Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях

Белушкина, Наталья Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях"

На правахрукописи

БЕЛУШКИНА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ПРИ ОПУХОЛЕВЫХ, ВИРУСНЫХ И АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание степени доктора биологических наук

Москва, 2004

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова

Научные консультанты:

доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор Е.С. Северин

Официальные оппоненты:

• доктор биологических наук, академик РАМН, член-корреспондент РАН, профессор В АТкачук;

• доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Н.Е.Кушлинский;

• доктор биологических наук, профессор АВ.Иткес.

Ведущая организация:

НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН

Защита состоится «17» декабря 2004 года в 14°° часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 в Российском университете дружбы народов по адресу: 119198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 119198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203.13, л

кандидат фармацевтических наук, доцент СЬук^"^ Т.П.Лагуткина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Гибель клеток, наряду с пролиферацией и дифференцировкой, является фундаментальным процессом, определяющим жизнедеятельность многоклеточного организма. Интенсивные исследования клеточной гибели, выполненные в последнее десятилетие, привели к созданию определенных представлений о природе этого сложного явления, играющего важную роль в развитии ряда процессов в здоровом организме и при патологии. Вместе с тем, имеющиеся знания об особенностях биохимии апоптоза при различных патологических состояниях, в первую очередь при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях, явно неполны и недостаточны, что делает изучение особенностей регуляции программированной гибели клеток при этих заболеваниях весьма актуальным для медицинской биохимии.

Нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, ингибированием апоптоза. К заболеваниям, в основе которых лежит ингибирование заболеваний, относятся, в первую очередь различные опухолевые заболевания. При этом неспособность клеток вступать в апоптоз в ответ на физиологические стимулы приводит к дисбалансу между пролиферацией и гибелью клеток [Новиков B.C., 1996; Cohen J. 1993; Meier P., 2000]. С нарушением регуляции апоптоза также связывают высокую устойчивость опухолевых клеток к различным химиотерапевтическим препаратам. В последние десятилетия во многих странах мира, в том числе в России, отмечается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями органов пищеварения, а также увеличение смертности от этих заболеваний. Прогресс в борьбе со злокачественными новообразованиями напрямую зависит от установления механизмов развития опухолей и их ранней диагностики [Аксель Е.М., 2001; Гарькавцева Р.Ф., 2001; Воробьев Г.И., 1998; Орлова Л.П., 1998].

Среди заболеваний, связанных с усилением апоптоза, особое внимание следует уделить вирусным заболеваниям. В последние годы ведется интенсивное изучение проблемы хронических вирусных гепатитов В и С (ХВГ В и С), которая приобретает социальную значимость ввиду широкого распространения этих заболеваний, роста заболеваемости, особенно среди лиц молодого возраста, тяжести осложнений в виде цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы и отсутствия эффективных методов лечения. Исследование этой проблемы с точки зрения регуляции апоптоза позволит значительно расширить имеющиеся представления о биологии вирусов гепатита В и С (HBV, HCV) [Crovatto M., 2000; Stoll-BeckerS. 1997].

Апоптоз также играет важную роль в развитии и функционировании иммунной системы [Барышников А.Ю., 2002; Krammer P. H., 2000; Rose LM., 1997]. Аутоиммунные заболевания характеризуется поликлональной активацией В-лимфоцитов и продукцией широкого спектра антител к ядерным и цитоплазматическим антигенам. Одним из механизмов, благодаря которым осуществляется элиминация аутореакшвных^^^^^шцоддл&даяг^я апоптоз.

Нарушения его регуляции может вносить определенный вклад в патогенез данного аутоиммунного заболевания [Mountz J D. et я!., 1994].

Очевидно, что понимание молекулярных механизмов клеточной гибели в норме и при различных патологиях будет способствовать не только пониманию причин заболеваний, но и осуществлению направленного поиска способов лечения. Анализ современной литературы позволяет заключить, что в наступающем веке основополагающие исследования по регуляции клеточной активности будут связаны с направленным введением генов в отдельные клетки человека. Учитывая важность процессов апоптоза в функционировании органов и тканей организма, несомненно, что ключевые гены апоптоза должны быть в центре внимания исследований по клеточной активности.

Целью настоящего экспериментального исследования явилось изучение механизмов регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях, а также исследование возможности коррекции апоптоза клеток с помощью регуляции уровня экспрессии генов белков семейства Вс1-2.

Задачи исследования:

1. Исследование регуляции апоптоза в новообразованиях желудка и толстой кишки с помощью проапоптотических и антиапоптотических белков семейства Вс1-2.

2. Изучение роли Вс1-2 в возникновении устойчивости клеточных линий к противоопухолевым препаратам.

3. Установление закономерности регуляции апоптоза в новообразованиях желудка и толстой кишки с помощью белков системы Раз/РазЬ.

4. Выяснение роли системы Раз/РазЬ в регуляции апоптоза при аутоиммунных заболеваниях на примере системной красной волчанки.

5. Исследование регуляции апоптоза при вирусных гепатитах В и С.

6. Изучение зависимости процесса апоптоза лимфоцитов от инфицированности вирусами герпетической группы у пациентов с Т-клеточной лимфомой.

7. Влияние антисмысловых олигонуклеотидов к гену Вс1-2 на устойчивость опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам.

8. Исследование возможности генной терапии противоопухолевых клеток с помощью трансфекции гена Вах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушение регуляции апоптоза является важным звеном патогенеза опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваний.

2. Изменение соотношения количества белков семейства Вс1-2 в клетке как за счет увеличения антиапоптотических белков, так и за счет уменьшения проапоптотических белков, приводит к опухолевой трансформации клеток.

3. Снижение функциональной активности белка Вах, обусловленное наличием мутаций в гене Вах, приводит к нарушению регуляции апоптоза клетки и способствует онкотрансформации клетки.

4. Нарушение регуляции апоптоза за счет рецептор-опосредованного пути системы Раз/РазЬ приводит к нарушению иммунного статуса и к развитию опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваний.

5. Увеличение количества антиапоптотичсского белка Вс1-2 в клетке приводит к развитию феномена лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

6. Применение генно-терапевтических подходов на основе антисмысовых олигонуклеотидов к гену Bcl-2 способствует уменьшению количества антиапоптотического белка Вс1-2 и преодолению лекарственной устойчивости.

7. Применение генно-терапевтических подходов на основе трансфек^Ъи проапоптотического гена Вах, способствует нормализации апоптоза клетки за счет увеличения уровня Вах, что приводит к повышению чувствительности этих клеток к химиотерапевтическим препаратам и к гибели клеток, что позволит рассматривать этот подход в качестве противоопухолевой терапии.

Научная новизна исследования. Впервые подробно исследованы особенности регуляции апоптоза при опухолевых заболеваниях ЖКТ. Определены полуколичественные показатели белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL нетрансформированными, опухолевыми клетками и лейкоцитами периферической крови у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки. При исследовании уровня белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки выявлено статистически значимое увеличение уровня исследованных антигенов опухолевыми клетками по сравнению с нетрансформированными (р = 0,03). Установлены положительные достоверные корреляционные зависимости между процентным содержание антиген-экспрессирующих клеток и степенью экспрессии антигенов как в нетрансформированной (для Вс1-2, Вах, Bcl-X Fas и FasL), так и в опухолевой ткани (для Вс1-2, Вах, Bcl-X). Впервые в клеточной линии SKOV3 обнаружена мутация в гене Вах - она имеет генотип G7/G9, в отличие от нативного типа гена Вах - G8/G8, приводящая к инактивации проапоптотической активности гена Вах. Впервые обнаружено, что метастазирование регионарных лимфатических сосудов коррелирует с низкой степенью экспрессии Fas опухолевой тканью больных с новообразованиями желудка и толстой кишки.

Впервые проведено исследование уровня апоптоза клеток печени и лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С как двух мишеней действия вирусов гепатита В и С. Изучен уровень апоптоза клеток печени (гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата) в сравнении с уровнем экспрессии мембранных бежов, участвующих в индукции апоптоза (Fas, FasL). Выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии FasL лимфоцитов внутрипеченочного инфильтрата и уровнем апоптоза гепатоцитов. Обнаружена защитная роль экспрессии FasL гепатоцитами от апоптоз-индуцирующего действия ЦТЛ. Впервые проведено одновременное исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК у больных ХВГ В и С. Обнаружено, что у больных ХВГ В и С наблюдается достоверно более высокий по сравнению со здоровыми добровольцами уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК. Обнаружено, что

наиболее высокий уровень апоптоза ЛПК наблюдался у больных с виремией и повышенным уровнем сывороточного TNF-a.

Выявлена достоверная корреляционная зависимость степени повреждения ДНК свежевьщеленных ЛПК с долей клеток в состоянии апоптоза после их инкубации в культуральной среде в течение 24 часов, что свидетельствует о наличии в периферической крови не только клеток в состоянии апоптоза, но и клеток, коммитированных к нему. Впервые доказана прямая зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах у больных системной красной волчанкой. Показано также, что уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных системной красной волчанкой зависел от выраженности заболевания и активности системы Fas -Fas-L. Продемонстрирована роль белка Вс1-2 в развитии лекарственной устойчивости к ряду химиотерапевтических препаратов, обусловленной гиперэкспрессией гена Вс1-2, что может играть решающую роль в химиотерапии опухолей с повышенным уровнем этого белка. Показано, что использование антисмысловых олигонуклеотидов может оказаться эффективным способом преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток с высоким уровнем экспрессии Bcl-2. Впервые обнаружена высокая чувствительность клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 и клеток карциномы шейки матки человека линии HeLa к трансфекции гена Вах.

Научно-практическая значимость работы. Исследование имеет большое научно-практическое значение, так как в ходе работы проведено комплексное исследование нарушений регуляции апоптоза клеток при новообразованиях желудка и толстой кишки, Т-клеточной лимфомаме, вирусных гепатитах В и С, системной красной волчанкой. Установление механизмов нарушения регуляции процесса апоптоза в дальнейшем позволит найти пути устранения последних. Показано, что регистрация однонитевых разрывов ДНК может являться тестом для выявления клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза или коммитированных к нему. Обнаруженный высокий уровень апоптоза гепатоцитов при ХВГ В, и особенно ХВГ С, и появление экспрессии FasL на гепатоцитах могут быть использованы в качестве новых прогностических критериев для оценки эффективности проводимой противовирусной и иммуномодулирующей терапии ХВГ. Информация о роли системы Fas/FasL в патогенезе СКВ, а также обнаруженная зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах может быть использовано в клинической практике при планировании лечебных мероприятий и прогнозе исхода заболевания. Разработаны принципиальные подходы к коррекции патологии апоптоза генно-терапевтическими методами на основе трансфекции генов Вах, Вс1-2 в клетки, а также с помощью применения антисмысловых олигонуклеотидов к гену Вс1-2.

практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (июнь 2002, Москва), на VIII Международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» (апрель 2002, Канны, Франция), на I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (июнь 2002, Москва), на III международном симпозиуме «Genetic anticancer agents»(Февраль 2002 г., Амстердам, Нидерланды), на специальной конференции FEBS «Signal Transduction» (июль 2003 г., Брюссель, Бельгия), на 18 конференции Европейской ассоциации по опухолевым исследованиям (июль 2004 г., Инсбрук, Австрия), на I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (октябрь 2004, г. Москва), а также неоднократно обсуждалась на научно-практических конференциях кафедры биохимии и НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы состоялась на научно-практической конференции совместного заседания кафедры биохимии и НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова 30 июня 2004 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 257 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, список цитированной литературы, включающий 382 источника. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 24 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Общее количество больных составляет 247 человек (табл.1).

Получение клинического материала: образцы периферической крови здоровых доноров и больных помещали в пластиковые пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта 3,8 % цитрат натрия (в соотношении антикоагулянт/кровь = 1/10); мононуклеарные и полиморфноядерные лейкоциты периферической крови выделяли из свежеполученной крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин. Выделение геномной ДНК проводили из цельной крови, которую замораживали и хранили в морозильной камере при температуре -70'С («Sanyo Ultra Low», Япония). Операционные фрагменты тканей от больных помещали или в пластиковые пробирки, замораживали и хранили при температуре -70°С до проведения анализа (выделения геномной ДНК, определение экспрессии белков с помощью иммуноблоттинга), или в 10% раствор формалина для дальнейшего иммуногистохимического анализа экспрессии генов.

В работе использованы клеточные линии опухолей человека: SKOV-3 (карцинома яичника), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), Colo 320HSR и Сасо-2 (колоректальная аденокарцинома), SW837 (ректальная аденокарцинома), HuTu 80 (аденокарцинома двенадцациперстной кишки), SKOV3 (аденокарцинома яичника человека), HeLa (карцинома шейки матки),

Таблица 1.

Классификация больных, обследованных в диссертации.

Группа Заболевание Подгруппа Количество больных

в подгруппе всего

1 Опухолевые заболевания Рак желудка 29 49

Рак толстой кишки 20

2 Т-клеточные лимфомы кожи - - 70

3 Хронические заболеваний печени Хронический вирусный гепатит В 24 60

Хронический вирусный гепатит С 36

4 Аутоиммунные заболевания Системная красная волчанка 46 68

Системная склеродермия 22

СЕМ и Jurkat (Т-клеточный лейкоз) и В-клеточные линии Raji и Namalva (лимфома Беркитта), МК и 35 (В-лимфоцитов периферической крови здоровых добровольцев трансформированные вирусом Эпштейна-Барр), IM9 и U266BL (миеломного происхождения), получены из банка клеток Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения, Москва.

Клеточные линии MCF-7, HeLa, SW837 культивировали в среде DMEM («Sigma», США), а остальные клеточные линии - в среде RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США), 50 мкг/мл гентамицина («Sigma», США) в пластиковых культуральных флаконах («Costar», США) при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста по методу Mosmann.

Экспрессию Вах, Bcl-2, Fas и FasL проводили с помощью иммуноблотинга [Москалева Е.Ю., 2003] и иммуногистохимического анализа с помощью непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода метода [Charalambous G. К., 2000; Shilkaitis А., 2000; Misao J., 1996]. Оценку уровня апоптоза по степени повреждения ДНК клеток печени (гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата) in situ осуществляли с помощью метода TUNEL (Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling) с использованием набора АРО-BRDU™ (PharminGen).

Оценка уровня поверхностных антигенов мононуклеарными и полиморфноядерными лейкоцитами с помощью проводили с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL-2 ("Beckman coulter", США) с использованием соответствующих антител. Регистрация апоптоза клеток осуществлялась с помощью проточной цитофлуориметрии после окрашивания ДНК йодистым пропидием в качестве флуорохрома и измерением процента

гиподиплоидных клеток на проточном цитофлуориметре-сортировщике клеток EPICS-XL-2 ("Beckman coulter", США).

Определение концентрации sFas в плазме периферической осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител к sFas (клон 2F3, «Биоарсенал», Россия). Определение уровня сывороточного TNF-a проводили иммуноферментным методом (ELISA) с использованием тест-системы «R&D Systems» (США).

Выделение геномной ДНК из цельной периферической крови и культур клеточных линий проводили по методу Lindblom [Lindblom В., 1988], из тканей желудка и толстой кишки - стандартным гуанидинтиоцианатным методом [Федоров НА, 1996]. Амплификация исследуемого участка гена Вах с помощью полимеразной цепной реакции. Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 67 мМ трис-HCl (pH 8,8, 25°С), 16,6 мМ (NH^SO^ 0,01% Твин-20, 2,1 мМ MgCl2, четыре дезоксинуклеотидтрифосфата (0,16 мМ каждый), 50 нг геномной ДНК человека, по 5 пмоль каждого из праймеров, 1 ед. акт Taq-полимеразы. Для проведения ПЦР использовали следующий температурный режим: 94°С - 3 мин.; 94°С - 30 сек., 60°С - 30 сек., 72°С - 45 сек., 29 циклов; 72°С - 5 мин.

Скрининг мутаций в октадезоксигуанозиновой последовательности 3 экзона гена Вах с помощью анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ПЦР, который осуществляли по стандартной методике [Oto M., 1993; Ulvik А., 1995; Yagi O.K., 1998] с использованием электрофореза в 20% ПААГ. Подтверждение мутаций проводили путем автоматического секвенирования продукта ПЦР на приборе ABI Prism 310 Genetic Analyser («Applied Biosystems», США), согласно инструкциям производителя. Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3.01.

Оценка степени повреждения ДНК лейкоцитов проводилась прямым флуориметрическим методом по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток с бромистым этидием в качестве флюорофора [Змызгова А.В., 1999].

pLPC-Bcl-2 любезно предоставлен Г. П. Беловым (Институт полимиелита РАМН, г.Москва). Вектор pLPC был сконструирован на основе бактериальной плазмиды pBR322. Он содержит ген устойчивости к пуромицину, ранний промотор транскрипции цитомегаловируса (CMV), полилинкерную последовательность, необходимую для клонирования нужных генов, и правый LTR, содержащий сигнал полиаденилирования, необходимый для терминации транскрипции. Контрольный вектор получен путем обработки вектора pLPC-Bcl-2 рестриктазами Hind Ш и XhoL Клонирование гена Вах в вектор осуществляли в pLPC. Кодирующий фрагмент кДНК Вах-а был амплифицирован с помощью мРНК, выделенной из культуры клеток В-клеточной лимфомы человека линии Raji.

Трансфекцию клеточных линий человека плазмидной ДНК и антисмысловыми олигонуклеотидами осуществляли с помощью набора Maxifectin-21™, содержащем липосомообразующий препарат Unifectin-21. Для трансфекции культуры клеток плазмидой ретровирусной конструкции наращивали плазмиду с использованием штамма E. coli TOP 10.

Олигонуклеотидные последовательности: 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3' - анти-Bcl-2; 5'-AGCTCTGCCACGCCTTCG-3' - случайная последовательность синтезированы в фирме «Сингал», г. Москва.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной обработки данных в программе Microcal Origin 5,0. Результаты представлены в виде средних значений ± ошибка среднего. Достоверность различия двух средних в выборке оценивали с помощью параметрического (Стьюдента) и непараметрического (Уижоксона) критериев в зависимости от характера данных. Уровень значимости менее 0,05 рассматривали как статистически значимый.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование особенностей регуляции апоптоза при онкологических заболеваниях

Клетки большинства опухолей обладают пониженной способностью запускать механизмы клеточной гибели в ответ на некоторые физиологические стимулы, что связано с нарушением регуляции апоптоза в этих клетках. В первую очередь следует отметить нарушение регуляции апоптоза, приводящее к развитию опухолевых заболеваний, связанное с экспрессией одного из основных звеньев в регуляции программированной гибели клетки - бежов семейства Вс1-2. В связи с этим целью данного раздела работы явилось изучение количества белков семейства Вс1-2 в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки человека и определение роли белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза и онкотрансформации клеток.

Общую группу исследования составили 49 больных онкологическими заболеваниями желудка и толстой кишки, из которых у 29 диагностирован рак желудка и у 20 - рак толстой кишки. Гистологическая классификация опухолей проведена в соответствии с рекомендациями ВОЗ: опухоли подразделены на эпителиальные и неэпителиальные. Среди эпителиальных опухолей выделены высоко-, умеренно-, низкодифференцированные аденокарциномы и недифференцированные раки

При иммуногистохимическом (ИГХ) исследовании уровня экспрессии Bcl-2 нетрансформированными и атипическими клетками желудка и толстой кишки показано, что Bcl-2 экспрессируется подавляющим большинством клеток на достаточно высоком уровне (табл.2, рис. 1). Наблюдается статистически значимое увеличение степени экспрессии Bcl-2 атипическими клетками по сравнению с нетрансформированными (р = 0,04): экспрессия Bcl-2 клетками опухолевой ткани увеличивается в среднем примерно в 1,5 раза. При выявлении взаимосвязи степени дифференцировки опухолевой ткани с уровнем белка Bcl-2, было установлено, что в группе высокодифференцированных опухолей желудка и толстой кишки не выявлено и даже отмечено незначительное снижение экспрессии Bcl-2, примерно в 1,2 раза, в группе умеренно-, низкодифференцированных аденокарцином и недифференцированных раков -увеличение экспрессии Bcl-2 в 3,4 раза. Наиболее выраженное различие в степени экспрессии Bcl-2 между нетрансформированными и атипическими клетками

наблюдается в случае умсрсннодифференцированной аденокарциномы толстой кишки с метастазами: экспрессия Bcl-2 опухолевой тканью увеличивается в 9,0 раз по сравнению с нетрансформированной. Кроме того, установлена положительная статистически значимая корреляция между количеством Вс!-2-экспрессирующих клеток и степенью экспрессии данного АГ: чем больше процентное содержание Bcl-2-положительных клеток, тем выше степень экспрессии Bcl-2 как нетрансформированными (r= 0,91; р = 0,00075), так и опухолевыми (r = 0,70: р = 0,002) клетками желудка и толстой кишки. Полученные результаты позволяют сделать вывод об увеличении степени экспрессии Bcl-2 при развитии низкодифференцированных и недифференцированных опухолей желудка и толстой кишки, что согласуется с выводами Ayhan А. (1994), Bosari S. (1995) и Yang H.B. (1997). Таким образом, увеличение уровня экспрессии Bcl-2, по-видимому, является одним из механизмов ингибирования апоптоза в изученных опухолевых клетках.

При ИГХ исследовании уровня экспрессии Вах нетрансформированными и атипическими клетками желудка и толстой кишки было обнаружено, что Вах экспрессируется подавляющим большинством клеток желудка и толстой кишки на достаточно высоком уровне (табл. 2, рис. 1). Наблюдается статистически значимое увеличение степени экспрессии Вах атипическими клетками по сравнению с нетрансформированными (р =0,01): экспрессия Вах опухолевой тканью увеличивается примерно в 2 раза. Белок Вах относится к проапоптотическим членам семейства Bcl-2 и в норме повышение его концентрации в некоторых типах клеток является достаточным условием для вступления в апоптоз. Так как в основе формирования опухоли лежит ингибирование апоптоза, то логично было бы предположить, что при опухолевых заболеваниях человека будет снижаться уровень экспрессии Вах. Действительно при раке молочной железы [Reed J. С, 1996], карциноме эндометрия [Pryde J. G., 2000] показано снижение экспрессии Вах. Однако при некоторых новообразованиях (поджелудочной железы [Friess Н., 1998], яичников [Marone M., 1998] и др.) наряду с увеличением уровня антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-XL выявлено увеличение уровня проапоптотического белка Вах вместо ожидаемого снижения. Что касается изменения количества Вах при опухолях желудка и толстой кишки, то в литературе также нет однозначных данных. Krajewska M. с соавт. [Krajewska M.. 1996] выявили, что уровень экспрессии Вах снижается при опухолях толстой кишки и желудка. A. Jansson с соавт. [Jansson А., 1998] установили, что количество Вах увеличивается в опухолевой ткани по сравнению с нормальной и уменьшается в опухолевой ткани с выраженными метастатическими процессами, что способствует инфильтративному росту и развитию отдаленных метастазов.

Увеличение экспрессии Вах свидетельствует об активации апоптоз-индуцирующих механизмов в онкотрансформированных клетках. По-видимому, в случае исследуемых опухолей ЖКТ нарушены какие-либо другие пути реализации апоптоза, соотношение про- и антиапоптотических факторов, либо синтезируется функционально неактивный (например, мутантный) белок Вах. Изучению последней возможности была посвящена часть наших исследований, результаты которых представлены в следующем разделе.

Установлена положительная статистически значимая корреляция между степенью экспрессии Вах в нормальной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (г= 0,91; р < 0,0007): чем больше степень экспрессии Вах нетрансформированными клетками, тем больше степень экспрессии Вах атипическими клетками. Однако в ряде случаев, определяющее значение имеет не уровень экспрессии белка, а способность выполнять свою функцию. В связи с этим следующих этап работы посвящен выявлению мутаций в гене Вах.

3,00 V«' 2ДЗ* 2да*

з,м Г*

1. № 1Л

1,00 •,50 (.00 М5' »,га «.«Л

тн •

ВеМ Вм Гш ВД.

ВсМ Вы Рк РмЬ

□ ¡«трансформированная ткань □ опухолевая ткань В иеметастазирующие опухоли ■ метастазирующие опухоли

Рис. 1. Иммуногистохимическое исследование белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL. А. Степень экспрессии антигена, усл.ед.; Б. Процентное содержание клеток, экспрессирующих антиген.

* Различия показателеймежду нетрансформированной и опухолевой тканью достоверны, _р<0,05

** Различия показателеймежду неметастазирущими иметастазирующими опухолями достоверны,рр<0,05

Таблица 2

Результаты иммуногистохимического исследования уровня экспрессии белков семейства Вс1-2 и системы Рая/РазЬ еетрансформнровааными и атипическими клетками желудка и толстой кишки. _

Антиген Нетрансформированная ткань Опухолевая ткань

Степень экспрессии антигена, СПС, усл.ед. Процентное содержание клеток, экспрессирующих антиген г Р° Степень экспрессии антигена, СПС, усл.ед. Процентное содержание клеток, экспрессирующих антиген г Р

Вс1-2 1,48±0,27 83,9±8,8 0,91 0,00075 2,20±0,19* 98,2±1,0 0,70 0,002

Вах 1,53±0,26 86,5±6,6 0,88 0,002 2,23±0,14* 97,7±1,1 0,71 0,01

Га$ 0,70±0,13 75,3±9,1 0,83 0,005 0,77±0,17 79,3±7,8 0,57 0,09

1а$Ь 1,32±0,25 91,1±7,8 0,86 0,006 2,22±0,20* 99,7±0,4* 0,10 0,78

* Различия показателеймеждунетрансформированной и опухолевой тканью достоверны, _р<0,05

°rup-характеристики корреляционныхзависимостейпроцентного содержания антиген-экспрессирующихклеток и степени экспрессии антигенов (СГК) внетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой ки шки

Мутации гена Вах- одна из возможных причин утраты проапоптотической активности Вах.

Для выявления мутаций использовали прием совмещения ПЦР и анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных продуктов ПЦР (88СР). При последовательной постановке серии ПЦР/^СР с образцами геномной ДНК, выделенными из периферической крови, нетрансформированной и опухолевой ткани, взятыми от больных с новообразованиями желудка и толстой кишки обнаружены изменения схемы 88СР у 5 из 25 больных, что составляет 20% (рис. 2). Причем, у I и П больных схемы 88СР схожи, что дает возможность предположить одинаковые изменения в первичной последовательности ДНК. У больных I - IV наблюдаются изменения схемы 88СР только в опухолевой ткани, а амплифицируемый участок в нормальной ткани и периферической крови оставался интактным. Полученные данные свидетельствует о соматической мутации в гене Вах. У больного V наблюдаются изменения схемы 88СР как в опухолевой ткани, так и в периферической крови. У данного больного диагностирована низкодифференцированная аденокарцинома желудка с метастазами. По-видимому, методом анализа ПЦР с использованием полиморфизма конформаций одноцепочечных продуктов ПЦР удалось определить метастатические клетки, находящиеся в кровеносном русле.

Кроме опухолей желудка и толстой кишки, на наличие мутаций исследованы

123 123123123123

I. II. III. IV. V.

Y~t brf _...

V-* y í

Рис. 2. Результаты предварительного скрининга мутаций в (0)8-

последовательности 3 экзона гена Вах путем ПЦР/88СР у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки.

Электрофореграмма20%ПААГ(29:1), окрашенного нитратом серебра, после разделения продуктовПЦР/SSCP в электрическом поле: дорожка 1 -кровь, 2 - нетрансформированная ткань, 3 - опухолевая ткань.

клеточные линии различных новообразований человека В клеточных линиях опухолей кишки мутаций не выявлено. В клетках SKOV3 (карцинома яичника), СЕМ (Т-клеточный лейкоз), IM9 (миелома) выявлены изменения в исследуемом участке гена Вах (рис. 3). Для подтверждения мутаций и установления их природы проводили автоматическое секвенирование продукта ПЦР и выявили, что клетки SKOV3 несут гетерозиготную мутацию: в одном аллеле определяется делеция 1 остатка гуаниловой кислоты, во втором - вставка 1 остатка гуаниловой кислоты. Т.е. клеточная линия SKOV3 имеет генотип G7/G9, в отличие от дикого типа гена Вах - G8/G8 (рис.4). Таким образом, в обоих аллелях наблюдается мутации со сдвигом рамки считывания, что ведет к синтезу белка со случайной последовательностью, по-видимому, лишенного биологической активности, что, в свою очередь, будет приводить к ингибированию апоптоза и онкотрансформации клетки.

Исследование нарушений регуляции рецептор-опосредованного пути апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки Внешний путь апоптоза опосредуется рецепторами клеточной поверхности, в первую очередь семейства фактора некроза опухоли, ярким представителем которого является Fas. Взаимодействие Fas с физиологическим лигандом, FasL,

Рис. 3. Результаты предварительного скрининга мутаций в (С)8-последовательности 3 экзона гена Вах путем ПЦР/88СР в клеточных линиях различных новообразований человека. Электрофореграмма20%ПААГ(29:1), окрашенного нитратом серебра, послеразделенияпродуктовПЦР/SSCP вэлектрическомполе:

дорожка 1 -мутация отсутствует; наличие мутации в исследуемой области гена Вах в клетках SKOV3 (2), СЕМ (3), Ш9 (4).

*- meoca SSCP

полоса SSCT

•жтт w

ауиептчный процгм ПЦР

1. I. 3. 4.

С AG G G С G A AT GGGGG GG AG tyC А С CC G 1С С 7 GG CCCTG CAGGG CGAATGGGGGGGGG AGGC AC С С G A G CT GGC CCT

Рис. 4. Результаты прямого секвенирования исследуемой области 3 экзона гена Вах в клетках SCOV3. Стрелками указано место мутации. В одном аллеле определяется делеция одного остатка гуаниловой кислоты, во втором - вставка одного остатка гуаниловой кислоты, т.е. клеточная линия SKOV3 имеет генотип G7/G9, в отличие от дикого типа гена Box - G8/G8.

ведет к формированию белкового комплекса, активации каспаз и индукции апоптоза. Существует предположение, что одной из причин развития опухолевых заболеваний является изменение в системе Fas/FasL. [Барышников А.Ю., 2002; Pinkoski М. J., 2000].

Экспрессия Fas клетками желудка и кишечника.

При иммуногистохимическом исследовании уровня экспрессии Fas нетрансформированными и опухолевыми клетками желудка и толстой кишки (п = 11) показано, что Fas экспрессируется на низком уровне меньшим количеством клеток по сравнению с Bcl-2, Bax, FasL (табл. 2). Статистически значимых различий в степени экспрессии Fas между клетками нетрансформированной и опухолевой ткани не выявлено. Однако обнаружены достоверные изменения степени экспрессии Fas клетками метастазирующих опухолей по сравнению с нетрансформированной тканью (р=0,04) и клетками неметастазирующих опухолей (р=0,04): при опухолях с метастазами определяется более низкая степень экспрессии Fas, чем в нормальной ткани на 54% и на 89% меньше, чем при опухолях без метастазов (табл. 2, рис. 1). Также выявлены достоверные различия между количеством Fas-положительных клеток у больных с метастазирующими опухолями по сравнению с больными без метастазов (р=0,009): у больных с метастазирующими опухолями не только снижается степень экспрессии Fas, но и уменьшается количество Fas-положительных клеток на 49%. Полученные результаты согласуются с данными Yoong и соавт. [Yoong K.F., 1999], которые установили, что в метастазирующих опухолях имеет место полная утрата антигена, т.е. злокачественная трансформация ведет к утрате физиологического уровня экспрессии Fas. К этому же выводу пришли Osaki и соавт. [Osaki М., 2001], которые показали, что экспрессия Fas

коррелирует с более высоким апоптотическим индексом и более доброкачественным течением заболевания.

Таким образом, снижение экспрессии Fas на поверхности опухолевой клетки ведут к неспособности ЦТЛ индуцировать апоптоз онкотрансформированной клетки через систему взаимодействий Fas/FasL. Можно полагать, что этот факт играет важную роль в метастазировании опухолей желудка и толстой кишки.

Экспрессия FasL при новообразованиях желудка и толстой кншкн

Клетки, несущие FasL, способны индуцировать апоптоз клеток, экспрессирующих Fas-рецептор и чувствительных к FasL-индуцированному апоптозу. При иммуногистохимическом исследовании уровня экспрессии FasL клетками нетрансформированной ткани из зоны резекции и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (n=11) наблюдалось среднее и сильное окрашивание, обнаруживающие присутствие FasL в исследованных образцах. Показано, что FasL экспрессируется подавляющим большинством клеток желудка и толстой кишки (табл. 2). Надо отметить, что количество клеток, экспрессирующих FasL, в опухолевой ткани достоверно больше, чем в нетрансформированной (р = 0,03). Увеличение степени экспрессии FasL в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной является статистически значимым (р = 0,01): экспрессия FasL в опухолевой ткани увеличивается примерно в 1,7 раза. Выявлена

Ряс. 5. Положительная статистически значимая корреляция между степенью БазЬ в

нетрансформированной и

опухолевой ткани желудка и толстой кишки.

положительная статистически значимая корреляция между степенью экспрессии FasL в нетрансформированной и опухолевой ткани (г= 0,75; р = 0,03): чем выше степень экспрессии FasL нетрансформированными клетками, тем выше степень экспрессии FasL атипическими клетками (рис. 5), что свидетельствует о нарушении регуляции экспрессии FasL у этих больных.

Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что некоторые типы опухолей экспрессируют FasL и обладают способностью убивать Fas-экспрессирующие лимфоциты, «ускользая» от иммунного распознавания [Yoong K.F., 1999; Барышников А.Ю., 2002; Bennett M.W., 1999]. Активированные лимфоциты накапливаются в строме на периферии опухоли и не проникают в опухолевую ткань. В отсутствии Fas-несущих опухолевых клеток-мишеней, FasL-экспрессирующие лимфоциты взаимодействуют с другими Fas-несущими клетками, включая лимфоциты или гепатоциты. Можно

предположить, что увеличение уровня экспрессии FasL опухолевыми клетками вносит существенный вклад в патогенез опухолевого процесса в тканях желудка и толстой кишки посредством индукции апоптоза ЦТЛ, способствует «ускользанию» онкотрансформированной клетки от иммунного надзора, а также метастатической колонизации печени.

Увеличение уровня sFasL в опухолевой ткани желудка

С помошью иммуноблоттинга нами показано, что в опухолевой ткани желудка определяется sFasL, в отличие от нетрансформированной ткани (рис. 6). sFasL - результат расщепления металлопротеиназами. Повреждение ткани вследствие иммунных и воспалительных реакций ведет, как правило, к увеличению активности металлопротеиназы и образованию sFasL [Yoong K.F.,. 1999]. Превращение цитотоксического FasL в его защитную растворимую форму представляет важный регуляторный механизм, с помощью которого чувствительные ткани защищают себя от чрезмерного иммунного ответа. Это также используется опухолевыми клетками для ингибирования противоопухолевого иммунного ответа [Pinkoski М. J., 2000]. Таким образом, появление sFasL при опухолях желудка и толстой кишки является одним из механизмов «ускользания» опухолей от иммунного ответа и представляет собой фактор риска прогрессии заболевания.

Позитивная регуляция FasL мононуклеарными лейкоцитами периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки

В ответ на опухолевую трансформацию клетки в организме наблюдается размножение определенного клона лимфоцитов, что сопровождается увеличением уровня экспрессии FasL Т-клетками, то есть наблюдается активация ЦТЛ, которая в норме должна вести к гибели аномальной клетки [Pinkoski М. J., 2000]. При исследовании уровня экспрессии FasL лимфоцитами периферической крови методом проточной цитофлуориметрии после непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания нами выявлена тенденция к увеличению уровня экспрессии FasL: в 5 из 6 случаев (83,3%) наблюдается повышение уровня экспрессии FasL на 199,8%. Это свидетельствует о наличии в крови больных ЦТЛ, активированных в отношении аномальных клеток. Однако по литературным данным [Bennett M.W., 1999; O'Connell J., 2000; Shiraki К., 1997], большинство опухолевых клеток относительно резистентно к FasL-опосредованному апоптозу вследствие различных приобретенных дефектов

40 кД (мембранно-свжанныйPasI) ряс. 6. Исследование экспрессии FasL методом иммуноблоттинга в 26 КД (растворимый FasL) нетрансформированной

(1) и опухолевой (2) тканях желудка.

сигнального пути реализуемого через Fas. В частности, в нашей работе, как было отмечено выше, показано снижение уровня экспрессии Fas-рецептора и увеличение уровня экспрессии FasL атипическими клетками желудка и толстой кишки, а также увеличение уровня sFasL.

Общие тенденции изменения экспрессии белков системы Fas/FasL и семейства Вс1-2 при новообразованиях желудка и толстой кишки

При исследовании особенностей регуляции апоптоза при опухолевых заболеваниях желудка и толстого кишечника было обнаружено нарушение регуляции апоптоза по механизму его ингибирования. Этому способствует увеличение уровня антиапоптотического бежа Вс1-2, наличие мутаций в проапоптотическом белке Вах, снижение уровня Fas (особенно в метастазируемых опухолях), увеличение уровня FasL, появление sFasL. Таким образом, можно сделать вывод о патогенетическом значении нарушений регуляции апоптоза при опухолевых заболеваниях.

2. Исследование регуляции апоптоза при вирусных заболеваниях

Как известно, вирусы могут индуцировать или блокировать апоптоз в зараженной клетке, как за счет специфического действия продуктов вирусных генов, так и в результате изменения свойств поверхностной мембраны клетки, что делает ее мишенью для цитотоксических иммунокомпетентных клеток. В связи с этим представляло интерес изучение влияния на апоптоз клеток как вирусов ингибирующих апоптоз, так и вирусов индуцирующих апоптоз.

Исследование апоптоза в лимфоцитах периферической крови пациентов с Т-клеточной лимфомой кожи.

К вирусам, ингибирующим апоптоз клеток-хозяев, относят вирусы герпетического ряда, такие как EBV, CMV, HSV1 и HSV2 и ретровирус HTLV1. На основании данных об ингибирующей роли вирусов герпетического ряда и ретровируса HTLV1 апоптоза клеток, можно предполагать их участие в патогенезе опухолевых заболеваний. Мы изучали роль вирусов EBV, HSV1, HSV2, CMV и HTLV1 в индуцировании опухолевых заболеваний клеток иммунной системы, в частости Т-клеточных лимфом кожи (ТКЛК). ТКЖ - это группа опухолей разной степени злокачественности, развивающихся из Т-лимфоцитов преимущественно в коже. В настоящее время полагают, что возникновение ТКЖ обусловлено онкогенными мутациями, которые возникают под влиянием разнообразных факторов, в том числе вирусов.

Анализ геномов вирусов EBV, CMV, HSV1, HSV2 и HTLV, у пациентов с Т-клеточными лимфомами кожи.

На наличие вирусов EBV, CMV, HSV1 и HSV2 и HTLV1 было обследовано 70 больных (40 мужчин и 30 женщин) в возрасте от 21 до 72 лет, имеющих продолжительность заболевания ТКЖ от 7 месяцев до 14 лет. Распределение больных по стадиям заболевания было следующим: 10 больных - с Т-клеточной лимфомой кожи (ТКЖ) низкой степени злокачественности, 36 больных - ТКЖ средней степени злокачественности, 24 больных - ТКЖ низкой степени злокачественности. При исследовании образцов ДНК мононуклеарных клеток

периферической крови пациентов с ТКЛК на содержание геномов HSV1,HSV2, CMV, EBV методом ПЦР были получены следующие результаты.

Геном EBV был обнаружен у 42 пациентов из 70, что составляет 62%. Обнаружение достаточно высокой степени инфицированности EBV пациентов с ТКЛК хорошо согласуются с литературными данными о том, что 69% пациентов с ТКЛК имеют повышенный титр антител к ядерному антигену EBV (EBNA), который является фактором репликации вируса [Но V., 1990].

Геном CMV отсутствовал во всех анализируемых образцах пациентов и здоровых доноров. Геном вируса HSV2 отсутствовал во всех анализируемых образцах пациентов и здоровых доноров. Геном HSV1, который отсутствовал в контрольной группе, был обнаружен в 28 случаях из 70 пациентов, что составляет 39% инфицирования. Анализируя полученные результаты, можно отметить, что геном HSV1 присутствовал, в основном, у EBV-инфицированных больных. Кроме того, данные больные имеют более тяжелое клиническое течение ТКЛК (средней и высокой степени злокачественности), по сравнению с теми больными, у которых присутствовал только геном EBV. Таким образом, наличие коинфекции вирусами герпетической группы может быть показателем степени обострения и/или прогрессирования данного заболевания.

В развитии ТКЛК предполагается этиологическая роль HTLV1. Согласно литературным данным HTLV1 выявляется в 40-60% случаев с ТКЛК [Hall W.W., 1991]. Анализ 70 образцов ДНК пациентов с ТКЛК на содержание генома HTLV1 показал, что в 38 случаях наблюдается высокое содержание данного вируса (54%).

В зависимости от инфицированности вирусами все обследованные больные были разделены на 3 группы: 1. Больные, в лимфоцитах которых не обнаружен геном EBV (EBV); 2. Больные, лимфоциты которых содержат геном EBV (EBV4); 3. Больные, лимфоциты которых содержат геном и EBV и HTLV1 (EBV' HTLV14).

Было обнаружено, что количество лимфоцитов, находящихся в состоянии апоптоза как у пациентов с ТКЛК практически не отличалось от величины, наблюдаемой у здоровых доноров (1,1 - 2,2% и 1,6% от общего числа клеток, соответственно) (табл. 3). Усиления спонтанного апоптоза в лимфоцитах пациентов с ТКЛК, содержащих в геноме лимфоцитов геном вируса HTLV1 (1,2% и 1,1 клеток от общего числа клеток у пациентов EBV (HTLV1+ и EBV+) соответственно), обнаружено не было. Отсутствие изменения количества лимфоцитов в состоянии апоптоза в периферической крови обследуемых пациентов относительно группы доноров может быть связано с тем, что в периферической крови апоптотические клетки быстро фагоцитируются макрофагами, что не позволяет зарегистрировать это явление в периферической крови. В связи с этим представляло интерес выявление комитированных к апоптозу лимфоцитов при их культивировании в виде первичной культуры и при действии агентов, индуцирующих апоптоз.

Таблица 3.

Исследование апоптоза в свежевыделенных лимфоцитах периферической крови и через 24 часа культивирования у пациентов с ТКЛК в сравнении со здоровыми донорами.

Клинический образец % лимфоцитов в состоянии апоптоза в первичной культуре

Сразу после выделения Через 24 часа

Доноры (6) 1,6 + 0,25 5,8 + 0,15

а EBV" HTLV1(5) 1,8 + 0,18 4Л0,20

н EBV" (5) 1,2 + 0,22 4,9 + 0,27

EBV + HTLVl+(3) 1,1 + 0,12 5,1+ 0Д9

Примечание. Достоверность изменений по сравнению с контролем: * - р < 0,05. В скобках - количество случаев.

Исследование индукции апоптоза в первичной культуре лимфоцитов пациентов с ТКЛК под действием доксорубнцина.

В качестве индуктора апоптоза выбран доксорубицин - противоопухолевый антибиотик, механизм действия которого связан с интеркаляцией в ДНК клеток и образованием однонитевых разрывов молекул ДНК, что приводит к развитию программированной гибели этих клеток. Были проведены эксперименты для определения диапазона концентраций, в которых ДР проявляет апоптотическое воздействие на лимфоциты в течение 24 часов в первичной культуре клеток, состоянии апоптоза увеличивается. При концентрации ДР 1 мкМ наблюдаются значительные различия в уровне апоптоза, индуцируемого ДР в лимфоцитах различных групп больных.

Анализ полученных результатов показал, что при данной концентрации ДР у пациентов, содержащих геном EBV в геноме лимфоцитов как при ТКЛК количество клеток в состоянии апоптоза было выше по сравнению с клетками здоровых доноров и с клетками больных, не содержащих геном EBV (рис. 7).

Полученные результаты позволяют заключить, что EBV - инфицированные лимфоциты более чувствительны к действию ДР. При такой же концентрации ДР у пациентов, содержащих геномы и EBV и HTLV1 (коинфицированность HTLV1 и EBV) доля клеток в состоянии апоптоза не отличается от таковой для контрольных лимфоцитов в первичной культуре (возможно за счет ингибирования апоптоза клеток). Таким образом, EBV может играть существенную роль в патогенезе ТКЛК и ангиитов кожи, сенсибилизируя к апоптозу лимфоциты периферической крови пациентов при действии повреждающих факторов. Обнаруженная чувствительность инфицированных EBV лимфоцитов к ДР может быть использована при разработке новых подходов для лечения этих заболеваний.

«КПШ В СОСТОИМ)

амт»%

Рис 7. Зависимость индукции апоптозалимфоцитов от концентрации доксорубицина.

, l.-доноры, 2- EBV, HTLVr пациенты с ТКЛК, 3- EBV+, и HTLV1+ пациенты с ТКЛК, 4-

EBV+ пациенты с ТКЛК

1,0

т«м

Исследование уровня апоптоза и экспрессии белков Fas и FasL в ткани печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С.

К вирусам индуцирующим апоптоз относятся вирусы гепатита В и С. Цель данного раздела работы заключалась в выяснении механизмов цитопатического действия вирусов гепатита В и С.

При гистологическом исследовании биопсийных препаратов печени 26 обследованных больных ХВГ (12 больных ХВГ В и 14 больных ХВГ С) в значительном числе случаев обнаружена очаговая лимфо-гистиоцитарная инфильтрация склерозированных портальных полей, минимальные или умеренные дистрофические изменения гепатоцитов и некроз гепатоцитов. При этом установлено, что активность гепатита была минимальной (Индекс гистологической активности (ИГА) по Knodell 1-3) у пяти из 26 больных ХВГ, легкой у 16 больных (ИГА 4-8), и у 5 человек наблюдали среднюю степень гистологических изменений (ИГА 9-12). В обследованной группе не было ни одного больного с тяжелым течением ХВГ. У 8 из 26 обследованных пациентов признаки фиброза отсутствовали, у 11 обнаружен слабый фиброз (индекс фиброза (ИФ) 1 балл), у 5 - умеренный фиброз (ИФ 2 балла), и у 2 больных был обнаружен тяжелый фиброз (ИФ 3 балла). У 3 из 12 больных ХВГ В и 6 из 14 больных ХВГ С была выявлена жировая дистрофия печени, у 18 из 26 больных обеих групп - деструктивный холангит. Результаты биохимического анализа крови показали, что активность сывороточных трансаминаз была практически нормальной (< 1,5 норм) у 12 больных (для ACT) и 15 больных (для АЛТ), незначительно повышенной (1,5 -3 нормы) у 9 больных для ACT и 9 больных для АЛТ, и умеренно повышенной (3-5 норм) у 5 больных для АЛТ и 2 больных для

При сравнительном анализе морфологических характеристик биоптатов печени и лабораторных показателей у обследованных пациентов в зависимости от этиологии вирусного гепатита обнаружено, что исследованные больные ХВГ В имеют достоверно более высокий уровень ИГА по сравнению с группой

ACT.

Таблица 4.

Сравнительный анализ тяжести гистологических изменений в печени больных при хроническом гепатите В и С в баллах по КгюсЫЬ

Исследуемый показатель Хронический вирусный гепатит В Хронический вирусный гепатит С

ИГА 7,5±0,6 5,2±0,7*

Перипортальный некроз 1,1±0,3 1,<жи

Внутридольковый некроз 2,6±0,2 1,6±0,3*

Воспаление портального тракта 3,6±0,3 2,5±0,3*

Фиброз 1,4±0,3 0,7±0,2*

* -различиямежду гепатитомВи Сдостоверны, р<0,05

больных ХВГ С: 7,5±0,6 и 5,2±0,7 (р=0,03), соответственно, главным образом за счет таких параметров, как внутридольковый некроз и воспаление портального тракта. Степень фиброза у исследованных больных ХВГ В также достоверно превышает таковую у больных ХВГ С (табл. 4). По другим параметрам, таким как возраст, уровень сывороточных трансаминаз, наличие жировой дистрофии и деструктивного холангита, среди больных двух исследованных групп достоверных отличий выявлено не было. Полученные данные свидетельствуют о более тяжелом течении хронического гепатита в случае инфицирования вирусом гепатита В в обследованной выборке.

Исследование уровня апоптоза гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата в печени больных ХВГ В и С с помощью метода TUNEL In situ.

При исследовании уровня апоптоза в препаратах печени лиц из группы сравнения с помощью метода TUNEL наряду со слабо флуоресцирующими клетками (фоновая флуоресценция гистологического среза) с темными («пустыми») ядрами, обнаруживается некоторое количество гепатоцитов, в ядрах которых наблюдается легкое окрашивание ядерной мембраны, а иногда регистрируются включения в виде ядрышка (рис. 8 А, слева, указано стрелками). Такое окрашивание объясняется существованием "метаболических" разрывов в ДНК в тех клетках печени, в которых в данный момент идут активные синтетические процессы, связанные с активацией ядерных синтезов, усиленной экспрессией или амплификацией генов, а также с процессами репарации ДНК. Каждый из этих процессов сопровождается появлением свободных З'-ОН концов в ДНК клеток, протекает в местах прикрепления хроматина к ядерной мембране. По таким З'-ОН концам также происходит включение бромдезоксиуридинтрифосфата под действием концевой

дезоксирибонуклеотидилтрансферазы. При изучении того же поля зрения исследуемого препарата после докрашивания флуорофором Хехст 33258 (рис. 8 А, справа) можно отметить, что все ядра гепатоцитов равномерно окрашены в голубоватый цвет и отсутствует конденсация хроматина, т.е. явных признаков'

апоптотических изменений нет.

Результаты проведения реакции TUNEL на гистологических срезах биоптатов печени больных ХВГ В и С неоднородны. Так, у 9 из 12 (75%) больных ХВГ В не было обнаружено апоптотических изменений в гепатоцитах и лишь незначительное число клеток воспалительного инфильтрата демонстрировало положительное окрашивание по методу TUNEL. У трех больных ХВГ В наблюдали достаточно высокий TUNEL-индекс и гепатоцитов, и клеток инфильтрата. При проведении реакции TUNEL на препаратах печени больных ХВГ С обнаружено, что у большинства больных (9 из 14) TUNEL-индекс гепатоцитов колебался от 30 до 65%. Значительное количество клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата также находилось в состоянии апоптоза (в среднем 52%).

На рис. 8Б, слева представлен типичный препарат биоптата печени больного ХВГ С с высоким уровнем апоптоза гепатоцитов. Ядра TUNEL-положительных клеток имеют интенсивную зеленую флуоресценцию по периферии ядра и частично - в ядерном матриксе (указано стрелками). При докрашивании препарата флуорофором Хехст 33258 в ядрах клеток наблюдались признаки прикраевой конденсации хроматина (рис. 8Б, справа). В таблице 5 представлены данные, позволяющие сравнить средний уровень апоптоза гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата при хроническом гепатите В и С.

Оказалось, что при ХВГ С уровень апоптоза и гепатоцитов, и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата достоверно выше, чем при ХВГ В. Однако при сравнении тяжести гистологических изменений при ХВГ В и С по таким показателям, как ИГА, уровень перипортального и особенно внутридолькового некроза, воспаления портального тракта и фиброза при ХВГ В имеют место более тяжелые изменения, чем при ХВГ С (табл. 4). По-видимому, при ХВГ В наблюдаются более интенсивные некротические процессы, чем при ХВГ С. При исследовании уровня TUNEL-положительных клеток в печени больных ХВГ В и С в зависимости от степени тяжести хронического гепатита было обнаружено, что у больных со средней тяжестью ХВГ (ИГА 9-12) наблюдались более высокие значения апоптоза гепатоцитов по сравнению с группой больных с минимальной и легкой степенью активности вирусного гепатита (ИГА 1-8, табл. 6).

Рис. 8. Окрашивание по методу TUNEL для выявления апоптоза (слева) и контрокрашивание

красителем Хехст 33258 для подсчета клеток (справа) нормальной печени (А) и гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата при ХВГ (Б). Увеличение 400х.

Таблица 5.

Уровень апоптоза (количество TUNEL-положительных клеток) гепатоцнтов а клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата в биоптатах печени при хроническом гепатите В и С.

Исследуемая группа Уровень апоптоза, %

Гепатоцнты Клетки инфильтрата

Хронический вирусный гепатит В 7,6±4,3 11 Д± 1,8

Хронический вирусный гепатит С 32,0±7,1* 22,2*3,5*

* -различия между гепатитом ВиС достоверны, р<0.05

Таким образом, в результате проведенного исследования нами обнаружено, что в препаратах печени 25% (3 из 12) исследованных больных ХВГ В и 64% (9 из 14) больных ХВГ С наблюдали появление гепатоцитов в состоянии апоптоза Уровень апоптоза гепатоцитов у отдельных больных составлял от 12 до 65%. Среди клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата также отмечен значительный уровень апоптоза, достигавший в отдельных случаях 30%. Уровень апоптоза гепатоцитов был существенно выше при ХВГ С и в среднем составил 7,6±4,3% и 32,0+7,1%, а клеток инфильтрата 11,2+1,8% и 22,2+3,1% при ХВГ В и при ХВГ С, соответственно.

Полученные данные о значительном количестве гепатоцитов в состоянии апоптоза (от 12 до 65%) у больных ХВГ ВиС изменяют сложившееся ранее представление о некрозе как об основной форме гибели клеток печени при этих заболеваниях и подчеркивает важную роль апоптоза в патогенезе ХВГ. Обнаруженное нами значительное количество клеток печени в состоянии апоптоза, как уже отмечалось, может быть как следствием цитопатического действия вирусов, так и результатом повреждения гепатоцитов

Таблица 6.

Уровень апоптоза гепатоцитов в зависимости от тяжести патологического процесса при хронических вирусных гепатитах ВиС.

Тяжесть гистологических изменений в печени больных ХВГ (ИГА по КпойеП) УровеньТШЕЬ-положительных гепатоцитов в биоптатах печени

Больные ХВГ В (п=12) Больные ХВГ С (п=14)

Минимальная степень гистологической активности (ИГА 1-8) 4,3 ±4,3 27,4 ±9,6

Средняя степень гистологической активности (ИГА 9-12) 10,8 ±7,6 43,5 ±4,6

цитотоксическими Т-лимфоцитами при участии системы взаимодействий Fas-антигена клетки-мишени и Fas-лиганда активированного Т-лимфоцита. Чтобы оценить возможную роль этой системы в поражении клеток печени при вирусных гепатитах, мы исследовали уровень экспрессии белков Fas и FasL на гепатоцитах и клетках лимфо-гистиоцитарного инфильтрата.

Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков Fas и FasL в ткани печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С.

В результате иммуногистохимического исследования уровня экспрессии белка Fas на всех исследованных контрольных образцах биопсий печени (n=8) была обнаружена экспрессия Fas диффузно в цитоплазме гепатоцитов по всей дольке и в виде зерен (гранул) в цитоплазме гепатоцитов, окружающих центральную вену. Средний Fas-индекс составил 2,3±0,1 усл.ед.. Так же как и при исследовании контрольных образцов, на всех исследованных препаратах биоптатов печени больных ХВГ В и С была обнаружена выраженная экспрессия Fas. Гепатоциты больных ХВГ экспрессируют Fas главным образом в цитоплазме, иногда в виде зерен, и частично на мембране, причем примерно в равной степени как в перипортальной области, так и внутри дольки, вблизи центральной вены. Выраженная экспрессия Fas обнаружена среди клеток воспалительного инфильтрата (табл. 7).

При подсчете Fas-положительных клеток показано, что уровень экспрессии Fas на гепатоцитах больных ХВГ В и С достоверно не различался, в отличие от такового для клеток воспалительного инфильтрата: при ХВГ С клетки

Таблица 7.

Уровень экспрессии белков Fas и FasL на гепатоцитах и клетках лимфо-гистиоцитарного инфильтрата в биоптатах печени при хроническом вирусном гепатите В и С.

N Исследуемая группа Уровень эксп цессии, усл. ед.

Fas FasL

(А) Гепатоциты (В) Клетки инфильтрата (А) Гепатоциты (В) Клетки инфильтрата

1 Хронический вирусный гепатит В 2,3±0,2 0,9±0,2 * 0,8±0,1 *** 1,1±0,3

2 Хронический вирусный гепатит С 2,1*0,2 2,3±0,2 *• 1,0±0,2 *** 2,5±0,2 *; **

3 Контрольная группа (Группа сравнения) 2,3±0,1 инфильтрат отсутствует 0,2±0,1 инфильтрат отсутствует

* - отличие в экспрессии антигена на гепатоцитах и клетках воспалительного инфильтрата внутри одной исследуемой группы,рАВ< 0.05 ** - отличие в экспрессии антигена на клетках одного типа между группами больныхсХВГВи С, р1-2 < 0.05

*** - отличие в экспрессии антигена при ХВГ от нормы, р 13 2-3 < 0.05

воспалительного инфильтрата экспрессируют Fas в достоверно большей степени, что свидетельствует о значительной роли апоптоза в патогенезе этого заболевания, особенно среди внутрипеченочных лимфоцитов.

При исследовании образцов печени из группы сравнения экспрессии белка FasL практически не обнаружено. Можно считать, что в клетках нормальной печени здорового человека FasL не экспрессируется. В то же время экспрессия FasL обнаруживается у больных ХВГ (примерно в равной степени на гепатоцитах больных ХВГ В и С) как на гепатоцитах, так и на клетках воспалительного инфильтрата (табл. 7).

Таким образом, при сравнении степени экспрессии Fas и FasL на клетках печени больных ХВГ и контрольных образцах показано, что гепатоциты больных ХВГ и лиц контрольной группы в равной степени экспрессируют Fas. В то же время гепатоциты больных ХВГ, в отличие от нормальной печени, экспрессируют FasL (табл. 7). В нормальной печени не было выявлено явлений воспаления и появления лимфоцитов. При сравнении уровня экспрессии Fas и FasL на биоптатах печени больных ХВГ В и С основные отличия обнаружены в степени экспрессии исследованных маркеров на клетках лимфо-гистиоцитарного инфильтрата. Так, при ХВГ С внутрипеченочные лимфоциты экспрессируют Fas и FasL в достоверно более высокой степени, чем при ХВГ В (табл. 7).

По накопленным в литературе данным, FasL на гепатоцитах в норме не обнаруживается ни иммуногистохимически, ни с помощью иммуноблотгинга [Mita Е. et al., 1994, Galle P.R. et al., 1995]. Согласно проведенным нами исследованиям, экспрессия FasL практически отсутствует в контрольных образцах, но у больных ХВГ появляется как в гепатоцитах, так и в клетках воспалительного инфильтрата Если экспрессия FasL в клетках лимфо-гистиоцитарного инфильтрата вполне ожидаема и связана, скорее всего, с активацией лимфоцитов в процессе индукции противовирусного иммунного ответа, то появление экспрессии FasL в гепатоцитах больных ХВГ неожиданно. Можно полагать, что в этом случае экспрессия FasL прямо или опосредованно индуцируется вирусами и является одним из механизмов защиты вирус-инфицированных гепатоцитов от действия ЦТЛ, т. к. известно, что конститутивная экспрессия FasL приводит к созданию иммунопривилегированной зоны, защищенной от лимфоцитов, потому что клетки, экспрессирующие FasL, способны индуцировать гибель активированных лимфоцитов по Fas-зависимому механизму [Griffith T.S. et aL, 1995]. Поэтому появление экспрессии FasL в гепатоцитах больных ХВГ может рассматриваться как одна из составляющих проканцерогенных изменений клеток печени под действием вирусов гепатита В и С.

Изучение взаимосвязи между уровнем апоптоза в клетках печени и уровнем экспрессии белков Fas и FasL в этих клетках у больных ХВГ В и С.

В результате проведенных исследований нами обнаружено наличие конститутивной экспрессии белка Fas на гепатоцитах печени больных ХВГ В и С, а также в образцах печени исследованной группы сравнения. Этот факт согласуется с результатами ряда предыдущих исследований [Leithauser R.F. et al., 1993, Hiramatsu N. et al., 1994, Mochizuki K. et al., 1996]. Необходимо отметить,

что обнаружение экспрессии Fas и FasL в печени при той или иной патологии еще не означает участия системы Fas/FasL в процессе клеточной гибели. Поэтому важно было провести параллельные исследования уровня апоптоза и экспрессии данных белков в изучаемом материале.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что при изучении уровня экспрессии бежа Fas клетками важно не только наличие этого бежа, но и локализация Fas в клетке. При сравнении уровня апоптоза гепатоцитов у больных ХВГ с характером экспрессии Fas в клетках печени оказалось, что высокий уровень апоптоза наблюдается тогда, когда имеет место мембранная локализация белка или его накопление в цитоплазме гепатоцитов в виде зерен. При такой локализации Fas доля TUNEL-положительных гепатоцитов была достоверно выше, чем при диффузной, гомогенной локализации Fas в цитоплазме, хотя уровень экспрессии Fas в этих случаях был одинаковым (табл.

8)'

Следует еще раз подчеркнуть, что мембранная локализация белка Fas или его накопление в виде зерен в цитоплазме гепатоцитов имеет место и в исследованных контрольных образцах: зерна Fas наблюдаются в цитоплазме гепатоцитов, окружающих центральную вену. Этот тип локализации Fas, по-видимому, свидетельствует о возможности и готовности элиминации таких клеток в случае появления соответствующих апоптогенных стимулов в виде растворимого FasL или FasL на мембране активированных лимфоцитов в случае их инфильтрации в ткань печени.

При сопоставлении результатов иммуногистохимического исследования уровня экспрессии FasL клетками печени с уровнем апоптоза этих клеток, исследованным с помощью метода TUNEL, обнаружено следующее:

1) прямая, статистически значимая корреляция уровня апоптоза гепатоцитов больных ХВГ В и С с уровнем экспрессии FasL клетками лимфо-гистиоцитарного инфильтрата (г=0.5, р=0.04; рис. 9, А);

2) обратная корреляция уровня апоптоза гепатоцитов с уровнем экспрессии FasL гепатоцитами (г=-0.5, р=0.01;рис9, Б).

Таблица 8.

Уровень апоптоза гепатоцитов в зависимости от локализации белка Fas при хронических вирусных гепатитах В и С.

Локализация белка Fas Уровень апоптоза, %

В цитоплазме диффузно (п=12) 6,7±3,1

в том числе при ХВГ В (п=9) 8,4±3,6

при ХВГ С (п=3) 0,0±0,0

На мембране или в цитоплазме

в виде гранул (п=11) 42,5±6,3*

в том числе при ХВГ В (п=3) 36,3±13,3*

при ХВГ С (п=8) 44,8±7,5*

*- различия между группами достоверны, р<0.05

FasL, усл.ед ует.ад

Рис. 9. Анализ корреляция уровня апоптоза гепатоцнтов больных ХВГ В и С с уровнем экспрессии FasL клетками лимфо-гистиоцитарного инфильтрата (А) и уровнем экспрессии FasL гепатоцитами (Б), г - коэффициент корреляции, р -уровень значимости.

Эти данные подтверждают роль белка FasL лимфоцитов инфильтрата в индукции апоптоза гепатоцитов, а также указывают на защитную роль экспрессии FasL гепатоцитов от индукции апоптоза под действием ЦТЛ инфильтрата.

Таким образом, одновременное исследование уровня апоптоза клеток печени (гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата) и уровня экспрессии на поверхности этих клеток белков, участвующих в индукции апоптоза (Fas, FasL), позволило установить ведущую роль системы Fas/FasL-взаимодействий в повреждении гепатоцитов при ХВГ В и С и подтвердило важное значение клеточного иммунного ответа в повреждении паренхимы печени при этих заболеваниях. Обнаружение экспрессии FasL на гепатоцитах при вирусных гепатитах В и С может являться фактором, способствующим ускользанию вирус-инфицированных клеток от иммунной системы, приводить к персистенции вирусов и хронизации инфекции, а также являться одной из причин проканцерогенных изменений клеток печени при ХВГ В и С.

Исследование уровня апоптоза в сравнении со степенью повреждения ДНК в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных ХВГ В и С.

Как отмечено выше, при вирусных гепатитах В и С мононуклеарные и полиморфноядерные лейкоциты периферической крови также поражаются вирусами. Ранее при вирусном гепатите В была обнаружена высокая степень повреждения ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови [Змызгова А.В., Москалева Е.Ю. и др., 1999]. Для выяснения связи между этим явлением и развитием апоптоза этих клеток нами было проведено исследование уровня апоптоза свежевыделенных лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови и уровня апоптоза этих клеток через 24 часа инкубации в культуральной среде in vitro на 12 образцах периферической крови больных ХВГ В и на 22 образцах - больных ХВГ С.

Полученные результаты представлены на рис. 10. Обнаружено, что количество клеток обоих типов в состоянии апоптоза у больных хроническим гепатитом достоверно превышает значения такового в контрольной группе как непосредственно после выделения, так и после инкубации в течение суток. При этом доля свежевыделенных лимфоцитов в состоянии апоптоза составила 1,2±0,2% у здоровых доноров и 7,7±1,3% у больных вирусным гепатитом (р<0,05), а гранулоцитов - 9,2±1,6% и 15,3+1,8% (р<0,05), соответственно. Доля клеток в состоянии апоптоза после инкубации в течение 24 часов in vitro в питательной среде составила 3,6±0,7% и 15,4+2,4% (р<0,05) для лимфоцитов здоровых и больных, соответственно и 22,0+3,0% и 36,2±3,2% (р<0,05) для гранулоцитов здоровых и больных, соответственно.

При проведении сравнительного анализа уровня апоптоза ЛПК, разделяя больных на группы в зависимости от а) этиологии вирусного гепатита; б) наличия или отсутствия цирроза и в) присутствия нуклеиновой кислоты вирусов в крови пациентов (виремии), как показателя активной репликации вируса в печени, были получены следующие результаты (табл. 9). Достоверных отличий по уровню апоптоза клеток между группами больных с HBV- или HCV-инфекцией не обнаружено (табл. 9, А), хотя можно отметить (как и в случае клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата в печени) несколько более высокие средние значения уровня апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови у больных ХВГ С по сравнению с больными ХВГ В. Также не было выявлено достоверных различий изучаемого показателя между группами больных в зависимости от наличия/отсутствия цирроза (табл. 9, Б), хотя при хроническом гепатите без цирроза мы наблюдали более высокие уровни повреждения клеток крови. При разделении больных на группы по наличию/отстутствию виремии в группе больных с виремией (HBV ДНК+, HCV РНК+) уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов после инкубации в течение суток in vitro достоверно превышает такой показатель в группе больных без виремии (табл. 9, В).

Таким образом, у больных хроническим вирусным гепатитом В и С наблюдается достоверно более высокий по сравнению с контролем уровень апоптоза как лимфоцитов, так и гранулоцитов периферической крови. При сравнении уровня апоптоза ЛПК больных различными формами вирусного гепатита (ХВГ В или С, на стадии цирроза или без цирроза) достоверных отличий в уровне апоптоза этих клеток не обнаружено. В то же время при виремии обнаружен более высокий уровень апоптоза как лимфоцитов, так и гранулоцитов периферической крови после инкубации клеток in vitro в культуральной среде по сравнению с теми больными, у которых нуклеиновая кислота вирусов гепатита в периферической крови отсутствовала. Полученные результаты свидетельствуют о более глубоком поражении ЛПК у больных с наличием нуклеиновой кислоты вируса в крови. Возможно, это связано с цитопатической активностью вирусов, проявляемой в процессе вирусной репликации, или с наблюдающимся в этот период в крови больных высоким уровнем проапоптотического цитокина

Рис. 10. Уровень апоптоза лимфоцитов (А) и гранулоцитов (Б) периферической крови здоровых добровольцев и больных ХВГ В и С непосредственно после выделения клеток из крови в через 24 часа их инкубации в культуральной среде in vitro.

*- отличия от контроля достоверны, р <0,05.

Таблица 9.

Уровень апоптоза лейкоцитов периферической крови здоровых доноров и больных хроническим вирусным гепатитом В и С.

Исследуемая группа Уровень апоптоза клеток, %

Лимфоциты Гранулоциты

Время инкубации Время инкубации

0ч 24 ч 0ч 24 ч

Здоровые добровольцы, п=15 1,2±0,2 3,6±0,7 9,2±1,6 22,0±3,0

Больные ХВГ, п=34 7,7±1,3* 15,4±2,4* 15,3±1,8* 36,2±3,2*

А: ХВГ В, п=12 ХВГ С, п=22 5,9±1,7* 8,8±1,8* 10,0±2,9* 18,2±3,2* 14,0+4,2* 15,9±1,8* 32,7±4,2* 38,0+4,4*

Б: цирроз, №=12 хрон. гепатит, п=22 5,6±1,4* 8,9±1,9* 12,1±3,2* 17,1±3,2* 13,4±3,9 16,2±2,0* 29,5±4,5 39,7+4,2*

В:НВУБ^(+), НСУША(+), п=20 8,8 ± 2,0* 18,9±3,7*, *♦ 15,5±2,3* 46,5±3,8*, **

НВУБЩ-), НСУШАН, п=14 6,0 ±1,1* 10,6*2, !• 14,9 ±3,1 20,7 ±2,2

* - отличия от контроля достоверны, р< 0,05

**-отличиямежду двумя сравниваемыми группами достоверны, р< 0,05

Анализ уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови (ЛПК) в сравнении с уровнем сывороточного TNF-o у больных хроническим вирусным гепатитом.

Как показали результаты недавних исследований [Маммаев С.Н., 2000], в сыворотке крови больных ХВГ наблюдается повышенный уровень ряда провоспалительных цитокинов (ИЛ-8, TGF-|i, TNF-a). При проведении экспериментов по определению уровня апоптоза ЛПК больных ХВГ у 14 из 34 больных из исследованной нами группы был исследован уровень сывороточного TNF-a с помощью иммуноферментного метода. Оказалось, что в сыворотке крови больных с виремией наблюдается достоверно более высокий по сравнению с группой больных без виремии уровень TNF-a (30,8±5,5 и 15,7±3,0 пг/мл, соответственно, р=0,05).

При проведении корреляционного анализа взаимосвязи уровня сывороточного TNF-a и уровня апоптоза ЛПК у исследованных больных было обнаружено, что уровень апоптоза свежевыделенных клеток пропорционален концентрации TNF-a, но эта зависимость была статистически малозначимой (г=0,04, р=0,89 для лимфоцитов и r=0,3,р=0,27 для гранулоцитов). В то же время уровень апоптоза ЛПК больных ХВГ после 24 часов инкубации в полной питательной среде in vitro с высокой значимостью коррелирует с уровнем сывороточного TNF-a у таких больных (r=0,9, р=0,0001 для лимфоцитов и r= 0,7, р=0,004 для гранулоцитов, рис. 11). Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышенный уровень спонтанного апоптоза ЛПК и повышенный уровень провоспалительных/ проапоптотических цитокинов в сыворотке крови больных ХВГ В и С тесно взаимосвязаны.

Представленные данные позволяют заключить, что при ХВГ В и С в результате повреждающего действия вирусов и иммуноопосредованных процессов по механизму апоптоза погибают не только клетки печени, но и лейкоциты периферической крови. Полученные результаты расширяют имеющиеся представления о тканевом тропизме вирусов гепатита В и С и позволяют объяснить многообразие клинических, в том числе внепеченочных, проявлений вирусных гепатитов В и С. Поражение клеточного звена иммунитета, безусловно, вносит вклад в развитие неспособности организма элиминировать инфекцию, способствует персистенции вирусов и хронизации заболевания.

Рис. 11. Анализ корреляция уровня

апоптоза лимфоцитов (А) и гранулоцитов (Б)

периферической крови больных ХВГ В и С через 24 часа инкубации клеток в культуральной среде с уровнем сывороточного TNF-a. r - коэффициент корреляции, р - уровень значимости.

Уровень TMF-а, nr/мл Уровень TNF-a, nrtim

3. Исследование регуляции апоптоза при аутоиммунной патологии.

Апоптоз играет важную роль в развитии и функционировании иммунной системы [Барышников. А.Ю, 2002]. Путем апоптоза в результате отрицательной селекции погибает 95-98% тимоцитов в период созревания тимоцитов в тимусе [Shigekazu N.6 1997]. Апототическая гибель клеток иммунной системы наблюдается в периферических и центральных органах иммунной системы в процессе селекции лимфоцитов при лиганд-рецепторных взаимодействиях [Ju S Т. , 1995], при активации лимфоцитов и при ограничении иммунного ответа после элиминации гаптена [Mei X W6 1997]. Апоптоз лимфоцитов является одним из основных механизмов поддержания толерантности к аутоантигенам путем клональной делеции аутореактивных Т- и В-лимфоцитов [Mountz J D, 1996].

Аутоиммунные заболевания характеризуется поликлональной активацией В-лимфоцитов и продукцией широкого спектра антител к ядерным и цитоплазматическим антигенам. Одним из механизмов, благодаря которым осуществляется элиминация аутореактивных лимфоцитов, является апоптоз. Нарушения его регуляции может вносить определенный вклад в генез данного аутоиммунного заболевания [Mountz J D. et al., 1996]. Целью данного раздела работы явилось изучение особенностей регуляции апоптоза в лейкоцитах периферической крови больных системной красной волчанкой.

Исследование уровня апоптоза клеток периферической крови при СКВ.

При изучении апоптоза лейкоцитов периферической крови больных СКВ при культивировании их in vitro было обнаружено повышение уровня апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов в зависимости от степени активности заболевания (табл. 10). Третья активность СКВ характеризуется самым высоким уровнем развития апоптоза лимфоцитов. В изменении уровня апоптоза гранулоцитов аналогичной зависимости от степени активности заболевания наблюдалось, но была менее выраженной. Возможно, апоптоз лимфоцитов является определяющим звеном в патогенезе СКВ в отличие от апоптоза гранулоцитов, развитие которого определяется сопутствующим воспалительным синдромом.

Таблица 10.

Зависимость уровня апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов от активности СКВ.

Активность СКВ % апоптоза лимфоцитов (М + ш) % апоптоза гранулоцитов (М + т)

Свежевы-деленные Через 18ч. Свежевыде ленные Через 18ч.

I (п=14) 1,5 ±1,1 4,3 ± 1,5 3,01 ± 1,6 10,0 + 2,8

II(n=12) 1,5 ±0,3 7,8" ±2,0 2,72 ± 1,9 12,8 ±3,6

Ш(п=12) 1,1 ±0,11 8,08'±1,0 2,03 ±0,7 17,3 ±6,8

здоровые доноры (п=22) 1,08 ±0,51 5,55 ±3,2 3,58 ±1,4 15,3 ±5,6

*Р< 0,05 относительно I степени активности.

Исследование корреляции между титром аутоантител, уровнем повреждений ДНК и апоптозом клеток крови.

Основным морфологическим проявлением апоптотической гибели клеток является конденсация хроматина по периферии ядра с последующей деградацией ДНК. Происходящая в процессе апоптоза фрагментация ДНК может происходить последовательно: фрагментация на большие, 50-300 тыс. пар нуклеотидов фрагменты с последующим образованием фрагментов ДНК, размером с нуклеосому, т.е. 180 пар оснований [Oberhammer F., 1993]. Было сделано предположение о том, что предшествует фрагментации ДНК многочисленные однонитевые разрывы ДНК, могут служить сигналом инициации апоптоза [Bortner С D, 1995]. Из данных литературы известно, что при апоптозе из клеток осуществляется экскреция нуклеосом, что приводит к появлению антигенов в крови человека [Woodruff E., 1994]. Образование аутоантител к ДНК при при аутоиммунных заболеваниях может быть следствием интенсивной гибели клеток путем апоптоза.

При СКВ большое клиническое значение имеют аутоантитела в двухцепочечной ДНК (dsDNA) или одноцепочечной ДНК (ssDNA). Мы обнаружили достоверную корреляцию между титрами антител к dsDNA и процентом повреждений ДНК в свежевыделенных лимфоцитах и гранулоцитах (r=0,71 и r=0,62 соответсвенно), концентрация титра антител возрастала при увеличении повреждений в ДНК (рис.12). Уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных СКВ изменялся в зависимости от активности заболевания. В активной фазе заболевания (III активность) у 12 больных (35%) отмечалось повышение антинуклеарного фактора, титр которого составил 1:320, 1:160. При II активности (12 больных (35%)) и при I активности (10 больных (30%)) стадиях СКВ титр антинуклеарного фактора составил 1:40 и 1:20. Таким образом, обнаруженная зависимость между уровнем повреждений ДНК в лимфоцитах больных СКВ и титром аутоантител позволяет сделать предположение о взаимосвязи интенсивности апоптоза лимфоцитов и появлением аутоантител у данных больных.

Ряс 12. Корреляция между антителами к ds DNA и процентом повреждения ДНК в лимфоцитах (г= 0.71) и гранулоцитах (г=0.,62). По оси абсцисс- титр

рос национальная Библиотека

С Петербург 09 300 мт

~~ч»и т. ml

антитело к dsDNA. По оси ординат - процент повреждения ДНК в клетках (100% -D%).

Исследование системы Fas/Fas-L в регуляции апоптоза при СКВ.

Система Fas/Fas-L принимает активное участие в регуляции апоптоза клеток. Нарушение регуляции апоптоза с помощью системы Fas/Fas-L может приводить к аутоиммунным заболеваниям [Барышников А.Ю., 2002; Nagata S, 1999; Lorenz НМ} 2000].

В нашей работе установлено, что экспрессия Fas-L на поверхности лимфоцитов и гранулоцитов больных СКВ значительно и достоверно повышена по сравнению с нормальными донорами (табл. 11). Высокий уровень экспрессии Fas-L на лимфоцитах и его увеличение в зависимости от активности заболевания (табл. 18) может указывать на активацию лимфоцитов. Повышенная экспрессия Fas-L может комитировать Fas-экспрессирующие клетки к апоптозу, что подтверждается нашими результатами об увеличении апоптоза лимфоцитов в экспериментах in vitro.

В наших исследованиях мы определяли уровень экспрессии Fas во фракции мононуклеарных клеток, содержащих как В- и Т-лимфоциты, так и моноциты, и во фракции гранулярных клеток, содержащих как нейтрофилы, так и эозинофилы и базофилы. Fas экспрессирован на (26,1 ±7,1)% лимфоцитов и на (28,3 ± 11,2)% гранулоцитов здоровых доноров. Однако при исследовании в зависимости от степени активности СКВ была обнаружена тенденция к увеличению экспрессии Fas на поверхности как лимфоцитов, так и гранулоцитов (табл. И). Представляло интерес исследовать экспрессию Fas-рецептора на отдельных субпопуляциях лимфоцитов и взаимосвязь уровня апоптоза клеток от экспрессии Fas. Уровень экспрессии Fas были измерен на CD3 (Т-супрессоры), CD4 (Т-хелперы), CD8 (цитотоксические лимфоциты), и CD 19 (В-лимфоциты) лимфоцитах. Было обнаружено, что для всех исследованных субпопуляций лимфоцитов уровень экспрессии бежа был выше по сравнению с контролем (табл. 12). Уровень апоптоза был определен в этих же субпопуляциях с помощью проточной цитофлюориметрии. Было обнаружено, что уровень апоптоза был увеличен в CD3, CD4, CD8, и CD20 субпопуляциях лимфоцитов (табл. 13). Реализации апоптогенного сигнала также может способствовать повышенный уровень FasL на поверхности лимфоцитов. Увеличение апоптоза лимфоцитов согласуется с клиническими данными о лимфопении у больных СКВ.

Обнаруженная закономерность позволяет сделать предположение об участии системы Fas/FasL в патогенезе СКВ за счет активации апоптоза клеток.

Как известно, в организме существуют защитные механизмы, предотвращающие выработку аутоантител. В основе этих механизмов лежат процессы положительной и отрицательной селекции лимфоцитов в центральных и периферических органах иммунной системы. Реализация отрицательной селекции осуществляется путем апоптоза лимфоцитов.

Нарушение механизма этого явления может лежать в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Нарушение механизма отрицательной селекции лимфоцитов, в частности появление в крови больных аутоиммунными заболеваниями растворимой формы Fas (sFas) [Cheng J., Zhou Т. 1994], по-

Таблица. 11.

Зависимость экспрессии Fas и FasL на лимфоцитах и гранулоцитах от

активности СКВ.

Активность СКВ % Лимфоциты (М±ш) % Гранулоциты (М + т)

Fas FasL Fas FasL

I (п=18) 26,3 ±4,9 2,1 ± 1,6 26,9 ±22,8 3,5 ±2,7

II (п=6) 27,7± 8,7 2.0 ± 1.8 20,8 ±12,4 4,9±3,0

III (п=14) 32,8 ±8,6 4,3 ±3,3 72,8 ±21,9 6,7 ±2,5

Здоровые (п=22) 26,1 ±7,1 1,7 ±М 28,3 ± 5,2 1,8 ±1,4

Таблица. 12.

Экспрессия Fas (CD9S) в различных субпопуляциях лимфоцитов.

Группа Субпопуляции лимфоцитов, %

CD3 CD4 CD8 CD19

здоровые (п=8) 7,69±1,52 6,28±1,28 5,97 ±1,25 6,96±2,71

СКВ (п=16) 17,32±3,9' 20,35±7,0* 16,25±3,0* 21,03±5,Г

* р<0,05.

Таблица. 13.

Результаты оценки выраженности апоптоза в лимфоцитах разных популяций.

Группа % апототических лимфоцитов в различных субпопуляциях (М±ш)

CD3 CD4 CD8 CD20

здоровые(п= 16) 8,92±2,7 10,88±3,5 10,47±2,5 8,23±2,8

СКВ (п =14) 17,57"±8,6 24,32*±5,7 20,54'±8,5 17,49*±4,4

* р < 0.05

видимому, может играть важную роль в изменении регуляции апоптоза при помощи системы Fas/FasL. sFas может ингибировать апоптоз путем взаимодействия с FasL, предотвращая удаление активированных лимфоцитов. Выяснению роли sFas в регуляции апоптоза лимфоцитов будут посвящены дальнейшие исследования.

Определение sFas в плазме больных СКВ.

При исследовании растворимого Fas было обнаружено умеренное увеличение в уровне растворимого Fas у больных СКВ по сравнению с нормальными здоровыми донорами (1,62±0,29 и 1,38±0,06 нг/мл, соответственно).

В зависимости от активности заболевания, была обнаружена обратная корреляция между sFas и активностью заболевании: первая стадия заболевания

* г =0.5

• •

Рис. 13. Зависимость уровня sFas в плазме больных СКВ от содержания активированных лимфоцитов. По оси абсцисс - концентрация sFas (нг/мл), по оси ординат -процентное содержание

активированных лимфоцитов, определяемого по содержанию Fas(M + m).

Tu <0 и и 1* К 20

характеризовалась самым высоким уровнем sFas по сравнению со второй или третьей (1,81±0,10, 1,35±0,03, 1,26+0,02, соответственно). Этот результат может быть объяснен возможностью sFas соединяться с мембранно-связанным FasL, экспрессия которого возрастает с развитием заболевания (табл.18). Снижение sFas при наиболее тяжелой степени активности СКВ можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, при Ш активности была зарегистрирована повышенная экспрессия FasL на поверхности лимфоцитов, что приводит к взаимодействию sFas/FasL и к снижению концентрации sFas в плазме крови. Использование в наших экспериментах иммуноферментного анализа для определения уровня sFas регистрирует только свободный sFas. Во-вторых, нефропатия, характерная для третьей стадии СКВ, может влиять на экскрецию белков маленького размера с мочой, снижая их уровень в плазме. Было обнаружено, что существуетдостаточно высокая положительная корреляция (г=0,5) междусод лимфоцитов (рис. 13).

Таким образом, можно предположить, что экспрессия Fas возрастает в момент активации лимфоцитов. Увеличение уровня sFas у больных СКВ при этом объясняется протеолитическим расщеплением трансмембранной формы Fas либо альтернативным сплайсингом. Это может являться механизмом, регулирующим функцию Fas-рецептора.

Изучение системы комплемента у больных СКВ.

Мы обнаружили, что большинство обследуемых нами больных СКВ имеют низкий уровень общего комплемента У 27 больных СКВ (67,5%) оценка профиля системы комплемента установила его среднее значение менее 20 мг % (12,5-18,4 мг%) в то время, как нормальное значение составляет 20-40 мг%.

Вместе с тем, 13 больных (32,5%) имели нормальный уровень системы комплемента, что не позволяет рассматривать механизм нарушения функционирования системы комплемента как универсальное звено патогенеза

Изучение антифосфолипидного иммунного ответа.

У 24 больных СКВ (64%) уровень антикардиолипиновых антител класса составлял более 23 МЕ / мл (норма 0-23 МЕ/ мл) в то время как у 13 больных СКВ (35,1%) этот показатель составлял менее 23 МЕ/мл. У 12 больных СКВ

СКВ.

(32,4%) уровень антикардиолипиновых антител класса IgM был выше 26 ME/ мл (норма 0-26 ME/ мл).

Таким образом, обнаруженное выраженное угнетение иммунореактивности у больных системной красной волчанкой, проявляется в снижении уровня общего комплемента, количества CD4+ Т-клеток и иммунорегуляторного индекса (с 1,6 у здоровых доноров до 1,2 у больных) связано с нарушением регуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови больных СКВ.

Показано, что система Fas/FasL играет значительную роль в патогенезе системной красной волчанки. Уровень экспрессии Fas и FasL на лимфоцитах различных субпопуляций (CD3, CD4, CD8, CD19) возрастает в зависимости от степени активности заболевания. При этом в крови пациентов было обнаружено достоверное увеличение апоптоза лимфоцитов и обратная зависимость между содержанием в крови ингибитора sFas и стадией заболевания. Доказанная прямая зависимость, выраженная линейным уравнением регрессии, между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах подтверждает определяющее значение апоптоза клеток в патогенезе СКВ.

4. Коррекция апоптоза на основе генной терапии*

Высокая устойчивость опухолевых клеток к различным комбинациям химиотерапевтических препаратов вынуждает искать новые способы терапевтических воздействий. В этом направлении наиболее интенсивно развиваются исследования, касающиеся создания таких методов генотерапии, которые направленны на регуляцию апоптоза опухолевых клеток. В настоящей главе отражены результаты работы, связанные с коррекцией апоптоза опухолевых клеток с использованием генно-терапевтических подходов регуляции экспрессии генов семейства ВЫ-2.

Изучение устойчивости клеточных линий к противоопухолевым препаратам после трансфекции гена Bcl-2.

Одним из основных ингибиторов апоптоза является продукт гена Bcl-2 -одноименный белок Вс1-2. При увеличении его содержания в клетке происходит ингибирование гибели клеток. Нарушение регуляции апоптоза за счет белка Bcl-2 является одним из механизмов резистентности к лекарственным препаратам опухолевых клеток. Лекарственная устойчивость, обусловленная гиперэкспрессией Вс1-2, обнаружена для опухолей самого различного происхождения, в частности для рака предстательной железы, молочной железы, эндометрия, пищевода, легкого, в В-клетках больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом, фолликулярных лимфомах, у детей, больных острым лимфолейкозом, в меланомах [Brada M., 1992; Hague А., 1994; Sakuragi R, 1998; Schelwies К., 2002; Silvestrini R., 1994]. Особенностью лекарственной устойчивости, обусловленной гиперэкспрессией Вс1-2, является то, что при этом не происходит снижения накопления лекарства в опухолевых клетках (как в

*Автор выражает благодарность д.б.н. Е.Ю.Москалевой за помощь в организации проведения экспериментов.

Рис. 14. Определение уровня белка Bd-2 (26 кД) методом иммуноблотинга в трансфицированных и контрольных клеточных линиях. l-Raji-Bd-2, 2-Иа]1-контроль, 3-Ката1уа-контроль, 4-№ша1уа-Вс1-2, 8-НеРа-контроль, 6-НеРа-Вс1-2.

случае гиперэкспрессии М^-1) не меняется степень повреждения молекулярной мишени (как при увеличении уровня глутатиона или при усилении процессов репарации ДНК), а происходит блокирование передачи сигнала, индуцирующего гибель клетки Вс1-2. таким образом, превращает цитотоксический препарат в щггостатический Следовательно, увеличение концентрации белка Вс1-2 в клетке может служить механизмом к онкотрансформации клеток. В связи с этим изучение белков семейства Вс1-2 и способов регуляции их активности имеет большое значение не только для фундаментальных, но и для научно-прикладных исследований. В этом разделе описаны результаты исследований по выяснению устойчивости клеточных линий к противоопухолевым препаратам в зависимости от уровня белка Вс1-2 в клетке. Для получения опухолевых клеток с высоким уровнем белка Вс1-2 проводили трансфекцию интересующих клеточных линий геном Вс1-2.

Условия максимальной трансфекции подбирали для каждой клеточной линии с использованием аналогичной конструкции, содержащей ген зеленого белка (ОРР) Анализ экспрессии зеленого белка в клетках проводили с помощью флюоресцентной микроскопии по зеленой флюоресценции этого белка и подбирали условия, когда уровень экспрессии зеленого белка в трансфицированных клетках составлял не менее 80%. Далее по подобранным условиям проводили трансфекцию клеток плазмидой, содержащей ген Вс1-2, и контрольной плазмидой, содержащей только ген устойчивости к селектирующему антибиотику (пуромицину). Для получения клонов со стабильной экспрессией интересующего белка после трансфекции клеток отбирали клоны по устойчивости к пуромицину.

Рис. 15. Индукиия апоптоза в клетках динии НеЬа, трансфицированных геном Вс1-2, через 24 часа инкубации с этопозидом(10 мкМ). 1 - клетки, трансфицированные контрольной плазчидой, 2 - клетки, трансфицированные плазчидой, содержащей ген Вс1-2, а- контрольные клетки, б- клетки после инкубации с этопозидом.

Таблица 14.

Увеличение устойчивости клеток к этопозиду после трансфекции гена Bcl-2

Клеточная линия 1С» мкМ

Контроль Вс1-2-трансфицарованпые клетки

МК U ±0,0 10,8 ±0,5

Raji 13 ±0,0 3,2 ±0,1

Namalva 8,1 ± 0,4 12,5 ±0^

HeLa 3,0 ±0,1 7,8 ± 0(4

Таким образом получали контрольные и опытные клоны клеток HeLa (карцинома шейки матки) и В-клеточных линий, МК, Raji, Namalva. Анализ экспрессии Bcl-2 полученных клонов клеток различных линий проводили с помощью иммуноблотинга (Western blot - анализа) (рис. 14). При анализе экспрессии Bcl-2 обнаружили увеличение уровня этого белка как минимум в 2 раза. Изучение чувствительности клонов клеточных линий к химиотерапевтическому препарату этопозиду исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 15) и МТТ-теста (рис.16). Было обнаружено снижение чувствительности к этому реагенту клеточных линий, трансфицированных геном Bcl-2 (рис. 15, 16 и табл.15). Так, IC50 для трансфицированной и контрольной клеточной линии МК различалась в 8 раз, для Raji — в 2,5 раза, для Namalva — в 1,5 раза, для HeLa — в 2,6 раза. Следует отметить, что наибольшее повышение устойчивости клеточной линии к

1 ю 1 ю

Рис. 16. Анализ чувствительности к этопозиду контрольных и трансфицированных геном Вс1-2 клеточных линий. По оси абсцисс -концентрация этопозида, мкМ, По оси ординат- выживаемость клеток,%.

действию цитотоксического препарата при трансфекции гена Bcl-2 наблюдалось для клеточной линии МК, в которой исходно экспрессии ВЫ-2 не обнаружено. Таким образом, продемонстрирована роль бежа Вс1-2 в развитии лекарственной устойчивости, обусловленной гиперэкспрессией гена Вс1-2, что необходимо учитывать в химиотерапии опухолей с повышенным уровнем этого бежа.

Регуляция устойчивости опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к генувс1- 2.

Высокий конститутивный уровень экспрессии Bcl-2 в опухолевых клетках и высокий уровень, достигнутый в результате трансфекции гена Bcl-2, предопределяют устойчивость опухолевых клеток к цитотоксическим препаратам за счет ингибирования апоптоза. В настоящее время интенсивно изучается возможность подавления экспрессии генов с использованием антисмысловых олигонуклеотидов (АСОН). Проникновение свободных олигонуклеотилов в клетки возможно только при высоких концентрациях последних, что приводит к неспецифической токсичности олигонуклеотидов на клетки. Снизить действующую концентрацию олигонуклеотида позволяет технология использования липосомообразующих агентов. Для доставки АСОН в клетки был использован новый липосомообразующий агент ипйёсйп-М, который характеризуется достаточно высокой эффективностью трансфекции и низкой токсичностью для клеток. Полученные результаты представлены на рис. 17 и в табл. 15. Для клеток линии Каша1уа 1С50 для этопозида при использовании случайной олигонуклеотидной последовательности (СОН) составила 0,94 мкМ, в то время как при использовании АСОН к Bcl-2 — 0,3 мкМ. Для клеточной линии Ка^ соответствующие значения 1С50 составили 1,4 и 0,9 мкМ. Свободные АСОН и СОН в исследованном диапазоне концентраций не оказывали токсического влияния на клетки, и выживаемость исследуемых клеток в данных условиях была равна 100%. Необходимо отметить, что при исследовании уровня

Таблица 15.

Увеличение устойчивости клеток к этопознду после инкубации клеточных линий комплексами ШНесйп-М— АСОН и Шйёсйп-М— СОН.

Клеточная линия Обработка клеток 1Ся,мкМ

СОН 1,40 + 0,10

АСОН к Вс1-2 0,94 + 0,03

ЛашаКа СОН 0,97 + 0,03

АСОН к Вс1-2 0,29 + 0,01

Рис. 17. Анализ устойчивости клеточных линий Raji (а) и Namalva (б) к этопозиду после трансфекции антисмысловых олнгонуклеотидов (АСОН) к гевуВс1-2и и случайных олнгонуклеотидов (СОН). Трансфекцию олигонуклеотидов осуществляли с помощью липосомобразующего агента -ШйеСт-М.

По оси абсцисс - концентрация этопознда, мкМ, по оси ординат

t Ig dt ÜJS ЦВ M I,г ¥ Ifi о 0,1 0/1 Oß ii W у у - выживаемость клеток, %.

экспрессии BcI-2 с помощью иммуноблоттинга не было обнаружено значительного подавления экспрессии этого бежа через 24 ч с АСОН. По-видимому, даже незначительные изменения содержания этого белка в клетках (в пределах чувствительности метода) под действием АСОН к Вс1-2 существенно влияют на их резистентность. Резюмируя полученные результаты, следует подчеркнуть, что резистентность к этопозиду для клеток линии Namalva при использовании АСОН к Bcl-2 была снижена в 3 раза, а для клеток линии Raji — в 1,5 раза. При этом следует отметить, что эффект АСОН к Вс1-2 был более значительным в отношении тех клеток, которые характеризуются более высоким уровнем экспрессии Bcl-2. Таким образом, использование АСОН может оказаться эффективным способом преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток с высоким уровнем экспрессии Bcl-2.

Инактивация и сенсибилизация опухолевых клеток с помощью трансфекции гена Вах.

Обнаруженная нами мутация в 3 экзоне гена Вах клеточной линии SCOV3 (аденокарцинома яичника человека) позволяет сделать вывод о роли мутантного проапоптотического белка Вах в онкотрансформации клеток. С этой целью для

J Рис.18. Эффективность трансфекции клеток

аденокарциномы яичника человека линии 8КОУ3, оцениваемая по уровню экспрессии гена ОРР по данным проточной флуориметрии.

По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, по оси ординат- количество клеток. 1 - аутофлуоресценция; 2 -флуресценция траясфицированных клеток.

коррекции апоптоза перспективно использовать терапевтический потенциал гена Вах. При использовании гена Вах в качестве токсического гена, гиперэкспрессия которого может либо непосредственно привести к гибели опухолевых клеток, либо к их сенсибилизации к цитотоксическим препаратам. Целью исследования явилось изучение противоопухолевой активности гена Вах при его переносе в культивируемые опухолевые клетки аденокарциномы яичника и карциномы шейки матки человека in vitro с помощью липофекции и при сочетании трансфекции гена Вах с действием противоопухолевого препарата доксорубицина

Для введения генов в клетки исследуемых линий использовали липотрансфицирующие агенты набора Maxifectin-21™. Для контроля эффективности трансфекции генов в исследуемые клетки оценивали уровень экспрессии гена зеленого белка (GFP) с помощью проточной цитофлуориметрии (рис. 18) и флуоресцентной микроскопии (рис.19). В в выбранных условиях эффективность трансфекции клеток обеих линий составляла около 70-80%, однако уровень экспрессии гена GFP в отдельных клетках различался очень существенно (рис.19).

При трансфекции опухолевых клеток в этих же условиях конструкцией, содержащей ген Вах, и контрольной плазмидой обнаружена интенсивная гибель (90%) трансфицированных геном Вах клеток линии SKOV3 и умеренная гибель (34%) клеток HeLa через 24 часа после трансфекции (рис.20). После трансфекции клетки подвергали селекции на среде с пуромицином (1 мкг/мл) и исследовали уровень экспрессии гена Вах через 24 часа после трансфекции в живых и погибших клетках линии SKOV3 и в селектированных после трансфекции клетках обеих линий (рис.21). Оказалось, что через 24 часа после трансфекции клеток линии SKOV3 наблюдается гиперэкспрессия этого белка в погибших (открепившихся от подложки) к этому времени клетках и повышенный по сравнению с исходным уровень эксперессии Вах в живых клетках. Полученные результаты прямо свидетельствуют о том, что гибель клеток этой линии зависит от уровня экспрессии трансфицированного гена. В тоже время после селекции трансфицированных клеток уровень экспрессии Вах в клетках линии SKOV3 не

Рис. 19. Эффективность трансфекции клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3, оцениваемая по уровню экспрессии гена GFP по данным флуоресцентной

микроскопии.

А - фазово-контрастная микроскопия; В - флуоресцентная микроскопия.

Рис. 20. Выживаемость клеток аденокарциномы яичника человека линии 8КОУ3 и карциномы шейки матки человека линии ЫеЬа через 24 часа после трансфекции гена Вах По оси ординат- выживаемость клеток,%.

Контроль Трансфекция Вах

отличался от контроля (рис. 21 А), что свидетельствует очевидно о гибели всех трансфицированных клеток. Те клетки линии 8КОУ3, которые были живы через 24 часа после трансфекции, но содержали повышенный уровень экспрессии Вах, погибали в более поздний период. В трансфицированных Вах клетках линии ЫеЬа после селекции обнаружена гиперэкспрессия Вах (рис.21 Б).

При исследовании чувствительности к доксорубицину клеток, селектированных после трансфекции геном Вах, оказалось, что чувствительность трансфицированных Вах клеток линии 8КОУ3, в которых отсутствовала повышенная экспрессия этого белка, не отличалась от контрольных клеток. В то же время чувствительность к этому противоопухолевому антибиотику селектированных после трансфекции геном Вах клеток линии ЫеЬа, характеризующихся гиперэкспрессией Вах, возрастала более, чем в 4 раза по 1С50 (рис.22). Таким образом, гиперэкспрессия Вах приводила либо к гибели опухолевых клеток (в случае линии 8КОУ3), либо к повышению их чувствительности к доксорубицину (в случае линии ЫеЬа).

Рис. 21. Western blot анализ экспрессии гена Вах в клетках линии SKOV3 (А) и HeLa (Б), в качестве контроля приведена экспрессия глицеральдегиддегидрогеназы(САРНБ).

А - 1 - выжившие клетки через 24 часа после трансфекции геном Вах; 1 -трансфицированные контрольной плазмидой клетки через 24 часа после трансфекции; 3 - клетки, погибшие через 24 часа после трансфекции геном Вах; 4 - клетки, трансфицированные контрольной плазмидой, после селекции; 5 - клетки, трансфицированные геном Вах, после селекции; 6 - контрольные нетрансфицированные клетки. Б - 1 - контрольные нетрансфицированные клетки; 2 - клетки, трансфицированные контрольной плазмидой, после селекции; 3 - клетки, трансфицированные геном Вах, после селекции.

Рис 22. Чувствительность селектированных после трансфекции контрольной плазмидой (1) или плазмидой, несущей ген Вах (2) клеток аденокарцииомы яичника человека линии БКОУЗ (А) и карциномы шейки матки человека линии ИеЬа (Б) к доксорубицину.

По оси ординат - выживаемость клеток, %; по оси абсцисс - концентрация доксорубицина.

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о различной степени чувствительности опухолевых клеток к гиперэкспрессии нативного гена Вах. Гиперэкспрессия Вах приводила к гибели 90% опухолевых клеток аденокарциномы яичника человека линии БКОУЗ с мутантным геном Вах. При селекции оставшихся живых опухолевых клеток выживали только клетки с очень низким уровнем экспресии этого белка, который не влиял на чувствительность селектированных клеток к доксорубицину. В тоже время клетки линии ИеЬа были более устойчивы к гиперэкспрессии Вах - после транзиторной трансфекции выживало около 65% клеток, трансфицированные клетки удавалось селектировать и получить клетки со стабильной гиперэкспрессией Вах, которые были высокочувствительны к доксорубицину.

Полученные данные о гиперчувствительности клеток линии БКОУЗ к трансфекции нативным геном Вах позволяют заключить, что обнаруженная мутация приводит к синтезу функционально неактивного проапоптотической мутантного белка Вах, играющего значительную роль в онкотрансформации клеток В случае выявления мутаций в гене Вах опухолевых заболеваний человека, в частности опухолей ЖКТ, коррекция апоптоза с использованием гена Вах по-видимому будет наиболее эффективна.

Таким образом, на основании результатов исследований, приведенных в данной главе продемонстрирована важная роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза клетки. Изменение соотношения концентрации белков Вс1-2/Вах в сторону увеличения антиапоптотической активности влияет на формирование лекарственной устойчивости. Индукция проапоптотической активности белков семейства Вс1-2 - основная цель при терапии опухолевых заболеваний. Это можно достигнуть уменьшением концентрации Вс1-2 за счет использования антисмысловых олигонуклеотидов к этому гену или за счет трансфекции гена Вах в клетки-мишени.

Таким образом, показана принципиальная возможность регуляции апоптоза на основе генной терапии за счет изменения проапоптотической и. антиапоптотической активности белков семейства Вс1-2.

Выводы

1. При заболеваниях разной этиологии, сопровождающихся изменением иммунного статуса пациентов, нарушения апоптоза происходят как в области внешнего (система Fas/FasL), так и внутреннего пути регуляции (белки семейства Вс1-2)

2. При развитии новообразований желудочно-кишечного тракта обнаружено увеличение антиапоптотической активности белков семейства вс1-2. Содержание белка вс1-2 в опухолях желудка и тонкой кишки возрастает в полтора раза. Увеличение уровня белка вс1-2 в опухолевой ткани приводила к развитию феномена лекарственной устойчивости. У 20% пациентов заболевание сопровождается наличием мутаций в третьем экзоне гена Вах. Полученные данные соотносятся с результатами исследований опухолевых клеточных линий.

3. Установлено, что уменьшение продукции белка Fas в опухолях желудочно-кишечного тракта с различной способностью к метастазированию сопровождается достоверным увеличением синтеза FasL.

4. Обнаружена более высокая чувствительность лимфоцитов больных Т-клеточной лимфомой кожи, содержащих вирус Эгаптейн-Барра по сравнению с лимфоцитами, инфицированными вирусом Т-клеточной лейкемии-I к индукции апоптоза, вызванного доксорубицином.

5. Показано, что увеличение апоптоза вирус-инфицированных клеток происходит за счет активации клеток иммунной системы. Доказано, что уровень апоптоза гепатоцитов при хроническом вирусном гепатите В и С прямо пропорционален степени экспрессии FasL клетками лимфо-гистиоцитарного инфильтрата в печени и обратно пропорционален уровню экспрессии FasL гепатоцитами.

6. Показано, что система Fas/FasL играет значительную роль в патогенезе системной красной волчанки. Уровень экспрессии Fas и FasL на лимфоцитах различных субпопуляций (CD3, CD4, CD8, CD 19) возрастает в зависимости от степени активности заболевания. При этом в крови пациентов было обнаружено достоверное увеличение уровня апоптоза лимфоцитов и обратная зависимость между содержанием в крови ингибитора sFas и стадией заболевания.

7. Показана принципиальная возможность использования антясмысловых олигонуклеотидов в качестве препаратов для преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток, обусловленной высоким уровнем экспрессии Bcl-2.

8. Показана возможность применения подходов генной терапии на основе трансфекции Вах в качестве противоопухолевых препаратов: гиперэкспрессия Вах приводит к повышению их чувствительности к химиотерапевтическим средствам и к гибели клеток.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации.

1. Хасан Хамад А., Глухов А.И., Гордеев С.А., Силуянова С.Н., Белушкина НН, Тахер А Смирнова Л .М., Северин Е. С, Иванов О Л. Анализ содержания геномной ДНК некоторых вирусов герпетической группы в мононуклеарных клетках крови пациентов с кожной Т-клеточной лимфомой // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии.- 1998.-№3.-С25-28

2. Белушкяна Н.Н., Хасан Хамад А., Северин СЕ. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. -1998. - №4. - С. 15-24.

3. Хасан Хамад А., Глухов А.И., Гордеев CAL, Силуянова С.Н., Белушкина Н.Н., Тахер А., Смирнова Л.М., Северин Е.С, Иванов ОЛ Определение этиологической роли вирусов герпетического ряда методом полимеразной цепной реакции у пациентов с кожной лимфомой // VIII конференция «Новые направления биотехнологии» г.Москва. - 1998. -С.98.

4. Хасан Хамад А, Глухов А.И., Гордеев СА, Силуянова С.Н Белушкина НН, Шилова Н.Г., Северин Е.С., Иванов О Л. Исследование вирусной этиологии ангиитов кожи // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 1999- № 1. - С. 27-30.

5. Белушкина Н.Н. Контроль процесса апоптоза белками семейства Вс1-2 // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2000. - №4. - С. 9-16.

6. Хасан Хамад А., Попова О.Н., Силуянова С.Н., Белушкина НН Исследование апоттоза лимфоцитов периферической крови больных с Т-клеточной лимфомой кожи и ангиитами кожи. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2000. - №4. -С. 22-25.

7. Буеверов А.О., Тихонина Е.В., Москалева ЕЛО., Белушкина Н.Н., Попова О.Н., Ивашкин В.Т., Северин Е.С. Апоптоз и повреждение ДНК лейкоцитов периферической крови у больных хроническим гепатитом // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2000. - № 1. - С25.

8. Буеверов А.О., Тихонина Е.В., Москалева Е.Ю., Белушкина Н.Н., Попова О.Н., Ивашкин

В.Т., Северин Е.С. Апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови при хронических HBV- и HCV-инфекниях // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2000. - №б. - G33-36.

9. Белушкина H.R, Москалева ЕЛО., Северин СЕ. Апоптоз в патогенезе заболеваний (Глава

2.)// «Биохимические основы патологических процессов» под редакцией Е.С.Северина. Учебное пособие, издательство «Медицина». - 2000. - С. 31-50.

10. Буеверов А.О., Дмитриева Е.В., Мамаев С.Н., Москалева Е.Ю., Белушкина Н.Н., Попова О.Н., Ивашкин ВХ, Северин ЕС. Апоптоз периферических лейкоцитов при хронической HBV- и HCV-инфекции: тезисы VI Рос Конф. «Гепатология сегодня», Москва, 20-23 марта 2001 г. // Рос журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2001. -Т.11, прилож.12, №1. - С. 6.

11. Белушкина Н.Н Северин СЕ. Молекулярные основы патологии апоптоза // Архив патологии. - 2001. - № 1. - С. 51-60.

12. Белушкина H^ Зыкова Е.С, Обухова В.В., Зыкова ОЛ., Лесничук СА, Силуянова СЛ., Харнас С.С, Самохвалов А.В., Северин СЕ. Обнаружение мутаций в проапоптотическом гене Ьах у больных с опухолями желудка с помощью полимеразной цепной реакции // Цитология. - 2001. - Т.43, С3 21.

13. Сладкова Л.В., Москалева Е.Ю., Белушкина Н.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. Экспрессия генов bcl и Ьах в различных линиях В-клеток человека // Цитология. -2001.-Т.43, С393-394.

14. Белушкина Н.Н., Зыкова Е.С., Закераева Т.З., Зыкова О.Н Родина А.В Силуянова СН, Лесничук СЛ., Северин СЕ. Обнаружение мутаций в проапоптотическом гене Ьах различных клеточных линий с помощью полимеразной цепной реакции // Цитология. -2001.-T.43.-N9.-C.841.

15. Белушкина Н.Н Зыкова Е.С., Обухова В.В., Зыкова А.Н., Лесничук СЛ., Силуянова СН, Харнас С.С. Самохвалов А.В., Северин СЕ. Детекция мутаций в проапоптотическом гене ВАХ методом ПЦР/SSCP // Научно-практический симпозиум «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках

Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (июнь 2002,), Сборник тезисов, Москва.- С. 47-52.

16. Мохиль-Дейн АХ, Белушкина НН, Петрова У А, Замаева Н.Ю., Лыскина ГА Исследование экспрессии Fas и Fast в лимфоцитах периодической крови человека у здоровых доноров и у детей с системной красной волчанкой. // International Journal on Immunorehabilitation. - 2002. - No 1. - VoIA- P.I 13.

17. Мохиль-Дейн А.Х., Белушкина НН Петрова У.Н., Лыскина ГА,Белоусова ТА, Замаева Н.Ю., Северин С.Е. Повреждение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови у больных системной красной волчанкой н другими аутоиммунными заболеваниями как маркер апоптогенной готовности. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2002. - №3. ■ С. 24-28.

18. Severn S.E., Sladkova L.V., Rodina A.V., Moscaleva EYu., Zakeraeva T.Z., BelusbJdna N.N., Zykova E.S., Prusakova O.V., Belecky I.P., Surovoy AVu. Transfection of gene bax induces death of human ovary carcinoma cells (SKOV3) // 3 international symposium of genetic anticancer agents. Feb. 28 - Marsh 2. Amsterdam. - 2002. - P.82

19. Сладкова Л.В., Родина А.В., Москалева Е.Ю., Закераева ТЗ, Белушкина Н.Н., Зыкова Е.С., Северин С.Е. Терапевтический потенциал гена Вах-индукция апоптоза и сенсибилизация опухолевых клеток при трансфекции этого гена // I Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака». - 2002. - С.105-107.

20. Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Обухова В.В., Белушкина H.FL, Посыпанова ГА, Харнас С.С., Самохвалов В.Т., Северин Ё.С., Кетлинский А.В., Пальцев МА Регуляция чувствительности опухолевых клеток с помощью антисмысловых нуклеотидов к гену bcl-2 // Молекулярная медицина. - 2003. - № 1, С.45-51.

21. Belushldna N.N., Mohiel-Dein AN., Petrova UJ4. Phenotype and apoptosis of lymphocyte subpopulations from patients with systemic lupus erythematosus. // The FEBS Journal - 2003. -P. 91.

22. Дмитриева Е.В., Москалева Е.Ю., Коган ЕЛ., Буеверов АО., Белушкина Н.Н., Ивашкин

B.Т., Северин Е.С., Пальцев М.А. Роль системы Fas/FasL в индукции апоптоза гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах //Архив патологии. - 2003. - Т.65. -

C.13-17.

23. Мохиль-Дейн А.Х., Белушкина Н.Н., Петрова У.Н., Обухова В.В., Замаева Н.Ю., Северин С.Е., Северин Е.С. Исследование уровня апоптоза и экспрессии Fas и Fas-L в лейкоцитах периферической крови у детей, больных системной красной волчанкой // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2003. - № 2. - С. 28-33.

24. Белушквна Н.Н. Апоптоз клеток, как пример межклеточного взаимодействия (Глава 4) // МАПальцев, ААИванов, СЕСеверин «Межклеточные взаимодействия», изд. Медицина, г.Москва. - 2003. - С. 187-218.

25. Обухова В.В., Белушкина Н.Н., Макарова О.В., Дмитриева Е.В., Замаева Н.Ю., Харнас С.С., Самохвалов А.В., Белецкий ИЛ., Жукова АЛ., Телегина Е.С., Северин Е.С., Северин Е.С. Система Fas/Fasl при новообразованиях желудка и толстой кишки. // Молекулярная медицина - 2004. - №2. - С. 44-49.

26. V.Obukhova, N.Belusbkina, E.Dmitrieva, LBeletsky, S.Severin, E.Severin, A.Samochvalov, S.Charnas The role of sFas as a marker predicting metastasis in gastric and colon cancer. 18 Meeting of the European Association for Cancer Research. 3-6 July 2004. - №371

27. Обухова B.B., Белушкина Н.Н., Самохвалов А.В., Харнас С.С. Определение содержания белков семейства BCL-2 при опухолях желудудка и толстой кишки // Сборник тезисов I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2628 октября 2004.- С. 142-143

28. Родина А.В., Сладкова Л.В., Обухова ВВ., Везирханова T.3., Москалева Е.Ю., Белушкина Н.Н., Прусакова О.В., Белецкий ИП, Стрельников В.В, Иванов МА, Северин С.Е., Северин Е.С. Инактивация и сенсибилизация опухолевых клеток с помощью трансфекции геном ВАХ//Молекулярная биология. - 2004. - Т.38. - №6. -1-8

29. Белушкина Н.Н., Белецкий ИЛ. Молекулярно-медицинские аспекты клеточной гибели (Глава 9) // «Введение в молекулярную медицину» под редакцией МАПальцева. -Москва. - Издательство «Медицина». - 2004

»25 17}

Белушкина Наталья Николаевна (Россия)

Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях.

Работа посвящена исследованию особенностей регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях. Выявлено, что при заболеваниях разной этиологии, сопровождающихся изменением иммунного статуса пациентов, нарушения апоптоза происходят как в области внешнего (система Fas/FasL), так и внутреннего пути регуляции (белки семейства Bcl-2). Показана принципиальная возможность использования антисмысловых олигонуклеотидов в качестве препаратов для преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток, обусловленной высоким уровнем экспрессии Вс1-2, а также возможность применения подходов генной терапии на основе трансфекции Вах в качестве противоопухолевых препаратов: гиперэкспрессия Вах приводит к повышению их чувствительности к химиотерапевтическим средствам и к гибели клеток.

Betushkina Natalya INikolaevna (Russia)

Features ofapoptosis regulation at tumoral, vims and autoimmunity diseases.

Work is devoted to research of apoptosis regulation features at tumoral, virus and autoimmunity diseases. It is revealed, that at different diseases, accompanying by change of the immune status of patients, apoptosis infringements occur in the field of external (system Fas/FasL), and internal way of regulation (protein of family Bcl-2). It was shown the basic opportunity of use antisense oligonucleotides as medical product for overcoming drug resistance of the tumoral cells caused by a high level expression Bcl-2, and also an opportunity of application of gene therapy approaches on the basis transfection Bax as antineoplastic preparations: hyper expression Bax leads to increase of their sensitivity chemotherapeutic means and to destruction of cells.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Белушкина, Наталья Николаевна

Содержание

Список сокращений

Введение

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Апоптоз как общебиологический механизм гибели клеток

1.1.1. Морфологические изменения в процессе апоптоза

1.1.2. Молекулярно-биохимические изменения в процессе апоптоза

1.1.3. Пути передачи апоптотического сигнала в клетку

1.2. Белки семейства Вс1

1.2.1. Функциональные домены белков семейства Вс1-2 и их участие в формировании димеров

1.2.2.Пороформирующая активность белков семейства Вс1

1.2.3. Антиапоптотические белки

1.2.4.Проапоптотические мультидоменные белки

1.2.5.Влияние белков семейства Вс1-2 на прохождение по клеточному циклу

1.2.6. Механизм действия белков семейства Вс1

1.2.7. Взаимодействие различных путей апоптоза

1.3. Заболевания, связанные с нарушением регуляции апоптоза

1.3.1. Нарушение регуляции апоптоза при опухолевых заболеваниях.

1.3.2. Апоптоз и вирусная инфекция

1.3.3. Апоптоз и аутоиммунные заболевания

1.4. Принципы коррекции апоптоза клетки с использованием генно- 64 терапевтических подходов

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование регуляции апоптоза при онкологических заболеваниях

3.1.1. Исследование нарушений регуляции внутреннего пути апоптоза 113 при новообразованиях желудка и толстой кишки

3.1.1.1. Иммуногистохимическое исследование уровня 114 экспрессии белков семейства Вс1-2.

3.1.1.2. Выявление мутаций в (С)8-последовательности 3 экзона гена 128 Вах

3.1.2. Исследование нарушений регуляции внешнего пути апоптоза при 135 новообразованиях желудка и толстой кишки

3.1.2.1. Экспрессия Fas при новообразованиях желудка и толстой кишки

3.1.2.2. Экспрессия FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки 140 3.2. Исследование регуляции апоптоза при вирусных заболеваниях

3.2.1. Исследование апоптоза в лимфоцитах периферической крови пациентов 146 с Т-клеточной лимфомой кожи.

3.2.1.1. Анализ геномов вирусов EBV, CMV, HSV1, HSV2 и HTLV, у 147 пациентов с Т-клеточными лимфомами кожи.

3.2.1.2. Исследование индукции апоптоза в первичной культуре 150 лимфоцитов пациентов с Т-клеточной лимфомой кожи под действием доксорубицина

3.2.2. Исследование уровня апоптоза и экспрессии белков Fas и FasL в ткани 156 печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С.

3.2.2.1. Анализ основных клинико-лабораторных показателей 156 исследованной группы больных.

3.2.2.2. Исследование уровня апоптоза гепатоцитов и клеток лимфо- 158 гистиоцитарного инфильтрата в печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С с помощью метода TUNEL in situ.

3.2.2.3. Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков

Fas и FasL в ткани печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С.

3.2.2.4. Изучение взаимосвязи между уровнем апоптоза в клетках печени 168 и уровнем экспрессии белков Fas и FasL в этих клетках у больных хроническим вирусным гепатитом В и С. 3.2.3. Исследование уровня апоптоза в сравнении со степенью повреждения 170 ДНК в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных ХВГ В и С.

3.2.3.1. Исследование уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови 173 больных хроническим вирусным гепатитом В и С непосредственно после выделения и после культивирования in vitro в течение суток.

3.2.3.2. Анализ уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови в сравнении с уровнем сывороточного фактора некроза опухоли-a у 178 больных хроническим вирусным гепатитом.

3.3. Исследование регуляции апоптоза при аутоиммунной патологии.

3.3.1. Исследование уровня апоптоза клеток периферической крови при 181 системной красной волчанке.

3.3.1.1. Исследование взаимосвязи между уровнем повреждения ДНК и 182 апоптозом лейкоцитов.

3.3.1.2. Исследование корреляции между титром аутоантител, уровнем повреждений ДНК и апоптозом клеток крови.

3.3.1.3. Исследование предрасположенности к апоптозу различных ^^ субпопуляций лимфоцитов больных системной красной волчанке.

3.3.2. Исследование роли системы Fas/Fas-L в регуляции апоптоза при системной красной волчанке.

3.3.2.1. Исследование экспрессии CD95 (Fas) и оценка уровня апоптоза 192 различных субпопуляций лимфоцитов.

3.3.2.2. Определение растворимого sFas в плазме больных системной красной волчанке.

3.3.2.3.Определение зависимости относительного содержания sFas/Fas от содержания активированных лимфоцитов.

3.3.2.4. Изучение взаимосвязи уровня sFas и титра антиядерных антител

3.3.2.5. Изучение системы комплемента у больных СКВ.

3.3.2.6. Изучение антифосфолипидного иммунного ответа. ^^

3.4. Коррекция апоптоза на основе генной терапии

3.4.1. Изучение устойчивости клеточных линий к противоопухолевым 202 препаратам после трансфекции гена Bcl-2.

3.4.2. Регуляция устойчивости опухолевых клеток к противоопухолевым 208 препаратам с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к гену Bcl-2.

3.4.3. Инактивация и сенсибилизация опухолевых клеток с помощью 213 трансфекции гена Вах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях"

Гибель клеток, наряду с пролиферацией и дифференцировкой, является фундаментальным процессом, определяющим жизнедеятельность многоклеточного организма. Интенсивные исследования клеточной гибели, выполненные в последнее десятилетие, привели к созданию определенных представлений о природе этого сложного явления, играющего важную роль в развитии ряда процессов в здоровом организме и при патологии. Вместе с тем, имеющиеся знания об особенностях биохимии алоптоза при различных патологических состояниях, в первую очередь при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях, явно неполны и недостаточны, что делает изучение особенностей регуляции программированной гибели клеток при этих заболеваниях весьма актуальным для медицинской биохимии.

Нарушение регуляции апоптоза сопровождает развитие различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, ингибированием апоптоза. К заболеваниям, в основе которых лежит ингибирование апоптоза, относятся, в первую очередь различные опухолевые заболевания. При этом неспособность клеток вступать в апоптоз в ответ на физиологические стимулы приводит к дисбалансу между пролиферацией и гибелью клеток [17, 35, 75, 126, 206]. С нарушением регуляции апоптоза также связывают высокую устойчивость опухолевых клеток к различным химиотерапевтическим препаратам [19, 67, 75, 111, 196,203,255,258,280, 306, 334].

В последние десятилетия во многих странах мира, в том числе в России, отмечается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями органов пищеварения, а также увеличение смертности от этих заболеваний. Наиболее часто опухолевые заболевания выявляются в пожилом возрасте (60 лет и старше), однако, все чаще подобный диагноз ставят в более молодом возрасте (40-50 лет).

Неудовлетворительное состояние онкологической помощи населению в Российской Федерации привело к росту числа лиц с IV стадией заболевания и увеличению уровня летальности на 1-ом году с момента установления диагноза. Около 80% злокачественных новообразований органов пищеварения приходится на рак желудка, поджелудочной железы и толстой кишки. Таким образом, заболевания раком желудка и толстой кишки не снижаются на протяжении многих лет. Прогресс в борьбе со злокачественными новообразованиями напрямую зависит от установления механизмов развития опухолей и их ранней диагностики [2, 6, 7, 20, 61].

Среди заболеваний, связанных с усилением апоптоза, особое внимание следует уделить вирусным и аутоиммунным заболеваниям. В последние годы широким кругом специалистов ведется интенсивное изучение проблемы хронических вирусных гепатитов В и С (ХВГ В и С), которая приобретает социальную значимость ввиду широкого распространения этих заболеваний, роста заболеваемости, особенно среди лиц молодого возраста, тяжести осложнений в виде цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы и отсутствия эффективных методов лечения. Применение современных методов молекулярной и клеточной биологии позволило значительно расширить имеющиеся представления о биологии вирусов гепатита В и С (НВУ, НСУ) [76, 224, 318, 381]. Вместе с тем, многие вопросы патогенеза вирусных гепатитов остаются неясными, в частности, механизмы повреждения гепатоцитов - основной мишени действия вирусов. Открытие регулируемого процесса апоптоза [157] стимулировало изучение роли этого явления в патологии печени, в результате чего было обнаружено, что при развитии острых и хронических вирусных гепатитов на первых этапах гибель гепатоцитов происходит путем апоптоза [123, 211] Это также касается также ряда других заболеваний печени, включая аутоиммунные, лекарственные, алкогольные поражения печени. Предотвращение повреждения клеток печени при гепатите -одна из задач, которая стоит перед научными исследователями и медиками.

При вирусном гепатите апоптоз гепатоцитов может быть результатом как прямого повреждающего действия вирусной инфекции (цитопатическое действие), так и опосредованного, развивающегося в результате иммунных реакций. Цитопатическая активность вирусов гепатита В и С проявляется в процессе вирусной репликации в клетке. Традиционно считалось, что вирусы вызывают гибель клеток в результате узурпации механизмов транскрипции и трансляции и разрушения клеточной мембраны. Однако в настоящее время не вызывает сомнений, что большая часть вирусов индуцирует апоптоз инфицированной клетки [156, 352]. Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых вирусы гепатита В и С активируют апоптоз:

1) путем непосредственного проапоптотического действия специфических вирусных белков, образующихся в процессе репликации вируса: X белка вируса гепатита В [158,261] и кор-белка вируса гепатита С [129, 151];

2) путем повышения концентрации на клеточной мембране тех рецепторов, через которые передается сигнал к индукции апоптоза, например, Fas [123], и увеличения чувствительности клеток к различным проапоптотическим стимулам, в частности, к TNF-a [320, 330, 380]. Таким образом, цитопатическая активность вирусов гепатита В и С проявляется в прямом или косвенном проапоптотическом действии вирусов на инфицированные клетки и вносит существенный вклад в патогенез поражения печени при вирусных гепатитах.

Известно, что в современной медицинской практике часто встречаются онкологические заболевания, ассоциированные с вирусной, например цитомегаловирусной или герпесной инфекцией. Изучение особенноствей регуляции апоптоза в таком сочетании представляет значительный интерес, т.к. позволяет судить о патогенезе сложных сочетанных форм заболеваний у конкретных больных.

Апоптоз также играет важную роль в развитии и функционировании иммунной системы [142, 172, 272]. Путем апоптоза в результате отрицательной селекции погибает 95-98% тимоцитов в период созревания тимоцитов в тимусе [297]. Апоптотическая гибель клеток иммунной системы наблюдается в периферических и центральных органах иммунной системы в процессе селекции лимфоцитов при лиганд-рецепторных взаимодействиях [146], при активации лимфоцитов [205, 332] и при уменьшении иммунного ответа после элиминации гаптена [3]. Апоптоз лимфоцитов является одним из основных механизмов поддержания толерантности к аутоантигенам путем клональной делеции аутореактивных Т- и В-лимфоцитов [222].

Известно, что аутоиммунные заболевания характеризуются поликлональной активацией В-лимфоцитов и продукцией широкого спектра антител к ядерным и цитоплазматическим антигенам. Одним из механизмов, благодаря которым осуществляется элиминация аутореактивных лимфоцитов, является апоптоз. Нарушения его регуляции вносит существенный вклад в генез аутоиммунного заболевания [221].

Понимание молекулярных механизмов клеточной гибели в норме и при различных патологиях позволяет не только понять причины заболеваний, но и осуществлять направленный поиск способов их лечения. Анализ современной литературы показывает, что основные исследования в области регуляции клеточной активности связаны с направленным введением генов в отдельные клетки человека. Учитывая важность апоптоза в функционировании органов и тканей организма, можно полагать, что ключевые гены этого процесса находятся в центре внимания исследователей [4, 5, 62, 94,237, 268, 283, 304, 335, 362].

В связи с вышеперечисленным, целью настоящего экспериментального исследования явилось изучение механизмов регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях, а также исследование возможности коррекции апоптоза клеток с помощью регуляции уровня экспрессии генов белков семейства Вс1-2.

При этом были поставлены следующие задачи исследования:

2. Изучение роли Вс1-2 в возникновении устойчивости клеточных линий к противоопухолевым препаратам.

3. Установление закономерности регуляции апоптоза в новообразованиях желудка и толстой кишки с помощью белков системы Рав/РавЬ.

4. Выяснение роли системы Раз/ТаБЛ в регуляции апоптоза при аутоиммунных заболеваниях на примере системной красной волчанки.

5. Исследование регуляции апоптоза при вирусных гепатитах В и С.

8. Исследование возможности генной терапии противоопухолевых клеток с помощью трансфекции гена В ах.

Научная новизна исследования. Впервые подробно исследованы особенности регуляции апоптоза при опухолевых заболеваниях ЖКТ. Определены полуколичественные показатели экспрессии белков семейства Вс1-2 и системы

Fas/FasL нетрансформированными и опухолевыми клетками, а также белков системы Fas/FasL лейкоцитами периферической крови у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки. При исследовании экспрессии белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки выявлено статистически значимое увеличение уровня экспрессии исследованных антигенов опухолевыми клетками по сравнению с нетрансформированными (р = 0,03). Установлены положительные достоверные корреляционные зависимости между процентным содержание антиген-экспрессирующих клеток и степенью экспрессии антигенов как в ^трансформированной (для Bcl-2, Вах, Bcl-X, Fas и FasL), так и в опухолевой ткани (для Bcl-2, Вах, Вс1-Х). Впервые в клеточной линии SKOV3 обнаружена мутация в гене Вах - она имеет генотип G7/G9, в отличие от нативного типа гена Вах - G8/G8, приводящая к инактивации проапоптотической активности гена Вах. Впервые обнаружено, что метастазирование регионарных лимфатических сосудов коррелирует с низкой степенью экспрессии Fas опухолевой тканью больных с новообразованиями желудка и толстой кишки.

Впервые проведено исследование уровня апоптоза клеток печени и лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С как двух мишеней действия вирусов гепатита В и С. Изучен уровень апоптоза клеток печени (гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата) в сравнении с уровнем экспрессии мембранных белков, участвующих в индукции апоптоза (Fas, FasL). Выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии FasL лимфоцитов внутрипеченочного инфильтрата и уровнем апоптоза гепатоцитов. Обнаружена защитная роль экспрессии FasL гепатоцитами от апоптоз-индуцирующего действия ЦТЛ. Впервые проведено одновременное исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК у больных ХВГ В и С.

Обнаружено, что у больных ХВГ В и С наблюдается достоверно более высокий по сравнению со здоровыми добровольцами уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК. Обнаружено, что наиболее высокий уровень апоптоза ЛПК наблюдался у больных с виремией и повышенным уровнем сывороточного TNF-a.

Выявлена достоверная корреляционная зависимость степени повреждения ДНК свежевыделенных ЛПК с долей клеток в состоянии апоптоза после их инкубации в культуральной среде в течение 24 часов, что свидетельствует о наличии в периферической крови не только клеток в состоянии апоптоза, но и клеток, коммитированных к нему. Впервые доказана прямая зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах у больных системной красной волчанкой. Показано также, что уровень антиядерных антител и антител к ДНК у больных системной красной волчанкой зависел от выраженности заболевания и активности системы Fas - Fas-L. Продемонстрирована роль белка Вс1-2 в развитии лекарственной устойчивости к ряду химиотерапевтических препаратов, обусловленной гиперэкспрессией гена Bcl-2, что может играть решающую роль в химиотерапии опухолей с повышенным уровнем этого белка. Показано, что использование антисмысловых олигонуклеотидов может оказаться эффективным способом преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток с высоким уровнем экспрессии Bcl-2. Впервые обнаружена высокая чувствительность клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 и клеток карциномы шейки матки человека линии HeLa к трансфекции гена Вах.

Научно-практическая значимость работы. Исследование имеет большое научно-практическое значение, так как в ходе работы проведено комплексное исследование нарушений регуляции апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки, больных Т-клеточными лимфомами, вирусных гепатитах В и С, системной красной волчанкой. Установление механизмов блокирования процесса апоптоза в дальнейшем позволит установить причины нарушений и, следовательно, пути устранения последних. Показано, что регистрация однонитевых разрывов ДНК может являться тестом для выявления клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза или коммитированных к нему. Обнаруженный высокий уровень апоптоза гепатоцитов при ХВГ В, и особенно ХВГ С, и появление экспрессии FasL на гепатоцитах могут быть использованы в качестве новых прогностических критериев для оценки эффективности проводимой противовирусной и иммуномодулирующей терапии ХВГ. Информация о роли системы Fas - Fas-L в патогенезе СКВ, а также обнаруженная зависимость между уровнем антител к ДНК и ее фрагментам и степенью повреждения ДНК в лейкоцитах выражена в виде линейного уравнения регрессии, которое может быть использовано в клинической практике при планировании лечебных мероприятий и прогнозе исхода заболевания. Разработаны принципиальные подходы к коррекции патологии апоптоза генно-терапевтическими методами на основе трансфекции генов Вах и Вс1-2 в клетки и с помощью применения антисмысловых олигонуклеотидов к гену Вс1-2.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на VIII конференции "Новые направления биотехнологии» (апрель 1998, Москва), на V и VI Российской конференции «Гепатология сегодня» (март 2000 г., март 2001 г., Москва), на Всероссийском симпозиум «Клеточная биология на пороге XXI века» (октябрь 2000 г., октябрь 2001 г., Санкт-Петербург), на Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (июнь 2002, Москва), на VIII Международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, иммунология и глобальная сеть» (апрель 2002,

Канны, Франция), на I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (июнь 2002, Москва), на III международном симпозиуме «Genetic anticancer agents»(Фeвpaль 2002 г., Амстердам, Нидерланды), на специальной конференции FEBS «Signal Transduction» (июль 2003 г., Брюссель, Бельгия), на 18 конференции Европейской ассоциации по опухолевым исследованиям, июль 2004 г., Инсбрук, Австрия), на I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», а также неоднократно обсуждалась на научно-практических конференциях кафедры биохимии и НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Белушкина, Наталья Николаевна

Выводы

2. При развитии новообразований желудочно-кишечного тракта обнаружено увеличение антиапоптотической активности белков семейства Bel. Содержание белка Bcl-2 в опухолях желудка и тонкой кишки возрастает в полтора раза. Гиперэкспрессия белка Bcl-2 в опухолевой ткани приводила к развитию феномена лекарственной устойчивости. У 20% пациентов заболевание сопровождается наличием мутаций в третьем экзоне гена Вах. Полученные данные соотносятся с результатами исследований опухолевых клеточных линий.

4. Обнаружена более высокая чувствительность лимфоцитов больных Т-клеточной лимфомой кожи, содержащих вирус Эпштейн-Барра по сравнению с лимфоцитами, инфицированными вирусом Т-клеточной лейкемии I к индукции апоптоза, вызванного доксорубицином.

6. Показано, что система Fas/FasL играет заметную роль в патогенезе системной красной волчанки. Уровень экспрессии Fas и FasL на лимфоцитах различных субпопуляций (CD3, CD4, CD8, CD 19) возрастает в зависимости от степени активности заболевания. При этом в крови пациентов было обнаружено достоверное увеличение уровня апоптоза лимфоцитов и обратная зависимость между содержанием в крови ингибитора Fas и стадией заболевания.

7. Показана принципиальная возможность использования антисмысловых олигонуклеотидов в качестве препаратов для преодоления лекарственной устойчивости опухолевых клеток, обусловленной высоким уровнем экспрессии Вс1-2.

Заключение.

Одной из важных проблем, интересующих в настоящее время медицинскую и биологическую науку, является проблема апоптоза. Открытый более 30 лет назад этот феномен на протяжении последних лет подвергается пристальному вниманию, как со стороны биологов, так и со стороны клиницистов. Количество экспериментальных данных по исследованию программированной клеточной гибели растет стремительно и значительно опережает теоретическое осмысление полученных фактов. Сложность связана с тем, что процесс апоптоза является крайне разносторонним явлением, зависящий от типа клеток, от функционального состояния клетки (стадия дифференцировки и пролиферации, от активности репарирующей системы, окислительно-восстановительной системы и т.д). На регуляцию апоптоза также оказывают влияние межклеточные взаимодействия данной конкретной ткани и наличие или отсутствие различных регуляторных влияний.

Идентификация апоптоза также представляет существенные трудности, так как определение формы гибели клеток проводят не только по морфологическим критериям, но и по биохимическим и молекулярно-генетическим. Однако имеющиеся расхождения между различными критериями вносит неясности в описание явления апоптоза. Например, у некоторых типов клеток обнаружено несоответствие между морфологическими проявлениями апоптоза и межнуклеосомным расщеплением ДНК, которое долгое время считалось «классическим» биохимическим проявлением апоптоза. Такое положение следует считать нормальным, т.к. каждое явление имеет свою специфику, свои механизмы, свой уровень и нельзя ожидать обнаружения каких-либо универсальных выражений апоптоза, которые позволили бы создать единую картину. Огромный интерес к проблеме и интенсивные исследования молекулярных механизмов апоптоза приводят к обнаружению новых участников процесса и установлению деталей уже описанных сценариев апоптоза.

Нарушение регуляции апоптоза вызывает изменение гомеостаза и приводит к различным патологическим состояниям. Важная роль апоптоза установлена в возникновении опухолевых заболеваний, их прогрессии и чувствительности к химиотерапевтическим препаратам. Активно изучается регуляция апоптоза клеток при вирусных и аутоиммунных заболеваниях. Однако наличие индивидуальных определяющих механизмов в реализации апоптоза для разных типов клеток, а также существование общих и частных механизмов реализации программированной гибели клеток во многих случаях затрудняет интерпретацию экспериментальных результатов.

Исследование регуляции апоптоза при патологических состояниях, идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза в перспективе способствует более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний, улучшению дифференциальной диагностики и созданию принципиально нового направления в терапии заболеваний.

В данной работе обобщены данные об особенностях регуляции апоптоза при онкологических, вирусных и аутоиммунных заболеваниях.

Исследована роль белков семейства Вс1-2 при опухолевых заболеваниях желудка и толстой кишки. Показано, что Вс1-2 экспрессируется подавляющим большинством клеток желудка и толстой кишки на достаточно высоком уровне. Обнаружено статистически значимое увеличение степени экспрессии Вс1-2 атипическими клетками по сравнению с нетрансформированными. Несмотря на то, что не выявлено статистически значимых различий в степени экспрессии Вс1-2 между гистологическими типами опухолей желудка и толстой кишки, при высокодифференцированных аденокарциномах наблюдается уменьшение степени экспрессии Вс1-2, что может отражать увеличение уровня апоптоза и, следовательно, более доброкачественное течение опухолевого процесса. При низкодифференцированных и недифференцированных опухолях желудка и толстой кишки обнаружено увеличение степени экспрессии Вс1-2, что может свидетельствовать о снижении уровня апоптоза и более злокачественном течение заболевания. Увеличение экспрессии гена Bcl-2 при низкодифференцированных и недифференцированных опухолях, по-видимому, играет важную роль в механизме онкотрансформации клеток и их резистености к химиотерапевтическим препаратам. Обнаружение мутаций в гене Вах свидетельствует о синтезе функционально неактивного проапоптотического белка, не способного выполнять программу реализации апоптоза. Нарушения регуляции апоптоза в опухолевых клетках также связаны с системой Fas/FasL. Уменьшение количества и уровня экспрессии Fas-положительных клеток в метастазирующих опухолях желудка и толстой кишки, способствовуют снижению уровня апоптоза при онкологических заболеваниях желудка и толстого кишечника. Увеличение уровня экспрессии FasL опухолевыми клетками желудка и толстой кишки обеспечивает «ускользание» опухоли от иммунного ответа. Обнаруженные особенности регуляции апоптоза клеток при опухолевых заболеваниях желудка и толстой кишки связаны со снижением уровня апоптоза в этих клетках, как за счет нарушения программы гибели клеток, так и за счет снижения иммунного ответа организма.

При исследовании Т-клеточных лимфом обнаружено, что вирусное инфицирование клеток мишеней предрасполагает их к индукции апоптоза, вызванного антибиотиками. Данные о реализации программы апоптоза при хронических вирусных гепатитах В и С, выявленные в настоящей работе, подчеркивают важную роль системы Раз/ТазЬ в патогенезе данных заболеваний, способствующую интенсификации гибели гепатоцитов. Также обнаружено, поражение клеточного звена иммунитета, что вносит вклад в неспособность организма элиминировать инфекцию и способствует персистенции вирусов и хронизации заболевания. Полученные результаты расширяют имеющиеся представления о тканевом тропизме вирусов гепатита В и С и позволяют объяснить многообразие клинических, в том числе и внепеченочных, проявлений вирусных гепатитов В и С.

Также обнаружено нарушение регуляции апоптоза при системной красной волчанке в результате нарушения экспрессии системы Раз/Рая!,, что приводит к увеличенному апоптозу лимфоцитов РаБ-эксперссирующих клеток периферической крови и дисбалансу клеток иммунной системы. Появление в крови большого количества аутоантигенов, по-видимому, связано с нарушением терминальных стадий реализации апоптоза, связанных с утилизацией апоптозных телец.

Значимость изучения регулируемого процесса гибели клетки - апоптоза, как в плане фундаментальных, так и в плане прикладных аспектах несомненна. Биохимическую картину развития апоптоза можно гипотетически разделить на несколько этапов, включающих действие фактора, вызывающего апоптоз, передачу сигнала с рецепторной молекулы в клеточное ядро, активацию апоптоз-специфических генов, синтез апоптоз-специфических белков и заключительную, и вместе с тем определяющую, стадию - регулируемую активацию эндонуклеаз и фрагментацию ДНК (Рис. 38). В настоящее время считается, что если клетка погибает от апоптоза, то подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза - нет. На основе знаний регуляции программированной гибели клетки используется широкий ряд подходов с целью регуляции этого процесса в различных типах клеток. Обнадеживающим с точки зрения перспективности и эффективности является возможность управления процессом гибели клеток с помощью регуляции уровня экспрессии ключевых генов,

Повреждения ДНК

Удаление ростовых факторов

Связывание специфических рецепторов

Апоптоз-специфические протеазы I

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ Е 1

Фрагментация ДНК

Рис. 38. Последовательность биохимических событий при индукции апоптоза. контролирующих процессы апоптоза в клетках. На основании результатов, приведенных в данной работе, перспективной мишенью для воздействия на апоптоз клетки являются гены белков семейства Вс1-2. Регуляция апоптоза на основе генно-терапевтических подходов возможно как с помощью введения апоптоз-специфических генов, так и с помощью уменьшения их экспрессии с помощью антисмысловых олигонуклеотидов.

На примере генов Вс1-2 и Вах была продемонстрирована возможность регуляции апоптоза. Ген Вс1-2 был клонирован в ретровирусный вектор и осуществлена трансфекция опухолевых клеточных линий полученной конструкцией. Изучен уровень индукции апоптоза и выживаемость трансфицированных линий клеток под действием цитотоксических препаратов. Повышение экспрессии гена Вс1-2 в результате трансфекции приводило к устойчивости клеток к действию цитотоксических препаратов в результате подавления процессов апоптоза.

Усиление процессов апоптоза достигалось снижением экспрессии Вс1-2 за счет применения специфических антисмысловых олигонуклеотидов, либо за счет увеличения экспрессии проапоптотического гена Вах за счет трансфекции этого гена в клетки. Проникновение свободных олигонуклеотилов в клетки возможно только при высоких концентрациях последних, что приводит к неспецифической токсичности олигонуклеотидов на клетки. Снизить действующую концентрацию олигонуклеотида позволяет технология использования липосомообразующих агентов. Для доставки антисенсов в клетки мы использовали новый липосомообразующий агент и^есйп-М, который характеризуется достаточно высокой эффективностью трансфекции и низкой токсичностью для клеток. Применение антисмысловых олигонуклеотидов к гену Вс1-2 приводит к повышению чувствительности онкотрансформированных клеток к цитостатическим препаратам. Клонирование гена Вах было осуществлено в плазмиду рВЛ322 и полученной конструкцией трансфицировали опухолевые клетки. При этом обнаружена интенсивная гибель (90%) трансфицированных геном Вах клеток линии БКОУЗ и умеренная гибель (34%) клеток НеЬа через 24 часа после трансфекции.

Полученные результаты демонстрируют возможность избирательного управления процессами апоптоза и регуляции интенсивности гибели клеток как при использовании различных цитотоксических препаратов, регулирующих изменение метаболических процессов клеток, так и при помощи введения в клетки отдельных генов, регулирующих процессов апоптоза. Представленные результаты получены на модели пролиферирующих линий клеток, для которых существенный вклад в процессы чувствительности клеток вносят особенности метаболизма, связанные с интенсивной пролиферацией и блоком клеточного цикла при действии повреждающих факторов. В то же время в покоящихся клетках, а в тканях и органах организма человека и животных именно такие клетки составляют основную массу, процессы апоптоза могут регулироваться несколько иначе. Именно этот аспект представляет несомненный интерес при переходе к организменному уровню.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Белушкина, Наталья Николаевна, Москва

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников H.H., Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и при патологии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999.- №3.- С.3-17

2. Аксель Е.М., Казубская Т.П., Белев Н.Ф. и др. Генетика рака желудочно-кишечного тракта. 2001. -№4.~ Т. З.-С. 141-145

3. Барышников. А.Ю. , Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза //Москва.-2002. С. 18-37.

4. Баснакьян А.Г., Басков A.B., Соколов H.H., Борщенко И.А. Апоптоз при травматическом повреждении спинного мозга: перспективы фармакологической коррекции// Вопросы медицинской химии.- 2000.- № 5.-С.

5. Белецкий И.П., Сорокина О.В., Никонова Л.В. Генная терапия на основе системы Раз-антиген-Раз-лиганд // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии 1999. - №4. - С.40-49

6. Воробьев Г.И., Одарюк Т.С., Шелыгин Ю.А. Диагностика и лечение рака толстой кишки // Русский медицинский журнал. 1998. -том 6. -№ 19. -с. 1244-1256

7. Гарькавцева Р.Ф., Давыдов М.И., Ушакова Т.И. и др. Злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта: основные статистические показатели и тенденции // Современная онкология. 2001. - №4. - Т. 3. - С. 151153

8. Жданов Р.И. Генная терапия: надежды и реалии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999. - №4. - С.3-6.

9. Змызгова A.B., Москалева Е.Ю., Максимов С.Л. и др. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и показатели клеточного иммунитета больных вирусным гепатитом В // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -1999, №2, с. 16-19

10. Лунькова Л.К.,Макарова О.В., Каниболоцкий A.A., Миткова C.B. Морфология органов иммунной системы при наркомании // Архив патологии.-2002.-№4. -С.21-25

11. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). М.: Медицина, 2001. -192 с.

12. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./ Под ред. С Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - 558 с.

13. Нестерова М.В., Чо-Чанг Ю.С., Северин Е.С. Роль антисмысловых олигонуклеотидов в регуляции клеточных процессов. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1998. - №4. - С.3-14.

14. Петрова У. Н., Радыгина Т. В., Лыскина Г. А., Продеус А. П. Современные аспекты этиопатогенеза системной красной волчанки // вопр. Гематол. И иммунопатол. В педиатр. 2002. - Т. 1, № 1. -С.92-94.

15. Практическая химия белка: Пер. с англ./ Под ред. А. Дарбле. М.: Мир, 1989. - 623 с.

16. Программированная клеточная гибель под ред. Новикова B.C., Санкт-Петербург.-1996.

17. Северин С.Е. Биохимия и медицина новые подходы и достижения. - М.: Русский врач, 1998. - 96с.

18. Сладкова Л. В., Москалева Е. Ю., Посыпанова Г. А. и др. Устойчивость В-клеточных линий человека с разным уровнем экспрессии Вс1-2 к противоопухолевым препаратам / / Вопр. биол., мед. и фарм. химии. — 2000. — № 3, —С. 25-29.

19. Смирнов А.Б. Заболеваемость раком желудка. http://www.sci.aha.ru/ATL/ra531.htm. -1998

20. Федоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методическое пособие для начинающих/Принципы и практические рекомендации для ее постановки с целью детекции микроорганизмов. - 1996.- 33 с.

21. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. М.: Наука, 1999. -429 с.

22. Ackermann Е. J., Taylor J. К., Narayana R. et al. The role of antiapoptotic Bcl-2 family members in endothelial apoptosis elucidated with antisense oligonucleotides // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 16. - P. 11245-11252

23. Adrain C., Creagh E. M., Martin S. J. Apoptosis-associated release of Smac/DIABLO from mitochondria requires active caspases and is blocked by Bcl-2 // The EMBO journal.- 2001. Vol. 20. - N. 23. - P. 6627-6636

24. Akshay KV., Orlinick J R. The molecular basis for apoptotic defects in patients with CD95 (Fas/Apo-1) mutations// J Clin Invest. 1999. - Vol. 103, №. 3. - P. 355-363.

25. A1 Maini MH., Mountz JD., AlMohri HA., et al. Serum levels of soluble Fas correlate with induces of organ damage in systemic lupus erythematosus// Lupus. 2000. - Vol. 9. -P.132-139.

26. Almawi W.Y., Melemedjian O. K., and Abou Jaoude M. M. On the link between Bcl-2 family proteins and glucocorticoid-induced apoptosis // J. Leukoc. Biol. 2004. -V. 76. -P. 7-14

27. Ambar B.B., Frei K., Malipiero U. et al. Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand //Hum Gene Ther.-1999.- V. 10,- P. 1641-1648.

28. Andrade F., Casciola-Rosen L., Rosen A. apoptosis in systemic lupus erythematosus. Clinical implications// Rheum Dis Clin North Am. 2000. - Vol.26. - P.215-27.

29. Antonsson B. Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family "killer-proteins" and their victim the mitochondrion // Cell Tissue Res. 2001. - Vol. 306. - N. 3. - P. 347-361

30. Antonsson B., Montessuit S., Sanchez B. et al. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells // The journal of biological chemistry.-2001.-Vol. 276.-N. 15-P. 11615-11623

31. Aoki K., Akyurek L.M., San H., et al. Restricted expression of an adenoviral vector encoding Fas ligand (CD95L) enhances safety for cancer gene therapy// Mol Ther. -2000.-V.l.-P. 555-565

32. Arafat W.O., Gomez-Navarro J., Xiang J. et al. An adenovirus encoding proapoptotic Bax induces apoptosis and enhances the radiation effect in human ovarian cancer// Molecular Therapy.-2000.-V.1.-P. 545-554

33. Aral H., Gordon D., Nabel E. G., Nabel G. J. Gene transfer of Fas ligand induces tumor regression in vivo // Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94, N 25. - P. 1386213867.

34. Arends M. J., Wyllie A. H. Apoptosis. Mechanism and role in pathology // Inlern. Rev. Exp. Pathol. -1991. Vol.32. - P.223-254.

35. Aschoff A. P., Ott U., Funfstuck R. et al. Colocalisation of Bax and Bcl-2 in small intestine and kidney biobsies with different degrees of DNA fragmentation // Cell Tissue Res. 1999.-Vol. 296.-P. 351-357

36. Ashkenazi A., Pai, R.C., Fong S. et al. Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand// Clinical Investigation. 1999.- V. 104. - P. 155-162

37. Ayhan A., Yasui W., Yokozaki H. et al. Loss of heterozygosity at the Bcl-2 gene locus and expression of Bcl-2 in human gastric and colorectal carcinomas // Jpn. J. Cancer research. 1994. - Vol. 85. - N. 6. - P. 584-591

38. Bardelli A. HGF receptor associates with the anti-apoptotic protein Bag-1 and prevents cell death // The EMBO journal. 1996. - Vol. 15. - P. 6205-6212

39. Basanez G., Nechushtan A., Drozhinin O. et al. Bax, but not Bcl-XL, decreases the lifetime of planar phospholipid bilayer membranes at subnanomolar concentrations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - N. 10. - P. 5492-5497

40. Basanez G., Zhang J., Chau B. N. et al. Pro-apoptotic cleavage products of Bcl-XL form cytochrome c-conducting pores in pure lipid membranes // The journal of biological chemistry. 2001. - Vol. 276. - P. 31083-31091

41. Batteux F., Tourneur L, Trebeden H. et al. Gene therapy of experimental autoimmune thyroiditis by in vivo administration of plasmid DNA coding for Fas ligand // J. Immunol. — 1999. — Vol. 162, N 1. P. 603-608.

42. Baumann H., Gearing D., Ziegler S. F. Signaling by the cytoplasmic domain of hematopoietin receptors involves two distinguishable mechanisms in hepatic cells // J. Biol. Chem. — 1994,- Vol. 269, N 23. P. 16297-16304.

43. Bellgrau D., Gold D., Selawry H. et al. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection // Nature. — 1995. — Vol. 377, N 6550. P. 630-632.

44. Bennett M.W., O'Connell J., Houston A. et al. Fas ligand upregulation is an early event in colonic carcinogenesis // J. Clin. Pathol. 2001. - Vol. 54. - N. 8. - P. 598-604

45. Bennett M.R. Apoptosis in the cardiovascular system// Heart.- 2002.-V. 87.- № 5.-P. 480-487

46. Bennett M.W., O'connell J., O'sullivan G.C. et al. Expression of Fas ligand by human gastric adenocarcinomas: a potential mechanism of immune escape in stomach cancer // Gut. 1999.-Vol. 44.-N. 2.-P. 156-162

47. Berke G. Killing mechanisms of cytotoxic lymphocytes. Curr Opin Hematol 1997;4:32-40

48. Berman M. L, Silhavy T. J., Enquist L. W. Experiments with gene fusions. — New York, 1984.

49. Biswas S. K., Huang J., Persaud S., and Basu A. Down-regulation of Bcl-2 is associated with cisplatin resistance in human small cell lung cancer H69 cells //Mol. Cancer Ther.-2004.-V.3.-P. 327-334

50. Bodmer J. TRAIL receptor-2 signals apoptosis through FADD and caspase-8 //Nature Cell Biology. 2000. - V. 2.- P. 241-243

51. Boerrigter ME., Mullaart ET., Van der Schans G. P., Vijg I. Quiescent human peripheral blood lymphocytes do not contain a sizable amount of preexistent DNA single-strand breaks // Exp. Cell Res. 1989. - Vol. 180. - P. 569 - 573.

52. Boerrigter M. E. T. I., Mullaart E., Van der Schans G. P., Vijg I. Illusory DNA breaks in quiescent lymphocytes? // Cancer Res. 1990. - Vol. 188. - P. 1 -4.

53. Bonavida B., Ng C.P., Jazirehi A., Schiller G., and Mizutani Y. Selectivity of TRAIL-mediated apoptosis of cancer cells and synergy with drugs: the trail to non-toxic cancer therapeutics //International Journal of Oncology.-1999.-V. 15. P. 793-802

54. Bortner C D et al. The role of DNA fragmentation in apoptosis. Trends in cell biology 1995;5:21-26.

55. Bosari S., Moneghini L., Graziani D. et al. bcl-2 oncoprotein in colorectal hyperplastic polyps, adenomas, and adenocarcinomas // Hum. Pathol. 1995. - Vol. 26. - N. 5. - P. 534-540

56. Brada M. Bcl-2 gene: current relevance to clinical oncology // Eur. J. Cancer. 1992. -Vol. 28. - P. 270-272.

57. Brady H.J.M., Gil-Gomez G. Molecules in focus Bax. The pro-apoptotic Bcl-2 family member, Bax // The international journal of boichemistry and cell biology. 1998. - Vol. 30. - P. 6407-650

58. Branet F., Brousset P., Krajevski S. Expression of the cell death inducing gene Bax in carcinomas developed from the follicular cells of the thyroid gland // Journal of clinical endocrinology and metabolism. 1996. - Vol. 81. -N. 7. - P. P2726-P2730

59. Bresalier R. S. Colorectal cancer // Cancer and metastases reviews.-2004.-V.23.-P.7-10

60. Bunnel B.A., Morgan R.A. Gene therapy for infectious diseases // Clin. Microb. Rev. -1998. V.l 1. - N.l. - P.42-56

61. Butler L.M., Hewett P.J., Butler W.J. et al. Down-regulation of Fas gene expression in colon cancer is not a result of allelic loss or gene rearrangement // Br. J. Cancer. 1998. -Vol. 77.-N. 9.-P. 1454-1459

62. CandeC., Vahsen N., Garrido C., Kroemer G. Apoptosis-inducing factor (AIF)- caspase independent after all //Cell death. 2004. - V.l 1 - P.591-595

63. Chandra D., Liu J.-W., Tang D. G. Early Mitochondrial activation and cytochrome c up-regulation during apoptosis // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. -N. 52.-P. 50842-50854

64. Chang B. S., Minn A. J., Muchmore S.W. et al. Identification of a novel regulatory domain in Bcl-XL and Bcl-2 // The EMBO journal. 1997. - Vol. 16. - N. 5. - P. 968977

65. Chao D. T., Korsmeyer S. J. Bcl-2 family: regulators of cell death // Annu. Rev. Immunol. 1998. - Vol. 16. - P. 395-419

66. Charalambous G. K., Gomatos I. P., Konstadoulakis M. M. et al. Protein expression of Bax, Bcl-2, and p53 in patients with non-Hodgkin's gastric lymphoma: prognostic significance // World j. Surg. 2000. - Vol. 24. - P. 608-614

67. Chen Y., Wilson J. M. Fas ligand — a double-edged sword // Nature Biotechnol. 1998. -Vol. 16, N 11.-P. 1011-1012.

68. Cheng J., Zhou T. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of Fas molecule // science. 1994. - Vol. 263. - P. 1759-1762.

69. Chinnaiyan A.M., O'Rourke K., Lane B.R., Dixit V.M. Interaction of Ced-4 with Ced-3 and Ced-9: a molecular frame for cell death // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 1122-1126

70. Chizari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis//Annu Rev Immunol 1995, 13.29-60

71. Ciardiello F. and Tortora G. Inhibition of bcl-2 as cancer therapy // Ann. One. 2002.-V.13(4). - P. 501 -502

72. Cohen J. Apoptosis: the physiologic pathway of cell death // Hosp. Pract. 1993. -Vol.28.-N12.- P.35-43.

73. Crovatto M., Pozatto G., Zorat F. et al. Peripheral blood neutrophils from hepatitis C virus-infected patients are replication sites of the virus//Haematologica 85 (4), 356-361 (2000)

74. Cuconati A., White E. Viral homologs of BCL-2: role of apoptosis in the regulation of virus infection // Genes Dev. 2002. - Vol. 16. - N. 19. - P. 2465-2478.

75. Curiel D.T., Douglas J.T. Adenoviral Vectors for Gene Therapy. Academic Press. 2002. - C.677

76. Dutton G. Debating Gene Therapy's Future // Genetic Engineering News. 2000. -V.20. - № 1.

77. Eissa S., Seada L.S. Quantitation of Bcl-2 protein in bladder cancer tissue by enzyme immunoassay: comparison with Western blot and immenohistochemistry // Clinical chemistry. 1998. - Vol. 44. -N. 7. - P. 1423-1429

78. Eskes R., Antonsson B.,Osen-Sand A. et al. Bax-induced cytochrome c release from mitochondria is independent of the permeability transition pore but highly dependent on Mg2+ ions // The journal of cell biology. 1998. - Vol. 143. - P. 217-224

79. Eskes R., Desagher S., Antonsson B. Bid induces the oligomerization and insertion of Bax into the outer mitochondrial membrane // Molecular and cellular biology. 2000. -Vol. 20. -N. 3. - P. 929-935

80. Fadok V.A., Bratton D.L., Henson P.M. Phagocyte receptors for apoptotic cells: recognition, uptake, and consequences// J. Clin. Invest.- 2001.-V. 108.-№7.-P.957-962.

81. Farid P., Gomb S.Z., Peter I. et al. Bcl-2, p53 and Bax in thyroid tumors and their relation to apoptosis // Neoplasma. 2001. - Vol. 48. -N. 4. - P. 299-301

82. Ferrante A., Thong Y.H. A rapid one-step procedure for purification of mononuclear and polymorphonuclear leukocytes from human blood using a modification of the Hypaque-Ficoll technique // J. Immunol. Methods. 1978. - Vol. 24. - P. 389-393

83. Ferraro E., Corvaro M., Cecconi F. Physiological and pathological roles of Apafl and apoptosome// J.Cell.Mol.Med.- 2003,- V.7.-P.21-34

84. Feudis P., Vignati S., Rossi C., et al., Driving p53 response to Bax activation greatly enhances sensitivity to taxol by inducing massive apoptosis.//Neoplasia. 2000. - Vol.2. - P.202-207.

85. Finucane D. M., Bossy-Wetzel E., Waterhouse N. J. et al. Bax induced caspase activation and apoptosis via cytochrome c release from mitochondria is inhibitable by Bcl-XL // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 4. - P. 2225-2233

86. Franziska Oberhammer et al. Apoptotic death in epithelial cells: cleavage of DNA to 300 and/or 50kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation. EMBO 1993; 12: 3679-3684.

87. Friess H., Lu Z., Graber H. U. et al. Bax, but not Bcl-2, influences the prognosis of human pancreatic cancer // Gut. 1998. - Vol. 43. - P. 414-421

88. Galle PR, Hoffmann WJ, Walsczac H et al. Involvement of the CD 95 (APO-l/Fas)receptor and ligand in liver damage. J Exp Med 1995; 182: 1223-30

89. Gaumann A., Tews D.S., Mayer E. et al. Expression of apoptosis-related proteins, p53, and DNA fragmentation in sarcomas of the pulmonary artery // Cancer. 2001. - Vol. 92.-N. 5.-P. 1237-1244

90. Gene Medicine Therapy Clinical Trials// www.wiley .co.uk

91. Gewirtz M. Oligonucleotide Therapeutics: A Step Forward // J. Clin. Oncol. 2000.-V. 18(9).-P. 1809- 1811

92. Gil J., Yamamoto H., Zapata J. M. et al. Impairment of the proapoptotic activity of Bax by missense mutations found in gastrointestinal cancers // Cancer research. 1999. -Vol. 59.-P. 2034-2037

93. Glaser V. Antisense Drug Hope to Enter the Mainstream // Genetic Ingineering News. -2003.- Vol.23.- No.18.-P.l-14

94. Golstein P. Controlling cell death // Sceince 1997, v.275, p.1081-1082.

95. Gong B., Chen Q., Endlich B. et al. Ionizing radiation induced Bax mediated cell death is dependent on activation of cysteine and serine proteases // Cell Growth & Differentiation. -1999.-Vol. 10.-P. 491-502

96. Grady W.M. Genomic instability and colon cancer// Cancer and metastases reviews.-2004.-V.23.-P. 11-27

97. Green D. R., Ware C. F. Fas-ligand: privilege and peril // Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94, N 12. - P. 59865990

98. Griffith T.S., Brunner T., Fletcher S.M., Green D.R. and Ferguson T.A. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege// Science.- 1995.-V. 270.-P. 1189-1192

99. Groeger A.M., Esposito V., Cassandro R. et al. A model of BAX gene delivery to human lung cancer// Anticancer Res. 2001.- V.21(5).- P.3627-3630

100. Gross A., Jockel J., Wei M.C., Kosmeyer S.J. Enforced dimerization of Bax results in its translocation, mitochondrial disfunction and apoptosis. // EMBOj. 1998. -Vol.17. - P.3878 - 3885.

101. Gross A., McDonnell J. M., Korsmeyer S. J. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis // Genes Dev. 1999. - Vol. 13. - N. 15. - P. 1899-1911

102. Gu J., Zhang L., Huang X., Lin T. et al. A novel single tetracycline-regulative adenoviral vector for tumor-specific Bax gene expression and cell killing in vitro and in vivo //Oncogene. -2002.-V. 18-21(31).-P.4757-4764

103. Guo B., Godzik A., Reed Y.R. Bcl-G, a novel pro-apoptotic member of the Bcl-2 family // The journal of biological chemistry. 2001. - Vol. 276. - N. 4. - P. 2780-2785

104. Guo Bin, Cao Sh., Toth K. et al. Overexpression of Bax enchances antitumor activity of chemotherapeutic agents in human head and neck squamous cell carcinoma.// Clin Cancer Res. 2004 - Vol.6. - P.718-724.

105. Guo Y., Srinivasula S. M., Druilhe A. et al. Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria// The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 13430-13437

106. Hague A., Moorghen M., Hicks D. et al. Bcl-2 expression in human colorectal adenomas and carcinomas // Oncogene. — 1994. Vol. 9. - P. 3367-3370.

107. Hall W.W., Lin C.R., Shneewind O. Detected HTLV1 in blood and cutaneous lesions of patients with mycosis fungoides // Science. 1991. - V.253. - P.317-320

108. Hardwick J.M. Virus-induced apoptosis // Adv. Pharmacol. -1997, v.41, p.295-336.

109. Harima Y., Harima K., Shikata N. et al. Bax and Bcl-2 expressions predict response to radiotherapy in human cervical cancer // J. Cancer research. Clin. Oncol. 1998. - Vol. 124.-P. 503-510

110. Harris M. H., Heiden M. G. V., Kron S. J. et al. Role of oxidative phosphorylation in Bax toxicity // Molecular and cellular biology. 2000. - Vol. 20. - N. 10. - P. 35903596

111. Haunstetter A., Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease// Circ. Res.- 1998-V. 82.- №1 l.-P.l 111-1129

112. Hay S., Kannourakis G. A time to kill: viral manipulation of the cell death program// J. Gen. Virol.- 2002.-V. 83.-P. 1547-1564

113. Hayashi, N., E. Mita. Fas system and apoptosis in viral hepatitis. J. Gastroenterol. Hepatol. 12: S223-S226, 1997

114. Hedlund T.E., Meech S.J., Srikanth S., Kraft A.S., Miller G.J., Schaack J.B. and Duke R.C. Adenovirus-mediated expression of Fas ligand induces apoptosis of human prostate cancer cells // Cell Death Differ.- 1999.-V. 6. P. 175-182

115. Heiden M. G. V., Chandel N. S., Li X. X. et al. Outer mitochondrial membrane permeability can regulate coupled respiration and cell survival // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - N. 9. - P. 4666-4671

116. Hengarten O.M. The Biochemistry of apoptosis // Nature. 2000. - Vol.407. -P.770-775.

117. Hersh E. M., Stopeck A. T. Advances in the biological therapy and gene therapy of malignant disease//Clin. Cancer Res. —1997. Vol. 12, Pt 2. - P. 2623-2639.

118. Hiramatsu N, Hayashi N, Katayama K et al. Immunohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patient with chronic hepatitis C. //Hepatology. 1994.- V. 19.-P.1354-1359

119. Hirotani M., Zhang Y., Fujita N. et al. NH2-terminal BH4 domain of Bcl-2 is functional for heterodimerization with Bax and inhibition of apoptosis // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 29. - P. 20415-20420

120. Ho V., Baadsgaard O., Lee P.Y.P., Genotipic analysis of T-cell clones arrived from cutaneous T-cell lymphoma lesions demonstrates selective growth of tumor infiltrating T-lymphocytes // J.Invest.Derm. 1990. - V.95. - P.4-8

121. Hockenbery D. Defining apoptosis. Review // Amer. J. Pethol. 1995. - Vol.146. - P.16-19.

122. Hoetelmans R.W.M., Slooten H-J, Keijzer R. et al. Bcl-2 and Bax proteins are present in interphase nuclei of mammalian cells. //Cell death and Different. 2000. -Vol.7.-P.384-392.

123. Holler N., Tardivel A., Kovacsovics-Bankowski M. et al. Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex // Molecular and Cellular Biology. 2003. - Vol. 23. - N. 4. - P. 1428-1440

124. Honda M, Kaneko S, Shimazaki T. et al. Hepatitis C virus core protein induces apoptosis and impairs cell-cycle regulation in stably transformed Chinese hamster ovary cells// Hepatology 2000, 31(6), 1351-1359,

125. Honda T., Kagawa S., Spurgers K.B. et al. A recombinant adenovirus expressing wild-type Bax induces apoptosis in prostate cancer cells independently of their Bcl-2 status and androgen sensitivity// Cancer Biol. Ther. 2002.- V.I(2).-P. 163-167

126. Hsu Y.-T., Youle R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family // The journal of biological chemistry. 1997. - Vol. 272. - N. 21. -P. 13829-13834

127. Huang D.C.S., O'Reilly L. A., Strasser A. et al. The anti-apoptosis function of Bcl-2 can be genetically separated from its inhibitory effect on cell cycle entry // The EMBO journal.- 1997.-Vol. 16.-N. 15.-P. 4628-4638

128. Huang D.C.S., Hahne M., Schroeter M. et al. Activation of Fas by FasL induces apoptosis by a mechanism that cannot be blocked by Bcl-2 or Bcl-XL // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 14871-14876

129. Huang X., Lin T., Gu J. et al. Combined TRAIL and Bax gene therapy prolonged survival in mice with ovarian cancer xenograft //Gene Ther. 2002.- V.9(20).-P.1379-1386.

130. Huh W.K., Gomez-Navarro J., Arafat W.O., Xiang J., Mahasreshti P.J., Alvarez R.D. Bax-induced apoptosis as a novel gene therapy approach for carcinoma of the cervix//J. Gynecol Oncol. 2001V.83(2).-P.370-377

131. Ilyas M., Hao X.P., Wilkinson K. et al. Loss of Bcl-2 expression correlates with tumour recurrence in colorectal cancer // Gut. 1998. - Vol. 43. - N. 3. - P. 383-387

132. Inohara N., Ekhterae D., Garcia I. et al. Mtd a novel Bcl-2 family member activates apoptosis in the absence of heterodimerization with Bcl-2 and Bcl-XL // The journal of biological chemistry. - 1998. - Vol. 273. -N. 15. - P. 8705-8710

133. Ionov Y., Yamamoto H., Krajewski S. et al. Mutational inactivation of the proapoptotic gene Bax confers selective advantage during tumor clonal evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. -N. 20. - P. 10872-10877

134. Jansson A., Sun X.F. Bax expression decreases significantly from primary tumor to metastasis in colorectal cancer // J. Clin. Oncol. 2002. - Vol. 20. - N. 3. - p. 811-816

135. Jeremias, I. and Debatin, K.M. TRAIL induces apoptosis and activation of NF kappa B // European Cytokine Network. 1998. - V. 9. -P. 687-688.

136. Jeremy McNally et al. Fas ligand expression and function in systemic lupus erythematosus. J. Immunol. 1997; 159: 4628-4636.

137. Jerrold S., Koh LS. The role of apoptosis in autoimmunity: Immunogen, antigen, and accelerant// Seminars in Nephrology. 1999. -Vol.19. -P.34-47.

138. Johnson A. L. Editorial: Mcl-1 just another antiapoptotic Bcl-2 homolog? // Endocrinology. - 1999. - Vol. 140. - N. 12. - P. 5465-5468

139. Joyner A.L. Gene Targeting. Oxford. 2003. - C.293

140. Ju S T. et al. Fas (CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after activation. Nature 1995; 373: 444

141. Kagawa S., Pearson S.A., Ji L. et al. A binariy adenoviral vector for expressing high levels on the proapoptotic gene bax.// Gene Ther. 2000. - Vol.7. - P.75-79.

142. Kagawa Sh., Gu J., Swisher S., et al. Antitumor effect of adenovirus-mediated Bax gene transfer on p53-sensitive and p53-resistant cancer lines. // Cancer Res. 2000. -Vol.60. -P.l 157-1161.

143. Kaklamanis L., Savage A., Whitehouse R. et al. Bcl-2 protein expression: association with p53 and prognosis in colorectal cancer // Br. J. Cancer. 1998. - Vol. 77.-N. 11.-P. 1864-1869

144. Kaliberov S.A., Buchsbaum D.J., Gillespie G.Y. et al. Adenovirus-mediated transfer of BAX driven by the vascular endothelial growth factor promoter induces apoptosis in lung cancer cells // Mol. Ther. 2002.- V.6(2).-P. 190-198

145. Kalkeri G, Khalap N, Garry RF et al. Hepatits C virus protein expression induced apoptosis in HepG2 cells//Virology 2001, 282(1), 26-37

146. Kang P.M., Izumo S. Apoptosis and heart failure: A critical review of the literature// Circ. Res.- 2000.-V. 86,- № 11 .-P. 1107-1113

147. Kang S. M., Schneider D. ., Lin Z. et al. Fas- ligand expression in islets of Langerhans does not confer immune privilege and instead targets them for rapid destruction //Nature Med. —1997. Vol. 3, N 7. - P. 738-743.

148. Kato N, Yoshida H, Kioko Ono-Nita S. et al. Activation of intracellular signaling by hepatitis B and C viruses: C-viral core is the most potent signal inducer//Hepatology 2000, 32(2), 405-412

149. Kawaguchi Y., Takebayashi H., Kakizuka A. et al. Expression of Fas-estrogen receptor fusion protein induces cell death in pancreatic cancer cell lines II Cancer Lett. — 1997.— Vol. 116, N 1. P. 53-59.

150. Kawanishi M. Epstein-Barr virus induces fragmentation of chromosomal DNA during lytic infection// J. Virol. 67 (12), 7654-7658 (1993)

151. Kerr JF, et al: Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26:239, 1972

152. Kim H, Lee H, Yun Y. X-gene product of hepatitis B virus induces apoptosis in liver cells//J Biol Chem 1998,273(1), 381-385,

153. Kim T.-H., Zhao Y., Barber M. J. et al. Bid induced cytochrome c release is mediated by a pathway independent of mitochondrial permeability transition pore and Bax // The journal of biological chemistry. 2000. - Vol. 275. - N. 50. - P. 39474-39481

154. Kingham P. J., Pocock J. M. Microglial apoptosis induced by chromogranin A is mediated by mitochondrial depolarisation and the permeability transition but not bycytochrome с release // Journal of neurochemistry. 2000. - Vol. 74. - N. 4. - P. 14521462

155. Kirsch D.G., Doseff A., Chau B. N. et al. Caspase-3-dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome с // The journal of biological chemistry. 2001. - Vol.274.-N. 30.-P. 21155-21161

156. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R. et al. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis // Science. 1997. - Vol.275.-P. 1132-1136

157. Knodell RG et al. Formulation and application of numerical scoring system for assesing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis//Hepatology 1981; 1 (5): 431-435

158. Komatsu K., Suzuki S., Ohara S. et al. Expression of Bcl-2 and Bax in human gastric cancer tissue // Nippon Rinsho. 1996. - Vol. 54. - N. 7. - P. 1929-1934

159. Kondo S., Shinomura Y., Kanayama S. et al. Over-expression of Bcl-XL gene in human gastric adenomas and carcinomas // Int. J. Cancer. 1996. - Vol. 68. - N. 6. - P. 727-730

160. KorbuttG. S., Elliott J. F., Rajotte R. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression//Diabetes. 1997. - Vol. 46, N 2. - P. 317-322.

161. Kornblau S.M., Vu H.T., Ruvolo P. et al. Bax and PKCa modulate the prognostic impact of Bcl-2 expression in acute myelogenous leukemia // Clinical cancer research. -2000.-Vol. 6.-P. 1401-1409

162. Koyama S., Koike N., Adachi S. Fas receptor counterattack against tumor-infiltrating lymphocytes in vivo as a mechanism of immune escape in gastric carcinoma // J. Cancer research. Clin. Oncol. 2001. - Vol. 127. - N. 1. - P. 20-26

163. Koziel MJ. The role of immune responses in the pathogenesis of hepatitis С virus infection//J Viral Hepat 1997;4 Suppl 2:31-41

164. Krajewska M., Fenoglio-Preiser C.M., Krajewski S. et al. Immunohistochemical analysis of Bcl-2 family proteins in adenocarcinomas of the stomach // American journal of pathology. 1996. - Vol. 149. -N. 5. - P. 1449-1457

165. Krajewska M., Moss S.F., Krajewski S. et al. Elevated expression of Bcl-X and reduced Bak in primary colorectal adenocarcinomas // Cancer research. 1996. - Vol. 56.-N. 10.-P. 2422-2427

166. Krammer P. H. CD95's deadly mission in the immune system // Nature. 2000. -Vol. 407. - P. 789-795

167. Krueger A., Baumann S., Krammer P. H., Kirchhoff S. FLICE-inhibitory proteins: regulators of death receptor-mediated apoptosis // Molecular and cellular biology. 2001. - Vol. 21. - N. 24. - P. 8247-8254

168. Kurabayashi A., Furihata M., Matsumoto M. et al. Expression of Bax and apoptosis-related proteins in human esophageal squamous cell carcinoma including dysplasia // Mol. Pathol. 2001. - Vol. 306. -N. 3. - P. 741-747

169. Lam M., Bhat M. B., Nunez G. et al. Regulation of Bcl-XL channel activity by calcium // The journal of biological chemistry. 1998. - Vol. 273. - N. 28. - P. 1730717310

170. Lau H. Yu M., FontanaA., Stoeckert C. J., Jr. Prevention of islet allograft rejection with engineered myoblasts expressing FasL in mice // Science. 1996. - Vol. 273.1. P. 109-112

171. Lebedeva I.V., Stein C.A. Antisense Downregulation of the Apoptosis-related Bcl-2 and Bcl-XL proteins: a new approach to cancer therapy// Molecular Biol.- 2000.-V.34.-N.6.-P.875-888/

172. Lee S.S., Cho K.J., Hong S.I. et al. Nuclear overexpression of Bcl-2 oncoprotein during the progression of human stomach cancer // J. Korean. Med. Sci. 1998. - Vol. 13.-N. 2.-P. 153-158

173. Leithauser RF, Dhein J, Mechtersheimer G et al. Constitutive and induced expression of APO-1, a new member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily, in normal and neoplastic cells // Lab. Invest.- 1993.- V. 69. -P. 415-429

174. Li X. K., Okuyama Tamura A. et al. Prolonged survival of recipient rats with Fas-ligand-transfected liver allografts by using HVJ-liposome // Transplant. Proc. — 1998. —Vol. 30, N4.

175. Liang Y., Nylander K. D., Yan C., Schor N. F. Role of caspase 3-dependent Bcl-2 cleavage in potentiation of apoptosis by Bcl-2 // Mol. Pharmacol. 2002. - Vol. 61. - P. 142-149

176. Lian-Jun Y., Wen-Liang W. Expression of Bcl-2 and Bax proteins in hepatocellular carcinoma tissue // J. Fourth Mil. Med. Univ. 2002. - Vol. 23. - P. 337340

177. Lim M.L., Minamikawa T., Nagley P. The protonophore CCCP induces mitochondrial permeability transition without cytochrome c release in human osteosarcoma cells // FEBS Lett. 2001. - Vol. 503. - N. 1. - P. 69-74

178. Lim S.C. Fas-related apoptosis in gastric adenocarcinoma // Oncol. Rep. 2003. -Vol. 10. -N. 1. - P. 57-63

179. Lindblom B, Holmlund G. Rapid DNA purification for restriction fragment length polymorphism analysis // Gene Anal. Tech. 1988. - Vol. 5. - N. 5. - P. 97-101.

180. Ling Y.-H., Tornos C., Perez-Soler R. Phosphorylation of Bcl-2 is a marker of M fhase events and not a determinant of apoptosis // The journal of biological chemistry. -1998. Vol. 273. - N. 30. - P. 18984-18991

181. Liu F.-T., Goff L. K., Hao J.-H et al. Increase in the ratio of mitochondrial Bax/Bcl-XL induces Bax activation in human leukemic K562cell line// Apoptosis.-2004.-V.9.-P.377-384

182. Liu Q. and Gazitt Y. Potentiation of dexamethasone-, paclitaxel-, and Ad-p53-induced apoptosis by Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotides in drug-resistant multiple myeloma cells // Blood. 2003. - V. 101. - P. 4105-4114

183. Liu X.-H., Castelli J. C., Youle R. J. Receptor-mediated uptake of an extracellular Bcl-XL fusion protein inhibits apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96. -N. 17. - P. 9563-9567

184. Lock R. B. Bcl-2 inhibits a Fas induced conformational change in the Bax N-terminus and Bax mitochondrial translocation // The journal of biological chemistry. -2000. Vol. 275. -N. 23. - P. 17225-17228

185. Lorenz HM., Herrmann M, Winkler T., et al. Role of apoptosis in autoimmunity//Apoptosis. 2000. -Vol. 5. -P.443-9.

186. Lowe S.L., Rubinchik S., Honda T., McDonnell T.J., Dong J.Y., Norris J.S. Prostate-specific expression of Bax delivered by an adenoviral vector induces apoptosis in prostate cancer cells //GeneTher.- 2001.- V.8(18).-P.1363-1371

187. Lynch DH., Ramsdell F., Alderson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses// Immunol Today. -1995. -Vol. 16. -P.569.

188. MacFarlane M., Merrison W., Bratton S. B. et al. Proteasome-mediated degradation of Smac during fpoptosis: XIAP promotes Smac ubiquitination in vitro // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 36611-36616

189. Marani M., Tenev T., Hancock D. et al. Identification of novel isoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis // Molecular and cellular biology. 2002. - Vol. 22. - N. 11. - P. 3577-3589

190. Markowitz D., GoffS., Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotropic cell line // J. Virol. — 1988. — Vol. 167. P. 400-406.

191. Marone M., Scambia G., Mozzetti S. et al. Bcl-2, Bax, Bcl-XL, and Bcl-XS expression in normal and neoplastic ovarian tissues // Clinical cancer research. 1998. -Vol. 4.-P. 517-524

192. Martin A. G., Fearnhead H. O. Apocytochrome c blocks caspase-9 activation and Bax-induced apoptosis // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 50834-50841

193. Martin S., Toquet C., Oliver L. et al. Expression of Bcl-2, Bax and Bcl-XL in human gliomas: a re-appraisal // J. Neurooncol. 2001. - Vol. 52. - N. 2. - P. 129-139

194. Matsuyama S., Schendel S. L., Xie Z. et al. Cytoprotection by Bcl-2 requires the pore-forming a5 and a6 helices // The journal of biological chemistry. 1998. - Vol. 273. -N. 47. - P. 30995-31001

195. Maurer C.A., Friess H., Buhler S.S. et al. Apoptosis inhibiting factor Bcl-XL might be the crucial member of the Bcl-2 gene family in colorectal cancer // Dig. Dis. Sci. 1998. - Vol. 43. -N. 12. - P. 2641-2648

196. McDonnel J., Bechm A., Sarkiss M. et al. Importance of the Bcl-2 family in cell death regulation // Experientia. 1996. - Vol. 52. - P. 1008-1017

197. McDonnell T. J., Troncoso P., Brisbay S. M. et al. Expression of the protooncogene bcl-2 in the prostate and its association with emergence of androgen-independent prostate cancer // Cancer Res. 1992. - Vol. 52. - P. 6940-6944.

198. McGinnis K. M., Gnegy M. E., Wang K. K. W. Endogenous Bax translocation in SH-SY5Y human neuroblastoma cells and cerebellar granule neurons undergoing apoptosis // Journal of neurochemistry. 1999. - Vol. 72. - N. 5. - P. 1899-1906

199. Mei X W et al. Induction and detection of apoptosis in human periphery blood T-cells. J. Immunological methods 1997; 206: 153162.

200. Meier P., Finch A., Evan G. Apoptosis in development // Nature. 2000. -Vol.407.-P.796-801.

201. Meijerink J. P.P., Mensink E. J.B.M., Wang K. et al. Hematopoietic malignancies demonstrate loss-of-iunction mutations of Bax // Blood. 1998. - Vol. 91. - N. 8. - P. 2991-2997

202. Mercatane D.R., Bortner C.D., Cidlowski J.A. et al. Modification of alternative splicing of Bcl-X pre-mRNA in prostate and breast cancer cells // The journal of biological chemistry. 2001 - Vol. 276. - P. 16411-16417

203. Miller S., Simon J., Vesfig J. Interdisciplinary approaches to gene therapy. Berlin-Heidelberg-New York: Springer, 1997.

204. Misao J., Hayakawa Y., Ohno M. et al. Expression of Bcl-2 protein an inhibitor of apoptosis and Bax an accelerator of apoptosis in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction // Circulation. 1996. - Vol. 94. - P. 1506-1512

205. Mita E, Hayashi N, Lio S et al. Role of fas ligand in apoptosis induced by hepatits C infection // Biochem. Boiphis. Res. Commun. 1994. - 204. - P. 468-474

206. Mochizuki K, Hiramatsu N, Hayashi N et al. Fas antigen expression in in liver tissues of patient with chronic hepatitis B //J. Hepatol.- 1996.-V. 24.- P. 1-7

207. Mok C.-L., Gil-Gomez G., Williams O. et al. Bad can act as a key regulator of T cell apoptosis and T cell development // The Journal of Experimental Medicine. 1999. -Vol. 189. -N. 3.-P. 575-586

208. Morris M. J., Tong W. P., Cordon-Cardo C. et al. Phase I Trial of BCL-2 Antisense Oligonucleotide (G3139) Administered by Continuous Intravenous Infusion in Patients with Advanced Cancer //Clin. Cancer Res.- 2002. -V. 8(3).- P. 679 683

209. Morrow WJ., Nelson L., Watts R, Isenberg DA. Autoimmune rheumatic disease. 2nd.// Oxford: Oxford University Press. 1999.

210. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and cy-totoxicity assays // J. Immunol. Meth. — 1983. — Vol. 65. — P. 55-63.

211. Mounier N., Briere J., Gisselbrecht C. et al. Rituximab plus CHOP (R-CHOP) overcomes bcl-2—associated resistance to chemotherapy in elderly patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) // Blood. 2003. -V.101. - P. 4279-4284

212. Mountz J.D., Wu J., Cheng J., Zhou T. Autoimmune disease: A problem of defective apoptosis// Arthritis Rheum. 1994. -Vol. 37. -P. 1415-1420.

213. Mountz J D et al. The role of programmed cell death as an emerging new concept for the pathogenesis of autoimmune diseases. Clinical immunology and immunopathology 1996; 80: S2-S14.

214. Mullauer L., Gruber P., Sebinger D. et al. Mutations in apoptosis genes: a pathogenetic factor for human disease // Mutat Res. 2001. - Vol. 488. - N. 3. - P. 211231

215. Muller HM, Pfaff E, Goeser T. et al. Peripheral blood leukocytes as a possible extrahepatic site for hepatits C replication. J. Gen. Virol., 1993, 74: 669-676)

216. Murphy K/M., Ranganathan V., Farnsworth M.L. et al Bcl-2 inhibits Bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells. //Cell death and Different. 2000. - Vol.7. - P.102-111.

217. Muzio M., Salvesen G.S. and Dixit V.M. FLICE induced apoptosis in a cell-free system. Cleavage of caspase zymogens// J. Biol Chem. 1997. - V. 272. - P. 29522956.

218. Nadal-Ginard B., Kajstura J., Anversa P., Leri A. A matter of life and death: cardiac myocyte apoptosis and regeneration// J, Clin. Invest.- 2003 .-V. 111.- №10.-P.1457-1459

219. Nagata S., Golstein P. The Fas death factor// Science. 1995. -Vol. 267. -P. 1449-56.

220. Nagata S., Suda T.Fas and Fas ligand: lpr and gld mutations// Immunol Today. -1995.-Vol. 16.-P.39.

221. Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell. 1997. - Vol. 88. - P. 355-365.

222. Nagata S. Fas ligand- induced apoptosis// Ann. Rev. Genet. 1999. -Vol. 33. - P. 29-55.

223. Nakamuro M., Matute-Bello G., Liles W.C. et al. Differential response of human lung epithelial cells to FAS-induced apoptosis // Am. J. Pathol.-2004.-V.164. P.1949-1958

224. Narasimhan S. R., Yang L., Gerwin B. I. et al. Resistance of pleural mesothelioma cell lines to apoptosis relation to expression of Bcl-2 and Bax // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1998. - Vol. 275. -N. 1. - P. L165-L171

225. Narita M., Shimizu S., Ito T. et al. Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. -N. 25. - P. 14681-14686

226. Nauman U., M. Weller. Retroviral В AX gene transfer fails to sensitise malignant glioma cells to CD95L-induced apoptosis and cancer chemotherapy.// Int. J. Cancer. -1998. -Vol.77. -P.645-648.

227. Nechushtan A., Smith C.L., Lamensdorf I. et al. Bax and Bak coalesce into novel mitochondria-associated clusters during apoptosis // The journal of cell biology 2001. -Vol. 153.-N. 6.-P. 1265-1276

228. Nicolson W.D. From bench to clinic with apoptosis-based therapeutic agents // Nature. 2000. - Vol.407. - P.810-816.

229. Nishimoto I., Okamoto Т., Gramorella U., Iwatsubo T. Apoptosis in neurodegenerative disease // Adv.Pharmacol. 1997, v.41, p.337-369.

230. Nomura M., Shimizu S., Ito T. et al. Apoptotic cytosol facilitates Bax translocation to mitochondria that involves cytosolic factor regulated by Bcl-2 // Cancer research. 1999. - Vol. 59. - P. 5542-5548

231. NorrisJ.S., HyerM.L., Voelkel-Johnson C. etal. The use of Fas Ligand, TRAIL and Bax in gene therapy of prostate cancer // Curr Gene Ther.- 2001.-V1(1).-P. 123-136

232. O'Connell J., Bennett M.W., Nally K. et al. Altered mechanisms of apoptosis in colon cancer: Fas resistance and counterattack in the tumor-immune conflict // Ann. N. Y. Acad. Sci.-2000. Vol. 910. - P. 178-192

233. Ogasawara J, Watanabe-Fukunaga R, Adachi M et al. Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice//Nature 1993 Aug 26;364(6440):806-809

234. Ogura E., Senzaki H., Yamamoto D. et al. Prognostic significance of Bcl-2, Bcl-XL/S, Bax and Bak expressions in colorectal carcinomas // Oncol. Rep. 1999. - Vol. 6. -N. 2.-P. 365-369

235. Okamoto K., Asahara H., Kobayashi T. et al. Induction of apoptosis in the rheumatoid synovium by Fas ligand gene transfer// Gene Ther. 1998. - Vol. 5, N 3. - P. 331-338.

236. Osaki M., Kase S., Kodani I. et al. Expression of Fas and Fas ligand in human gastric adenomas and intestinal-type carcinomas: correlation with proliferation and apoptosis // Gastric cancer. 2001. - Vol. 4. - N. 4. - P. 198-205

237. Oto M., Miyake S., and Yuasa Y. Optimization of nonradioisotopic single strand conformation polymorphism analysis with a conventional minislab gel electrophoresis apparatus // Analytical biochemistry. 1993. - Vol. 213. - P. 19-22

238. Ouyang H., Furukawa T., Abe T. et al. The Bax gene, the promoter of apoptosis, is mutated in genetically unstable cancer of the colorectum, stomach, and endometrium // Clinical cancer research. 1998. - Vol. 4. - P. 1071-1074

239. Owen-Shaub L. Fas/APO-1: a cell surface protein mediating apoptosis // Cancer Bull. 1994.-Vol. 46. - P.141-145.

240. Ozvaran M.K., Cao X. X., Miller S. D. et al. Antisense oligonucleotides directed at the bcl-xl gene product augment chemotherapy response in mesothelioma //Mol. Cancer Ther. 2004. -V. 3. -P. 545-550

241. Pan H. Yin C., Dyke T. Apoptosis and cancer mechanisms // Cancer Surveys.1997.-Vol. 29.- P.305-327.

242. Pastorino J.G., Chen S.T., Tafani M. et al. The overexpression of Bax produces cell death upon induction of the mitochondrial permeability transition. // J. Biol. Chem.1998. Vol.273. - P.7770-7775.

243. Peiro G., Diebold J., Mayr D. et al. Prognostic relevance of hMLHl, hMSH2, and Bax protein expression in endometrial carcinoma // Mol. Pathol. 2001. - Vol. 14. - N. 8. - P. 777-783

244. Pepper C., Bentley P., Hoy T. Regulation of clinical chemore-sistance by bcl-2 and bax oncoproteins in B-cell chronic lym-phocytic leukaemia // Br. J. Haematol. — 1996. —Vol.95. —P. 513-517.

245. Perlman H., Sata M., Le Roux A. et al. Bax mediated cell death by the Gax homeoprotein requires mitogen activation but is independent of cell cycle activity // The EMBO journal. 1998. -Vol. 17.-P. 3576-3586

246. Petrella G. T., Beylot-Barry M., Joly P. et al. Bcl-2 protein expression is the strongest independent prognostic factor of survival in primary cutaneous large B-cell lymphomas // Blood. 2004. - V. 103(10). -P. 3662 - 3668

247. Pezzella F., Turley H., Keizer I. et al. Bcl-2 protein in non-small-cell carcinoma// N. Engl. J. Med. 1993. - Vol. 329. - P. 690-694.

248. Pinkoski M. J., Brunner T., Green D. R. et al. Fas and Fas ligand in gut and liver // Gastrointestinal and liver physiology. 2000. - Vol. 278. - N. 3. - P. G354-G366

249. Pirccftnac E.C., Nassirpour R., Yang M. Et al. Bax-induction gene therapy of pancreatic cancer// J. Surg. Res. -2002.- V. 106(2).- P.346-51.

250. Pollicino T., Terradillos O, Lecoeur H. et al. Pro-apoptotic effect of the hepatitis B virus X gene//Biomed Pharmacoter, 1998, 52 (9), 363-368;

251. Poulaki V., Mitsiades N., Romero M. E. and M. Tsokos Fas-mediated Apoptosis in Neuroblastoma Requires Mitochondrial Activation and Is Inhibited by FLICE Inhibitor Protein and bcl-2 // Cancer Res. June 1.- 2001,- V. 61(12).- P. 4864 - 4872

252. Proussakova O.V., Rabaya N.A., Moshnikova A.B. et al. Oligomerization of soluble Fas antigen induces its cytotoxicity // The journal of biological chemistry. 2003. - Vol. 278. -N. 38. - P. 36236-36241

253. Pryde J. G., Walker A., Rossi A. G. et al. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 °C prevents the release of cytochrome c // The journal of biological chemistry. 2000. - Vol. 275. - N. 43. - P. 33574-33584

254. Rajagopalan S., Somers E. C., Brook R. D. et al. Endothelial cell apoptosis in systemic lupus erythematosus: a common pathway for abnormal vascular function and thrombosis propensity // Blood. 2004.- V. 103. - P. 3677-3683

255. Rampino N., Yamamoto H., Ionov Y., Li Y., Sawai H., Reed J.C., Perucho M. Somatic frameshift mutations in the Bax gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 967-969

256. Reed J. C. Balancing cell life and death: Bax, apoptosis, and breast cancer // J. Clin. Invest. 1996. - Vol. 97. - N. 11. - P. 2403-2404

257. Reed J.C. Apoptosis-based therapies // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. - Vol. 1. -N. 2. -P.111-121.

258. Reed J.C. Potential functions of Bcl-2 family proteins. // Advances in pharmacology. 1997. -Vol.41. - P. 510-514.

259. Rehermann B, Chang K, McHutchison JG. et al Quantitative analysis of the peripheral blood cytotoxic T lymphocyte response in patients with chronic hepatitis C virus infection//J.Clin.Invest. 1996. 98.1432-1440

260. Rieux-Laucat F., et al. Mutations in Fas associated with human Lymphoproliferative syndrome and autoimmunity// Science. -1995. -Vol. 268. -P. 13471349.

261. Rose LM., Latchman DS., Isenberg DA. Apoptosis in peripheral lymphocytes in systemic lupus erythematosus: a review// British J. Rheumatol. -1997. Vol. 36. -P. 158163.

262. Roya S., Nicholsona D. W. Cross-talk in cell death signaling // The Journal of Experimental Medicine. 2000. - Vol. 192. - N. 8. - P. F21-F26

263. Rudin C. M., Otterson G. A., Mauer A. M. et al. A pilot trial of G3139, a bcl-2 antisense oligonucleotide, and paclitaxel in patients with chemorefractory small-cell lung cancer// Ann. One.- 2002.- V. 13(4).-P. 539 545

264. RudnerlJ., Lepple-Wienhues A., Budachl W. et al. Wild-type, mitochondrial and ER-restricted Bcl-2 inhibit DNA damage-induced apoptosis but do not affect death receptor-induced apoptosis // Journal of Cell Science. 2001. - Vol. 114. - P. 4161-4172

265. Ruvolo P.P., Deng X., May W.S. Phosphorylation of Bcl-2 and regulation of apoptosis // Leukemia. 2001. - Vol. 15. -N. 4. - P. 515-522

266. Saegusa M., Takano Y., Okayasu I. Bcl-2 expression and its association with cell kinetics in human gastric carcinomas and intestinal metaplasia // J. Cancer research. Clin. Oncol. 1995. - Vol. 121. - N. 6. - P. 357-363

267. Saeterdal I., Bjorheim J., Lislerud K. et al. Frameshift-mutation-derived peptides as tumor-specific antigens in inherited and spontaneous colorectal cancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001. Vol. 98.-N. 23.-P. 13255-13260

268. Sahara S., Aoto M., Eguchi Y. et al. Acinus is a caspase-3-activated protein required for apoptotic chromatin condensation // Nature. 1999. - Vol. 401. - N. 6749. -P. 168-173

269. Sakuragi N., Ohkouchi T., Hareyama H. et al. Bcl-2 expression and prognosis of patients with endometrial carcinoma // Int. J. Cancer. 1998. - Vol. 79. - P. 153-158.

270. Salmon M., Gordon C. The role of apoptosis in systemic lupus erythematosus/ZRheumatology. 1999. -Vol. 38. -P.l 177-1183.

271. Savill J., Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death // Nature. 2000. - Vol. 407. - P.784-788.

272. Sawa H., Kobayashi T, Mukai K. et al. Bax overexpression of enhances cytochrome c release from mitochondria and sensitizes gastric cells to chemotherapeutic agent-induced apoptosis.// Intern. J. Oncol. 2000. - Vol.16 - P.745-749.

273. Schaich M., Illmer T., Seitz G. et al. The prognostic value of Bcl-XL gene expression for remission induction is influenced by cytogenetics in adult acute myeloid leukemia // Haematologica. 2001. - Vol. 86. - N. 5. - P. 470-477

274. Schelwies K., Sturm I., Grabowski P. et al. Analysis of p53/Bax in primary colorectal carcinoma: low Bax protein expression is a negative prognostic factor in UICC stage III tumors // Int. J. Cancer. 2002. - Vol. 99. -N. 4. - P. 589-596

275. Schendel S. L., Xie Z., Montal M. O. et al. Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 5113-5118

276. Schlesinger P. H., Gross A., X.-M. Yin et al. Comparison of the ion channel characteristics of proapoptotic Bax and antiapoptotic Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.-Vol. 94.-P. 11357-11362

277. Schmollinger J. C., Dranoff G. Targeting melanoma inhibitor of apoptosis protein with cancer immunotherapy// Apoptosis.-2004.-V.9.-P.309-314

278. Schon M. P., Schon M. Immune modulation and apoptosis induction: Two sides of the antitumoral activity of imiquimod// Apoptosis.-2004.-V.9.-P.291-298

279. Schwandner O., Schiedeck T.H., Bruch H.P. et al. p53 and Bcl-2 as significant predictors of recurrence and survival in rectal cancer // Eur. J. Cancer. 2000. - Vol. 36. -N. 3.-P. 348-356

280. Sharma S., Saltz L. B. Oral chemotherapeutic agents for colorectal cancer // The Oncologist. 2000. - Vol. 5. -N. 2. - P. 99-107

281. Shaw-Stiffel T.A. Chronic hepatitis //Principles and practice of infectious diseases/Mandell, 5th ed„ 2000.-P.1298-1320

282. Sheehan K.M., O'Donovan D.G., Fitzmaurice G. Prognostic relevance of Fas (Apo-l/CD95) ligand in human colorectal cancer // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. -2003. Vol. 15. - N. 4. - P. 375-380

283. Shi Y. Caspase Activation: revisiting the induced proximity model // Cell.- 2004.-V.l 17.-P.855-858

284. Shibasaki T., Kondo E., Akagi T., McKeon F. Suppression of signalling through transcription factor NF-AT by interaction between calcineurin and Bcl-2 // Nature. -1997.-Vol. 386.-P. 728-731

285. Shigekazu N. Apoptosis by death factor. Cell 1997; 88: 355-365.

286. Shilkaitis A., Graves J., Mehta R. R. et al. Bcl-2 and Bax are differentially expressed in hyperplastic premalignant and malignant lesions of mammary carcinogenesis // Cell Growth Differ. 2000. - Vol. 11. - P. 437-445

287. Shimoyama M., Kanda T., Liu L. et al. Expression of Fas ligand is an early event in colorectal carcinogenesis // J. Surg. Oncol. 2001. - Vol. 76. - N. 1. - P. 63-68

288. Shinoura N., Saito K., Yoshida Y. et al. Adenovirus-mediated transfer of Bax with caspase-8 controlled by myelin basic protein promoter exerts an enhanced cytotoxic effect in gliomas.//Cancer Gene Ther. 2000. - Vol.7. - P.739-748.

289. Shinoura N., Yoshida Y., SadataA. et al. Apoptosis by retrovirus- and adenovirus-mediated gene transfer of Fas ligand to glioma cells: implications for gene therapy // Hum. Gene Ther. —1998. Vol. 9, N 14. - P. 1983-1993.

290. Shugar D. Perspectives in antisense Therapeutics // Pharmacol. Ther., 1997, v.76, p.151-160.

291. Siegel RM.,. Frederiksen J K., Zacharias D A., et al. Fas pre-association required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations//Science. -2000. -Vol. 288. -P.2354-2357.

292. Silvestrini R., Veneroni S., Daidone M. G. et al. The Bcl-2 protein: a prognostic indicator strongly related to p53 protein in lymph node negative breast cancer patients // J. Natl. Cancer Inst. 1994. - Vol. 86. - P. 499-504.

293. Simonian P.L., Grillot D.A.M., Andrews D.W. et al. Bax homodimerization is not required for Bax to accelerate chemotherapy-induced cell death // The journal of biological chemistry. 1996. - Vol. 271. -N. 50. - P. 32073-32077

294. Simonian P.L., Grillot D.A.M., Nunez G. Bcl-2 and Bcl-XL can differentially block chemotherapy-induced cell death // Blood. 1997. - Vol. 90. - N. 3. - P. 12081216

295. Sinkovics J. G., Horvath J. Can virus therapy of human cancer be improved by apoptosis induction? // Med. Hypothes. —1995. Vol. 44, N 5. - P. 359-368.

296. Smith A.E. Gene therapy where are we // The Lancet. - 1999. - V.354. (Suppl. 1). - P.1-4

297. Socie G., Mary J -Y., Lemann M. Et al.Prognostic value of apoptotic cells and infiltrating neutrophils in graft-versus-host disease of the gastrointestinal tract in humans: TNF and Fas expression // Blood. 2004. - V. 10. - P. 50-57

298. Soini Y., Kinnula V., Kaarteenaho-Wiik R. et al. Apoptosis and expression of apoptosis regulating proteins Bcl-2, Mcl-1, Bcl-X and Bax in malignant mesothelioma // Clinical cancer research. 1999. - Vol. 5. - P. 3508-3515

299. Song E., Chen J., Ouyang N. et al. Soluble Fas ligand released by colon adenocarcinoma cells induces host lymphocyte apoptosis: an active mode of immune evasion in colon cancer // Br. J. Cancer. 2001. - Vol. 85. - N. 7. - P. 1047-1054

300. Srinivas G., Kusumakumary P., Krishnan M. et al. Mutant p53 protein, Bcl-2/Bax ratios and apoptosis in paediatric acute lymphoblastic leulaemia // J. Cancer research. Clin. Oncol. 2000. - Vol. 126. - P. 62-67

301. Steinberg AD., Krieg AM., Gourley MF., Klinman DM. Theoretical and experimental approaches to generalized autoimmunity// Immunol Rev. 1990. -Vol.118. -P. 129-163.

302. Steinberg AD., Gourley MF., Klinman DM., et al. Systemic lupus erythematosus// Ann Intern Med. 1991. -Vol. 115. -P.548-559.

303. Stoll-Becker S, Repp R, Glebe D et al. Transcription of hepatitis B virus in peripheral blood mononuclear cells from persistently infected patients//J. Virol 1997, 71 (7), 5399-407

304. Strack P.R. Apoptosis mediated by HIV protease is preceded by cleavage of Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, v. 93, p. 9571-9576

305. Su F., Schneider R.J. Hepatitis B virus HBx protein sensitizes cells to apoptotic killing by tumor necrosis factor alpha//Proc Natl Acad Sei 1997, 94(16), 8744-8749

306. Swenson K. M., Ke ., Wang T. et al. Fas ligand gene transfer to renal allografts in rats: effects on allograft survival // Trans plantation. 1998. - Vol. 65, N 2. - P. 155-160.

307. Szymkowski D.E., Developing antisense oligonucleotides from the laboratory to clinical trials. // Drug Discovery Today. 1996. - V.l. - N. 10. - P.415-428

308. Takahashi ., Tanaka M., Ogasawara J. et al. Swapping between Fas andgranulocyte colony-stimulating factor receptor // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271, N 29. - P. 17555-17560.

309. Takebayashi H., Oida H., Fujisav/a K. et al. Hormone-induced apoptosis by Fas-nuclear receptor fusion proteins: novel biological tools for controlling apoptosis in vivo // Cancer Res. —1996. Vol. 56, N 18. - P. 4164-4170.

310. Tanaka M., Suda T., Takahashi T., Nagata S. Expression of the functional soluble form of human Fas ligand in activated lymphocytes// EMBO. 1995. -Vol.14. -P.l 1291135.

311. Tanaka M., Suda T., Haze K., et al. Fas ligand in human serum// Nat Med. -1996. -Vol. 2. -P.317.

312. Terradillos O, Pollicino T, Lecoeur H. p53-independent apoptotic effects of the hepatitis B virus HBx protein in vivo and in vitro//Oncogene 1998, 17(16). 2115-2123

313. Tokano Y., Miyake S., Kayagaki., N et al. Soluble Fas molecule in serum of patients with systemic lupus erythematosus// J Clin immunol . -1996. -Vol.16. -P.261-265.

314. Toshio Miyawaki et al. Differential expression of apoptosis-related Fas Antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral blood. J. Immunology 1992; 149: 3752-3758

315. Trent RJ. Molecular medicine // 1997. P.154-173

316. Tron V. A., Krajewski S., Klein-Parker H. et al. Immunohisto-chemical analysis of Bcl-2 protein regulation in cutaneous melanoma // Am. J. Pathol. 1995. - Vol. 146. -P. 643-650.

317. Tsuruta Y., Mandai M., Konishi I., et. Al Combination effect of adenovirus-mediated proapoptotic bax gene transfer with cisplatin or paclitaxel treatment in ovarian cancer cell lines. //European J. Cancer. 2001. - Vol.37. - P.531-541.

318. Ulvik A., Aarskog N.K., Ogreid D. Detection and identification of Ki-ras exon 1 mutations by minigel single-strand conformation polymorphism // Analytical biochemistry. 1995. - Vol. 232. - P. 137-138

319. Van Lopik Т., Bijl M., Hart M., et al. Patients with systemic lupus erythematosus with high plasma levels of sFas risk relapse// J Rheumatol. 1999. -Vol.26. -P.60-67.

320. Vaux D.L., Strasser A. The molecular biology of apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, v.93, p.2239-2244.

321. Viruses & Apoptosis By C. L. Alonso, C. Alonso Hardcover / March 2004

322. Wagenaar-Miller R.A., Gorden L., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases in colorectal cancer: Is it worth talking about?// Cancer and metastases reviews.-2004.-V.23.-P. 119-135

323. Walers C. Molecular mechanism of neuronal cell death // Neurotransmissions. -1997.-Vol. XIII,- P. 1-7.

324. Wallach D. Placing death under control // Nature, 1997, v.388, p.123-126.

325. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis // Genes Dev. 2001. -Vol. 15. - N. 22. - P. 2922-2933

326. Wang Z.H., Ding M.X., Chew S.B. et al. Bcl-2 and Bax proteins are nuclear matrix associated proteins.// Anticancer Res 1999. - Vol.19. - P.5445-5450.

327. Waters J.S., Webb A., Cunningham D. et al. Phase I Clinical and Pharmacokinetic Study of Bcl-2 Antisense Oligonucleotide Therapy in Patients With Non-Hodgkin's Lymphoma// J. Clinical Oncology.-2000.-V. 18.-P. 1812-1823

328. Webb A., Cunningham D., Cotter F et al. Bcl-2 antisense therapy in patient with non-Hodgkin lymphoma//Lancet. -1997.- V.349.-P.1137-1141.

329. Webster K.A. and Bishopric N. H. Apoptosis Inhibitors for Heart Disease //Circulation. 2003. - V. 108. - P. 2954-2956

330. Weller M., Malipiero U., Rensing-Ehl A. et al. Fas/APO-1 gene transfer for human malignant glioma//Cancer Res. — 1995,- Vol. 55, N 13. P. 2936-2944.

331. Werner A.B., Vries E., Tait S.W.G. et al. Bcl-2 family member Bfl-l/Al sequesters truncated Bid to inhibit its collaboration with pro-apoptotic Bak or Bax // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 22781-22788

332. White E. Regulation of apoptosis by transforming genes of the DNA tumor virus adenovirus//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1993, 204(1), 30-39)

333. Wohlfart S., Sebinger D., Gruber P. et al. FAS (CD95) mutation are rare in gastric MALT Lymphoma but occur more frequently in primary gastric diffuse large B-cell Lymphoma//Am. J. Pathol.-2004.-V.164. P.1081-1089

334. Wolf H.K., Stober C., Hohenfellner R. et al. Prognostic value of p53, p21/WAFl, Bcl-2, Bax, Bak and Ki-67 immunoreactivity in pTl G3 urothelial bladder carcinomas // Tumour Biol. 2001. - Vol. 22. - N. 5. - P. 328-336

335. Woodruff Emlen et al. accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J. immunol. 1994; 152: 3685-3692.

336. Wu M.-S., Lee C.-W., Shun C.-T. et al. Clinicopathological significance of altered loci of replication error and microsatellite instability-associated mutations in gastric cancer // Cancer research. 1998. - Vol. 58. - P. 1494-1497358. www.genta.com

337. Wyllie A.N., Kerr J.F., Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis//Intern. Rev.Cytol.-1980.- V.68. P.251

338. Xiang H., Kinoshita Y., Knudson C. M. et al. Bax involvement in p53 mediated neuronal cell death // The journal of neuroscience. 1998. - Vol. 18. - N. 4. - P. 13631373

339. Xiang J., Chao D.T., Korsmeyer S.J. Bax-induced cell death may not require interleukin 1 p-converting enzyme-like proteases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93. - P.14559-14563.

340. Xiang J., Gomez-Navarro J., Arafat W. et al. Pro-apoptotic treatment with an adenovirus encoding Bax enchances the effect of chemotherapy in ovarian cancer.// J. Gene Medicine. 2000. - Vol.2. - P.97-106.

341. Xiang J., Piche A., Rancourt C., et al. An inducible recombinant adenoviral vector ancoding Bax selectively induces apoptosis in ovarian cancer cells. // Tumor targeting. -1999.-Vol. 4.-P. 84-91.

342. Xiong H.Q., Ajani J.A. Treatment of colorectal cancer metastasis: The role of chemotherapy // Cancer and metastases reviews.-2004.-V.23.-P. 145-163

343. Yagi O.K., Akiyama Y., Nomizu T., Iwama T., Endo M., and Yuasa Y. Proapoptotic gene Bax is frequently mutated in hereditary nonpolyposis colorectal cancers but not in adenomas// Gastroenterology. 1998. - Vol. 114. - P. 268-274

344. Yamaguchi H., Wang H.-G. Bcl-XL protects BimEL-induced Bax conformational change and cytochrome c release independent of interacting with Bax or BimEL // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 41604-41612

345. Yamamoto H., Sawai H., Weber T.K. et al. Somatic frameshift mutations in DNA mismatch repair and proapoptotic genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer // Cancer research. 1998. - Vol. 58. - P. 997-1003

346. Yamamoto K., Ichijo H., Korsmeyer S. J. Bcl-2 is phosphorylated and inactivated by an ASKl/Jun N-terminal protein kinase pathway normally activated at G2/M // Molecular and cellular Biology. 1999. - Vol. 19. - N. 12. - P. 8469-8478

347. Yang H.B., Chow N.H., Sheu B.S. et al. The role of Bcl-2 in the progression of the colorectal adenoma-carcinoma sequence // Anticancer Res. 1999. - Vol. 19. - N. IB.-P. 727-730

348. Yang J., Liu X., Bhalla K. Et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 1129-1132

349. Yao M., Cowie A., Wasfy G.W. et al. EBV in latent infection // EMBO J. -1985.-V.15.-P.4130-4141

350. Yokota J. Tumor progression and metastasis // Carcinogenesis. 2000. - Vol. 21. -N.3.-P. 497-503

351. Zeuner A., Pedini F., Signore M. et al. Stem cell factor protects erythroid precursor cells from chemotherapeutic agents via up-regulation of BCL-2 family proteins // Blood. 2003. -V.102. - P. 87-93.

352. Zha J., Harada H., Yang E., Joket J., Korsmeyer S.J. Serine phosphorylation of death agonist Bad in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not Bcl-XL // Cell. 1996. - Vol. 87. - P. 619-628

353. Zhang H., Xu Q., Krajewski S. et al. Bar: An apoptosis regulator at the intersection of caspases and Bcl-2 family proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 2597-2602

354. Zhang H., Yang Y., Horton J. L. et al. Amelioration of collagen-induced arthritis by CD95 (Apo-1 /Fas)-ligand gene transfer // J. Clin. Invest. 1997. - Vol. 100, N 8. - P. 1951-1957.

355. Zhao W-L., Daneshpouy M. E., Moimier N. Et al.Prognostic significance of bcl-xL gene expression and apoptotic cell counts in follicular lymphoma // Blood. 2004. -V. 103.-P. 695-697

356. Zhu N., Khoshnan A, Schneider R. et al. Hepatitis C virus core protein binds to the cytoplasmic domain of TNF receptor 1 and enhances TNF-induced apoptosis// J.Virol. 1998, 72(5), 3691-3697

357. Zignego AL, Masshia D, Monti M. et al. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C. J.Hepatol., 1992,15: 382- 386

358. Zucker S., Vacirca J. Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer // Cancer and metastases reviews.-2004.-V.23.-P. 101-117

Информация о работе

Белушкина, Наталья Николаевна
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Особенности регуляции апоптоза при опухолевых, вирусных и аутоиммунных заболеваниях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы