell death in human T limphoytes // J. exp.Med. - 1995. -V. 181. - P. 71-77.

48. Agrawal В., Krantz M. J., Parker J., Longenecker В. M. Expression of MUC1 mucin on activated human T cells: implications for a role of MUC1 in normal immune regulation // Cancer. Res. 1998. - V. 58. - P. 4079-4081.

49. Barclay A.N., Birekeland M.L., Brown M.H. et al. The leucocyte antigen facts book. London: Academic Press. - 1993. - 492 p.

50. Black P.H., Shedding from normal and cancer cell surface antigens // New England J. Med.- 1980.-V. 303.-N. 24. P. 1415-1416.

51. Bonilla F., Alvarez-Mon M., Merino F., de la Hera A., Ales J.E., Espana P., Durantez A. Interleukin-2 induces cytotoxic activity in lymphocytes from regional axillary nodes of breast cancer patients // Cancer. 1988. - N61(4). - P. 629-34.

52. Brenner B.G., Benarrosh S., Margolese R.G. Peripheral blood natural killer cell activity in human breast cancer patients and its modulation by T-cell growth factor and autologous plasma // Cancer. 1986. N58(4). - P.895-902.

53. Carbone E., 1996 Carbone E., Terrazzano G., Colonna M. at al. Natural killer clones recognize specific soluble HLA class I molecules // Eur. J. Immunol. 1996. -V. 26.-N3.-P. 683-689.

54. Cascino I., Fiucci G., Papoff G., Ruberti G. Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing // J. Immunol. 1995,-V. 154.-N 6.-P. 2706-2713.

55. Coen J.J., Duke R.C. Glucocorticoid activation of a calcium dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell // Arch. Biochem. Biophys. - 1987. -V.258.-P. 498 -503.

56. Cohen J.M., Sun X.M., Snowden R.T. et al. Formationof large molecular weight fragments of DNA is a key committed step of apoptosis in thymocytes // J. Immunol. 1984.-V. 153.- P. 507-516.

57. Colomer R., Ruibal A., Salvador L. Circulating tumor marker levels in advanced breast carcinoma correlate with the extent of metastatic disease // Cancer. 1989. -N64(8).-P. 1674-81.

58. Contini P., Ghio M., Merlo A. et al. Soluble HLA class I/CD8 ligation triggers apoptosis in EBV CD8(+) cytotoxic T lymphocytes by Fas/Fas-ligand interaction // Hum. Immunol. 2000. - Vol. 61. - N12. - P. 1347-1351.

59. Cosman D., Cerretti D.P., Larsen A. et al. Cloning, sequence and expression of human interleukin-2 receptor // Nature. 1984. - V. 312. -N768. - P. 1223-1228.

60. Crespo J., Rivero M., Mayorga M. et al. Involvement of the fas system in hepatitis С virus recurrence after liver transplantation // Liver Transpl. 2000. - Vol. 6. -№5.-P. 562-569.

61. Dadian G., Riches P.G., Henderson D.C., Taylor A., Moore J., Atkinson H., Gore M.E. Immunological parameters in peripheral blood of patients with renal cellcarcinoma before and after nephrectomy // Br. J. Urol. 1994. - V.74. -Nl. - P. 1522.

62. Debatin K.-M., Suess D., Krammer P.H. Differential expression of APO-1 on human thymocytes: implications for negative selection? // Eur. J. Immunol. — 1994. -V. 24.-N3.-P. 753-758.

63. Debatin K.-M., Krammer P.H. Resistance to APO-1 (CD95) induced apoptosis in T-ALL is determined by a BCL-2 independent anti-apoptotic program // Leukemia. 1995.-V. 9.-N5.-P. 815-820.

64. DeVito-Haynes L.D., Jankowska-Gan E., Sollinger H.W. Monitoring of kidney and simultaneous pancreas-kidney transplantation rejection by release of donor-specific, soluble HLA class I // Hum Immunol. 1994. - V.40. -N 3. - P. 191-201.

65. Dhein J., Walczak H., Baumler C. et al. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/CD95) //Nature. 1995. -V. 373. -N 6513. - P. 438-441.

66. Duvall E., Willie A.H., Macrophase recognition of cell undergoins programmed cell death ( apoptosis ) // Immunol. Today. 1996. - V.7. - P. 115-119.

67. Funaro A., Horenstein A.L., Calosso L. at al. Identification and characterization of an active soluble form of human CD38 in normal and pathological fluids. // Int. Immunol. 1996.-V. 8.-N ll.-P. 1643-1650.

68. Ghio M., Contini P., Mazzei C. at al. Soluble HLA class I, HLA class II, and Fas ligand in blood components: a possible key to explain the immunomodulatory effects of allogeneic blood transfusions // Blood. 1999. - V.93. - N 5. - 1770-1777.

69. Hadden J.W. The immunology and immunotherapy of breast cancer: an update // Int. J. Immunopharmacol. 1999. - V.21(2). - P. 79-101.

70. Hagihara M., Shimura Т., Yamamoto K. at al.Clinical significance of serum soluble HLA class I antigens in systemic lupus erythematosus // J. Exp. Clin. Med. — 1993. V.18. -N 1-2.-P. 61-64.

71. Hagihara M., Shimura Т., Takebe К at al.Serum concentrations of soluble HLA-class I and CD8 forms in patients with viral hepatic disorders // J. Gastroenterol. -1997.- V.32.-N3.-P. 338-343

72. Hakim AA. Peripheral blood lymphocytes from patients with cancer lack interleukin-2 receptors //Cancer. 1988. - V.61. - N4. - P. 689-701.

73. Harmon B.V., Takano Y.S., Winterford C.M., Gobe G.C. The role of apoptosis in the response of cells and tumours to mild hyperthermia // Int J Radiat Biol. 1991. -V.59.-N2.-P. 489-501.

74. Herberman R.B. Possible role of natural killer cells and other effector cells in immune surveillance against cancer // J Invest Dermatol. 1984. - V.83. - P. 137140.

75. Hayes D.F. Serum tumor markers for breast cancer // 5-th International conference on adjuvant therapy of primary breast cancer. St Callen. Switzerland. 1-4 March. Anti-cancer Drags. 1989. vol. 6. suppl.2 P. 26-27.

76. Hiromatsu Y., Bednarczuk Т., Soyejima E. et al. Increased serum soluble Fas in patients with Graves' disease // Thyroid. 1999. - V. 9. - N 4. - P. 341-345.

77. Hilkens J., Buijs F. Biosynthesis of MAM-6, an epithelial sialomucin. Evidence for involvement of a rare proteolytic cleavage step in the endoplasmic reticulum // J Biol. Chem. 1988. - V.263. - P. 4215-4222.

78. Hori Y., Wada H., Mori Y. at al. Plasma sFas and sFas ligand levels in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura and in those with disseminated intravascular coagulation//Am. J. Hematol. 1999.- V. 61.-N1.-P. 21-25.

79. Hortobagyi G.N., Buzdar A.U. Progress in inflammatory breast cancer: cause for cautious optimism // J. Clin. Oncol. 1986. - V.4 - N12. - P. 1727-1729.

80. Hughes D.P., Crispe I.N. A naturally occurring soluble isoform of murine Fas generated by alternative splicing // J. Exp. Med. 1995. - V.182. - N 5. - P. 13951401.

81. Jacobson M.D., Burne J.F., Raff M. Programmed cell death and Bcl-2 protektion in the absence of a nucleus // EMBO J. 1994. - V.13. - P. 1899-1910.

82. Jodo S., Kobayashi S, Nakajima Y. at al. Elevated serum levels of soluble Fas/APO-1 (CD95) in patients with hepatocellular carcinoma // Clin. Exp. Immunol. 1998.-V. 112.-N2.-P. 166-171.

83. Jodo S., Kobayashi S., Kayagaki N. et al. Serum levels of soluble Fas/APO-1 (CD95) and its molecular structure in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and other autoimmune diseases // Clin. Exp. Immunol. 1997. - V.107. - N1. -P. 89-95.

84. Keane M.M. Fas expression and function in normal and malignant breast cell lines // Cancer Res. 1996. - V.56. - N20. - P. 4791-4798.

85. Kevin L.O., Kevin E.D., Edward A.C. CD22 regulator B-cell receptor-mediated signals via two domains that independently recruit Grb 2 and SHP-1 // J. Biol. Chem. -2001. V. 276 . - № 47. - P. 44315-44332.

86. Kawakami H., Shigematsu Y, Ohtsuka T. at al. Increased circulating soluble form of Fas in patients with dilated cardiomyopathy // Jpn. Circ. J. 1998. - V. 62. -N 12,- 873-876.

87. Kasahara Y., Wada Т., Niida y., Seki H. et al. Novel Fas (CD95/APO-1) mutations in infants with a limphoproliferative disorder // Int. Immunol. V.10. — N2.-P. 195-202.

88. Lang E, Schirrmacher V, Altevogt P. Molecular identification of lectin binding sites differentiating related low and high metastatic murine lymphomas// Clin. Exp. Metastasis. -.1988. N6(1) - P. 61-72.

89. Lee S.H., Kim S.Y., Lee J.Y., Shin M.S., Dong S.M., Na E.Y., Park W.S.,.Kim K.M., Kim C.S., Kim S.H., Yoo N.J. Detection of soluble Fas mRNA using in situ reverse transcription-polymerase chain reaction // Lab. Invest. 1998. - V.78-N4. -P. 453-459.

90. Leonard W.J., Depper J.M, Crabtree G.R. et al Molecular cloning and expression of cDNAs for the human interleukin-2 receptor // Nature. 1984. - V. 311. - P. 626 -231.

91. Mansueto S., Vitale G., Mocciaro C. at al. Modifications of general parameters of immune activation in the sera of Sicilian patients with Boutonneuse fever // Clin. Exp. Immunol. 1998. - V. 111.-N 3.-P. 555-558.

92. Mapara M.Y., Bargou R., Zugck C. et al. APO-1 mediated apoptosis or proliferation in human chronic В lymphocytic leukemia: correlation with bcl-2 oncogene expression // Eur. J. Immunol. 1993. - V. 23. -N 3. - P. 702-708.

93. Mathew J.M., Shenoy S., Phelan D., Lowell J., Howard Т., Mohanakumar T. Biochemical and immunological evaluation of donor-specific soluble HLA in thecirculation of liver transplant recipients // Transplantation 1996. — V. 62. N 2. — P. 217-223.

94. Matsuoka Y. The role of sugar chains in the antigenicity of CEA molecule // Gan To Kagaku Ryoho. 1989. - V.16(3). - P. 702-714.

95. Matsuura H., Jimbo S., Miyamura M. at al. A study of the association between HLA phenotype and serum concentration of soluble HLA class I // Nihon Rinsho. Meneki. Gakkai. Kaishi. 1997. - V. 20. -N 2. - P. 102-107.

96. Mercep C., Bluestone J.A., Noguchi P.P, Ashwell J.P. Inhibition of transformed T cell growth in vitro by monoclonal antibodies directed aganst distinct activating molecules // J. Immunol. 1988. - V. 140. - P. 324-325.

97. Mizutani Y., Yoshida O., Bonavida B. at al. Prognostic significance of soluble Fas in the serum of patients with bladder cancer // J. Urol. 1998. - V. 160. - N 2. -P. 571-576.

98. Munker R., Younes A., Cabanillas F. et al. Soluble CD95 in the serum of patients with low and intermediate grade malignant lymphomas: absence of prognostic correlations // Leuk. Lymphoma. 1997. - Vol. 27.- № 5-6. - P. 517-521.

99. Muschen M., Warskulat U., Brekmann M. W. Defining CD9as tumor suppressor gene // J. Mol. med. 2000. - V. 78. - P. 312-325.

100. Muschen M., Warskulat U., Peters-pegehr T. Involvement of CD95 (Apo-l/Fas) ligand expressed by rat Kupffer cells in hepatic immunorelation // Gastroenterology. 1999. - V. 116. - P. 666-677.

101. Muschen M., Warskulat U., haussinger d. deranged CD95 sistem in a case of Charg-Strauss vasculit // Gastroenterology. 1998. - V. 114. - P. 1351-1352.

102. Muschen M., Warskulat U., Even JCD95 ligand expression as a mechanism of immune escape in breast cancer // Immunobiology. 2000. - V. 99. - P. 69-77.

103. Nagata S., Goldstein P. The Fas death factor // Science. 1995. - V. 267. - P. 1449-1456.

104. Nicoto M., Montalban C., Gouzaber-Porque P., Villar L. M. Increased soluble serum HLA clas I antigen in patiants with lymphoma // Hum Immunol. 1997. - V . 58. -№2.-P. 106-111.

105. Niitsu N., Sasaki K., Umeda M. A high serum soluble Fas/APO-1 level is associated with a poor outcome of aggressive non-Hodgkin's lymphoma // Leukemia. 1999.-V. 13.-N9.-P. 1434-1440.

106. Novellino PS, Trejo YG, Beviacqua M, Bordenave RH, Rumi LS.Cisplatin containing chemotherapy influences HLA-DR expression on monocytes from cancer patients // J. Exp. Clin. Cancer. Res. 1999. - N18(4). - P. 481-484.

107. Owen-Schaub L.B., Yonehara S., Crump W.L., Grimm E.A. DNA fragmentation and cell death is selectively triggered in activated human lymphocytes by Fas antigen engagement // Cell Immunol. 1992. - V. 140. -N 1. - P. 197-205.

108. Oberhammer F., Wilson J.W., Dive C. et al. Apoptotic death in epithelial cells : cleavage of DNA to 300 and/ or 50 kb fragments prior to or in the absens of internucleosomal fragmentation // EMBO J., 1993. - V.12. - P. 3679-3684.

109. Ohtsuka Т., Hamada M., Sasaki O. at al. Clinical implications of circulating soluble Fas and Fas ligand in patients with acute myocardial infarction // Coron. Artery. Dis. 1999.- V. 10.-N 4.-P. 221-225.

110. Papo Т., Parizot C,. Ortova M. at al. Apoptosis and expression of soluble Fas mRNA in systemic lupus erythematosus // Lupus. 1998. - V. 7. - N 7. - P. 455461.

111. Papoff G., Casino I., Eramo A. at al. An N-terminal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. 1996. - V. 156. -N 12.-P. 4622-4630.

112. Peter M.E., Scaffidi С., Medema J.P., Kischkel F., Krammer P.H. The death receptors. In Apoptosis, Problems and Diseases. Edited by Kumar S. Heidelberg: Springer. 1998.-P. 25-63.

113. Ptitsina Yu.S., Matveeva E.M., Kopnina E.O. at al. Increased level of soluble CD38 antigen in sera of HIV-infected persons // Russian J. HIV/AIDS and Rel. Probl.- 1999.-V. 3. N 1. - P. 166-167.

114. Puppo F., Picciotto A., Brenci S. at al. Behavior of soluble HLA class I antigens in patients with chronic hepatitis С during interferon therapy: an early predictor marker of response?// J. Clin. Immunol. 1995. - V. 15. - N 4. - P. 179-181.

115. Puppo F., Ghio M., Contini P. at al. Immunoregulatory role of soluble HLA molecules: a new skin for an old subject? // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). -1998.-V.46.-N3.-P. 157-160.

116. Puppo F., 1994 Puppo F., Brenci S., Lanza L. at al. Increased level of serum HLA class I antigens in HIV infection. Correlation with disease progression // Hum. Immunol. 1994. - V. 40. - N 4. - P. 259-266.

117. Regimbald L. H., Pilarski L. M., Longenecker В. M., Reddish M. A., Zimmermann G., Hugh J. C. 1996. The breast mucin MUCI as a novel adhesion ligand for endothelial intercellular adhesion molecule 1 in breast cancer // Cancer. Res. V. 56. P. 4244-4249

118. Rhynes V.K., McDonald J.C., Gelder F.B. et. al. Soluble HLA class I in the serum of transplant recipients // Ann. Surg. 1993. - Vol. 217. - № 5. - P. 485-489.

119. Sabine M. W., Leo A. J., Reshma A. A structure-function study of ligand recognition by CD22(3 // J. Biol.Chem. 2001. - V.276 - N16. - P. 12967 -12973.

120. Sano H., Asano K., Minatoguchi S. at al. Plasma soluble fas and soluble fas ligand in chronic glomerulonephritis // Nephron. 1998. - V. 80. - N 2. - P. 153161.

121. Shimaoka Y., Hidaka Y., Okumura M. at al. Serum concentration of soluble Fas in patients with autoimmune thyroid diseases // Thyroid. 1998. - V. 8. - N 1. - P. 43-47.

122. Shimura Т., Hagihara M., Yamamoto K. at al. Quantification of serum-soluble HLA class I antigens in patients with gastric cancer // Hum. Immunol. 1994. - V. 40. - N 3. - P. 183-186.

123. Saririan K.K., Contini P, Indiveri F., Gross P.A., Russo C. Serum HLA class I levels in elderly humans. Utilization in following the response to influenza vaccine // Hum. Immunol. 1994. - V. 40. - N 3. - P. 202-209.

124. Schneider C., Owen M.J., Banville D, Williams J.G. Primary structure of human transferrin receptor deduced from the mRNA sequence // Nature. 1984. - V. 311.— P. 675-681.

125. Shimaoka Y., Hidaka Y., Okumura M. at al. Serum concentration of soluble Fas in patients with autoimmune thyroid diseases // Thyroid. 1998. - V. 8. - N 1. - P. 43-47.

126. Suda Т., Hashimoto H., Tanaka M., Ochi Т., Nagata S Membrane Fas ligand kills human peripheral blood T lymphocytes, and soluble Fas ligand blocks the killing // J. Exp. Med. 1997. - V. 186. - P. 2045-2050.

127. Suda Т., Takahashi Т., Golstein P., Nagata S. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family // Cell. 1993. -V. 75.- P. 1169-1178.

128. Suda Т., Okazaki Т., Naito T. et al. Expression of the Fas ligand in cells of T cell lineage // J. Immunol. 1995. - V.154. - P. 3806-3812.

129. Stuart B.W. Mehanisms of apoptosis : integration of genetic, biocemical and cellular inductors // J. Natl. Cancer Inst. 1994. - V. 86. - P. 1286-1296.

130. Sellins K.S., Cohen J.J. Cytotoxic T limphosytes induse different types of DNA damage in target of different origins // J.Immunol. 1991.-v.147.-p. 795 -803.

131. Steger G.G., Mader R., Derfler K., Moser K., Dittrich C. Mucin-like cancer-associated antigen (MCA) compared with CA 15-3 in advanced breast cancer // Klin Wochenschr. 1989. - Aug 17. N67(16). - P. 813-817

132. Takahashi Т., Makiguchi Y., Hinoda Y., Kakiuchi H., Nakagawa N., Imai K., Yachi A. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient // J. Immunol. 1994. - V.153. -P. 2102-2109

133. Tanaka M., Suda Т., Takahashi Т., Nagata S. // EMBO J. 1995.- V.14. - P. 1129-1134.

134. Tortorella C., Sacco R., Orlando P. sICAM-1, sCD95 and sCD95L levels in chronic liver diseases of different etiology // Immunopharmacol. immunotoxicol. — 2000-V. 22.-Nl. P. 19-33.

135. Trowbridge I.S., Collawn J.F., Hopkins C.R. Signal-dependent membrane protein trafficking in the endocytic pathway // Annu. Rev. Cell Biol. 1993. - N 9. -P. 129-136.

136. Trowbridge I.S., Omary M.B. Human cell surface glycoprotein related to cell proliferation is the receptor for transferrin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1981. -V. 78.-P. 3039-3041.

137. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M. at al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis // Science. 1989. - 245. - P. 301-305.

138. Ueno Т., Toi M., Tominaga Т. Circulating soluble Fas concentration in breast cancer patiants // Clin. Cancer Res. 1999. - № 11 - P. 3529-3533.

139. Vaux D.L., Strasser A. The molecular biology of apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. - P. 2239-2244.

140. Waldmann T.A. The interleukin-2 receptor // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. -P. 2681-2685.

141. Wallach D, Kovalenko AV, Varfolomeev EE, Boldin MP. Death-inducing functions of ligands of the tumor necrosis factor family: a Sanhedrin verdict // Curr. Opin. Immunol. 1998. - N10(3). - P. 279-288.

142. Wobst B, Zavazava N, Luszuk D at al. Molecular forms of soluble HLA in body fluids: potential determinants of body odor cues // Genetica. 1998 V. 104. - N 3.-P. 275-283.

143. Wolf R.E., 1998 Wolf R.E., Adamashvili I.M., Gelder F.B. at al. Soluble HLA-I in rheumatic diseases // Immunol. 1998. - V. 59. - N 10. - P. 644-649.

144. Wyllie A.H. Glucocorticoid induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation // Nature, 1980. - v.284.- p. 555-556.

145. Wyllie A.H. Apoptosis // Br. J. Cancer. 1993. - v.67. - p. 205-208.

146. Yang C.W., Kim T.G., Kim Y.S. Serum soluble HLA class I antigen levels in hemodialysis patients and following renal transplantation // Am. J. Nephrol. 1995. -V. 15.-N4.-P. 290-294.

147. Yonehara S, Ishii A., Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor // J. Exp. Med. 1989. - V. 169. - P. 1747-1756.

148. York I.A., Rock K.L. Antigen processing and presentation by the class I major histocompatibility complex // Annu. Rev. Immunol. -1996. V. 14. - P. 369-396.

149. Zavazava N., Wobst В., Ferstl R., Muller-Ruchholtz W. Soluble MHC class I molecules in human body fluids// J. Clin. Lab. Anal. 1994.- V. 8.-N6. - P.432.436.

150. ZavazavaN. Soluble HLA class I molecules: biological significance and clinical implications//Mol. Med. Today. 1998. - V. 4. -N 3. - P. 116-121.

151. Zavazava N., Kronke M. Soluble HLA class I molecules induce apoptosis in alloreactive cytotoxic T lymphocytes // Nature Med. 1996. - V. 2. - P. 1005-1007.

152. Zipp F., Otzelberger K., Dichgans J., Martin R., Weller M. Serum CD95 of relapsing remitting multiple sclerosis patients protects from CD95-mediated apoptosis // J Neuroimmunol. 1998. - V. 86. -N 2. - P. 151-154.

Информация о работе

Тагиров, Олег Таликович
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2003
ВАК 03.00.13

Диссертация

Роль растворимых белков CD95 и HLA I класса в альтерации гомеостаза человека на примере неоплазий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы