Исследование механизмов регуляции апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой

Хассан Мохилдейн Абдел Маруф

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизмов регуляции апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов регуляции апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой"

На правах рукописи

ХАССАН МОХИЛДЕЙН АБДЕЛ МАРУФ

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ

03.00.04.-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена на кафедре биологической химиии Московской Медицинской Академии и.м. И.М.Сеченова.

Научные руководители:

Доктор химических наук, профессор Северин СЕ.

Кандидат биологических наук,

Белушкина Н.Н.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

Е. Ю. Москалева Доктор биологических наук, профессор С.П. Сяткин

Ведущая организация: НИИ биомедицинской химии и.м. В.Н. Ореховича РАМН.

Защита состоится «_»_2004 года в_часов на

заседании ученого совета Д 212.203.13 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «__»_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Кандидат формацевтических наук, доцент Лагуткина Т.П.

2004-4 22623

W/S36

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

СКВ характеризуется поликлональной активацией В-лимфоцитов и продукцией широкого спектра антител к ядерным и цитоплазматическим антигенам. Предполагается, что при СКВ пролиферация В-клеток является Т-клеточно-зависимой и антиген-опосредованной. Считается также, что персистенция аутореактивных В- и Т-лимфоцитов ответственна за гипергаммаглобулинемию и продукцию аутоантител [Dean GS. et al., 2000, Rose LM.,etal.,1997].

Одним из механгомов, благодаря которым осуществляется элиминация аутореактивных лимфоцитов, является апоптоз. Нарушения его регуляции может вносить определенный вклад в генез данного аутоиммунного заболевания [Mountz J D. et al., 1994]. Одним из главных путей, запускающих апоптоз, является путь, начинающийся с активации Fas-рецептора. Fas играет центральную роль в иммунном гомеостазе и опосредует передачу апоптотического сигнала в зрелых активированных лимфоцитах [Lynch DH. et al., 1995]. Перекрестное связывание Fas с лигандом FasL вызывает апоптоз с характерной цитоплазматической и ядерной конденсацией и фрагментацией ДНК [Itoh N et al., 1991].

Существует предположение о возможной роли апоптотических клеток в развитии СКВ [Andrade F. et al., 2000]. У больных СКВ показано возрастание уровня апоптотических лимфоцитов в периферической крови [Perniok A. et al., 1998]. Кроме того, было установлено, что в процессе апоптоза аутоантигены выносятся на поверхность внешней мембраны апоптотических клеток. Это может определять продукцию аутоантител непосредственно к внуриклеточно локализованным антигенам [Casciola-Rosen LA et al.,1994]. В эксперименте было показано, что введение большого количества апоптотических клеток животным вызывает у них аутоиммунную реакцию [Mevorach D et al., 1998].

иммунореактивностью организма больного в целом. Неизвестно также, какие еще факторы, вызывающие апоптоз и сопутствующие ему, могут играть роль в патогенезе заболевания. Из литературы известно, что у ряда больных СКВ происходит возрастание концентрации апоптоз-ингибирующих факторов, таких как растворимый Fas (sFas), Bcl-2, и антител против Fas-L [Cheng J ., 1994, Jodo S.et al., 1997, Rose LM, .et al., 1997, Tokano Y.et al., 1996, Van Lopik T.et al., 1999]. Апоптоз лимфоцитов может быть инициирован также использованием препаратов-иммуносупрессоров [Thompson СВ., 1995].

С другой стороны, на экспериментальных моделях мышей линий Ipr (лимфопролиферация) и gld (генерализованная лимфопролиферативная болезнь) показано, что развитие СКВ прямо связано с дефектами Fas-сигнального пути. У мышей обеих линий мутации в гене Fas и FasL приводят к развитию аутоиммунного синдрома с утратой Т-клеточной толерантности, В-клеточным нарушениям, гипергаммаглобулинемией и продукцией аутоантител [Rose LMet al., 1997]. MRL-lpr/gld мыши имеют мутацию в гене Fas, что приводит в экспрессии мутантного белка и нарушению сплайсинга мРНК, в то время как СЗН/HeJ-gld/gld мыши, дефицитны по функциональному лиганду FasL в результате одиночной мутации [Lorenz HM.et al., 1997]. Дальнейшие исследования СКВ у человека также привели к обнаружению аналогичных дефектов в функционировании Fas и FasL. Однако, до настоящего времени не определена степень участия системы Fas - Fas-L в развитии и регуляции апоптоза при СКВ у человека [Elmen W. Et al. ,1994].

Поэтому целью настоящего экспериментального исследования явилось изучение механизмов регуляции апоптоза в лейкоцитах периферической крови больных СКВ.

В связи с этим были сформулированны следующие задачи исследования:

1. Анализ иммунореактивности больных СКВ с количественным определением активированных лейкоцитов, основных субпопуляций лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD20, CD25), индекса иммунорегуляции (CD4/CD8) и уровня общего комплемента.

2. Изучение зависимости количества различных субпопуляций лейкоцитов в состоянии апоптоза от степени активности заболевания.

3. Исследование уровня экспрессии Fas и Fas-L в различных субпопуляциях лейкоцитов и содержания sFas в крови пациентов в зависимости от степени активности заболевания.

4. Анализ изменений ДНК лейкоцитов в качестве раннего маркера апоптоза в зависимости от степени выраженности заболевания.

Научная новизна. Показано, что степень фрагментации ДНК на начальных стадиях апоптоза лейкоцитов периферической крови больных СКВ значительно превышает значения этого показателя у здоровых доноров. Увеличение числа повреждений ДНК при этом определяется стадией развития заболевания.

Доказана выраженная прямая зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах. Показано также, что уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных системной красной волчанкой зависел от выраженности заболевания и активности системы Fas - Fas-L. Установлено, что уменьшение содержания В-лимфоцитов в периферической крови больных СКВ не является обязательным признаком.

Практическая значимость исследования. Информация о роли системы Fas - Fas-L в патогенезе СКВ, а также обнаруженная зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах выражена в виде линейного уравнения регрессии, которое может быть использовано в клинической практике при планировании лечебных мероприятий и прогнозе исхода заболевания. Апробация работы. Результаты исследований были доложены на II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (2001г., Москва), на VIII Международного конгресса по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» (21-24 апреля 2002., Канны, Франция), на FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction (3-8 July2003., Belgium, Brussels). Апробация работы состоялась на научно-практической конференции кафедры биологической химии и лаборатории молекулярной биологии и биохимии НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова г. Москва, 3 декабря 2003 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исседований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список цитированной литературы, включающий 246 источник, приложение. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 16 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Клинический материал. В исследование были включены 34 больных детей в возрасте от 6 до 17 лет с верифицированным диагнозом СКВ и 11 больных детей в возрасте от 5 до 16 лет с верифицированным диагнозом системной склеродермии. Диагноз и стадия СКВ устанавливались по критериям американской ревматоидной организации на основании

результатов клинических, биохимических, иммунологических и инструментальных методов исследований (полученные с Кафедры биохимии детских болезней ММА им. И. М. Сеченова «Москва»). Контрольную группу составили 33 здоровых донора в возрасте от 18 до 35 лет (из Научного Центра Хирургии им. А. А. Вишневского «Москва»). В ряде исследований в качестве выборки сравнения использовали группу больных системной склеродермией, диагноз которой также устанавливали по критериям американской ревматоидной организации.

Выделение мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов из периферической крови. Лимфоциты выделяли из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования в растворе фиколла-пак (р= 1,077 г/мл). Гранулоциты получали из фракции клеток, оседающих на дно пробирки при центрифугировании крови в градиенте фиколла-пакю Ганулоциты очищали от эритроцитов методом осмотического шока в ледяной бане [Ferrate A., Thong Y.H., 1978].

Анализ субпопуляций лимфоцитов. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили при помощи проточного цитофлуориметра - анализатора и сортировщика клеток EPICS XL-2 ("Beckman coulter", США).Суспензию лимфоцитов инкубировали с моноклональными. антителами фирмы. Сорбент-(Россия). При этом использовали двойную флуоресцентную метку: ФИТЦ для антител к CD-20 и CD-25 антигенам и фикоэритрин для антител, выявляющих CD-3, CD-4, CD-8, и CD-19 антигены. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) рассчитывали по отношению содержания CD-4 лимфоцитов к CD-8 лимфоцитам.

Оценка степени повреждения ДНК. лейкоцитов проводилась прямым флуориметрических методом по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток [Birnboim H.C., Jevcac J.J., 1981] с бромистым этидием в качестве флюорофора. Измеряли интенсивность флуоресценции ДНК лизатов проб, не подвергавшихся щелочной денатурации (Т), проб, после ограиченного щелочного лизиса в стандартных условиях (Р, 1 час инкубации лизата клеток в щелочного растворе при температуре 15С°), и фоновую флуоресценцию проб с полностью денатурированной ДНК (В), затем рассчитывали величину D по формуле D= (Р- В)/(Т-В)х100%, где Т, Р, и В-интенсивность флуоресценции соответствующих проб. Величина D при этом соответствует доле ДНК, остающейся в виде двунитевой ДНК в стандартных условиях лизиса. Это величина может быть прямо использована в качестве непосредственного показателя для количественной оценки степени повреждения ДНКклеток.

Определение количества апоптотических лейкоцитов. Количество апоптотических клеток определяли как в свежевыделенных лейкоцитах периферической крови, так и после их инкубации в среде RPMI-1640 в СО2 инкубаторе с 5% содержанием С02 за 18ч и 36ч .

Для исследования апоптоза клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 1 ч при 4°С. Фиксированные клетки отмывали от этанола и ресуспендировали в 1 мл DNA-окрашивающего реагента (PBS, рН 7,4, содержащий 0,1 % тритона Х-100, 0,1мМ ЭДТА (рН 7,4), 0,05 мг/мл рибонуклеазы А и 50 мкг/мл йодистого пропидия) в течение 1 ч при комнатной температуре. Окрашенные клетки анализировали с помощью проточного цитофлюориметра Epics XL-2 ("Beckman Coulter", США) при длине волны возбуждения Х,,=488нм и длине волны эмиссии Х,=620-700нм. Апоптотические ядра обнаруживались как широкий пик гиподиплоидной ДНК который был легко отличим от узкого диплоидного пика DNA нормальных клеток.

Определение количества апоптозных Т-лнмфоцитов. Клетки

общей популяции лимфоцитов, в количестве 1 млн суспендировали в 50 мкл PBS с 0,1% азида натрия, затем добавляли по 2 мкл ФИТЦ-меченых моноклональных антител (анти -CD3, анти-СО-4, анти-СБ-8, анти-СО-19, анти-СО-25), затем инкубировали в темноте при +4С°. После инкубации дважды отмывали в 200 мкл PBS с 0.1% азида натрия и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант отбрасывали, прецигштировавшие клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали при +4С° в течение 1 часа. Затем этанол удаляли и дважды отмывали клетки 200 мкл PBS с 0.1.% азида натрия при +4С° с центрифугированием 1000 об/ мин в течение 10 минут. Добавляли 0,1 млмл йодистого пропидия и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Анализировали клетки на проточном цитофлуориметре Epics XL-2 ("Beckman Coulter", США) при длине волны возбуждения Х,=488нм и длине волны эмиссии ^=620-700нм.

Определение Fas/Fas-L в лейкоцитах. В работе использовали первичные антитела к человеческому Fas (клон DX2, мышиные IgG( фирмы PharMigen, США), и к человеческому Fas-L (клон NOK-1, mouse IgGt> фирмы PharMigen, США). После добавления первичных антител клетки инкубировали 30 мин при 4 С0. После инкубации клетки дважды отмывали с PBS с 0,1% азидом натрия при 4 С0. Вторичные антитела козы к мышиному IgGi, меченые ФИТЦ, использовали в разведении 1:100 с PBS и с 0,5'% желатина и 0,1% азидом натрия. Клетки, зафиксированные 1% параформальдегидом, анализировали с помощью проточной

цитофлюориметрии Epics XL (Beckman Coulter).

Определение растворимого sFas в плазме методом ELISA.

Уровень растворимого sFas в плазме крови определялся методом «сэндвич» -иммуноферментного анализа (s-ELISA) с использованием моноклональных антител CLB-CD95/2 и CLB-CD95/6.

Определение Вс1-2 в нефракционированных лимфоцитах. 1хЮ6

клеток суспендировались в фосфатно-солевом буфере с добавлением 0.25% параформальдегида. Повышение проницаемости клеточных мембран достигалось путем инкубации клеток в 50% метаноле в течение I часа,

исследование производилось с использованием FlTC-меченых Вс1-2 моноклональных антител (Mab). Клетки инкубировались 30 минут при 4°С с последующей трехкратной- промывкой в фосфатно-солевом буфере. Флуоресценция определялась в проточном цитофлуориметре «Beckman Coulter», США.

Определение Вс1-2 в Т- и В-лимфоцитах. Т- и В- клетки в

количестве1х106 были РЕ-мечены CD3 или CD19 МАЬ соответственно в фосфатно-солевом буфере с добавлением 0.25% параформальдегида. Повышение проницаемости клеточных мембран достигалось путем инкубации клеток в 50% метаноле в течение 1 часа, исследование производилось добавлением FITC-меченых Вс1-2 МАЬ. Клетки инкубировались в течение 30 мин при 4°С с последующей трехкратной промывкой в PBS. Флуоресценция определялась на проточном цитофлуориметре «Beckman Coulter», США.

Определение общей гемолитической активности комплемента.

Общую гемолитическую активность системы комплемента определяли по Воробьевой Л.М. [1984] в так называемой гемолитической системе по реакции связывания комплемента.

Статистическая обработка данных.Статистическую обработку данных по методу стьюдента и регрессионный анализ проводили с использованием компьютерных программ "Microcal Origin" и "Statistical (Statsoft 6.0). Достоверными считали различия при р < 0.05. Корреляционный анализ проводили путем подсчета коэффициента Бравэ-Пирсона с использованием "Microcal Origin".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Повреждение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови у больных СКВ и другими аутоиммунными заболеваниями как маркер апоптогенной готовности.

1.1. Исследование уровня одноннтевых разрывов в ДНК иммунокомпетентных клеток при СКВ.

Структура ДНК больных СКВ была изучена в клетках лимфоцитов и гранулоцитов у 23 больных СКВ детей с достоверным диагнозом по критериям американской ревматоидной ассоциации, получающих глюкокортикоидную и/или цитостатическую терапию. Выборка сравнения включала в себя 11 больных детей системной склеродермией (ССД). В качестве контрольной группы исследовали аналогичные показатели у 33 здоровых добровольцев.

При обследовании здоровых добровольцев показатель поврежденной ДНК лимфоцитов периферической крови колебался от 7,3 до 30,7 %, составляя в среднем 20,1 + 1,5%. Для гранулоцитов показатель поврежденной ДНК периферической крови колебался от 1,4 до 21,1%, составляя в среднем 11,2 + 2,0% (табл.1). Эти данные свидетельствуют об

отсутствии эндогенных повреждений ДНК в исследуемых клетках [Boerrigter ME et в1.,1989, Boerrigter M. E. T. I., et 1990].

Результаты исследования повреждений структуры ДНК при СКВ и ССД представлены в табл.1. Можно со всей определенностью заметить, что при этих заболеваниях нарушается структура генетического материала лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови. При этом при СКВ более значительные повреждения наблюдаются в лимфоцитах (55,5+15,7%,), но не в гранулоцитах (34,9+16,8%). Возникновение нарушений структуры ДНК лимфоцитов при СКВ может свидетельствовать о непосредственном вовлечении в патогенез заболевания генетического аппарата клеток иммунной системы. Это подтверждается увеличением повреждений ДНК лимфоцитов в зависимости от степени активности заболевания - при Ш, более активной стадии заболевания, наблюдается наиболее высокое повреждение структуры ДНК как в лимфоцитах, так и в гранулоцитах (табл.2).

Таблица 1.

Степень повреждений ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах периферической крови человека у здоровых доноров и больных СКВ и ССД.

Группа -обследованных Число обследованных Степень повреждения ДНК (100%-0%) (М±ш)

лимфоциты гранулоцнты

здоровые 33 20,1 ±1.5 11.2±2,0

СКВ 23 55,5*±15,7 34,9±16,8

сед 11 44.7*±14.9 38.9±14.4

Примечание: * - р<0.05 по сравнению со значениями для здоровых.

Таблица 2.

Степень повреждений ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах периферической крови человека у больных СКВ в зависимости от стадии заболевания.

Степень Количество Степень повреждения ДНК

активность пациентов (100% -0%) (М±ш)

СКВ лимфоциты гранулоциы

Стадия I 6 51.7±12.2 36.3+10.5

Стадия II б 50.5±6.6 43.3*±10.7

Стадия III 11 65.6±15.2 41.3 ±14.5

Примечание: * - р<0.05 по сравнению со значениями стадии 1.

Суммарная доля повреждений генетического материала клеток лейкоцитарного звена при аутоиммунных заболеваниях намного выше, чем аналогичные показатели повреждений клеток лейкоцитарной системы здоровых доноров (рис. 1). Такое нарушение генетического материала

клеток лейкоцитарного звена может определять патогенез аутоиммунных заболеваний.

Рис.1. Суммарная доля повреждений ДНК лимфоцитов (1) и гранулоцитов (2) здоровых доноров (А), больных СКВ (Б) и ССД (В).

Таким образом, в результате изучения степени повреждения ДНК было обнаружено, что имеет место большая степень фрагментации ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах больных СКВ и ССД по сравнению со здоровыми донорами. Очевидно, что развитие аутоиммунного процесса у детей сопровождается повреждением генетического аппарата клеток крови. Было выдвинуто предположение, что степень фрагментации ДНК может служить маркером апоптогенной готовности клеток.

1.2. Изучение апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов при СКВ.

Было обнаружено незначительное повышение уровня апоптоза свежевыделенных лимфоцитов и гранулоцитов у больных СКВ (табл. 3) Однако увеличение количества клеток в состоянии апоптоза у пациентов с СКВ было не достоверно.

Таблица 3.

Результаты определения количества лимфоцитов и гранулоцитов в состоянии апоптоза у здоровых доноров и больных СКВ._

Группа % Апоптоза лимфоцитов (М + ш) % Апоптоза гранулоцитов (М + ш)

Свежевыд-еленные Через 18ч. Свежевы-деленные Через 18ч.

здоровые доноры (п=11) 1,08 ±0,51 5,55 ± 3,2 3,58 ± 1,4 15,3 ±5,6

СКВ (п=19) 1,62 ± 1,50 7,20' ±4,70 3,80 ±3,1 14,12 ±8,4

*Р<0,05

Отсутствие статистически достоверного изменения количества лимфоцитов в состоянии апоптоза в свежевыделенном образце

периферической крови обследуемых пациентов относительно группы доноров может быть связано с тем, что в периферической крови апоптотические клетки быстро подвергаются фагоцитозу макрофагами, что не позволяет зарегистрировать это явление. Более того, возможно в этом феномене проявляется ингибирующий эффект растворимого sFas in vivo. В связи с этим представляло интерес выявление комитированных к апоптозу лимфоцитов при их культивировании в виде первичной культуры в течение 18 часов.

Было обнаружено, что после инкубации количество апоптотических лимфоцитов, полученных от больных СКВ выше, чем от здоровых доноров и составляет 7,2% против 5,5% лимфоцитов в состоянии апоптоза у здоровых доноров. Другими словами, полученные данные свидетельствуют о том, что у больных СКВ большая часть лимфоцитов комитирована к апоптозу.

При исследовании апоптоза гранулоцитов у больных СКВ и здоровых доноров как в свежевыделенных клетках, так и в экспериментах in vitro при культивировании их в культуральной среде при 37С° и 5 % СО2 различий в уровне апоптоза не было обнаружено (табл. 3).

В зависимости от стадии заболевания уровень апоптоза лимфоцитов после культивирования in vitro повышался (табл. 4 и рис.2). Третья стадия СКВ характеризуется самым высоким уровнем развития апоптоза лимфоцитов. В изменении уровня апоптоза гранулоцитов аналогичной зависимости от степени активности заболевания наблюдалось, но была менее выраженной. Возможно, апоптоз лимфоцитов является определяющим звеном в патогенезе СКВ в отличие от апоптоза гранулоцитов, развитие которого определяется сопутствующим воспалительным синдромом.

Таблица 4.

Зависимость уровня апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов от активности СКВ.

Стадия Заболевания % апоптоза лимфоцитов (М±ш) % апоптоза гранулоцитов (М±ш)

Свежевы-деленные Через 18ч. Свежевыд-еленные Через 18ч.

Кп=7) 1,5 ±1,1 4,3 ±1,5 3,01 ± 1,6 10,0 ±2,8

Н(п=6) 1,5 ±0,3 7,8'±2,0 2,72 ± 1,9 12,8 ±3,6

Ш(п=6) 1,1 ±0,11 8,08*±1,0 2,03 ± 0.7 17,3 ± 6,8

*Р< 0,05 относительно I стадии.

' r j " г j л

<* 6

Рис.2. Процент апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов, свежевыделенных и инкубированных в течение 18 часов in vitro, полученных от больных СКВ и здоровых доноров.

а- здоровые доноры, б- больные СКВ

1 - свежевыделенные лимфоциты, 2 - лимфоциты после 18 часов культивирования. 3-свежевыделенные гранулоциты, 4 - гранулоциты после 18 часов культивирования.

Увеличенный уровень апоптоза лимфоцитов при СКВ может превышать возможности макрофагальной системы, что будет приводить к незавершению апоптоза и высвобождению различных внутриклеточных элементов, таких как апоптоз-специфические ДНК-фрагменты, гистоновые белки и др., что способствует формированию аутоантител.

13. Исследование корреляции между титром аутоантител, уровнем повреждений ДНК и апоптозом клеток крови.

При СКВ большое значение имеют аутоантитела в двухцепочечной ДНК (dsDNA) или одноцепочечной ДНК (ssDNA). Мы обнаружили достоверную корреляцию между титрами антител к dsDNA и процентом повреждений ДНК в свежевыделенных лимфоцитах и гранулоцитах (r=0,71 и r=0,62 соответсвенно), концентрация титра антител возрастала при увеличении повреждений в ДНК (рис.3 А и Б). Обнаруженная зависимость успешно описывается линейным уравнением регрессии.

РисЗ.Корреляция между антителами к ds DNA и процентом повреждения ДНК в лимфоцитах (г = 0.71) и гранулоцитах (г=0,62). По оси абсцисс- титр антитело 'к dsDNA. По оси ординат - процент повреждения ДНК в клетках (100% -D%).

Мы обнаружили также взаимосвязь между титром антител к dsDNA и ssDNA и уровнем апоптоза лимфоцитов инкубированных in vitro в течение 18 часов. Коэффициент корреляции равен 0,5 и 0,4 для dsDNA и ssDNA соответственно . Обнаруженная зависимость очень важна, потому, что сам процесс апоптоза является многоступенчатым процессом, определяемым большим количеством факторов. Тем не менее, в наших исследованиях все-таки удалось определить линейное уравнение регрессии, описывающее эту зависимость.

Мы также оценивали уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных СКВ на различных стадиях развития заболевания. В активной фазе заболевания (III стадия) у 12 больных (35%) отмечалось повышение антинуклеарного фактора, титр которого составил 1:320, 1:160. При II (12 больных (35%)) и I (10 больных (30%)) стадиях СКВ титр антинуклеарного фактора составил 1:40 и 1:20 ( табл. 5).

Таблнца.5.

Титр антиядерных антител при разных стадиях заболевания.

Стадия Титр антиядерных антител

заболевания__

Стадия I__отрицательный (6), 1:20(1), 1:40(3),

Стадия II отрицательный (3), 1:40(7), 1:80(2 ).

Стадия III 1 ;20(3), 1:40(1), I • 80( 1), 1:160(4), 1:320(3).

Существует мнение, что предрасположенность к апоптозу лимфоцитов периферической крови больных с СКВ может быть следствием лекарственной терапии кортикостероидами и цитостатиками. Большинство наших больных с СКВ находились на поддерживающей или базовой терапии преднизолоном.

1.4. Исследование уровня апоптоза лимфоцитов в зависимости от суточной дозы преднизолона у больных СКВ.

Мы проанализировали уровень апоптоза лимфоцитов в зависимости от суточной дозы преднизолона. Все обследуемые больные СКВ принимали преднизолон в суточной дозе от 10 мг до 40 мг. Была обнаружена корреляционная зависимость (г= 0,6) уровня апоптоза лимфоцитов от дозы преднизолона (рис. 4), выражаемая линейным уравнением регрессии Аналогичной зависимости апоптоза нейтрофилов в зависимости от суточной дозы преднизолона не наблюдалось. Глюкокортикоиды могут оказывать ингибирующее действие на апоптоз нейтрофилов. В культуре нейтрофилов i in vitro, глюкокортикоиды предотвращали развитие апоптотических процессов, определявшихся по изменению морфологии клеток (59 % по сравнению с 90 % в контроле) после 12, 24, и 48 часов применения глюкокортикоидов.

. г<4>59 , р-0 22

Рис. 4. Зависимость уровня апоптоза лимфоцитов от дозы преднизолона. По оси абсцисс - доза преднизолона (10-40мг). По оси ординат - процент апоптотических лимфоцитов больных СКВ после инкубации в течение 18 часов (г = 0,6).

1.5. Исследование уровня повреждений ДНК в зависимости от терапии у больных СКВ.

Нами было исследовано динамическое изменение уровня повреждений ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах до терапии и после 30 дней лечения в суточной дозе 45мг (1 мг/кг) преднизолона и 600 мг циклофосфана. Мы наблюдали уменьшение повреждений ДНК (в процентах) в лимфоцитах и гранулоцитах до лечения (53,6 и 31,0 соответственно) и после 30 дней лечения (50,0 и 27,8 соответственно). Уменьшение повреждений ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах, по-видимому, связано с усилением апоптоза клеток, комитированных к апоптозу. Иными словами, уровень повреждений ДНК в иммунокомпетентных клетках в результате терапии в течение 30 дней отражает количество клеток, оставшихся после апоптоза.

Снижение уровня повреждений ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах сопровождалось уменьшением титра антинуклеарного фактора до и после 30 дней лечения (1:160 против 1:10). Кроме того, лечение способствовало снижению активности заболевания: до лечения определялась третья стадия СКВ, в то время как после 30 дней лечения определялась вторая стадия.

Таким образом, можно предполагать, что уровень повреждения ДНК в лейкоцитах может служить показателем степени воздействия на патогенез болезни эффективности лечения пациентов.

1.6. Анализ субпопуляций лимфоцитов у больных СКВ.

Наши результаты показали, что, существенных различий в количестве Т-клеток у больных СКВ по сравнению с нормальными донорами не было; как для CD3+ Т-клеток (68,7%±9,9 % и 62,4%±12,2%, соответственно), так и в случае CD8+ Т-клеток (25,3± 10,6 в сравнении с 20,9%±11,5%); и CD20+ В-клеток (13,7%±8,0% в сравнении с 9.7%±8,9%). Однако, процент CD4+Т-клеток был значительно уменьшен у больных СКВ по сравнению с нормальными донорами: 25,5%± 12,7% и 40,6%±10,7% (р < 0,001). (Рис.5) Соответственно и ИР был уменьшен у больных СКВ по сравнению с нормальными донорами (1,2 против 1,6 соответственно). (Рис.6).

Рис5. Анализ субпопуляций лимфоцитов у больных СКВ и здоровых доноров. По оси абсцисс - интенсивность флюоресценции; по оси ординат -количество клеток. Гистограма, отражающая № 1 CD4 +Т- клеток из здоровых доноров , № 2 CD4+T- клеток из больных СКВ.

:-1

Рис.6, иммунорегуляторный инднкс (ИР) у больных СКВ по сравнению с нормальными донорами (1,2 против 1,6 соответственно).

Значительное уменьшение количества CD4+T-клеток по сравнению с нормальными донорами наводит на мысль о повышении количества активированных Т-лимфоцитов у больных СКВ. Действительно, было обнаружено увеличение количества CD25 (ранний маркер активации) Т-

клеток у больных СКВ по сравнению с нормальными донорами: 17,31 ± 12,6 и 7,44±1,0, соответственно.

Поскольку известно, что гиперактивация В-лимфоцитов зависит, в частности, от количества циркулирующих СБ4+ клеток, уменьшение количества СБ4+ Т-клеток может быть механизмом защиты от избыточной продукции аутоантител. Наши исследования проводились на фоне кортикостероидной терапии. Поэтому снижение СБ4+ клеток может предполагать, что данная субпопуляция клеток наиболее чувствительна к кортикостероидам в отношении чувствительности к апоптозу.

Активированные Т-клетки продуцируют цитокины, которые проявляют свое действие на различные клетки иммунной системы, модулируя иммунный ответ за счет образования антител,1 стимуляции аутокринных эффектов и фагоцитарной активности. По литературным данным, 1Ь-10, продукция которого возрастает при СКВ, индуцирует апоптоз Т-клеток через систему Раз/РазЬ.

2. Исследование роли системы Fas/Fas-L в регуляции апоптоза при СКВ.

Системе Fas/Fas-L принимает активное участие в регуляции апоптоза клеток. Нарушение регуляции апоптоза с помощью системы Fas/Fas-L может приводить к аутоиммунным заболеваниям.

2.1. Оценка уровня экспрессии Fas/Fas-L в лейкоцитах периферической крови при СКВ.

В нашей работе установлено, что экспрессия Fas-L на поверхности лимфоцитов и гранулоцитов больных СКВ значительно и достоверно повышена по сравнению с нормальными донорами (табл. 6).

Таблица 6.

Экспрессия Fas и Fas-L на поверхности свежевыделенных из

Группа обследова иных Лимфоциты (%) (М±ш) Гранулоциты (%) (М±ш)

Fas Fas-L Fas Fas-L

Здоровые (п=П) 26,1 ± 7,1 1,7 ±1,1 28,3 ± 5,2 1,8 ± 1,4

СКВ (п=38) 30,8 ±5,6 2,4" ± 1,9 32,9 ±6,4 4,4'±4,7

* р<0,05 по сравнению со значениями для здоровых доноров Высокий уровень экспрессии Fas-L на лимфоцитах и его увеличение в зависимости от активности заболевания (табл. 7) может указывать на активацию лимфоцитов . Повышенная экспрессия Fas-L может комитировать Fas-экспрессирующие клетки к апоптозу, что подтверждается нашими результатами об увеличении апоптоза лимфоцитов в экспериментах in vitro.

Таблица- 7.

Зависимость экспрессии Fas и Fas-L на лимфоцитах и гранулоцитах от активности СКВ. !

Стадия СКВ % Лимфоциты (М±ш) % Гранулоциты (М±ш)

Fas Fas-L Fas Fas-L

1(п=18) 26,3 ±4,9 2,1 ± 1,6 26,9 ±22,8 3.5 ±2,7

II (п=6) 27,7± 8,7 2,0 ± 1,8 20,8 ± 12,4 4,9± 3,0

III (п=14) 32.8 ±8,6 4,3 ±3,3 72,8 ±21,9 6,7 ± 2,5

В наших исследованиях мы определяли уровень экспрессии Fas во фракции мононуклеарных клеток, содержащих как В- и Т-лимфоциты, так и моноциты, и во фракции гранулярных клеток, содержащих как нейтрофилы, так и эозинофилы и базофилы. Fas экспрессирован на (26,1 ± 7,1)% лимфоцитов и на (28,3 ± 11,2)% гранулоцитов здоровых доноров. Однако при исследовании в зависимости от степени активности СКВ была обнаружена тенденция к увеличению экспрессии Fas на поверхности как лимфоцитов, так и гранулоцитов (табл. 7).

2-2- Исследование экспрессии CD95 (Fas) и оценка уровня апоптоза различных субпопуляций лимфоцитов.

Уровень экспрессии Fas были .измерен на CD3, CD4, CD8, и CD19 лимфоцитах. Было обнаружено, что для всех исследованных субпопуляций лимфоцитов уровень экспрессии белка был выше по сравнению с контролем (табл.8).

Таблица. 8.

Экспрессия CD95 в различных субпопуляциях лимфоцитов. * р<0,05

Субпопуляции лимфоцитов, %

Группа CD3 CD4 CD8 CD19

здоровые (п=4) 7,69±1,52 6,28±1,28 5,97 ±1,25 6,96±2,71

СКВ (п=8) 17,32±3,9' 20,35±7,0' 16,25±3,0* 21,03±5,Г

Уровень апоптоза был определен в этих же субпопуляциях с помощью проточной цитофлюориметрии. Было обнаружено, что уровень апоптоза был увеличен в CD3, CD4, CD8, и CD20 субпопуляциях лимфоцитов (табл. 9).

Таблица.9.

Результаты оценки выраженности апоптоза в лимфоцитах разных популяций. * р < 0.05

Группа обследованных % апоптотических лимфоцитов в различных субпопуляциях (М±ш)

CD3 CD4 CD8 CD20

здоровые (п = 8) 8.92±2.7 10.88±3.5 10.47±2.5 8.23±2.8

СКВ (п =7) 17.57"±8.6 24.32'±5.7 20.54*±8.5 17.49'±4.4

Таким образом, обнаруженная закономерность показывает участие рецептора Fas в патогенезе СКВ за счет активации апоптоза клеток. Повышенный уровень Fas-L на поверхности лимфоцитов может способствовать реализации апоптогенного сигнала. Увеличение апоптоза лимфоцитов согласуется с клиническими данными о лимфопении у больных СКВ.

Как известно, в организме существуют защитные механизмы, предотвращающие выработку аутоантител. В основе этих механизмов лежат процессы положительной и отрицательной селекции лимфоцитов в центральных и периферических органах иммунной системы. Реализация отрицательной селекции осуществляется путем апоптоза лимфоцитов. Нарушение механизма этого явления может лежать в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Нарушение механизма отрицательной селекции лимфоцитов, в частности - появление в крови больных аутоиммунными заболеваниями растворимой формы Fas (sFas) [Cheng J., Zhou Т. 1994], по-видимому, играет заметную роль в изменении регуляции апоптоза при помощи системы Fas/Fas-L. sFas может ингибировать апоптоз путем взаимодействия с Fas-L, предотвращая удаление активированных лимфоцитов. Исследованию роли sFas в регуляции апоптоза лимфоцитов будут посвящены наши дальнейшие исследования.

23. Определение растворимого sFas в плазме больных

СКВ.

При исследовании растворимого Fas было обнаружено умеренное увеличение в уровне растворимого Fas у больных СКВ по сравнению с нормальными здоровыми донорами (1,62±0,29 и 1,38±0,06 нг/мл, соответственно).

В зависимости от активности заболевания, была обнаружена обратная корреляция между sFas и активностью заболевании: первая стадия заболевания была связана с самым высоким уровнем sFas по сравнению с второй или третьей (1,81±0,10, 1,35±0,03, 1,26±0,02, соответственно). Этот результат может быть объяснен возможностью sFas соединяться с мембранно-связанным FasL, экспрессия которого возрастает с развитием заболевания (см.табл.7). Метод ELISA регистрирует наличие свободного sFas в плазме после осаждения клеточных элементов крови. Кроме того, полечная патология, характерная для третьей стадии СКВ, может влиять на циркуляцию протеинов маленького размера и их уровень в плазме.

Мы проанализировали эффект терапии на уровень плазматического sFas. С этой целью мы разделили наших пациентов на две группы: в первую группу были включены больные, принимающие преднизолон и циклофосфамид, в то время как во вторую группу были включены пациенты, принимающие только преднизолон. Было обнаружено, что уровень sFas был значительные уменьшен у тех больных СКВ, принимающих преднизолон и циклофосфамид (1,27±0,06 нг/мл) по сравнению с теми, которые принимали

только преднизолон (1,80±0,12 нг/мл). Это уменьшение в уровне sFas можно объяснить эффектом циклофосфамида, т.к. использование цитостатических средств может понижать уровень sFas, по-видимому, за счет индукции апоптоза клеток.

Мы обнаружили значимую умеренную обратную корреляционную зависимость (г = -0,4) между дозой принимаемого преднизолона и уровнем sFas. Доза преднизолона у исследуемых больных СКВ составляла от 7,5 мг до 55,0 мг (Рис.8).

Рис 8. Зависимость уровня sFas от дозы применяемого преднизолона. По оси абсцисс- уровень sFas. По оси ординат- доза (Применяемого преднизолона. Коэффициент корреляция между дозой преднизолона и уровнем sFas г = -0,4.

2.4.Определение зависимости относительного содержания sFas/Fas от содержания активированных лимфоцитов.

Целью исследования было определение зависимости между количеством апоптотических лимфоцитов и концентрацией sFas в плазме больных СКВ. Однако, корреляционный коэффициент в данном случае (r=0,2) свидетельствовал об отсутствии такой зависимости. Вместе с тем, было обнаружено, что существует достаточно высокая положительная корреляция (г =0,5) между содержанием sFas в плазме и процентом активированных лимфоцитов (рис.9).

Таким образом, можно предположить, что экспрессия Fas возрастает в момент активации лимфоцитов. Увеличение уровня sFas у больных СКВ при этом объясняется протеолитическим расщеплением трансмембранной формы Fas либо альтернативным сплайсингом. Это может являться механизмом, регулирующим функцию Fas-рецептора.

Рис 9. Зависимость содержания sFas в плазме больных СКВ от содержания активированных лимфоцитов По оси абсцисс -концентрация sFas (нг/мл), по оси ординат - процентное содержание активированных лимфоцитов, определяемого по содержанию Fas (M±m).

2.5. Изучение взаимосвязи уровня sFas и титра антиядерных антител.

Мы нашли положительную зависимость между уровнем зБаз и значением титра антиядерных антител (табл. 10.).

Таблица. 10.

Зависимость между уровнем зРаз и титром антиядерных антител у больных СКВ.

Эта в заимосвязь между высоким уровнем зРаз и высоким титром антиядерных антител отражает большое количество активированных лимфоцитов, которые подверглись апоптозу при СКВ.

Предопределять появление аутоантигенов в плазме больных СКВ может нарушение регуляции завершающей фазы апоптоза - удаления апоптозных телец с помощью макрофагов. Большую роль в этих процессах играет также система комплемента.

2.6. Изучение системы комплемента у больных СКВ:

Мы обнаружили, что большинство обследуемых нами больных СКВ имеют низкий уровень общего комплемента. У 27 больных СКВ (67,5%) оценка профиля системы комплемента установила его среднее значение менее 20 mg % (12,5-18,4 в то время, как нормальное

значение составляет 20-40 mg %. Вместе с тем, 13 больных (32,5%) имели нормальный уровень системы комплемента, что не позволяет рассматривать механизм нарушения функционирования системы комплемента как универсальное звено патогенеза СКВ.

2.7. Изучение антифосфолипндного иммунного ответа.

У 24 больных СКВ (64%) уровень антикардиолипиновых антител класса ^О составлял более 23 МЕ / мл (норма 0-23 МЕ/ мл) в то время как у 13 больных СКВ (35,1%) этот показатель составлял менее 23 МЕ/мл. У 12 больных СКВ (32,4%) уровень антикардиолипиновых антител класса ^М был выше 26 МЕ/ мл (норма 0-26 МЕ/ мл).

2.8.Определение экспрессии Bel -2 у больных СКВ.

Белок Вс1-2 измерялся у 25 больных СКВ и 18 здоровых доноров. Только у трех больных обнаружили повышенный уровень этого белка по сравнению с нормальным. В целом статистически достоверных различий между контрольной группой и больными СКВ по этому параметру отмечено

не было. Уровень Вс1-2 не коррелировал с проявлениями заболевания у больных СКВ.

У одного больного СКВ было обнаружено более высокое относительное содержание Вс1-2+ лимфоцитов общего пула (91,4%) по сравнению с нормальным (82,7%), в связи с чем можно утверждать, что экспрессия белка Вс1-2 у этого больного было повышенным по сравнению с нормой.

У второго больного СКВ не было обнаружено достоверных различий в содержании Вс1-2 по сравнению с контролем (77,1% и 75,3% соответственно).

У третьего больного СКВ был обнаружен более высокий процент содержания CD3+ клеток, экспрессирующих Вс1-2 (79,6%) по сравнению с контролем (44,7%); в то время как пул CD19+ клеток, экспрессирующих Вс1-2 составлял 37,9%.

Таким образом, по нашим данным экспрессия белка Вс1-2 не является значимой в патогенезе СКВ.

Выводы.

1. Обнаружено выраженное угнетение иммунореактивности у больных, системной красной волчанкой, проявлявшееся в снижении уровня, общего комплемента, количества CD4+ Т-клеток и иммунорегуляторного индекса (с 1.6 у здоровых доноров до 1.2 у больных). При- этом было выявлено значительное возрастание уровня клеток; несущих CD25, что свидетельствует о повышенном содержании в периферической крови пациентов активированных Т, В- лимфоцитов и моноцитов.

2. Установлено, что количество лейкоцитов периферической крови в состоянии апоптоза у больных системной красной волчанкой зависит от степени активности заболевания и превышает значения этого показателя у здоровых доноров. Наиболее значительные достоверные изменения выявлены в лимфоцитарной фракции лейкоцитов, а именно в клетках, экспрессирующих CD4, CD8 и CD20. Была обнаружена корреляционная зависимость (r=0,6) уровня апоптоза лимфоцитов в зависимости от дозы преднизолона, используемого для лечения.

3. Система Fas - Fas-L играет значительную роль в патогенезе системной красной волчанки. Уровень экспрессии Fas и Fas-L на лимфоцитах различных субпопуляций (CD3, CD4, CD8, CD 19) возрастает в зависимости от степени активности заболевания. При этом в крови пациентов было обнаружено достоверное увеличение апоптоза лимфоцитов и обратная зависимость между содержанием в крови ингибитора sFas и стадией заболевания.

4. Показано, что степень фрагментации ДНК на начальных стадиях апоптоза лейкоцитов периферической крови здоровых доноров составляет 20.1% в лимфоцитах и 11.2% в гранулоцитах. Больные системной красной волчанкой характеризуются достоверным более чем в 2 раза увеличением показателя в лимфоцитах. Рост числа повреждений ДНК лейкоцитов связан со степенью развития заболевания.

5. Доказана прямая зависимость, выраженная линейным уравнением регрессии, между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах. Уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных системной красной волчанкой зависел от выраженности заболевания и активности системы Fas -Fas-L.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Петрова У.Н., Абдель-Маруф Мохиль-Дейн. Анализ иммунологической толерантности и повреждения ДНК лейкоцитов периферической крови при СКВ у дети. Тезисы. II Росс. Конф. «молодых ученых», Москва, 2001г.// Рос. Журн. Педиатрия.-2001.-С. 104.

2. А.Х. Мохиль-Дейн, Н.Н. Белушкина, У.Н.Петрова, Н.Ю.Замаева, Г.А. Лыскина. Исследование экспрессии Fas и FasL в лимфоцитах периферической крови человека у здоровых доноров и детей с системной красной волчанкой// international Journal on immunorehabilitation . - March 2002. -Vol. 4, №. 1 .-P.113.

3. Мохиль-Дейн А. Х, Белушкина Н. Н, Петрова У. Н, Лыскина Г.А, Белоусова Т. А, Замаева Н. Ю, Северин С. Е. Повреждение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой и другими аутоиммунными заболеваниями как маркер апоптогенной готовности// Вопр. биол. Мед. и фармац.хими.-2002.-№3. - С.24-28.

4. Мохиль-Дейн А. X, Белушкина Н. Н, Петрова У. Н, Обухова В. В, Замаева Н. Ю, Северин С. Е, Северин Е. С.Исследование уровня апоптоза и экспрессии Fas и Fas-L в лейкоцитах периферической крови у детей, больных системной красной волчанкой // Вопр. биол. Мед. и фармац.хими.-2003.-№2. - С.28-32.

5. N.N. Belushkina, A.H. Mohiel-Dein, U.N. Petrova. Phenotype and apoptosis of lymphocyte subpopulations from patients with systemic lupus erythematosus// Europ. J. Biochem. - July 2003. - Vol. 270, Suppl. 1.-P.91.

Хассан Мохилдейн Абдел Маруф (Судан) Исследование механизмов регуляции апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой (СКВ).

Обнаружено выраженное угнетение иммунореактивности у больных СКВ, проявлявшееся в снижении уровня общего комплемента, количества CD4+ Т-клеток и иммунорегуляторного индекса.

Количество лейкоцитов периферической крови в состоянии апоптоза у больных, СКВ зависит от степени активности заболевания и превышает значения этого показателя у здоровых доноров.

Уровень экспрессии Fas и Fas-L на лимфоцитах различных субпопуляций (CD3, CD4, CD8, CD19) возрастает в зависимости от степени активности заболевания у больных СКВ.

Степень повреждений генетического материала клеток лейкоцитарного звена при СКВ намного выше, чем аналогичные показатели повреждений клеток лейкоцитарной системы здоровых доноров.

Докзана прямая зависимость, выраженная линейным уравнением регрессии, между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах у больных системной красной волчанкой.

Hassan Mohiel-Dein Abdelmarouf (Sudan)

Study mechanisms regulation apoptosis in peripheral leukocytes of patients with systemic lupus erythematosus (SLE).

Observed pronounced depression in immune activity in patients with SLE; this can be revealed in the decreased: level general complement proteins, quantity of CD4+ T-cells, and the immunoregulatory index.

The quantity of peripheral leukocytes which underwent apoptosis in patients with SLE depended on the activity of the disease and exceeded values of this parameter in healthy donors.

The level of expression Fas and Fas-L on surface of different lymphocyte subpopulations (CD3, CD4, CD8, CD 19) increased depending upon activity of disease in patients with SLE.

The degree of damage in genetic material of leukocytic cells in patients with SLE was much higher than the similar parameter of damage in healthy donors.

Demonstrated; the direct dependency, expressed by the linear equation of regression, between the titre of antibodies against DNA and degree of DNA damage leukocytic cells in patients with SLE.

РНБ Русский фонд I

2004-4 22623

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хассан Мохилдейн Абдел Маруф

Перечень основных сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Апоптоз.

1.1.1. Определение.

1.1.2. Этапы апоптоза.

1.1.3. Биохимическая характеристика апоптоза.

1.1.4. Стадии апоптоза.;.

1.1.5. Апоптоз и клеточный цикл.

1.1.6. Роль апоптоза.

1.1.7. Апоптоз и заболевания.

1.2. Fas и Fas-L.

1.2.1. Функция Fas рецептора.

1.2.2. Структура Fas рецептора.

1.2.3. Растворимая форма Fas рецептора.

1.2.4. Экспрессия Fas рецептора.

1.2.5. Структура Fas лиганда (FasL).

1.2.6. Экспрессия Fas лиганда.2В

1.2.7. Fas-опосредованный апоптоз.

1.2.8. Формы Fas-L.

1.2.9. Функция Fas-L.

1.2.10. Fas может запускать пролиферацию.

1.2.11. Патология системы Fas/Fas-L.

1.3. Системная красная волчанка (скв).

1.3.1. Определение.

1.3.2. Эпидемиология.

1.3.3. Клинические проявления.

1.3.4. Аутоантигены и аутоантитела при СКВ.

1.3.5. Этиология. Причины появления аутоантител.

1.3.6. Патогенез СКВ и антитела.

1.3.7. Роль комплемента в патогенезе системной красной волчанки.

1.3.8. Апоптоз и СКВ.

1.3.9. Факторы влияющие на апоптоз при СКВ.

1.3.10. Лимфоциты и СКВ.

1.3.11. Нейтрофилы и СКВ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 .Использованные материалы и реактивы.

2.2. Группы обследованных больных.

2.3.Методика выделения мононуклеарных лейкоцитов, их фракций и гранулоиитов из периферической крови человека.

2.4.Исследование структуры ДНК прямым флуориметрическим методом.

2.5.Методы определения количества апоптотических клеток.

2.6. Методы определения Fas/FasL и растворимого s Fas.

2.7.Метод определения Вс1-2.

2.8. Определение общей гемолитической активности комплемента.

2.9.Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Повреждение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой и другими аутоиммунными заболеваниями как маркер апоптогенной готовности.

3.1.1. Исследование уровня повреждений ДНК иммунокомпетентных клеток при СКВ.

3.1.2. Изучение апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов при СКВ.

3.1.3. Исследование корреляции между титром аутоантител, уровнем повреждений ДНК и апоптозом клеток крови.

3.1.4. Исследование уровня апоптоза лимфоцитов в зависимости от суточной дозы преднизолона у больных СКВ.

3.1.5. Исследование динамического изменения повреждений ДНК в зависимости от терапии у больных СКВ.

3.1.6. Анализ субпопуляций лимфоцитов у больных СКВ.

3.2. Исследование роли системы Fas/Fas-L в регуляции апоптоза при СКВ.

3.2.1. Оценка уровня экспрессии Fas/Fas-L в лейкоцитах периферической крови при СКВ.

3.2.2. Исследование экспрессии CD95 (Fas) и оценка уровня апоптоза различных субпопуляций лимфоцитов.

3.2.3. Определение растворимого sFas в плазме больных СКВ.

3.2.4.0пределение зависимости относительного содержания sFas/Fas от содержания активированных лимфоцитов.

3.2.5. Изучение взаимосвязи уровня sFas и титра антиядерных антител.

3.2.6. Изучение системы комплемента у больных СКВ.

3.2.7. Изучение антифосфолипидного иммунного ответа.

3.2.8.0пределение экспрессии bcl-2 у больных СКВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов регуляции апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой"

Актуальность проблемы. Системная красная волчанка (СКВ) представляет собой системное аутоиммунное заболевание, характеризующая широким спектром клинических и иммунологических нарушений. Этиопатогенез СКВ до настоящего времени неясен. Изучение пар близнецов указывает на важную роль в развитии заболевания, как генетической предрасположенности, так и факторов окружающей среды. Наряду с воздействием на иммунную систему различных вирусов и бактерий воздействие солнечного света описано как важный фактор окружающей среды, вызывающий как инициацию, так и распространение СКВ [85].

СКВ развивается, главным образом, у женщин детородного возраста и характеризуется поликлональной активацией В-лимфоцитов и продукцией широкого спектра антител к ядерным и цитоплазматическим антигенам. Предполагается, что при СКВ пролиферация В-клеток является Т-клеточно-зависимой и антиген-опосредованной. Считается также, что персистенция аутореактивных В- и Т-лимфоцитов ответственна за гипергаммаглобулинемию и продукцию аутоантител [52, 182].

Одиим из механизмов, благодаря которым осуществляется элиминация аутореактивных лимфоцитов, является программируемая клеточная гибель, также называемая апоптозом. Нарушения его регуляции может вносить определенный вклад в геиез данного аутоиммунного заболевания [153]. Одним из главных путей, запускающих апоптоз, является путь, начинающийся с активации Fas-рецептора. Fas, также известный как АРО-1 или CD95, является поверхностно-клеточным белком, имеющим размеры 45-48 кДа, принадлежащим к семейству рецепторов факторов TNF/NGF [154]. Fas экспрессируется на поверхности быстро делящихся клеток, и количество его на поверхности лимфоцитов в процессе активации жестко регулируется [148]. Перекрестное связывание Fas с лигандом FasL, мембранным гликопротеином размером 40 кДа [146], вызывает апоптоз с характерной цитоплазматической и ядерной конденсацией и фрагментацией ДНК [92]. Fas играет центральную роль в иммунном гомеостазе и опосредует передачу апоптотического сигнала в зрелых активированных лимфоцитах [131].

Существует предположение о возможной роли апоптотических клеток в развитии СКВ [10]. У больных СКВ показано возрастание уровня апоптотических лимфоцитов в периферической крови [170]. Кроме того, было установлено, что в процессе апоптоза аутоантигены выносятся на поверхность внешней мембраны апоптотических клеток. Это может определять продукцию аутоантитсл непосредственно к внутриклеточно локализованным антигенам [35]. В эксперименте было показано, что введение большого количества апоптотических клеток животным вызывает у них аутоиммунную реакцию [144].

Между тем, результаты исследований, посвященных апоптозу при СКВ, весьма разрозненны. С одной стороны, лимфоциты, полученные от людей, больных СКВ, проявляют увеличение уровня спонтанного апоптоза in vitro по сравнению со здоровыми донорами [59, 126]. Было выдвинуто предположение, что это обуславливается активацией мононуклеарных клеток периферической крови у больных СКВ, которая приводит к индукции клеточной гибели. Остается неясным, находится ли у больных СКВ уровень апоптоза в равновесии с возрастающим уровнем активированных лимфоцитов и с иммунореактивностью организма больного в целом. Неизвестно также, какие еще факторы, вызывающие апоптоз и сопутствующие ему, могут играть роль в патогенезе заболевания. Из литературы известно, что у ряда больных СКВ происходит возрастание концентраций апоптоз-ингибирующих факторов, таких как растворимый Fas (sFas), Bcl-2, и антител против Fas-L [41, 98,

183, 221, 228]. Апоптоз лимфоцитов может быть инициирован также использованием препаратов-иммуносупрессоров [219].

С другой стороны, на экспериментальных моделях мышей линий Ipr (лимфонролиферация) и gld (генерализованная лимфопролиферативная болезнь) показано, что развитие СКВ прямо связано с дефектами Fas-сигнального пули. У мышей обеих линий мутации в гене Fas и FasL приводят к развитию аутоиммунного синдрома с утратой Т-клеточной толерантности, В-клеточным нарушениям, гипергаммаглобулинемией и продукцией аутоантител. [182]. MRL-lpr/gld мыши имеют мутацию в гене Fas, что приводит в экспрессии мутантного белка и нарушению сплайсинга мРНК, в то время как C3H/HeJ-gld/gld мыши, дефицитны но функциональному лиганду FasL в результате одиночной мутации [126]. Дальнейшие исследования СКВ у человека также привели к обнаружению аналогичных дефектов в функционировании Fas и FasL. Однако, до настоящего времени не определена степень участия системы Fas - Fas-L в развитии и регуляции апоптоза при СКВ у человека [59].

Целыо диссертационного исследования было изучение механизмов регуляции апоптоза в лейкоцитах периферической крови больных СКВ.

В ходе исследования предполагалось решить следующие задачи:

2. Изучение зависимости количества различных субпопуляций лейкоцитов в состоянии апоптоза от степени активности заболевания. и

Научная новизна исследования. Степень фрагментации ДНК на начальных стадиях апоптоза лейкоцитов периферической крови больных СКВ значительно превышает значения этого показателя у здоровых доноров. Увеличение числа повреждений ДНК при этом определяется стадией развития заболевания. Впервые доказана выраженная прямая зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах. Показано также, что уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных системной красной волчанкой зависел от выраженности заболевания и активности системы Fas - Fas-L. Установлено, что уменьшение содержания В-лимфоцитов в периферической крови больных СКВ не является обязательным признаком.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хассан Мохилдейн Абдел Маруф

Выводы

1. Обнаружено выраженное угнетение иммунореактивности у больных системной красной волчанкой, проявлявшееся в снижении уровня общего комплемента, количества CD4+ Т-клеток и иммунорегуляторного индекса (с 1.6 у здоровых доноров до 1.2 у больных). При этом было выявлено значительное возрастание уровня клеток, несущих CD25, что свидетельствует о повышенном содержании в периферической крови пациентов активированных Т, В- лимфоцитов и моноцитов.

2. Установлено, что количество лейкоцитов периферической крови в состоянии апоптоза у больных системной красной волчанкой зависит от степени активности заболевания и превышает значения этого показателя у здоровых доноров. Наиболее значительные достоверные изменения выявлены в лимфоцитарной фракции лейкоцитов, а именно в клетках, экспрессирующих CD4, CD8 и CD20. Была обнаружена корреляционная зависимость (г=0,6) уровня апоптоза лимфоцитов в зависимости от дозы преднизолона, используемого для лечения.

3. Система Fas - Fas-L играет заметную роль в патогенезе системной красной волчанки. Уровень экспрессии Fas и Fas-L на лимфоцитах различных субпопуляций (CD3, CD4, CD8, CD19) возрастает в зависимости от степени активности заболевания. При этом в крови пациентов было обнаружено достоверное увеличение апоптоза лимфоцитов и обратная зависимость между содержанием в крови ингибитора sFas и стадией заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патогенез СКВ до настоящего времени остается невыяснен. Последнее время большое внимание уделяется роли апоптоза в патогенезе СКВ. Созданы экспериментальные модели СКВ на мышах линий MRL/lpr и gld. Роль апоптоза в патогенезе СКВ была изучена Emlen et al [59], описавших апоптоз в лимфоцитах больных СКВ по сравнению с лимфоцитами от здоровых людей in vitro. Наша работа, как указывалось ранее, посвящена изучению механизмов регуляции апоптоза в иммунокомпетентных клетках у больных СКВ. В ходе исследований подробно изучены некоторые аспекты программируемой клеточной гибели лейкоцитов периферической крови, а именно: фрагментация ДНК в ходе апоптоза; роль компонентов системы Fas- Fas-L и продуктов генов семейства Вс1-2.

Поскольку фрагментация ДНК принята за биохимический признак апоптоза, мы исследовали повреждение ДНК у больных СКВ по сравнению со здоровыми донорами методом прямого флуоресцентного анализа. Мы обнаружили, что лимфоциты и гранулоциты больных СКВ имеют большую степень нарушений цепей ДНК. Более того, степень этих нарушения ДНК коррелирует с активностью протекания СКВ. Фрагментация ДНК позволяет говорить о том, что клетка находится в процессе гибели, в связи с этим мы полагаем, что разрывы ДНК могут рассматриваться как маркер готовности клеток к апоптозу у больных СКВ.

Мы изучали также повреждение ДНК у больного СКВ до и после лекарственного воздействия. В лимфоцитах и гранулоцитах этого больного с активной формой болезни (третья стадия) до начала лечения отмечалась высокая степень повреждений ДНК, в то время как после 30 дней применения преднизолона и циклофосфамида определялся более низкий уровень повреждений ДНК в этих же клетках. Снижение уровня повреждений ДНК сопровождалось снижением титра антиядерных антител и уменьшением активности клинических проявлений болезни до II стадии. Это позволяет предположить снижение апоптотической готовности остаточной популяции клеток после того как большинство из них уже подвергаются апоптозу в процессе терапии вследствие действия глюкокортикоидов и циклофосфамида Известно, что глюкокортикоиды являются мощными индукторами апоптоза тимоцитов [43]. Циклофосфамид также индуцирует митохондриальный каспаза-9-зависимый путь апоптоза как в опухолевых, так и в здоровых клетках. [Schwartz et al, 2001]. Само по себе снижение апоптотической готовности остаточной популяции может свидетельствовать как о приостановлении распространения апоптоза вследствие включения защитных механизмов по типу обратной связи, так и об образовании популяции клеток, резистентных к воздействию лекарственных препаратов. Наблюдения за динамикой показателей в течение длительного периода времени поможет прояснить ситуацию.

Изучая апоптоз в свежевыделенных лимфоцитах и гранулоцитах периферической крови и при культивировании их in vitro без сопутствующих факторов, привнесенных из крови, мы обнаружили, что клетки, выделенные от больных СКВ, особенно после культивирования in vitro в большей степени подвергаются апоптозу по сравнению с клетками здоровых людей. Это может отражать степень апоптоза in vivo в периферических Т-лимфоцитах больных СКВ. Более того, мы показали, что процент апоптотических лимфоцитов коррелирует со степенью выраженности заболевания и лекарственным воздействием. Мы не обнаружили выраженных изменений в степени апоптоза свежевыделенных лимфоцитов больных и здоровых людей. Это может объясняться быстрым фагоцитозом большинства лимфоцитов, подвергшихся апоптозу, либо ингибирующим эффектом растворимого Fas на Fas - опосредованный апоптоз.

В случае гранулоцитов, как в свежевыделенных клетках, так и после культивирования in vitro, не было отмечено достоверно значимых различий между степенью апоптоза в клетках больных и здоровых людей. Поскольку все больные принимали преднизолон, который оказывает ингибирующий эффект на апоптоз нейтрофилов, можно заключить, что глюкокортикоиды обладают протективным эффектом по отношению к нейтрофилам человека, обеспечивая более высокую их жизнеспособность, уменьшая вероятность апоптоза.

Возрастание апоптоза в лимфоцитах больных СКВ может рассматриваться как источник аутоантигенов для В-клеток при образовании антител, являющихся важным проявлением заболевания. В связи с этим мы исследовали титры антител dsDNA, ssDNA в сыворотке больных СКВ и их корреляцию с процессами апоптоза в лимфоцитах и наличием повреждений ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах. Мы обнаружили положительную корреляцию между титром dsDNA, ssDNA и количеством апоптотических лимфоцитов после культивации in vitro. Мы также заметили положительную корреляцию между титром антител dsDNA и уровнем повреждений ДНК в лимфоцитах и гранулоцитах. Кроме того, мы обнаружили, что большинство больных СКВ III стадии характеризуются высоким титром антител dsDNA и высоким титром антинуклеарных факторов по сравнению с пациентами I и II стадий. Этот факт доказывает связь между титрами этих антител и степенью проявления болезни, и подтверждает наши предыдущие результаты, касающиеся соотношения уровня повреждений ДНК и процента апоптотических лимфоцитов и их корреляции со степенью выраженности СКВ.

Наши результаты показывают, что после культивирования in vitro в отсутствие привнесенных из крови регуляторных факторов возрастает процент апоптотоза нефракционированных лимфоцитов. При фенотипическом анализе различных фракций лимфоцитов не было обнаружено значительных различий между процентным содержанием CD3+, CD8+, CD20+ у больных СКВ и здоровых людей. Однако, у больных СКВ по сравнению со здоровыми донорами было отмечено значительное снижение процентного содержания С04+Т-клеток.

Мы предположили, что это нарушение фенотипа может быть связано с изменением уровня активации лимфоцитов. В связи с этим мы исследовали процентное содержание активированных лимфоцитов путем измерения маркеров активации CD25+ клеток (рецептор интерлейкина - 2), которые были обнаружены в более высокой концентрации у больных СКВ.

В этой связи, снижение содержания С04+Т-клеток может рассматриваться как протективный механизм для защиты определенных органов от повреждения, которое может быть результатом образования и отложения- иммунного комплекса. Обнаруженная гиперактивность В-лимфоцитов при СКВ может зависеть от клеточной активации, в частности от циркуляции С04+Т-клеток [Huang et al, 1988].

На следующем этапе мы исследовали экспрессию Fas, FasL на поверхности клеток и Вс1-2 в клетках. Мы выбрали для исследования эти белки потому, что вышеописанная экспериментальная модель СКВ на мышах основывается на генетических изменениях именно в этих генах. Среди нефракционированных клеток, свежевыделенных от больных СКВ, было обнаружено большее количество лимфоцитов и гранулоцитов, экспрессирующих эти белки по сравнению со здоровыми людьми. Также была обнаружена корреляция между степенью экспрессии этих белков, с одной стороны и выраженностью заболевания с другой стороны. Высокая степень экспрессии Fas и FasL в клетках больных СКВ является индикатором активации иммунной системы у этих больных, поскольку покоящиеся Т-клетки периферической крови не экспресируют FasL и умеренно экспрессируют Fas, в то время как активированные Т-лимфоциты вырабатывают повышенное количество FasL и Fas [153]. В связи с тем, что Fas может включать сигнальные пути, приводящие к апоптозу, обнаруженное явление указывает на то, что у больных СКВ функционируют Fas-рецепторные сигнальные пути. Полученные результаты соотносятся с данными изучения СКВ на модели мышей линии MRL/lpr [155].

У больных СКВ было показано нарушение равновесия между различными фракциями лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами. Мы отметили также, что все фракции лимфоцитов, выделенные от больных СКВ, подвержены апоптозу в большей степени по сравнению с клетками здоровых доноров. Кроме того, CD+4 Т-клетки составляют наибольший объем апоптотических клеток, в сравнении с друг ими фракциями лимфоцитов. Мы можем предположить, что CD+4 Т-клетки более подвержены апоптозу благодаря активизации системы Fas-Fas-L (CD95). В работе показана высокая экспрессия Fas во всех фракциях лимфоцитов. Так как перекрестное взаимодействие Fas через связывание с Fas-L вызывает индукцию апоптоза [5,6], мы можем прийти к выводу, что высокий уровень экспрессии Fas и активации апоптоза в различных фракциях лимфоцитов вносит вклад в развитие лимфопении, которая является самым выраженным первоначальным нарушением клинико-лабораторных показателей при СКВ.

Длительно продолжающийся процесс апоптоза может привести к возрастанию уровня апоптотических клеток и аутоантигенов в циркулирующей крови. Появление фосфатидилсерина на внешней части бислоя плазматической мембраны клеток, подвергшихся апоптозу, обеспечивает передачу целевого сигнала к фагоцитам помимо рецептор-лигандных систем. Существуют данные, свидетельствующие о том, что при СКВ антитела к фосфолипидам ухудшают утилизирующую функцию фагоцитов по отношению к апоптотическим клеткам [85]. В данной работе было проведено определение титров антифосфолипидных антител, в частности антител к кардиолипину классов IgG и IgM. Было обнаружено возрастание титра антикардиолипиновых антител в 64% (для IgG) и 32,4 % (в случае IgM) больных СКВ . Как уже было указано, эти антитела могут ухудшать процесс элиминации клеток, подвергшихся апоптозу внутри кровеносного русла, что способствует воспалению и характерным для СКВ аутоиммунным проявлениям.

Считается постулатом, что высокий уровень аутоантител, наблюдаемых у больных СКВ, может быть результатом патологически длительной продолжительностью жизни поликлональных активированных В-лимфоцитов. Это может сопровождаться повышенной продукцией Вс1-2 белка, который, в свою очередь, может повышать выживаемость лимфоидных клеток, регулируя процессы апоптоза. У трансгенных мышей, гиперэкспрессирующих Вс1-2 в В-клетках, наблюдается развитие аутоиммунного синдрома, соответствующего клинической картине СКВ. Мы изучали экспрессию Вс1-2 у больных СКВ. Только три пациента с СКВ имели повышенный уровень Вс1-2 по сравнению со здоровыми донорами. В целом не было отмечено статистически достоверного отличия по этому показателю у больных СКВ и здоровых доноров. Уровень Вс1-2 не коррелировал с проявлениями заболевания у больных СКВ.

Одной из важных физиологических функций классического биохимического пути активации комплемента является клиренс циркулирующих иммунных комплексов путем ингибирования образования преципитирующих иммунных комплексов в плазме. Альтернативный путь активации комплемента приводит к растворению уже образовавшихся иммунных комплексов, которые образовались или накопились в тканях организма [171]. В данной работе было обнаружено, что 67,5 % изучаемых больных СКВ имели общий уровень комплемента 12,5-18,4 мг% (при нормальном уровне 20-40мг%). Это снижение уровня комплемента может привести к нарушению процесса клиренса иммунных комплексов, что приводит к возрастанию накопления иммунных комплексов в тканях и последующему воспалению, сопровождающемуся повышением уровня аутоантигенов, приводящему к аутоиммунному ответу и развитию аутоиммунного заболевания. Вместе с тем, 13 больных (32, 5%) имели нормальный уровень системы комплемента, что не позволяет рассматривать механизм нарушения функционирования системы комплемента как универсальное звено патогенеза СКВ.

Защитные механизмы, служащие для предупреждения накопления аутоантител в организме, основываются на положительной и отрицательной селекции лимфоцитов в центральной и периферической иммунной системе. Отрицательная селекция лимфоцитов реализуется путем апоптоза. Нарушения в работе этого механизма играет важную роль в изменениях, вызванных системой Fas/FasL, в частности, выражается присутствием в крови больных СКВ растворимых форм Fas (sFas) [41 J. sFAS может ингибировать апоптоз путем взаимодействия с Fas-L, ухудшая процессы удаления апоптотических клеток. При исследованиях sFas в плазме больных СКВ и здоровых доноров было обнаружено возрастание уровня sFas у больных, которое может привести к продукции аутоантител и, как следствие, к персистенции аутореактивных лимфоцитов. Между sFas и экспрессией Fas на лимфоцитах имеется положительная корреляция. Возрастание sFas у больных СКВ коррелирует со степенью клинической выраженности заболевания и может изменяться в результате терапевтического воздействия.

Таким образом, при изучении системной красной волчанки у человека отмечается повышение чувствительности лимфоцитов периферической крови больных СКВ к апоптозу in vitro, что позволяет предположить также повышение их чувствительности к активации апоптоза in vivo. Вслед за возрастанием продукции апоптотических клеток происходит снижение клиренса этих клеток из циркулирующей крови, что может вносить определенный вклад в патогенез заболевания. Эти процессы при их одновременном протекании приводят к накоплению апоптотических клеток и последующем образовании аутоантител к присутствующим аутоантигенам. Среди прочих аутоантител наиболее важный вклад вносят аутоантитела к dsDNA. Ведущим механизмом, приводящим лейкоциты периферической крови в состояние апоптоза является активизация системы Fas- Fas-L. Наиболее ярким маркером апоптогенной готовности изученных клеток является уровень повреждений ДНК.

Для получения завершенной картины патогенеза системной красной волчанки требуется проведение дальнейших наблюдений над больными в течение ряда лет, с изучением процессов фагоцитарного клиренса апоптотических клеток, путей активации системы комплемента и всех его компонентов, гормонального и цитокинового профиля больных СКВ в зависимости от применяемого лечения. Исследования в этих областях могут принести новый вклад в фундаментальные знания о патогенезе аутоиммунных заболеваний и приведут к разработке новых, современных подходов к их лечению.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хассан Мохилдейн Абдел Маруф, Москва

1. Барышников. А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза //Москва.-2002. С. 18-37.

2. Петрова У. Н., Радыгина Т. В., Лыскина Г. А., Продеус А. П. Современные аспекты этиопатогенеза системной красной волчанки//вопр. Гематол. И иммунопатол. В педиатр. -2002.-Т. 1,№ 1. -С.92-94.

3. Adania JM., Cory S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival// Science. 1998. - Vol. 281. -P. 1322-6.

4. Aggarwal, ВВ., Singh S., LaPushin R., Totpal K. Fas antigen signals proliferation of normal human diploid fibroblasts and its mechanism is different from tumor necrosis factor receptor// FEBS Lett.-1995.-Vol. 364.-P. 5-8.

5. Akshay KV., Orlinick J R. The molecular basis for apoptotic defects in patients with CD95 (Fas/Apo-1) mutations// J Clin Invest. 1999. - Vol. 103, №. 3. - P. 355-363.

6. Al Maini MH., Mountz JD., AlMohri HA., et al. Serum levels of soluble Fas correlate with induces of organ damage in systemic lupus erythematosus// Lupus. 2000. - Vol. 9. - P. 132-9.

7. Albanese J., Sarkis M., Maria K., et al. Biologically Active Fas Antigen and Its Cognate Ligand Are Expressed on Plasma Membrane-Derived Extracellular Vesicles// Blood. 1998. - Vol. 91. No. 10. - P. 3862-3874.

8. Andrade F., Casciola-Rosen L., Rosen A. apoptosis in systemic lupus erythematosus. Clinical implications// Rheum Dis Clin North Am. 2000. - Vol.26. - P.215-27.

9. Andrew H., Wyllie and Pierre Golstein. More than one way to go// Proc. Natl. Acad. Set. USA. -2001. -Vol. 98, Issue l.-P. 11-13.

10. Ara J., Ali R. Reactive oxygen species modified DNA fragments of varying size are the preferred antigen for human anti-DNA autoantibodies// Immunol Lett. 1992. -Vol. 34. -P. 195-200.

11. Arce E., Jackson D G., Gill M A., et al. Increased Frequency of Pre-germinal Center В Cells and Plasma Cell Precursors in the Blood of Children with Systemic Lupus Erythematosus//J. Immunology. 2001. -Vol.167. - P. 2361-2369.

12. Arnold R., Seifert M., Asadullah K., Volk HD. Crosstalk between Keratinocytes and T Lymphocytes via Fas/Fas Ligand Interaction: Modulation by Cytokines// J. Immunology. -1999. Vol. 162. -P. 7140-7147.

13. Asherson RA., Higenbottam TW., Dinh-Xuan AT., et al. Pulmonary hypertension in a lupus clinic: experience with twenty-four patients//J Rheumatol. 1990. -Vol.17. -P.1292-1298.

14. Ayukawa K., Taniguchi S., Masumoto J., et al. La Autoantigen Is Cleaved in the COOH Terminus and Loses the Nuclear Localization Signal during Apoptosis// J. Biol. Chem. 2000. -Vol.275. -P.34465-34470.

15. Bamberger A., Schulte HM., Thuneke I., et al. Expression of the apoptosis-inducing Fas ligand (FasL) in human first and third trimester placenta and choriocarcinoma cells// J. Clin. Endocrinol. Metab.1997. -Vol. 82. -P. 3173-3175.

16. Bechmann, 1. FasL (CD95L, ApolL) is expressed in the normal rat and human brain-evidence for the existence of an immunological brain barrier// Glia.- 1999. -Vol.27. -P. 62-74.

17. Bellgrau D., Gold, D., Selawry, H„ et al. Nature (London). 1995. -Vol.377. -P. 630-632.

18. Biancone L., De Martino A., Orlandi V P. et al. Development of Inflammatory Angiogenesis by Local Stimulation of Fas In Vivo//J. Exp. Med.- 1997.-Vol. 186, No. 1. P. 147-152.

19. Bijl M„ Lopik TV., Limburg PC., et al. Do elevated levels of serum soluble Fas contribute to the persistence of activated lymphocytes in systemic lupus erythematosus// J autoimmunity. 1998. -Vol.11.-P.0896-8411.

20. Boerrigter ME., Mullaart ET., Van der Schans G. P., Vijg I. Quiescent human peripheral blood lymphocytes do not contain a sizable amount of preexistent DNA single-strand breaks // Exp. Cell Res. 1989. - Vol. 180. - P. 569 - 573.

21. Boerrigter M. E. Т. I., Mullaart E., Van der Schans G. P., Vijg I. Illusory DNA breaks in quiescent lymphocytes? //Cancer Res. 1990. - Vol. 188. - P. 1 -4.

22. Bortner С. D., Nicklas В. E., Cidlowski J. A. The role of DNA fragmentation in apoptosis// Trends Cell Biol. 1995. - Vol. 5. - P. 21 -26.

23. Bradley M., Zeytun A., Rafi-Janajreh A., et al. Role of Spontaneous and lnterleukin-2-Induced Natural Killer Cell Activity in the Cytotoxicity and Rejection of Fas* and Fas- Tumor Cells// Blood. -1998. -Vol. 92 No. 11. -P. 4248-4255.

24. Buckley CD,, Pilling D., Henriquez NV., et al. RGD peptides induce apoptosis by direct caspase-3 activation// Nature. 1999. -Vol.397. -P.534-9.

25. Buendia В., Santa-Maria A., Courvalin JC. Caspase-dependent proteolysis of integral and peripheral proteins of nuclear pore complex proteins during apoptosis//J. Cell sci. -1999. -Vol. -112. -P. 17431753.

26. Buttke TM., Sandstrom PA. Oxidative stress as a mediator of apoptosis/ZImmunoI Today. 1994. -Vol. 15. -P.7-10.

27. Cairns A P., Crockard AD., McConnell J R., et al. Reduced expression of CD44 on monocytes and neutrophils in systemic lupus erythematosus: relations with apoptotic neutrophils and disease activity// Ann Rheum Dis. 2001. -Vol. 60. -P.950-955.

28. Cairns D., Shelley L., Burke WMT., et al. The differing patterns of interstitial lung involvement in connective tissue diseases// J Rheumatol. 1992. -Vol. 19. -P. 1089-1095.

29. Callen JP. Mucocutaneous changes in patients with lupus erythematosus: the relationship of these lesions to systemic disease// Rheum Dis Clin North Am. 1988. -Vol. 14. -P.79-97.

30. Candi E., Sergio O., Terrinoni A., et al. Transglutaminase 5 Cross-links Loricrin, Involucrin, and Small Proline-rich Proteins in Vitro//J. Biol. Chem. 2001. -Vol.276. -P.35014-35023.

31. Carroll MC. A protective role for innate immunity in autoimmune disease// Linical immunology. -2000. -Vol.95. -P.S30-S38.

32. Carson DA., Ribeiro JM. Apoptosis and disease//Lancet. 1993. -Vol.341. -P. 1251-4.

33. Casciola-Rosen LA., Anhalt G., Rosen A. Autoantigens targeted in systemic lupus erythematosus are clustered in two populations of the surface structures on apoptotic keratinocytes// J Exp Med. 1994. -Vol.179. -P. 1317-30.

34. Casciola-Rosen LA., Anhalt GJ., Rosen A. DNA-dependent protein kinase is one of a subset of autoantigens specifically cleaved early during apoptosis//J. Exp. Med. 1995. -Vol.182. -P. 16251634.

35. Casiano CA., Martin SJ., Green DR., Tan EM. Selective cleavage of nuclear autoantigens during CD95 (Fas/APO-1)- mediated T cell apoptosis// J. Exp. Med. -1996. -Vol. 184. -P. 765-770.

36. Cervera R., Font J., Pare C., et al. Cardiac disease in systemic lupus erythematosus: prospective study of 70 patients//Ann Rheum Dis. 1992. -Vo!.51. -P.156-159.

37. Chan FK., Chun H J., Zheng L., et al. A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling// Science. 2000. -Vol.288. -P. 2351 -2354.

38. Cheng J., Zhou T. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of Fas molecule // science. 1994. - Vol. 263. - P. 1759-1762.

39. Clerici M., Shearer GM. The Thl-Th2 hypothesis of HIV infection: new insights// Immunol Today. -1994. -Vol. 15. -P.575-581.

40. Cohen JJ., DUKE R C. Glucocorticoid activation of a calcium- dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death//J. Immunol. 1984. - Vol. 132. - P. 38.

41. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis//J. Biochem. 1997. -Vol.326. -P. 1-16.

42. Cohen, J J. Programmed cell death in the immune system//Adv. Immunol. — 1991. —Vol.50. —P.55-85.

43. Collins R. J., Harman В. V., Souvlis J. K. Effect of cycloheximide on B- chronic lymphocytic leukaemic and normal lymphocytes in vitro: induction of apoptosis// Br. J. Cancer. 1991. - Vol. 64. - P. 518-5220.

44. Costallat LT., Coimbra AM. Systemic lupus erythematosus: clinical and laboratory aspects to age at disease onset// Clin Exp Rheumatol. 1994. -Vol.12. -P.603-607.

45. Courtney PA., Crockard AD., Williamson K., et al. Lymphocyte apoptosis in systemic lupus erythematosus: relationship with Fas expression, serum soluble Fas and disease activity// Lupus. 1999. -Vol.8. -P.508-513.

46. Cremesti A., Paris F., Grassme H., et al. Ceramide Enables Fas to Cap and Kill// J. Biol. Chem. -2001. -Vol. 276, Issue 26. -P. 23954-23961.

47. Dc Maria R., Testi R. Fas/FasL interactions: A common pathogenetic mechanism in organ-spcciflc autoimmunity// Immunol Today. 1998. -Vol.19. -P. 121.

48. Dean GS., Tyrrell-Price J., Crawley E., Isenberg D A. Cytokines and systemic lupus erythematosus// Ann Rheum Dis. 2000. -Vol.59. -P.243-251.

49. Desbarats J., Duke RC., Newel. MK. Newly discovered role for Fas ligand in the cell-cyclc arrest of CD4+ T cells// Nat Med. 1998. -Vol.4. -P.1377-82.

50. Diamond В., Katz JB., Paul E., Aranow C., et al. The role of somatic mutation in the pathogenic anti-DNA response// Annu Rev Immunol. 1992. -Vol.10. -P.731-757.

51. Doherty DG., Ireland R., Demaine AG., et al. Major histocompatibility complex genes and susceptibility to systemic lupus erythematosus in southern Chinese// Arthritis Rheum. 1992. -Vol.35.-P.641-646.

52. Drake CG., Kotzin BL. Superantigens: biology, immunology, and potential role in disease// J Clin Immunol. 1992. -Vol. 12. -P.149-162.

53. Dudich E., Semenkova L„ Dudich I., et al Q' Fetoprotein causes apoptosis in tumor cells via a pathway independent of CD95, TNFR1 and TNFR2 through activation of caspase-3-like proteases// Eur. J. Biochem. -1999. -Vol.266. -P. 750-761.

54. Duke R C., Chervenak R., Cohen J J. Endogenous endonuclease-induced DNA fragmentation: an early event in cell-mediated cytolysis// Proc Natl Acad USA. 1983. -Vol. 80. -P. 6361-6365.

55. Elmen W„ Neibur J., Kadera R. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus//J. Immunol. 1994. - Vol. 152. - P. 3685-3692.

56. Enari M., Talanian RV., Wong WW., Nagata S. Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis/ZNature (London). 1996. -Vol.380. -P. 723-726.

57. Evan G., Littlewood T. A matter of life and cell death// Science. 1998. -Vol.281. -P. 1317-22.

58. Famularo G., Nucera E., Marcellini S., De Simone C. Fas/Fas ligand on the road: an apoptotic pathway common to AIDS, autoimmunity, lymphoproliferation and transplantation//Med Hypotheses. 1999. -Vol.53. —P.50-62.

59. Fisher GH., et al. Dominant interfering Fas gene mutation impair apoptosis in a human autoimmune Ly mphoprol iferati ve syndrome// Cell. -1995. -Vol. 81. -P. 935-946.

60. French LE., Tschopp J. Thyroiditis and hepatitis: Fas on the road to disease// Nat Med. -1997,-VoI. 3. -P.387.

61. Fronek Z., Timmerman LA., Alper CA., et al. Major histocompatibility complex genes and susceptibility to systemic lupus erythematosus//Arthritis Rheum. 1990. -Vol.33. -P.1542-1553.

62. Furie RA., Chartash EK. Tendon rupture in systemic lupus erythematosus// Semin Arthritis Rheum. -1988. -Vol.18.-P.127-133.

63. Georgescu L., Vakkalanka RD., Elkon КВ., et al. Interleukon-10 promotes activation-induced cell death of SLE lymphocytes mediated by Fas ligand//J Clin invest. -1997. -Vol.100. -P.2622-2633.

64. Gershwin ME., Steinberg AD. Qualitative characteristics of anti-DNA antibodies in lupus nephritis// Arthritis Rheum. 1974. -Vol.17. -P.947-954.

65. Golstein P., Ojcius DM., Young J. D. Cell death mechanisms and the immune system//Immunol. Rev. 1991.-Vol. 121. -P.29-65.

66. Grana X., Garriga J., Mayol X. Role of the retinoblastoma protein family, pRB, pi 07 and pi 30 in the negative control of cell death// Oncogene. 1998. -Vol.17. -P.3365-3383.

67. Green DR. Apoptotic pathways: the road to ruin //Cell. 1998. -Vol. 94. -P.695-698.

68. Green DG„ Reed JL. Mitochondria and apoptosis// Science. 1998. -Vol.281. -P. 1309-1312.

69. Griffith TS., Brunner Т., Fletcher S., et al. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege // Science. 1995. -Vol. 270. -P. 1189-1192.

70. Haanen, C., Vermes 1. Apoptosis and inflammation// Med. Inflamm. -1995. -Vol. 4. -P. 5-15.

71. Hako N., Koji Т., Kobayash N., et al. Fas/APO-l/CD95 system as a mediator of granulose cell apoptosis in ovarian follicle atresia// Endocrinology. 1996. -Vol.137. -P. 1938-1948.

72. Haneji N. Nakamura Т., Takio K., et al. Identification of -Fodrin as a Candidate Autoantigen in Primary Sjogren's Syndrome // Science. -1997. -Vol. 276. -P. 604-607.

73. Hanson VG., Horowitz M., Rosenbluth D., et al. Systemic lupus erythematosus patients with central nervous system involvement show antibodies to a 50-kD neuronal membrane protein// J Exp Med. -1992. -Vol.176. -P.565-573.

74. Harley JB., Scofield RH. Systemic lupus erythematosus: RNA-protein autoantigens, models of disease heterogeneity, and theories of etiology//J Clin Immunol. 1991. -Vol.11. -P.297-316.

75. Hasegawa D., Kojima S., Tatsumi E., et al. Elevation of the Serum Fas Ligand in Patients With Hemophagocytic Syndrome and Diamond-Blackfan Anemia//Blood. -1998. Vol. 91 No. 8. -P. 27932799.

76. Hatzistilianou M., Hitoglou S., Gougoustamou D., et al. Effects of immunoregulatory drugs of human peripheral blood T lymphocytes function in vitro// Archive of oncology. 2002. -Vol. 10, No. 1. -P. 19-23.

77. Haupt MM., Moore CW„ Hutchins GM. The lung in systemic lupus erythematosus: analysis of the pathologic changes in 120 patients // Am J Med. -1981. -Vol.71. -P.791 -798.

78. Hay EM., Black D., Huddy A., et al. Psychiatric disorder and cognitive impairment in systemic lupus erythematosus// Arthritis Rheum. 1992. -Vol.135. -P.411-416.

79. Hayes MP., Berrebi GA., Henkart PA. Induction of target cell DNA release by the cytotoxic T lymphocyte granule protease granzyme A//J Exp Med. 1989. -Vol.170. -P.933—46.

80. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis// Nature. -2000. Vol. 407. -P. 770-776.

81. Herrmann M., Voll R. E., Zoller О. M., et al. Impaired Phagocytosis of apoptotic cell material by mobnocyte-derived macrophages from patients with systemic lupus erythematosus // Arthr. and Rheum. 1998. - Vol. 41. - P. 1241-1250.

82. Hochberg MC. Systemic lupus erythematosus// Rheum Dis Clin North Am. 1990. - Vol.16. - P.617-639.

83. Hoffman Bl., Katz WA. The gastrointestinal manifestations of systemic lupus erythematosus: a review of the literature// Semin Arthritis Rheum. 1980. -Vol.9. -P.237-247.

84. Hofmann K., Bucher P., Tschopp J. The CARD domain: a new apoptotic signalling motif// Trends Biochem Sci. 1997. -Vol.22. -P. 155-6.

85. Huang В., M. Bested ET., Olejniczak RP„ et al. NMR structure and mutagenesis of the Fas (APO-1/CD95) death domain//Nature (Lond.). 1996. -Vol. 384. -P. 638-641.

86. Isenberg DA., Meyrick-Thomas D., Snaith ML., et al. A study of migraine in systemic lupus erythematosus// Ann Rheum Dis. 1982. -Vol.41. -P.30-3.

87. Iverson GL. Psychopathology associated with systemic lupus erythematosus: a methodological review// Semin Arthritis Rheum. 1993. -Vol.22. -P.242-251.

88. Jason R.O., Akshay V., Elkon КВ., et al. Requirement of Cysteine-rich Repeats of the Fas Receptor for Binding by the Fas Ligand//J. Biol. Chem -1997. Vol. 272, No.46. -P. 28889-28894.

89. Jerrold S., Koh LS. The role of apoptosis in autoimmunity: Immunogen, antigen, and accelerant// Seminars in Nephrology. 1999. -Vol.19. -P.34-47.

90. Jodo S., Kobayashi S., Kayagaki N., et al. Serum levels of soluble Fas/Apo-1 (CD95) and its molecular structure in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and other autoimmune diseases//Clin Exp immunuol. 1997. -Vol. 107. -P. 89-95.

91. Kagi D., Ledermann В., Burki K., et al. Molecular mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological protection and pathogenesis in vivo// Annu Rev Immunol. -1996. -Vol. I4.-P.207.

92. K3gi D., Vignaux F., Ledermann В., Burki K., et aLFasand perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity//Science. -1994.-Vol. 265.-P.528.

93. K.ahl LE. The spectrum of pericardial tamponade in systemic lupus erythematosus: report often patients//Arthritis Rheum. 1992. -Vol.35. -P. 1343-1349.

94. Kalden JR., Winkler TH., Herrmann H., KrapfF. Pathogenesis of SLE: immunopathology in man// Rheumatol Int. 1991.-Vol.11.-P.95-100.

95. Kasten MM., Giordano A. pRb and the Cdks in apoptosis and the cell cycle// Cell Death Differ. -1998. -Vol.5. -P.I32-140.

96. Kerr JF., Wyllie AH., Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics// Br J Cancer. 1972. -Vol. 26. -P.239-57.

97. Kerr, JFR., Harmon BV. (1991) in Apoptosis: The Molecular Basis of Death (Tomci, L. D., and Cope, F. O., eds)// Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY . -1991. P. 5-29.

98. Krammer PH., Dhein J., Walczak H., et al. Immunol. Rev. -1994. -Vol. 142. -P.175-19I.

99. Lacki JK., Leszczynski P., Kelemen J., et al. Cytokine concentration in serum of lupus erythematosus patients: the effect on acute phase response//.!. Med. 1997. -Vol.28. -P.99-107.

100. Li PD., Nijhawan, IB., Srinivasula SM. et al. Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade// Cell. -Vol. 91. -P.479-489.

101. Liang MH., Partridge AJ., Daltroy LH., et al. Strategies for reducing excess morbidity and mortality in blacks with systemic lupus erythematosus//Arthritis Rheum.- 1991. -Vol.34. -P. 1187-1196.

102. Lieberthal W., Levine J S. Mechanisms of apoptosis and its potential role in renal epithelial cell injury// Am J Physiol. 1996. -Vol.271. -P. F477-F488.

103. Liem LM., Lopik Т., Annemarie EM., et al. soluble Fas levels in sera of bone marrow transplantation recipients are increased during acute graft-versus-host disease but not during infections// Blood. -1998. -Vol.91.-P. 1464-1468.

104. Liles WC., Dale DC., Klebanoff SJ. Glucocorticoids inhibit apoptosis of human neutrophils//Blood. -1995. -Vol.86. -P.3181-3188.

105. Liles WC., Kiener PA., Ledbetter JA., et al. Differential expression of Fas (CD95) and Fas ligand on normal human phagocytes: implications for the regulation of apoptosis in neutrophils// J. Experimental Medicine. -1996. -Vol. 184. -P. 429-440.

106. Lorenz HM., Grunke M., Hieronymus Т., et al. In vitro apoptosis and expression of apoptosis-related molecules in lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases// Arthritis Rheum. 1997. -Vol.40. -P.306-317.

107. Lorenz HM., Herrmann M, Winkler Т., et al. Role of apoptosis in autoimmunity//Apoptosis. 2000. -Vol. 5. -P.443-9.

108. Love PE., Santoro SA. Antiphospholipid antibodies: anticardiolipin and the lupus anticoagulant in systemic lupus erythematosus (SLE) and in non-SLE disorders: prevalence and clinical significance// Ann Intern Med. 1990. -Vol.112.-P.682-698.

109. Loweth AC., Williams GT., James RF., et al. Human islets of Langerhans express Fas ligand and undergo apoptosis in response to interleukin-1 beta and Fas ligation// Diabetes. 1998. -Vol. 47. -P.727-32.

110. Luo KX., Zhu YF., Zhang LX., et al. In situ investigation of Fas/FasL expression in chronic hepatitis В infection and related liver diseases//J. Viral Hepat. 1997. -Vol.4. -P.303-7.

111. Lynch DH., Ramsdell F., Alderson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses// Immunol Today. -1995. -Vol. 16. -P.569.

112. Maeda Т., Yamada Y., Moriuchi R., et al. Fas Gene Mutation in the Progression of Adult T cell Leukemia//J. Exp. Med.-1999. Vol. 189, No. 7.-P. 1063-1071.

113. Magil AB., Ballon HS., Chan V., et al. Diffuse proliferative lupus glomerulonephritis: determination of prognostic significance of clinical, laboratory and pathologic factors// Medicine (Baltimore). -1984. -Vol.63. -P.210-220.

114. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis//Am J Path.- 1995.-Vol. 146.-P.3-15.

115. Malefyt RD„ Yssel H., J. de Vries Direct effects of IL-10 on subsets of human CD4+ Tcell clones and resting T cells. Specific inhibition of IL-2 production and proliferation// J. Immunol. -1993. -Vol. 150. -P. 4754-4765.

116. Maria R De., Testa U., Luchetti L., et al. Apoptotic Role of Fas/Fas Ligand System in the Regulation of Erythropoiesis// Blood. -1999. Vol. 93, No. 3. -P. 796-803.

117. Marin S., O'Brien G., Nishioka, W., et al. Proteolysis of Fodrin (Non-erythroid Spectrin) during Apoptosis// J. Biol. Chem. -1995. -Vol. 270. -P. 6425-6428.

118. Mark JA., Andrew H. Apoptosis: Mechanism and roles in pathology// International review of experimental pathology. 1991. -Vol. 32.-P. 223-254.

119. Matsumoto K., Schleimer RP., Saito H., et al. Induction of apoptosis in human eosinophils by anti-Fas antibody treatment in vitro// Blood. -1995.-Vol. 86.-P.1437.

120. McHugh NJ. Systemic lupus erythematosus and dysregulated apoptosis-what is the evidence?// Rheumatology. 2002. -Vol.41. -P.242-245.

121. McLaughlin J., Gladman DD., Urowitz MB., et ai. Kidney biopsy in systemic lupus erythematosus. II. Survival analyses according to biopsy results//Arthritis Rheum. 1991. -Vol.34. -P. 1268-1273.

122. McNeil HP., Chesterman CN., Krilis SA. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies//Adv Immunol. 1991.-Vol.49.-P. 193-280.

123. Meikrantz W„ Robert S. Suppression of Apoptosis by Dominant Negative Mutants of Cyclin-dependent Protein Kinases//J. biological Chem.-1996. Vol. 271, No. 17.-P. 10205-10209.

124. Mevorach D., Mascarenhas Jo., Gershov D., Elkon KB. Complement-dependent clearancc of apoptotic cells by human macrophages// J Exp Med. 1998. -Vol.188. -P.2313-2320.

125. Meyaard L, Otto SA., Jonker RR., et al. Programmed death of T cells in HIV infection// Science. -1992.-Vol.257. -P.2I7-219.

126. Micheau О., Eric S., Arlette . Marie-Therese D. Fas Ligand-independent, FADD-mediated Activation of the Fas Death Pathway by Anticancer Drugs//J Biol Chem. -1999. Vol. 274, Issue 12. -P.7987-7992.

127. Mitsiades N., Vassiliki P., Vassiliki K., et al. Fas Ligand Is Present in Tumors of the Ewing's Sarcoma Family and Is Cleaved into a Soluble Form by a Metalloproteinase// American J. of Pathology. 1998. -Vol. 153. -P.1947-1956.

128. Miyawaki Y., UeharaT., Nibu R., etal. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulationsin human peripheral blood// J Immunol. 1992. -Vol. 149. -P.3753.

129. Mohan C., Adams S., Stanik V., Datta Sk. Nucleosome: a major immunogen for pathogenic autoantibody-inducing T cells of lupus// J. Exp Med. 1993. -Vol.177. -P. 1376-1381.

130. MorG., Gutierrez L., Eliza M., et al. Fas-Fas ligand system induced apoptosis in human placenta and gestational trophoblastic disease//Am. J. Reprod. Immunol. -1998. -Vol. 40. -P.89-95.

131. Morgan BP., Walport MJ. Complement deficiency and disease// Immunol Today. 1991. -Vol. 12,-P.301-6.

132. Morrow WJ., Nelson L., Watts R, Isenberg DA. Autoimmune rheumatic disease. 2nd.// Oxford: Oxford University Press. 1999.

133. Mountz J.D., Wu J., Cheng J., ZhouT. Autoimmune disease: A problem of defective apoptosis// Arthritis Rheum. 1994. - Vol. 37. -P. 1415-1420.

134. Nagata S., Golstein P. The Fas death factor// Science. 1995. -Vol. 267. -P. 1449-56.

135. Nagata S., Suda T.Fas and Fas ligand: Ipr and gld mutations// Immunol Today. -1995. -Vol. 16. -P.39.

136. Nagata S. Apoptosis by death factor//Cell. 1997. - Vol. 88. - P. 355-365.

137. Nagata S. Fas ligand- induced apoptosis// Ann. Rev. Genet. 1999. -Vol. 33. - P. 29-55.

138. Nambu Y., Steven J H., Rehemtulla A., Daniel et al. Lack of Cell Surface Fas/APO-1 Expression in Pulmonary Adenocarcinomas//J. Clin. Invest. -1998. Vol. 101, No. 5. -P. 1102-1110.

139. Newmeyer DD., Farschon DM., Reed JC. Cell-free apoptosis in xenopus egg extracts: inhibition by Bcl-2 and requirement for an organelle fraction enriched in mitochondria //Cell. 1994. -Vol.79. -P.353-64.

140. Orlinick JR., Vaishnaw AK., Elkon КВ., Chao MV. Requirement of cysteine-rich repeats of the Fas receptor for binding by the Fas ligand// J. Biol. Chem. -1997. -Vol. 272. -P.28889-28894.

141. Osborne BA. Apoptosis and maintenance of homeostasis in the immune system// Curr. Opin. Immunol. 1996. -Vol. 8. -P.245-254.

142. Paliogianni F., Ahuja SS., Balow JP., et al. Novel mechanism for inhibition of human T cells by glucocorticoids// J Immunol. 1993.-Vol. 151. -P.4081-4089.

143. Papo Т., Parizot C., Ortova M., et al. Apoptosis and expression pf soluble Fas mRNA in systemic lupus erythematosus// Lupus. — 1998. -Vol.7. -P.455-461.

144. Peitsch M.C., Muller C., Tschopp J. DNA fragmentation during apoptosis is causcd by frequent single-strands cuts// Nucleic Acids Research. 1993. -Vol.21, №18. -P.4206-4209.

145. Pistiner M., Wallace DJ., Nessim S., et al. Lupus erythematosus in the 1980s: a survey of 570 patients// Semin Arthritis Rheum. 1991. -Vol.21. -P.55-64.

146. Raff MC. Social controls on cell survival and cell death// Nature. 1992. -Vol. 356. -P. 397-400.

147. Rao L., Perez D., white E. Lamin proteolysis facilitates nuclear events during apoptosis//J. cell biol. -1996,-Vol.135.-P.1441-1455.

148. Reed J C. Mechanisms of apoptosis// Am. J. Pathology. 2000. -Vol. 157. -P. 1415-1430.

149. Reed JC. Cytochrome C: can't live with it; can't live without it// Cell. 1997. -Vol.91. -P.559-562.

150. Renehan AG., Catherine Booth., Christopher S P., What is apoptosis, and why is it important?// BMJ. 2001. -Vol. 322. -P. 1536-1538.

151. Reynolds JC., Inman RD., Kimberly RP., et al. Acute pancreatitis in systemic lupus erythematosus: report of twenty cases and a review of the literature//Medicine (Baltimore). — 1982. -Vol.61. -P.25-32.

152. Rieux-Laucat F., et al. Mutations in Fas associated with human Lymphoproliferative syndrome and autoimmunity// Science. -1995. -Vol. 268. -P. 1347-1349.

153. Rose LM., Latchman DS., Isenberg DA. Apoptosis in peripheral lymphocytes in systemic lupus erythematosus: a review// British J. Rheumatol. -1997. Vol. 36. -P. 158-163.

154. Rose LM., Latchman DS., Isenberg DA. Elevated soluble Fas production in SLE correlates with HLA status not with disease activity// Lupus. 1997. -Vol. 6. -P. 717-722.

155. Sachs L., Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukemic cells: new implications for therapy// Blood. 1993. -Vol. 82. -P.15-21.

156. Sakahira H., Enari M., Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradataion during apoptosis//Nature (London). 1998. -Vol.391. -P.96-99.

157. Salmon M., Gordon C. The role of apoptosis in systemic lupus erythematosus//Rheumatology. 1999. -Vol. 38.-P. 1177-1183.

158. Salvesen GS., Dixit V M. Caspases: intracellular signaling by proteolysis//Cell. -1997. -Vol. 91. -P.443-446.

159. Savill JS., et al. Macrophage phagocytosis of aging neutrophils in inflammation. Programmed cell death in the neutrophil leads to its recognition by macrophages// J. Clin. Invest. -1989. -Vol. 83. -P. 865.

160. Scaife JF. The effect of lethal doses of x-irradiation on the enzymatic activity of mitochondrial cytochrome c// Can J Biochem. 1966. -Vol.44. -P.433-48.

161. Shinagawa Т., Yoshioka K., Kakumu S., et al. Apoptosis in cultured rat hepatocytes: the effects of tumour necrosis factor alpha and interferon gamma// J. Pathol. 1991. -Vol. 165. -P.247-53.

162. Shvidel L., Duksin C., Tzimanis A., et al. Cytokines released by activated T cells in large granular lyphocytic leukemia associated with autoimmune disorders// J. hematology . 2002. -Vol.3. -P.32-37.

163. Sjostr6m J., Jonas B. How apoptosis is regulated, and what goes wrong in cancer// BMJ. 2001. -Vol.322.-P. 1538-1539.

164. Smith CA., Farrah Т., Goodwin RG. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death// Cell. 1994. -Vol. 76. -P.959-62.

165. Smyth MJ., Trapani JA. Granzymes: Exogenous proteinases that induce target cell apoptosis// Immunol Today. -1995. -Vol. 16. -P.202.

166. Song J., Eva S., Wendi В., et al." Roles of Fas and Fas ligand during mammary gland remodeling//J Clin Invest. 2000. - Vol. 106, No. 10. -P. 1209-3220.

167. Sontheimer RD. Subacute cutaneous lupus erythematosus: a decade's perspective//Med Clin North Am. 1989. -Vol.73.-P.1073-1090.

168. Spronk PE., Horst G., Van Der Gun ВТ., etal. Anti-dsDNA production coincides with concurrcnt В and T cell activation during development of active disease in systemic lupus erythematosus (SLE)// Clin Exp Immunol. 1996. -Vol.104. -P.446-53.

169. Starling GC., Jiirgen В., John E., et al. Identification of Amino Acid Residues Important for Ligand Binding to Fas//J. Exp. Med. -1997. Vol. 185, No. 8. -P. 1487-1492.

170. Steinberg AD., Gourley MF., Klinman DM., et al. Systemic lupus erythematosus// Ann Intern Med. -1991.-Vol. 115.-P.548-559.

171. Steinberg AD., Krieg AM., Gourley MF., Klinman DM. Theoretical and experimental approaches to generalized autoimmunity// Immunol Rev.- 1990.-Vol.118.-P.129-163.

172. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide//Science. 1995.-Vol. 267.-P. 1445-1449.

173. StolI ML., Gavalchin J. systemic lupus erythematosus-messages from experimental models// Rheumatology. 2000. -Vol.39. -P.18-27.

174. Strand S., Hofmann WJ., Hug H., et al. Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (APO-l/Fas) ligand-expressing tumor eel Is—A mechanism of immune evasion? //Nat Med. -1996. -Vol. 2. -P. 1361.

175. Sun-Mi PA., Ho-Sung C., et al Non-apoptotic Signaling Pathways Activated by Soluble Fas Ligand in Serum-starved Human Fibroblasts // Biol. Chem. -2001. Vol. 276, Issue 50. -P. 47100-47106.

176. Suzuki A., Enari M-, Eguchi Y., etal. Involvement ofFas in regression of vaginal epithelia ovariectomy and during an estrous cycle// EMBO. -1996. -Vol. 15. -P. 211-215.

177. Taga K., Mostowski H., Tosato G. Human interleukin-10 can directly inhibit T cell growth// Blood. -1993. -Vol. 81. -P. 2964-2971.

178. Tanaka M., Suda Т., Haze K.,et al. Fas ligand in human serum//Nat Med. -1996.-Vol. 2.-P.317.

179. Tanaka M., Suda Т., Takahashi Т., Nagata S. Expression of the functional soluble form of human Fas ligand in activated lymphocytes//EMBO.- 1995. -Vol. 14.-P.l 129-1135.

180. Tatsuta Т., Akio S. Mountz J.D. The Prodomain of Caspase-I Enhances Fas-mediated Apoptosis through Facilitation of Caspase-8 Activation// J Biol Chem. -200. Vol. 275, Issue 19. -P. 1424814254.

181. S.Taylor P., Carugati A., Fadok VA., et al. A hierachical role for classical pathway complement proteins in the clearance of apoptotic cells in vivo//J. exp Med. 2000. -Vol. 192. -P.359-366.

182. Thompson СВ. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease// Science. 1995. - Vol. 267. -P. 1456-1462.

183. Thornberry NA., lazebnik Y. Caspases: enemies within// Science. -1998. -Vol. 281. -P.1312-1316.

184. Tokano Y., Miyake S., Kayagaki., N et al. Soluble Fas molecule in serum of patients with systemic lupus erythematosus//J Clin immunol. -1996. -Vol.16. -P.261-265.

185. Tsokos GC. Overview of cellular immune function in systemic lupus erythematosus. Lahita RG, ed. Systemic lupus erythematosus// New York: Churchill Livingstone. 1992. -P.15.

186. Utz PJ., Anderson P. Posttranslational protein modifications, apoptosis, and the bypass of tolerance to Autoantigens// Arthritis Rheum. 1998. -Vol.41. -P.I 152-60.

187. Utz PJ., Hottelet M., Schur PH., Anderson P. Proteins phosphorylated during stress-induced apoptosis are common targets for autoantibody production in patients with systemic lupus erythematosus// J Exp med.- 1997.-Vol.185.-P.843-54.

188. Valerie A F., Aimee de C., David LD., et al. Loss of Phospholipid Asymmetry and Surface Exposure of Phosphatidylserine Is Required for Phagocytosis of Apoptotic Cells by Macrophages and Fibroblasts//J. Biol. Chem. 2001.-Vol. 276.-P. 1071-1077.

189. Van der Linden MW., Lopik Т., Aarden LA., et al. Soluble CD95 concentrations are increased in patients with severe systemic lupus erythematosus, but not in their first-degree relatives// Ann Rheum Dis. 2001. - Vol.60. -P.237-241.

190. Van Lopik Т., Bijl M., Hart M., et al. Patients with systemic lupus erythematosus with high plasma levels of sFas risk relapse// J Rheumatol. 1999. -Vol.26. -P.60-67.

191. Villunger A., Alexander E., Ingrid M., .et al. Constitutive Expression of Fas (Apo-l/CD95) Ligand on Multiple Myeloma Cells: A Potential Mechanism of Tumor-Induced Suppression of Immune Surveillance// Blood. -1997. Vol. 90. No. 1. -P. 12-20.

192. Watanabe-Fukunaga R., Brannan CI., Itoh N. et al. The cDNA structure, expression, and chromosomal assignment of the mouse Fas antigen//J. Immunol. -1992. -Vol. 148. -P. 1274-1279.

193. Waterhouse N., Kumar S., Song Q., et al. Heteronuclear Ribonucleoproteins CI and C2, Components of the Spliceosome, Are Specific Targets of Interleukin 1-converting Enzyme-like Proteases in Apoptosis// J. Biol. Chem. -1996. -Vol. 271. -P.29335-29341.

194. Weaver V., Carson C., Walker P., et al. Degradation of nuclear matrix and DNA cleavage in apoptotic thymocytes// J. Cell Sci. -1996.-Vol. 109. -P. 45-56.

195. Wener MH., Mannik M., Schwartz MM., Lewis EJ. Relationship between renal pathology and the size of circulating immune complexes in patients with systemic lupus erythematosus// Medicine (Baltimore). 1987. -Vol.66. -P.85-97.

196. Wiedemann HP., Matthay RA. Pulmonary manifestations of systemic lupus erythematosus// J Thorac Imaging. 1992. -Vol.7. -P. 1-18.

197. Wilcox PG., Stein HB., Clarke SD., et al. Phrenic nerve function in patients with diaphragmatic weakness and systemic lupus erythematosus// Chest. 1988. -Vol.93. -P.352-358.

198. Wong KL., Woo EKW., Yu YL., Wong RWS. Neurological manifestations of systemic lupus erythematosus: a prospective study//Q J Med. 1991.-vol.81. -P.857-870.

199. Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation// Nature. -1980. -Vol. 284. -P.555.

200. Yagita H„ Hanabuchi S., Asano Y., et al. Immunol. Rev. -1995. -Vol.l46. -P. 223-239.

201. Yamada Т., Ohyama H. Radiation-induced interphase death of rat thymocytes is internally programmed (apoptosis)// Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1988. -Vol.53. -P.65-75.

202. Yoong KF.S imon CA., Satinder R., et al. Fas/Fas Ligand Interaction in Human Colorectal Hepatic Metastases A Mechanism of Hepatocyte Destruction to Facilitate Local Tumor Invasion// American Journal of Pathology. 1999. -VoJ.154. -P.693-703.

203. Young RA. Stress proteins and immunoIogy//Annu Rev Immunol. 1990. -Vol.8. -P.401-420.

204. Zeytun A., Mona H., Mitzi N., et al. Fas-Fas Ligand-Based Interactions Between Tumor Cells and Tumor-Specific Cytotoxic T Lymphocytes: A Lethal Two-Way Street//Blood. -1997. Vol. 90 No. 5. -1952-1959.

205. Zhang J., Beiyang MM., Alan F. Characterization of a Novel Cis-element That Regulates Fas Ligand Expression in Corneal Endothelial Cells//J Biol Chem. -1999. Vol. 274, Issue 37. -P. 26537-26542.

206. Zhang L., Kevin J M., Marcia I D., et al. Evidence for the Involvement of Retinoic Acid Receptor RARQi-dependent Signaling Pathway in the Induction of Tissue Transglutaminase and Apoptosis by Retinoids// J. Biol. Chem. 1995. -Vol. 270. -P. 6022-6029.

Информация о работе

Хассан Мохилдейн Абдел Маруф
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование механизмов регуляции апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы