Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли негистоновых белков в организации хроматина на границах β-глобинового домена генома Gallus Gallus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли негистоновых белков в организации хроматина на границах β-глобинового домена генома Gallus Gallus"

На правах рукописи

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ В ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА НА ГРАНИЦАХ ß-ГЛОБИНОВОГО ДОМЕНА ГЕНОМА GALLUS GALLUS

03.00.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в департаменте биохимии и молекулярной биологии Медицинского Колледжа при Государственном Университете Штата Пенсильвания (Херши, США).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук

Григорьев Сергей Александрович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

кандидат биологических наук

Преображенская Ольга Владимировна

доктор биологических наук

Яровая Ольга Владимировна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится 21 декабря 2006 года в_ч на заседании

Диссертационного Совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан 2 октября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор биологических наук

— Н.О. Калинина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Геном эукариот упакован в ДНК-белковый комплекс — хроматин, включающий в себя гистоны и другие ядерные белки. Выделяют два основных типа хроматина, которые отличает уровень компактизации ДНК: активный и менее компактный эухроматин, а также конденсированный гетерохроматин. В основном гетерохроматин содержит репрессированные гены. В процессе клеточной дифференцировки, когда основная часть генома неактивна, большинство генов входят в состав гетерохроматина, однако ряд генов все же сохраняют свою экспрессию. Одним из интереснейших аспектов формирования гетерохроматина является тот факт, что он не распространяет свое репрессирующее влияние на гены, специфично транскрибирующиеся в клетках определенного типа, на данном этапе развития.

Примером эпигенетической регуляции экспрессии генов в процессе развития является регуляция экспрессии р-глобинового локуса кур. Это участок активного хроматина размером 30 тысяч пар оснований, отделенный от конденсированного хроматина так называемыми пограничными элементами или инсуляторами. Известно, что репрессированный хроматин характеризуется пониженным уровнем ацетилирования гистонов и повышенным уровнем метилирования гистона НЗ, по положению Lys9. Наиболее изученным негистоновым маркером гетерохроматина является гетерохроматиновый белок НР1, способный связываться только с метилированным гистоном НЗ. Ранее в нашей лаборатории был описан еще один белок гетерохроматина - MENT (от Myeloid and Erythroid Nuclear Termination stage-specific protein). Он накапливается в клетках крови птиц на конечных стадиях дифференцировки, связывается с репрессированным хроматином и вызывает его конденсацию.

Данная работа была направлена на определение негистоновых белков, участвующих в образовании конденсированного хроматина на границах р-глобинового домена и изучение их роли в этом процессе.

Во время выполнения данной работы было показано, что уровень всех

изоформ белка НР1 в зрелых клетках крови кур (Gallus. gallus) незначителен, а

значит, данный белок не может являться фактором конденсации хроматина на

1

конечных стадиях дифференцировки. Было показано, что количество белка MENT нарастает в процессе дифференцировки клеток крови, что делает его очевидным кандидатом в факторы, определяющие репрессию хроматина в процессе созревания клеток крови. При выполнении данной работы было показано, что распространение белка MENT вдоль (3-глобинового домена совпадает с картиной распределения диметилированного гистона НЗ и обратно картине распределения ацетилированных гистонов.

Изучение механизмов эпигенетической регуляции клеточной дифференцировки представляет особый интерес не только как одна из актуальных проблем современной биологи, но и имеет прикладное значение. Факторы, участвующие в дифференцировке клеток на уровне крупномасштабной компактизации хроматина и репрессии генов, могут являться причиной наследственных и онкологических заболеваний, обусловленных нарушением нормального хода клеточной дифференцировки и пролиферации.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выяснить, участвуют ли негистоновые белки MENT и НР1 в организации хроматина в клетках крови G. gallus на примере глобинового домена генома.

Для этого в ходе исследования предполагалось выполнить следующие задачи:

1. Оценить наличие вариантов белка НР1 в клетках крови G. gallus на разных стадиях их дифференцировки.

2. Используя методику иммунопреципитации хроматина, оценить, соответствуют ли последовательности ДНК, взаимодействующие с белком MENT, деконденсированному, конденсированному или пограничным участкам хроматина.

3. Исследовать, приводит ли экспрессия белка MENT в культуре клеток NIH ЗТЗ к изменению уровня ацетилирования и метилирования гистонов.

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе впервые была разработана методика формальдегидной фиксации и иммунопреципитации хроматина антителами к белку MENT. С использованием данной методики было картировано взаимодействие белка MENT с последовательностями ДНК в составе ß-глобинового локуса. В настоящей работе было впервые показано, что количество всех вариантов белка НР1 в ядрах клеток крови убывает в течение эмбрионального развития. Это позволяет заключить, что тотальная компактизация хроматина в клетках крови на конечных стадиях дифференцировки происходит не засчет белка НР1, а при участии белка MENT. ч

Полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию общих механизмов эпигенетической регуляции клеточной дифференцировки. Данные о белковых факторах, участвующих в дифференцировке клеток на уровне крупномасштабной компактизации хроматина и репрпессии генов, могут быть использованы при разработке потенциального подхода к лечению онкологических заболеваний, обусловленных нарушением нормального хода клеточной дифференцировки и пролиферации.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались или были представлены в виде стендовых сообщений на следующих международных конференциях: "22nd Summer Symposium in Molecular biology", Мейн Кампус, США, 2003; " Keystone Symposia", Санта Фе, США, 2002; "DNA in chromatin: at the frontiers of Biology, Biophysics and Genomic", Аркахон, Франция, 2002; "Chromatin Structure and Dynamics: State-of-the-Art Conference", Бетезда, США, 2002.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение» и «Выводы». Работа изложена на 104 страницах и содержит 17 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 137 публикаций.

Содержание работы

1. Белок MENT, но не гетерохроматиновый белок НР1, накапливается в клетках крови на конечных стадиях дифференцировки.

Гетерохроматиновый белок НР1 является консервативным многофункционалным хроматинсвязывающим белком, обнаруженным в ядрах клеток большинства эукариот.. Была показана его роль в сайленсинге генов, обусловленном компактизацией хроматина. Выделяют три изоформы белка НР1: а, р и у; для каждой из них характерна определенная картина распределения в ядре. HP la наиболее распространен в составе околоцетромерного гетерохроматина, НР1Р диффузно распределен по нуклеоплазме, а НР1у в основном локализован в эухроматине. Все изоформы незначительно отличаются по последовательности аминокислот, степень гомологии между ними составляет в среднем 95%. В структуре белков НР1 выявляют 3 функциональных домена, в том числе N-концевой хромодомен. Хромодомен связывается с гистоном НЗ, метилированным по положению Lys9. Показано, что именно так белок НР1 связывается с хроматином.

Поскольку в процессе дифференцировки клеток крови наблюдается резкое увеличение количества гетерохроматина, на первом этапе работы мы сравнили количество всех трех изоформ белка НР1 à пролиферирующих и дифференцированных клетках крови G. gallus. Параллельно проводилось наблюдение уровня гетерохроматинового белка MENT (Myeloid and Erythroid Nuclear Termination stage-specific protein). Последний был выбран, потому что ранее было показано, что именно этот белок накапливается в

4

дифференцированных клетках крови и способен вызывать конденсацию хроматина in vivo и in vitro. Таким образом, белок MENT является очевидным кандидатом в факторы, регулирующие компактизацию хроматина в процессе клеточной дифференцировки.

Для сравнения использовались равные количества образцов из ядер клеточной линии HD13 промиелоцитов цыпленка, 12-дневных эмбриональных эритроцитов, зрелых эритроцитов и лимфоцитов. Количество вариантов а, Р, и у белка НР1 и белка MENT оценивалось методом Western-гибридизации с антителами к вышеуказанным белкам (Рис. 1). В ядрах клеток линии HD13 и 12-дневных эмбриональных эритроцитов были обнаружены изоформы аир белка НР1, а НР1у определялся только в ядрах HD13. В отличие от недифференцированных клеток крови в экстрактах ядер зрелых эритроцитах и лимфоцитах уровень белка НР1 был либо низким (HPIP), либо неопределимым данным методом (НР1а и НР1у). Что касается белка MENT, его уровень оказался низким в ядрах клеток HD13 и эмбриональных эритроцитов, и высоким в зрелых клетках крови. Очевидно, что в процессе дифференцировки клеток крови G. gallus уровень белка НР1 падает, тогда как, как и было показано ранее, уровень белка MENT возрастает. Таким образом, белок MENT, но не НР1, можно рассматривать как фактор конденсации хроматина в зрелых клетках крови.

2. Уровень метилирования гистона НЗ не меняется в процессе созревания клеток крови.

Ранее было показано, что метилирование гистона НЗ по положению Lys9 является первичным сигналом для взаимодействия хроматина с белком НР1 и последующего перехода активного хроматина в гетерохроматин. Также известно, что повышенный уровень метилированного гистона НЗ в составе хроматина характерен для молчащих участков генома. На основании данных фактов следующим этапом работы было оценить уровень метилирования гистона НЗ по положению Lys9 в клетках крови G. gallus на разных стадиях

Рисунок 1. Гетерохроматиновые белки клеток крови G. gallus.

Белки ядерных экстрактов клеток HD-13, эмбриональных эритроцитов, зрелых эритроцитов и лимфоцитов идентифицировали методом Western-гибридизации с антителами к MENT, HP la, HPlp и HPly.

дифференцировки. Уровень метилирования оценивался методом Western-гибридизации с антителами к диметилированному (анти-НЗме2К9) и триметилированному (анти-НЗмеЗК9) по положению Lys9 гистону НЗ (Рис. 2), а также методом иммунофлуоресцентной микроскопии (Рис. 3). Известно, что триметилированный, но не диметилированный гистон НЗ характерен для перицентромерного конститутивного хроматина. Было показано, что уровень ' как диметилированного, так и триметилированного гистона НЗ остается неизменным как в пролиферирующих, так и в зрелых клетках крови (Рис. 2). Эго соответствует данным о метаболической стабильности метилированного гистона НЗ. Важно отметить, что картина распределения белка MENT в ядрах клеток крови G. gallus совпадает с картиной распределения только диметилированной по положению Lys9 модификации гистона НЗ,

3. Разработка метода формальдегидной фиксации и иммунопреципнтации хроматина антителами к белку MENT.

Метод формальдегадной фиксации и иммунопреципнтации хроматина (ChIP) является широко используемым подходом к изучению ДНК-белковых взаимодействий в хроматине. В основе метода лежит фиксация ДНК-белкового взаимодействия в хроматине при помощи формальдегида и дальнейшая

6

3

2 §

ю X О

анти-MENT анти-HPla анти-HPip анти-HPly

Рисунок 2. Уровень метилирования гистона НЗ в клетках крови С. gallus.

Электрофоретическое разделение ядерного материала клеток крови С. gallus, белки окрашены по Кумасси, гистоны обозначены; ^У^егп-гибридизация того же материала с антителами к ди- и триметилированному гистону НЗ по положению Ьуз9.

s я

I

а

s£|f s£|f

d "S il Й 'S I 4

я д <*7 H я д <*Г _я д &

21,5 — 14,4 —

Кумасси R-25Û анти-НЗме2К9 анти-НЗмсЗК9

иммунопреципитация фиксированных комплексов с антителами к интересующему белку. Далее полученные последовательности ДНК могут быть проанализированы методом ПЦР или ДНК-ДНК гибридизации. Поскольку MENT характерен для зрелых клеток крови птиц, была поставлена задача картировать его взаимодействие с хроматином in situ методом ChIP с последующей идентификацией выявленных участков ДНК методом ДНК-ДНК гибридизации с пробами из различных участков из Р-глобинового локуса G. gallus. Данный локус является универсальной генетической системой для

изучения свойств хроматина, поскольку несет в себе его основные структурные элементы: гетерохроматин, активный эухроматин и пограничные участки (инсуляторы) (Рис. 4).

Рисунок 3. Уровень метилирования гистона НЗ в клетках крови G. gallus.

Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер эмбриональных эритроцитов, зрелых эритроцитов и лимфоцитов кур антителами к ди- и три- метилированным гистонам и белку MENT.

В ходе работы были подобраны условия для проведения формальдегидной фиксации хроматина в ядрах куриных эритроцитов и лимфоцитов: температура и продолжительность формальдегидной фиксации; а также условия проведения иммунопреципитации хроматина за антитела к белку MENT. Последовательности ДНК в составе ß-глобинового кластера были проанализированы и приведены в соответствие с ранее составленной картой домена (Litt et al, 2001).

Для основных экспериментов нами были подобраны 12 проб (Табл. № 1). Пробы 1-4 соответствуют 5' границе ß-глобинового локуса G.gallus, причем проба №1 несет последовательность из области конденсированного хроматина, пробы 2 и 3 находятся по 5' и 3' сторону от 5' HS4 инсулятора, а проба № 4 соответствует области LCR ß-глобинового локуса (Рис. № 4). Пробы 5-7

8

СЕ-12 АЕ Lym

представляют кодирующие и не кодирующие последовательности Р-глобиновых генов. Пробы 8-12 соответствуют 3' границе р-глобинового локуса. Пробы 8 и 9 лежат 5' от 3' инсулятора (3'HS), проба № 10 в некодирующей области гена обонятельного рецептора, а пробы 11 и 12 в области 3' от Р-глобинового домена генома G.gallus. Пробы для гибридизации были подобраны так, чтобы не содержать повторов (Рис. 3, Табл.1).

Количество белка MENT, связанного с теми или иными участками локуса, выражалось в единицах относительного обогащения. Для сравнения в экспериментах также оценивалось относительное обогащение иммунопреципитированного материала последовательностями в составе гена овальбумина (проба Ov). Ген овальбумина не экспрессируется в эритроидной линии клеток.

5 ' Инсулятор 3 ' Инсулятор

Констит

о

ICTCDOXI

рецептора

_ , Конститутивный „ ^

1 ен фолатиогогете ^^ оматин р-глооиновые гены Ген ооопятелыюго

" * рецептора

Ч I

II , Р ß" ßA, е I

| Л ■■■■ ffi

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Устойчивость к ДНКазе I

Пробы для

т.п.н.

гибридизации 1234 5 6 7 '89 101112

Рисунок 4. Схематическое изображение р-глобинового генного кластера с основными генетическими элементами в составе домена. Нумерация пар оснований по (Litt et al, 2001). Вертикальные стрелки указывают положение участков гиперчувствительности к ДНКазе I, включая участки, соответствующие 5' и 3' инсуляторам.

4. Распределение белка MENT вдоль Р-глобинового домена эритроцитов G. gallus.

Картирование взаимодействия белка MENT с элементами в составе Р-глобинового домена в куриных эритроцитах, выявило значительные различия в количестве белка внутри и за пределами его пограничных элементов (Рис. 5). Максимальный уровень MENT наблюдался для устойчивого к ДНКазе I участка гетерохроматина, отделяющего р-глобиновый домен от гена фолатного рецептора (проба 1). Для проб № 1 и 4 уровень относительного обогащения различался более, чем в 100 раз. Два локальных минимума уровня MENT наблюдались в районе 5' и 3' пограничных элементов домена (проба 4 и 8, соответственно). Уровень MENT за пределами 3' границы р-глобинового домена, в районе неактивного в данной линии клеток гена обонятельного рецептора (пробы 11-12) оказался выше, чем внутри активного генного кластера (пробы 5-7), но ниже, чем в области конститутивного гетерохроматина. Таким образом, в районе 3' пограничного элемента уровень белка MENT возрастает менее резко, достигая около 60% от максимального значение (проба №1) в области 3' границы гена обонятельного рецептора (проба № 12). Приведенные выше данные позволяют сделать вывод, что MENT-это первый белок, конденсирующий хроматин, чье распространение на активные участки хроматина ограничивается пограничными элементами позвоночных.

№ ce U

м

S

PO

и «

я

[-

Проба №

Kb

анти-MENT

2 3 4 5

7 8 9 10 11 12

Рисунок 5. Распределение белка MENT вдоль р-глобинового домена G. gallus, метод иммунопреципитации хроматина . Вверху показано обогащение белком MENT для последовательностей в составе каждой пробы для гибридизации (отклонение показано для 3-ех повторов эксперимента). Ниже приведены результаты гибридизации последовательностей в составе связавшихся и не связавшихся фракций при иммунопреципитации комплексов MENT-ДНК антителами к MENT и неспецифической сывороткой.

Таблица. 1. Фрагменты ДНК, использовавшиеся в качестве зондов при гибридизации. Приведены размеры фрагментов, относительное расположение на карте р-глобинового домена генома б.^а/Ли, плазмиды, из которых они были получены, а так же рестрицирующие эндонуклеазы, использованные для получении.

Проба№ Размер п.н. На карте Сайты Рестрикции Плазми-да Источник

1 590 1782318413 1^11-ВатН1 pCBGD M. Reitman (NIH, Bethesde)

2 1300 1926720567 Крп1-Крп1 pCBGC To же

3 1200 2354324453 ЗврЬБат Н1 pCBGC To же

4 900 2445325356 ВатН1-ВатН1 pCBGB To же

5 1340 3226333603 МврЬМвр! pCBG4 Villeponteau et al (1982)

6 517 3652737044 ЕсоШ-ЕсоШ pNIl Клонирована

7 1364 4027741641 \4spl-NlspI pCABGl Wood et al (1981)

8 1300 4778249168 Н1п(И11-Р811 pCBG 23 M. Reitman (NIH, Bethesde)

9 900 4923550245 КрпЬРвН pCBG23 To же

10 891 5268653861 ЕсоК1-ЕсоШ pNI3 Клонирована

11 500 5468655186 ВатШ-ЕсоЯ1 pCBG28 M. Reitman (NIH, Bethesde)

12 1100 5651267612 №о1-Ксо1 pCBG28 To же

Ov 910 2375-3285 [на карте гена) РуиН-РуцП pOvl2 O'Malley

5. Распределение белка MENT вдоль ß-глобинового домена G. gallus повторяет распределение диметилированного гистона НЗ.

Ранее ряд лабораторий показали методом СЫР, что репрессированный хроматин 5' ß-глобинового домена G. gallus характеризуется пониженным уровнем ацетилирования гистонов НЗ и Н4 гистонов и повышенным уровнем метилирования гистона НЗ по положению Lys9. Поскольку в нашей работе мы использовали другие условия ChIP, нежели в предыдущих работах, было решено подтвердить, что участки обогащенные MENT, соответствуют участкам повышенного метилирования и пониженного ацетилирования гистонов. Для этого фиксированный формальдегидом материал ядер эритроцитов иммунопреципитировали антителами к гистону НЗ, метилированному по положению Lys9, и антителами к гистону НЗ, ацетилированному по тому же положению. Далее полученную ДНК анализировали гибридизацией с последовательностями ДНК в составе конститутивного гетерохроматина, 5' пограничного элемента домена и активного хроматина (пробы 1, 4 и 7, соответственно).

Сравнение уровня MENT и модифицированных гистонов на указанных участках ß-глобинового домена показало, что гетерохроматиновый участок обогащен MENT и метилированным гистоном НЗ, а уровень ацетилированного гистона НЗ там очень низок (Рис. 6). Обратная картина наблюдалась для 5' пограничного элемента домена, для него было характерно обогащение ацетилированным гистоном НЗ, а уровень MENT и метилированного гистона НЗ там был незначителен. Приведенные данные коррелируют с данными, полученными ранее в других группах. В середине ß-глобинового домена количество белка MENT достигает локального пика в районе гена рА-глобина, что совпадает с повышенным обогащение диметилировнным гистоном НЗ на этом участке домена. Проведенное ранее другими группами картирование распределения метилированных гистонов вдоль ß-глобинового домена G.gallus показало аналогичную картину распределения (Litt et al, 2001).

Интересно отметить, что уровень MENT и метилированного гистона НЗ в составе гетерохроматинового участка оказался выше, чем для репрессированного в эритроцитах гена овальбумина. Таким образом, накопление белка MENT скорее отражает уровень компактизации хроматина, нежели уровень генной репрессии.

Картирование триметилированного гистона НЗ вдоль (3-глобинового домена не выявило никакой согласованности с картиной распределения белка MENT. Эти данные согласуются с данными, полученными методом иммунофлуоресценции (Рис. № 3), которые показывают, что локализация белка MENT в ядрах куриных эритроцитов не совпадает с локализацией гистона НЗ, триметилированного по положению Lys9. Таким образом, приведенные факты свидетельствуют о том, что картина распределения белка MENT в куриных эритроцитах совпадает с картиной распределения диметилированных гистонов НЗ.

НЗАс

Рисунок 6. Относительное обогащение белком MENT, метилированным и ацетилированным гистоном НЗ гетерохроматина (проба №1), 5' пограничного элемента (проба № 4), (З-глобннового гена (проба№ 7) и гена овальбумина (Ov).

6. Экспрессия белка MENT в культуре клеток NIH ЗТЗ не приводит к изменению уровня ацетилирования и метилирования гистонов.

Ранее в нашей лаборатории было показано специфическое взаимодействие белка MENT с N-концевым доменом гистона НЗ in vitro. Данный факт, а также колокализация белка MENT и диметилированного гистона НЗ в эритроцитах G. gallus (Рис. 2) заставили предположить, что белок MENT способен направлять распределение метилированных гистонов in vivo. На основе линии NIH ЗТЗ в нашей лаборатории была получена клеточная линия, постоянно экспрессирующая белок MENT (3T3/MENT-63). Известно, что линия NIH3 ТЗ легко переходит из пролиферущего состояния в состояние покоя в результате контактного ингибирования. Поскольку белок MENT в норме присутствует в клетках позвоночных именно в состоянии покоя, мы решили оценить его влияние на уровень ацетилирования и метилирования гистонов, как в пролиферирующем состоянии, так и в состоянии покоя.

Уровень метилирования и ацетилирования оценивался методом Western-гибридизации с антителами к диметилированному (анти-НЗме2К9), триметилированному (анти-НЗмеЗК9), ацетилированному (анти-НЗАсК9), по положению Lys9 гистону НЗ и ацетилированному (анти-Н4АсК9) по положению Lys 12 гистону Н4 (Рис. 7). В ходе работы не было обнаружено значимого изменения уровня метилирования и ацетилирования гистонов в линии клеток, экспрессирующих MENT по сравнению с контрольными клетками линии NIH3 ТЗ. Также уровень модицированных гистонов в пролиферирующих клетках не отличался от уровня в клетках в состоянии покоя. Можно предположить, что все изменения в структуре хроматина вызванные экспрессией белка MENT, связаны с перераспределением модифицированных гистонов вдоль различных участков хроматина, но не с изменением их количества (Рис. № 8).

МЕНТ-63 NIH/3T3

Р q Р q

MENT

НЗМе2К9

НЗМеЗКЭ

mm m m нзАске

Н4АсК12

Рисунок 7. Уровень метилирования и ацетилирования гистонов НЗ и Н4 в клетках линии NIH3 ТЗ. Western-гибридизация ядерного материала клеток линии 3T3/MENT-63 и NIH3 ТЗ с антителами к гистону НЗ, ди- и триметилированному по положению Lys9, гистону НЗ, ацетилированному по положению Lys9 и гистону Н4, ацетилированному по положению Lys 12 .

Мы предполагаем, что in vivo белок MENT одновременно взаимодействует с конститутивным гетерохроматином и репрессированным эурохроматином, отмеченным гистоном НЗ, диметилированным по положению Lys9 (Рис. № 8). MENT кооперативно связывается с хроматином, формирует мостики между тяжами хроматина, тем самым пространственно сближая гетерохроматин и репрессированный эухроматин. Таким образом, MENT распространяется из фокусов полимеризации в гетерохроматине на репрессированный эухроматин, вызывая его конденсацию. Активные домены генома, отмеченные ацетилированными гистонами, защищены от распространения белка MENT пограничными элементами.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют заключить, что белок MENT является фактором, определяющим репрессию хроматина в процессе дифференцировки клеток крови.

Рисунок № 8. Модель конденсации хроматина в процессе клеточной дифференцировки, регулируемой белком MENT, пограничными элементами и модификациями гистонов. На рисунке обозначены нуклеосомы, содержащие метилированные (Me) и ацетилированные (Ас) гистоны.

выводы.

1. Все варианты белка НР1 обнаружены в промиелоцитах и эмбриональных эритроцитах G. gallus. В зрелых эритроцитах и лимфоцитах G. gallus варианты HP 1а и НР1у не определены, количество варианта HPlp значительно уменьшается в процессе дифференцировки клеток крови.

2. Максимальный уровень белка MENT на участках р-глобинового домена генома в эритроцитах G. gallus соответствует области гетерохроматина, минимальный - участкам в районе 5' и 3' пограничных элементов домена. *

3. Распределение белка MENT вдоль р-глобинового домена G. gallus аналогично распределению диметилированных гистонов и взаимнообратно распределению гистонов НЗ, ацетилированньгх по лизину в 9 положении.

4. Экспрессия белка MENT в культуре клеток NIH ЗТЗ не приводит к изменению уровня ацетилирования и метилирования гистонов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. N.E. Istomina, S.S. Shushanov, E.M. Springhetti, V.L. Karpov, I.A. Krasheninnikov, K. Stevens, K.S. Zaret, P.B. Singh, S.A. Grigoryev. (2003) Insulation of the p-globin chromosomal domain from a chromatin-condensing protein MENT. Mol Cell Biol. 23,6455-6468.

2. E.M. Springhetti, N.E. Istomina, J.C. Whisstock, T. Nikitina, C.L. Woodcock, S.A. Grigoryev. (2003) Role of the M-loop and reactive center loop domains in the folding and bridging of nucleosome arrays by MENT. J Biol Chem. 278, 43384-43393.

3. S.Grigoryev, N.Istomina, E.Springhetti, S. Shushanov, E.Popova. (2003) Role of histone H3 Lysine 9 methylation in developmentally regulated chromatin condensation. Abstracts of 22"'' Summer Symposium in Molecular biology. Main Campus, USA, July 30- August 2

4. N.E. Istomina, S.S. Shushanov, S.A. Grigoryev. (2002) Role of insulators and histone acetylation in confining a chromatin condensing protein, MENT, to heterochromatin. Abstracts of Keystone Symposia, Santa Fe, USA, January 26-31.

5. S.A. Grigoryev, E.S. Springhetti, N.E. Istomina, S.S. Shushanov. (2002) Chromatin condensation by MENT, mechanism and regulation by histone acetylation. Abstract book of DNA in chromatin: at the frontiers of Biology, Biophysics and Genomics, Arcachon, France, March 23-29.

6. N.E.Istomina, S.S.Shushanov, V.L. Karpov, I.A. Krasheninnikov, S.A.Grigoryev. (2002) Insulation of the Chicken p-globin Domain from a Chromatin-Condensing Protein, MENT. Abstracts of Chromatin Structure and Dynamics: State-of-the-Art Conference, NIH, Bethesda, USA, May 8-10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Истомина, Наталья Евгеньевна

Оглавление.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Структура хроматина и транскрипция.

1.1. Регуляция транскрипции на разных уровнях организации хроматина.

1.2. Общая характеристика доменов генома.

1.3. в-глобиновый генный кластер кур.

1.4. Отличительные черты и функции гетерохроматина.

2. Факторы, определяющие компактизацию хроматина.

2.1. Линкерные гистоны.

2.2. Гистоновый код.

2.3. Негистоновые белки хроматина позвоночных.

3. Генетические элементы на границах активного и неактивного хроматина.

3.1. Инсуляторы, как антагонисты энхансеров.

3.2. Инсуляторы. как барьерные элементы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Реактивы.

2. Коммерческие наборы.

3. Антитела.

4. Приборы и оборудование:.

5. Составы основных растворов.

6. Линии клеток.

6. Выделение ядер клеток.

8. Генно-инженерные методы.

8.1. Полимеразная цепная реакция ЩЦР).

8.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование.

9. Электрофоретические методы.

9.1. Электрофорез белков в ПААГ.

9.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

10. \Уе51егп-гибридизация.

11 Формальдегидная фиксация и иммунопреципитация хроматина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Оценка количества белка MENT и белков НР1, клетках крови на конечных стадиях дифференцировки.

2. Оценка уровня метилирования гистона НЗ в клетках крови на конечных стадиях дифференцировки.

3. Фиксация и иммунопреципитация хроматина клеток крови Gallus sallus.

3.1. Подбор условий для фиксации и иммунопреципитации хроматина при помощи белка MENT.

3.2. Подбор последовательностей ДНК для зондов, использованных в гибридизации.

3.3. Распределение белка MENT вдоль ß-глобинового домена G.gallus.

3.3.1. Распределение белка MENT вдоль ß-глобинового домена в эритроцитах G. gallus.

3.3.2. Распределение белка MENT вдоль ß-глобинового домена в лимфоцитах G.gallus.

4. Сравнение картины распределения белка MENT с картиной ацетилирования и метилирования гистонов вдоль ß-глобинового домена генома Gallus sallus.

5. Влияние экспрессии белка MENT в культуре клеток NIH ЗТЗ на уровень ацетилирования и метилирования гистонов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли негистоновых белков в организации хроматина на границах β-глобинового домена генома Gallus Gallus"

Геном эукариот упакован в ДНК-белковый комплекс - хроматин, включающий всебя гистоны и другие ядерные белки. Выделяют два основных типа хроматина,которые отличает уровень комнактизации ДНК: активный и менее компактныйэухроматин, а также конденсированный гетерохроматин. В основном гетерохроматинсодержит репрессированные гены. В процессе клеточной дифференцировки, когдаосновная часть генома неактивна, большинство генов входят в состав гетерохроматина,однако ряд генов все же сохраняют свою экспрессию. Одним из интереснейшихаспектов формирования гетерохроматина является тот факт, что он не распространяетсвое репрессирующее влияние на гены, специфично транскрибирующиеся в клеткахопределенного типа, на данном этапе развития.Примером эпигенетической регуляциии экспрессии генов в процессе развитияявляется регуляциии экспрессии р-глобинового локуса кур. Это участок активногохроматина размером 30 тысяч пар оснований, отделенный от конденсированногохроматина так называемыми пограничными элементами или инсуляторами. Известно,что репрессированный хроматин характеризуется пониженным уровнемацетилирования гистонов и повышенным уровнем метилирования гистона НЗ, поположению Lys9. Наиболее изученным негистоновым маркером гетерохроматинаявляется гетерохроматиновый белок НР1, способный связываться только сметилированным гистоном НЗ. Ранее в нашей лаборатории был описан еще один белокгетерохроматина - MENT (от Myeloid and Erythroid Nuclear Termination stage-specificprotein). OH накапливается в клетках крови птиц на конечных стадияхдифференцировки, связывается с репрессированным хроматином и вызывает егоконденсацию.Данная работа была направлена на определение негистоновых белков,участвующих в образовании конденсированного хроматина на границах (3-глобиновогодомена и изучение их роли в этом процессе. Во время выполнения данной работы былопоказано, что уровень всех изоформ белка НР1 в зрелых клетках крови кур (Gallusgallus) незначителен, а значит, данный белок не может являться фактором конденсациихроматина на конечных стадиях дифференцировки. Было показано, что количествобелка MENT нарастает в процессе дифференцировки клеток крови, что делает егоочевидным кандидатом в факторы, определяющие репрессию хроматина в процессесозревания клеток крови. Нри выполнении данной работы бьшо показано, чтораспространение белка MENT вдоль Р-глобинового домена совнадает с картинойраспределения диметилированного гистона НЗ и обратно картине распределенияацетилированных гистонов.Целью данной работы было выяснить, участвуют ли негистоновые белки MENTи НР1 в организации хроматина в клетках крови G. gallus на примере глобиновогодомена генома.Для этого в ходе исследования предполагалось выполнить следующие задачи:1. Оценить наличие вариантов белка НР1 в клетках крови G. gallus наразных стадиях их дифференцировки.2. Используя методику иммунопреципитации хроматина, оцепить,соответствуют ли последовательности ДНК, взаимодействующие сбелком MENT, деконденсированному, конденсированному илипограничным участкам хроматина.3. Исследовать, приводит ли экспрессия белка MENT в культуре клетокNIH ЗТЗ к изменению уровня ацетилирования и метилированиягистонов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Истомина, Наталья Евгеньевна

выводы

1. Все варианты белка НР1 обнаружены в промиелоцитах и эмбриональных эритроцитах G.gallus. В зрелых эритроцитах и лимфоцитах G.gallus варианты HP 1а и НР1у не определены, количество варианта HP 1р значительно уменьшается в процессе дифференцировки клеток крови.

2. Максимальный уровень белка MENT на участках Р-глобинового домена генома в эритроцитах G. gallus соответствует области гетерохроматина, минимальный - участкам в районе 5' и 3' пограничных элементов домена.

3. Распределение белка MENT вдоль р-глобинового домена G.gallus аналогично распределению диметилированных гистонов НЗ и взаимнообратно распределению гистонов НЗ, ацетилированных по лизину в 9 положении.

4. Экспрессия белка MENT в культуре клеток NIH ЗТЗ не приводит к изменению уровня ацетилирования и метилирования гистонов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Истомина, Наталья Евгеньевна, Москва

1. Allis C., Gasser S. 1998. Chromosomes and expression mechanisms New excitement over an old word: 'chromatin. Curr Opin Gent Dev 8:137-139.

2. Antes T.J, Namciu S.J, Fournier R.E.K, Levy-Wilson B. 2001. The 5' boundary of the human apolipoprotein B chromatin domain in intestinal cells. Biochemistry 40: 6731-6742.

3. Arney K.L, Fisher A.G. 2004. Epigenetic aspects of differentiation. J Cell Science 117:4355-4363.

4. Ausio J. 2000. Are linker histones (histone HI ) dispensable for survival? Bioessaya 22: 873-877.

5. Baggin M.D. 1999. Ultraviolet cross-linking assay to measure sequence-specific DNA binding in vivo. Meth Enzym 304: 496-515.

6. Bannister A.J, Zegerman P, Patridge J.F, Miska E.A, Thomas J.o, Allshire R.C, Kouzarides T.2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on hisotne H3 by the HP1 chromodomain. Nature 410:120-124.

7. Barath M.M, Chandra N.R, Rao M.R. 2003. Molecularmodeling of the chromosomal particle. Nucleic Acids Res 31: 4264-4274.

8. Belikov S, Preobrazhenskaya O, Karpov V. 1999. Protein image hybridization: mapping and positioning DNA-protein contacts along DNA. Methods in Enzymology 304: 600-612.

9. Bell A.C, Felsenfeld G. 2000. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 405: 482-485.

10. Bell A.C, West A.G, Felsenfeld G. 1999. The protein CTCF is required for the enhancer-blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98: 387-396.

11. Bellard M., Kuo V.N., Dretzen G., Chambon. 1980. Differential nuclease sensitivity of the ovalbumen and beta-globin chromatin regions in erythrocytes and oviduct cells of laying hen. Nucleic Acids Res 8: 2737-2750.

12. Bi X., Braunstein M., Shei G.J., Broach J.R. 1999. The yeast HML I silencer defines a heterochromatin domain boundary by directional establishment of silencing. Proc Natl Acad Sci 96: 11934-11939.

13. Botquin V., Hess H., Fuhrmann G., Anastassiadis C., Gross M.K., Vriend G., Scholer H.R. 1998. New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct4 and Sox2. Genes Dev 12: 2073-2090.

14. Braunstein M., Rose A.B., Holmes S.G., Allis C.D., Broach J.R. 1993. Transcriptional silencing in yeast is associated with reduced nucleosome acetylation.Genes Dev 7: 592-604

15. Bruns G.A., Ingram V.M. 1973. The erythroid cells and haemoglobins of the chick embryo. Philos. Trans. R. Soc Lond B Biol Sci 266: 225-305.

16. Brutlag D., Schlehuber C., Bonner J. 1969. Properties of formaldehyde-treated nucleohistone. Biochemestry 8:3212-3218.

17. Burgess-Beusse B., Farrel C., Gaszner M., Litt M., Mutskov V., Recillas-Targa F., Simpson M., West A., Felsenfeld G. 2002. The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin. Proc Nat. Acad Sci 99,: 1643316437.

18. Burley S.K, Clark K.L, Ferre-D'Amare, Kim J.L., Nikolov D.B. 1993. X-ray crystallographic studies of eukaryotic transcription factors. Cold Spring Harbor Symp 58: 123-132.

19. Chen H., Lin R.J., Xie W., Wilpitz D, Evans R.M. 1999.Regulation of hormone-induced histone hyperacetylation and gene activation via acetylation of an acetylase. Cell 98: 675-686.

20. Chung J.H., Bell A.C., Felsenfeld G. 1997. Characterization of the chicken beta-globin insulator. Proc Natl Acad Sci USA 94:575-580.

21. Chung J.H., Bell A.C., Felsenfeld G. 1997.Charaacterization of the chicken (3-globin insulator. Proc Natl Acad Sci USA 94:.9072-9077.

22. Chung J.H., Whiteley M., Felsenfeld G. 1993. A 5' element of the chicken p-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74: 505-514.

23. Dedon P.C., Soults J.A., Allis C.D., Gorovsky M.A. 1991. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interations. Anal. Biocheml97: 83-90.

24. Dugaiczyk A., Woo S.L., Colbert D.A., Lai E.C., Mace M.L., O'Malley J.W., O'Malley B.W. 1979. The ovalbumin gene: cloningand molecular organization of the entire natural gene. Proc Natl Acad Sci USA 76:2253-2257.

25. Eissenberg J.C., Elgin S.C.R. Boundary function in the control of gene expression. 1991. Trends Genet 7: 335-340.

26. Elgin S.C.R. 1988. The formation and function of DNase I hypersensitive sites in the process of gene activation. J Biol Chem 263: 19259-19262.

27. Felsenfeld G., Boyes J., Chung J, Clark D., Stiditsky V. 1996. Chromatin structure and gene expression. Proc Natl Acad Sci 93:9384-9388.

28. Filippova G.N,, Thienes C.P., Penn B.H., Cho D.H., Hu Y.J., Moore J.M, Klesert T.R., Lobanenkov V.V., Tapscott S.J. 2001. CTCF-binding sites flank CTG/CAG repeats and form a methylation-sensetive insulator at the DM1 locus. Nat. Genet. 28, 335-343.

29. Fischle W, Wang Y., Allis C.D. 2003. Histone and chromatin cross-talk. Curr Opin Cell Biol 15: 172-183.

30. Gerasimova T.I., Byrd K., Corces G. 2000.A chromatin insulatordetermines the nuclear localization of DNA. Mol Cell.6: 1025-1035.

31. Ghirlando R., Litt M.D., Prioleau M.N, Recillas-Targa F, Felsenfeld G. 2004. Physical properties of a genomic condensed chromatin fragment. J Mol Biol 336: 597-605.

32. Gilbert N, Boyle S, Fiegler H, Woodfine K., Carter N.P, Bickmore W.A. 2004. Chromatin architecture of the human genome:gene-rich domains are enriched in open chromatin fibers. Cell 118:555-566.

33. Gilbert N, Boyle S, Sutherland H, Heras J, Allan J, Jenuwein T, Bickmore W. 2003. Formation of facultative hetrochromatin in the absence of HP1. EMBO J 22(20): 5540-5550.

34. Grewal S.I, Moazed D. 2003. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science 301:597-605.

35. Grigoryev S.A, Bednar J, Woodcock C.L. 1999 MENT, a heterochromatin protein that mediates higher order chromatin folding, is a new serpin family member. J Biol Chem 274: 5626-5636.

36. Grigoryev S.A, Solovieva V.O, Spirin K.S, Krasheninnikov I.A. 1992. A novel nonhistone protein (MENT) promotes nuclear collapse at the terminal stage of avian erythropoiesis. Exp Biol Chem 198; 268-275.

37. Grigoryev S.A, Spirin K.S, Krasheninnikov I.A. 1990. Loosened nucleosome linker folding in transcriptionally active chromatin of chicken embryo erythrocyte nuclei. Nycleic Acids Res 18:7397-7406.

38. Grigoryev S.A, Woodcock C.L. 1999. Chromatin structure in granulocytes. A link between tight compaction and accomulation of a heterohromatin-associated protein (MENT). J Biol Chem 273 :3082-3089.

39. Gross S.G, Garrard W.T. 1988. Nuclease hypersensitive sites in chromatin. Ann Rev Biochem 57: 159-197.

40. Hamiche A, SchultzP, Ramakrishna V, Oudet P, Prunell A. 1996. Linker histone-dependent DNA structure in linear mononucleosomes. J Mol Biol 257: 30-42.

41. Hark A.T, Schoenherr C.J, Katz D.J, Ingram R.S, Levorse J.M, Tilghman S.M. 2000. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the HI 9/Tgf2 locus. Nature 405: 486-489.

42. Harvey A, Downs J. 2004. What functions do linker histones provide. Mol Microbiol 5: 771-775.

43. Hassan A.H, Neely K.E, Workman J.L. 2001. Histone acetyltransferase complexes stabilize SWI/SNF binding to promoter nucleosomes. Cell 104: 817-827.

44. Hebbes T.R, Clayton A.L., Thorne A.W, Crane-Robinson C. 1994. Core histone hyperaeetylation eomaps with generalized Dnase I sensitivity in the chicken (3-globin chromosomal domain. EMBO 13:1823-1830.

45. Holmgren C., Kanduri C., Dell G., Mizuno A., Mukhopadhya R., Kanduri M., Lobanenkov V., Ohlsson R. 2001. CpG methylation regulates the Igf2/H19 insulator. CurrBiol 11: 1128-1130.

46. Jackson V. 1999. Formaldehyde Cross-linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods 17 :125-139.

47. Jacobs S.A., Khorasanizadeh S. 2002. Structure of chromodomain bound to a lysine 9 dimethylated histone H3 tail. Science 295:2080-2083.

48. James T.C., Eissenberg J.C., Craig C., Dietrich V., Hobson A., Elgin S.C. 1989. Distribution pattern of HP1, a heterochromatin associated nonhistone chromosomal protein of Drosophila. Eur J Cell Biol 50: 170-180.

49. Jenuwein T., Allis C.D. 2001. Translating the histone code. Science 294: 1074-1080.

50. Jeong S., Pfeifer K. 2004. Shifting insulator boundaries. Nat Gen 36:10361037.

51. JimenezG., Griffiths S.D., Ford A.M., Greaves M.F., Enver T. 1992. Activation of the beta-globin locus control region precedes commitment to the erythroid lineage. Proc Natl Acad Sci USA 89:10618-10622.

52. Kamakaka R.T., Thomas J.O. 1990. Chromatin structure of transcriptionally competent and repressed genes. EMBO J 9: 3997-4006.

53. Kanduri C., Pant V., loukinov D., Pugacheva E, Qi C.F, Wolffe A., Ohlsson R., Lobanenkov V.V. 2000. Functional association of CTCF with the insulatorupstream of the H19 gene is parent of origin-specific and methylation-sensitive. CurrBiol 10: 853-856.

54. Karpov V.L, Preobrazhenskaya O.V, Mirzabekov A.D. 1984. Chromatin structure of hsp70 genes, activated by heat shock: selective removal of histones from the coding region and their absence from the 5' region. Cell 36: 423-431.

55. Kasinsky H.E.lewis J.D, Dacks J.B. Ausio J. 2001. Origin of HI linker histones. FASEB J 15: 34-42.

56. Kellum R, Elgin S.C.R. 1998. Chromatin boundaries: punctuating the genome. CurrBiol 8: R521-R524.

57. Kellum R, Schedl P. 1991. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64: 941-950.

58. Kellum R, Schedl P. 1992. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Moll Cell Biol 12: 2424-2431.

59. Kuo M, Allis C.D. 1999. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic protin:DNA associations in a chromatin enviroment. Methods. 19: 425-433.

60. Kuo M.H, Brownell J.E, Sobel R.E, Ranalli T.A, Cook R.G, Edmondson D.G, Roth S.Y, Allis C.D. 1996. Transcription-linked acetylation by Gcn5p of histones H3 and H4 at specific lysines. Nature 19: 269-272.

61. Kuo M.H., Zhou J, Jambeck P, Churchill M.E., Allis C.D. 1998. Histone acetyltransferase activity of yeast Gcn5p is required for the activation of target genes in vivo.Genes Dev 12 :627-639.

62. Lachner M, O'Carroll D, Rea S., Mechler K, Jenuwein T. 2001. Methylation of histone lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410. 116120.

63. Laemmly U.K. 1970. Cleavege of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

64. Lawson G.M., Knoll B.J., March C.J., Woo S.L., Tsai M.J., O'Malley B.W. 1982. Definition of 5' and 3' structural boundaries of the chromatin domain containing the ovalbumin multigene family.J Biol Chem 257: 1501-1507.

65. Leach et al., Nightingale K., Igarashi K., Levings P.P., Engel J.D., Becker P.B., Bungert J. 2001. Reconstitution of human ß-globin locus control region hypersensitive sites in the absence of chromatin assembly. Mol Cell Biology 21: 2629-2640.

66. Lewin B. Genes.//Oxford University Press. 1997.

67. Litt M.D., Simpson M., Gaszner M., Allis C.D., Felsenfeld G. 2001. Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293:2453-2455.

68. Litt M.D., Simpson M., Recillas-Targa F., Prioleau M.N., Felsenfeld G. 2001b. Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBO J 20: 2224-2235.

69. Magdinier F., Yusufzai T.M., Felsenfeld G. 2004. Both CTCF-dependent and independent insulators are found between the mouse T cell receptor a h Dadl genes. J Biol Chem 279: 25381-25389.

70. McGhee J. D., von Hippel P.H. 1975a. Formaldehyde as a probe of DNA structure. I. Reaction with exocyclic amino groups of DNA bases. Biocheestry 14:1281-1296.

71. McGhee J. D., von Hippel P.H. 1975b. Formaldehyde as a probe of DNA structure. I. Reaction with endocyclic amino groups of DNA bases.Biocheestry 14:1297-1303.

72. Meluh P.B., Koshland D. 1997. Budding yeast centromere composition and assembly as revealed by in vivo cross-linking. Genes Dev 15: 3401-3412.

73. Moss T., Dimitrov S.I., Houde D. 1997. UV-laser crosslinking of proteins to DNA. Methods 11: 225-234.

74. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenskaya T, Pirotta V, Georgiev P. 2001. Lossof insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. // Science 291: 495-4498.

75. Namciu S.J, Blochlinger K.B, Fournier R.E. 1998, Human matrix attachment regions insulate transgene expression from chromosomal position effects in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 18: 2382-8391.

76. Nielsen S.J, Schneider R, Bauer U.M, Bannister A.J, Morrison A, O'carrollD, Firestein R, Cleary M, Jenuwein T, Herrera R.E. Kouzarides. 2001. Rb targets histone H3 and HP1 to promoters. Nature 412:561-565.

77. O'Brien T, Wilkins R.C, Giardina C, Lis J.T. 1995. Distribution of GAGA protein on Drosophila genes in vivo. Genes. Dev 9: 1098-1110.

78. Ohlsson R, Renkawitz R, Lobanenkov V. 2001. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends Genet 17: 520527.

79. Oki M, Valenzuela L, Chiba T, Ito T, Kamakaka R.T. 2004. Barrier proteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. Moll Cell Biol 24: 1956-1967.

80. Orlando V. 2000. Mapping chromosomal proteins in vivo by fomaldehyde crosslinked-chromatin immunoprecipitation. TIBS 25: 99-104.

81. Orlando V, Jane E.P, Chinwalla V, Harte P.J, Paro R. Binding of Trithorax and Polycomb proteins to the bithorax complex: dynamic changes during early Drosophila embryogenesis. EMBO J 1998 17: 3621-3632.

82. Orlando V., Paro R. Mapping Polycomb-repressed domains in the bithorax complex using in vivo formaldehyde cross-linked chromatin. Cell 17: 11871198.

83. Orlando V., Strutt H., Paro R. 1997. Analysis of chromatin structure by in vivo formaldehyde cross-linking. Methods 11: 205-214.

84. Palmiter R.D., Brinster R.L. 1985. Transgenic mice. Cell 2: 343-5.

85. Parekh B.S., Maniatis T. 1999. Virus infection leads to localized hyperacetylation of histones H3 and H4 at the IFN-beta promoter. Mol Cell 3: 125-129.

86. Pikaart M.J., Recillas-Tagra F., Felsenfeld G.1998. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histone deacetylation and is prevented by insulators. Genes & Dev 12: 2852-2862.

87. Potts W., Tucker D, Wood H., Martin C. 2000. Chicken ß-globin 5'HS4 insulators function to reduce variability in transgenic founder mice. Biochem Biophys Res Commun 273:1015-1018.

88. Prioleau M., Nony P., Simpson M., Felsenfeld G. 1999. An insulator element and condensed chromotin region separate the chicken ß-globin locus from an independently regulated erythoid-specific folate receptor gene. EMBO J 18: 4035-4048.

89. Prioleau M.N., Nony P., Simpson M., Felsenfeld G. 1999. An insulator element and condensed chromatin region separate the chicken ß-globin locus from an independently regulated erythroid-specific folate receptor gene. EMBO J 18:2538-2550.

90. Pruss D., Gavin I.M., Melnik S., Bavykin S. 1999. DNA-protein cross-linking applications for chromatin studies in vitro and in vivo. Meth. Enzym 304: 516533.

91. Recillas-Targa F. 2000. The chicken a- and (3-globin gene domains and their chromatin organization. Cell Mol Biol Lett 5: 451-467.

92. Recillas-Targa F., Pikaart M.J., Burgess-Beusse B., Bell A.C., Litt M.D., West A.G., Gaszner M., Felsenfeld G. 2002. Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken beta-globin insulator are separable activities. EMBO J 22: 3113-3121,

93. Recillas-Targa F., Valadez-Grahal V., Farrell. C.M. 2004. Prospects and implications of using chromatin insulators in gene therapy and transgenesis. Bioessays 26: 796-807.

94. Reitman M., Felsenfeld G. 1990. Developmental regulation of topoisomerase II sites and DNase I-hypersensitive sites in the chicken beta-globin locus. Mol Cell Biol 10: 2774-2786.

95. Reitman M., Grasso J.A., Blumenthal R., Lewit P. 1993. Primary sequence and repetitive elements of the Gallus Gallus (chicken) (3-globin cluster. Genomics 18: 616-626.

96. Richards E.J., Elgin S.C.R. 2002. Epigenetic code for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell 108:489-500.

97. Rivella S., Callegari J.A., May C., Tan C.W., Sadelain M. 2000. The cHS4 insulator increases the probability of retroviral expression at random chromosomal integration sites. J Virol 74: 4679-4687.

98. Robinett C.C., O'Connor A., Dunaway M. 1997. The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes. Mol Cell Biol 17: 2866-2875.

99. Robinett C.C., O'Connor A., Dunaway M. 1997. The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes. Moll Cell Biol 10: 3195-3201.

100. Saitoh N, Bell A. C, Recillas-Tagra F, West A.G, Simpson M, Pikaart M. 2000. Felsenfeld G. Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken (3-globin domain. EMBO J 19: 2315-2322.

101. Sleckman B.P, Carabana J, Zhong X, Krangel M.S. 2001. Assessing a role for enhancer-blocking activity in gene regulation within the murine T-cell receptor a/p locus. Immunology 104: 11-18.

102. Solomon M.J, Larnes P.L, Varshavsky A. 1988. Mapping proteinDNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell 53: 937- 947.

103. Solomon M.J, Varshavsky A. 1985. Formaldehyde-mediated DNAprotein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structure.Proc Natl Acad Sci USA 82: 6470-6474.

104. Springhetti E.M, Istomina N.E, Whisstok J.C, Nikitina T, Woodcock C.L, Grigiryev S.A. 2003. Role of the M-loop and reactive center loop domains in the folding and bridging of ncleosome arrays by MENT. J Biol Chem 278(44):43384-43393.

105. Staines,D.M. and Thomas J.O. 1999. A sequence with homology to human HPFH-linked enhancer elements and to a family of G-protein linked membrane receptor genes is located downstream of the chicken beta-globin locus. Gene 234(2)345-352

106. Starck J, Sarkar R, Romana M, Bhargava A, Scarpa A.L, Tanaka M, Chamberlain J.W, Weissman S.M, Forget B.G. 1994. Developmental regulation of human gamma- and beta-globin genes in the absence of the locus control region. Blood 84: 1656-1665.

107. Strahl-Bolsinger S, Hecht A, Luo K, Grunstein M. 1997. SIR2 and SIR4 interactions differ in core and extended telomeric heterochromatin in yeast. Genes Dev 11: 83-93.

108. Struhl K. 1999. Fundamentally different logic of gene regulation in eukaryotes and prokaryotes.Cell .98: 1-4.

109. Sun F.L, Elgin S.C. 1999. Putting boundaries on silence. Cell 99: 459462.

110. Tanimoto K, Sugira A, Omori A, Felsenfeld G, Engel J.D, Fukumizu A. 2003. Human (3-globin locus control region HS5 contains CTCF- and developmental stage-dependent enhancer-blocking activity in erythroid cells. Cell Mol Biol 23: 8946-8952.

111. Thorvaldsen J.L, Duran K.L, Bartolomei M.S. 1998. Deletion of the H19 differentially methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2. Genes & Dev 12: 3693-3702.

112. Tulin A, Spradling A. 2003. Chromatin loosening by poly(ADP)-ribose polymerase (PARP) at Drosophila puff loci. Science 299 560-562.

113. Valadez-Graham V, Razin S.V, Recillas-Targa. 2004. CTCF-dependent enchancer blockers at the upstream of the chicken alpha-globin gene domain. Proc Natl Acad SciUSA 32: 1354-1362

114. Verreault A, Thomas J.O. 1993. Chromatin structure of the 3-globin chromosomal domain in adult chicken erythrocytes. Cold Spring Harb Symp Quant. Biol LVIII: 15-24.

115. Villenponteau V, Landes G.M, Pankratz m.J, Martinson H.G. The chicken (3 globin gene region. J Biol Chem 257:11015-11023.

116. Villeponteau B, Martinson H. 1981. Isolation and characterization f the coplete chicken P-globin gene region: frequent deletion of the adult P-globin genes.Nucleic Acids Res 9: 3731-3746.

117. Wang Y, DeMayo F.J, Tsai S.Y, O'Malley B.W. 1997. Ligand-inducible and liver-specific target gene expression in transgenic mice. Nat Biotechnol 15:239-243.

118. Webber A.L., Ingram R.S., Levorse J.M., Tilghamn S.M. 1998. Location of enhancers is essential for the imprinting of HI9 and Igf2 genes. Nature 391: 711-715.

119. Wei G.H., Liu D.P., Liang C.C. 2005. Chromatin domain boundaries: insulators and beyond. Cell Research 15: 292-300.

120. West A.G., Gaszner M., Felsenfeld G. 2002. Insulators:many functions, many mechanisms. Genes Dev 16: 271-288.

121. West A.G., Huang S., Gaszner M., Litt M.D., Felsenfeld G. 2004. Recruitment of histone modifications by USF proteins at a vertebrate barrier element. Mol Cell 16: 453-463.

122. Wolffe A.P. 1998. Packaging principle: how DNA methylation and histone acetylation control the transcriptional activity of chromatin. J Exp Zool 282: 239-244.

123. Wood W.I., Nickol J., Felsenfeld G. 1981. Repeated sequence organization and RNA Transcription map of the chicken adult |3-globin gene region. J Biol Chem. 256(4):1502-1505.

124. Wreggett K.A., Hill F., James P.S., Hutchings A., Butcher G.W., Singh P.B. 1994. A mammalian homologue of Drosophila heterochromatin protein 1 (HP1) is a component of constitutive heterochromatin. Cytogenet Cell Genet 66:99-103.

125. Yu W., Pant V., Chernukhin I., Whitehead J., Docquier F., Farrar D., Tavoosidana G., Mukhopadhyay R., Kanduri C. 2004. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation. Nat. Gen. 36,1105-1110.

126. Zhao K., Barolo S., Szymanski P., Levine M. 1996. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enchancer-promoter interactions in the Drosophila embryo.Denes Dev 10: 3195-3201.

127. Zhao K., Hart C.M., Laemmli U.K. 1995. Visialisation of chromosomal domains with boundatry element-associated factor BEAF-32. Cell 81: 879-889.

128. Zhong X.P., Krangel M.S. 1997. An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus. PNAS 94: 5219-5224.

129. Нактинис В.И., Малеева H.E., Санько Д.Ф., Мирзабеков А.Д. 1977. Два различных метода выделения ДНК с помощью цетавлона. Биохимия. 42: 1783-1790.

130. Постников Ю.И., Шик В.В., Белявский А.В., Крапко К.Р., Бродолин K.JL, Никольская Т.А.,Мирзабеков А.Д. 1991. Хромосомные белки в эмбриональных куриных эритроцитов в трансрипционно активных и неактивных генах. Мол Биол 23 1628-1691.

131. Искусственносинтезированныеолигонуклеотиды,использованные в данной работе.

132. Название Последовательность (5') Размер п.н.

133. Для определения нуклеотидной последовательности участка бета-глобинового домена, клонированного в вектор рСВвС. Соответствует позиции 20.041 на карте домена (Litt et al., 2001).bg20041F GAG GGG ATT TGG GCT CCC A 19

134. P501-1R CCA GCT CCC TCA GCC TGC T 19

135. Для определения нуклеотидной последовательности участка бета-глобинового домена, клонированного в вектор рСВвС. p501-2F GGA CTG CCC CAC TGT GCA A 19

136. P501-2R GCG GGG GAG GGA CGT AAT T 19

137. Для определения нуклеотидной последовательности участка бета-глобинового домена, клонированного в вектор рСВв28. p520-2F GAA GAG TAC TGG ТСС CAA GAC 21p520-lR AGA GCT TCA GGG AGT GGG AAA 21p520-lF ACC CCT CAA TCC ATA TCT CCC 21

138. Для определения нуклеотидной последовательности 3' участка бета-глобинового домена. Соответствует позиции 54.553 на карте домена 1.ttet al., 2001).bg54553F СТА TGG CAG TGG GAC TTC TCT G 22p520AR GCT CTT CTC CAA CCC CCT TAC А 22

139. Для амплификации и клонирования участка в 990 п.н. в составе бета-глобинового домена. Сответствует позициям 52.617 и 53.604 на карте домена (Litt et al., 2001).bg52617F CTG AAA АТС CAG CAC GGG AAG С 22bg53604R GCA GAT GAT CCC CAG TCC AAT С 22

140. Название Последовательность (5') Размер п.н.

141. Для определения нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, клонированных в векторе pCR 2.1 и pUCl 8 использовались универсальные праймеры:

142. М13 Прямой CTG GCC GTC GTT ТТА С М13 Обратный CAG GAA АСА GCT ATG АС

143. Генно-инженерные конструкции созданные и использованные в ходеработы. 1.Плазмида pNIl

144. На основе: pCR 2.1 vector (Invitrogen)

145. Содержит: 5'участок бета Н гена из ß-глобинового генного кластера G.gallus Размер фрагмента: 517 п.н. (Соответствует позициям 36.527-37.044 на карте домена (Littetal, 2001))

146. Фрагмент клонирован в его геномной ориентации жирным шрифтом обозначена последовательность, использованная в качестве Taqman пробы в работе Litt (2001), позиция 36.860 на карте домена.

147. GGAGAACTACCGTGGGCAACAACTATGGACAATTTCAAGGGACAACAGCTGTGA

148. AACTCTTCATGAGTACTGACAAGAAAGGAGAACCTTGCTTTCAAAGCATGAGGCC

149. TACATTTGGGATACGCACTGAGCTCTCGTTTCCCGGAAAGCCTCTGATCATTCAGT

150. TTGGGGCTGATGATGCCTGGAGCTGTTCACGATGGATTCCCAGGAGTGCAGGCAC

151. CAATGCACCATCAAGAGTCTGAAAACAAGGCCAAGTAAAGGCTGTGAGCTCTTT

152. GACATCACTGCCTATCTCACTGGATCTCCTCCACAAGTTCAGCCCCCAACCACTG

153. GCAGTGACACTGGAAACCTATGGCCATGGAGGAGCCATGCAGGCAGCTCCACCT

154. GCACTCGGGGCTGTGGCTACAAGATCATGGGTGTGAGATGAAGTTGGTCCACTCA

155. AAGGCAGAGGGGTAATGGGCCCCTTTTCCCCTTGGACAGGATCCAAATTTGC

156. TATCTTTCCTTCTGCAGCTCAACTCCC2.Плашида pNI2

157. На основе: pCR 2.1 vector (Invitrogen)

158. Содержит: Участок гена фолатного рецептора ß-глобинового генного кластера G.gallus Размер фрагмента: 910 п.н. (Соответствует позициям 2.283-3.193 на карте домена (Litt et al, 2001))

159. CAAACACTACCCACCCAGAGCACAGCCATCAGCACCTGTCCTATGGGCAGGAAA

160. CACAGGGTGGGAAGACAGAAGGAGCTCAGACACAAAGGATTGGAAATCACTGCC

161. TCCATCAGCTGGAAGCAGCAGCGGGCATCAAAGTCCAACACCACAGTCCATGCT

162. GAGCATCCACTGGGGCACACAAGCAAACTGAACAGACCAAGTGCCACTCATGCC

163. ACGGGAGCAGCCTCCTCCTTTGCAGAAAGAGAAGCCCCATCCCTTCAGGGAGCTG

164. TCACAGGGACCCCCACCCATAGGACCCCCAGCCTGCAGTGAGCAGCACGAGGGC

165. CAGCAGCAGGGTGAGCCGTGGCACAGCACACGCAGCTCTGCCTGTCTCAGGAGT

166. CACGTCCTCCATCCTGGCAGGAGAGGATCTCTTCTTCCAGGCGTAGTACTTTGC

167. CACAACCACATTGGGGTTCCCCTGCACGGGGTCAAACCACATCTGGATGCAGCGC

168. CCGCTGCCCCGGCGTTCTGTGGTGTATTTGTAGGAGTTGGACCAGATCTTCTCACA

169. CAGATCTTTGGGGCTGGGGAAGACCTGGGTGAAGGGTCTGCACATGGAGCCCCA

170. GGGACAGCGATTGGTTCCTG^ GGA CA GCA GCA GA GAA GGAAA CAA CAA CGTGA GCTA

171. TTCGCCCGCTTCCATAGGGGAGAGCAGGCCAGCAGCCTACCCACAGGTCATCACATCT

172. CA GCAA TGA CA TTGGTGGCCTGGCTGCCTCCCAGTCTGCAA CCCCCA TA GGA A GGCGA

173. CAGCAGCCCCTGGTTGGGCTCCAGGCACCCGGTGGGAGCAGGATCACTCCCAGGGTC

174. CCA CCTGCA GGGGGA GGGAA GGCTCTCTGCA GA GCCCA CT04CCTGTTGCCCAGTTC1. CAGCCCTTGTGCCAGTTCTCTTTGC1. З.Плазмида pNI3

175. На основе: pCR 2.1 vector (Invitrogen)

176. Содержит: 3'участок гена обонятельного рецептора из ß-глобинового генного кластера G.gallus

177. Размер фрагмента: 895 п.н. (Соответствует позициям 52.686-53.581 на карте домена (Littetal., 2001))

178. Фрагмент клонирован в ориентации обратной геномной.

179. CTGAAAATCCAGCACGGGAAGCTGAGATCTGGCTGGGCAGGTGTGCCTCCAAGC

180. AAGGCCAGACAGAGGGCTGGGGACATGGCCTAGGAGGGAGAACCCATGTGGAA

181. AGCCTGAGGGGAACCCTGACGGAGATGAGGATCATGGCTTGTCCGGCAAAGAGA

182. GCAATGTGATCCATGGGGACCAGGAGAAGGGGCTGCAGCAGCGCCCTGGGAGGA

183. ATGTAGGCTTGCTGCAATAGATAACGTTATTTTCTATTGTACAGGTGAGGAGCCT

184. GTAGAAATGAAGCAGAAGAGAAGAGAGCAGAAGCAAGACCTCCACAGTGAGCC

185. TTAGACTGTGTCCAGACACCGGTTGGTTTTCATTGCCCTCAGAATCTAATCCTGCA

186. TTACCTTTGAACTGTTCATGAGAGTGAAGTCTTTAGCCCAGGCTGGCCCCAGCCC

187. AAGCTGAACATGTACCCCAGGAACAGCAGTCAAGCTCAGCCTTTCCTGCTGGCAG

188. GCCTTCCCGGGATGGCTCAGTTTCACCACTGGGTGTTCCCCCCTTTTGGTCTCATG

189. TATCTGGTTGCAGTGCTGGGAAATGGTACCATCCTGCTGGTTGTGAGAGTGCATC

190. GCCAGCTCCACCAGCCCATGTACTATTTCCTTTTGATGCTGGCCACCACAGACCTG

191. GGCCTGACTCTGTCCACCCTGCCCACCGTTCTGCGCGTCTTCTGGTTGGGTGCCAT

192. GGAAATCAGCTTCCCCGCCTGCCTCATCCAGATGTTCTGCATCCATGTCTTTTCCT

193. TCATGGAGTCCTCAGTGCTCCTGGCCATGGCCTTTGATCGCTATGTGGCCATCTGC

194. TGCCCGCTGAGGTACTCCTCCATCCTCACTGGTGCCAGGGTTGCACAGATTGGAC1. TGGGGATCATCT

195. Количественное отображение сигнала фосфоимеджа при ДНК-ДНК гибридизации материала, обогащенногопоследовательностями, связанными с белком MENT из ядер куриных эритроцитов.

196. BS 5340824,004 4427780,594 913043,41 96649081,14 0,013871828 0,0095107 0,061255596