Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли митотической киназы Aurora A в развитии наследственной поликистозной болезни почек человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли митотической киназы Aurora A в развитии наследственной поликистозной болезни почек человека"

UUJ-

На правах рукописи

ПЛОТНИКОВА ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ МИТОТИЧЕСКОИ КИНАЗЫ AURORA А В РАЗВИТИИ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПОЛИКИСТОЗНОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК ЧЕЛОВЕКА

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 НОЯ ^

Москва-2009

003483585

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, доцент

Рихард Вольдемарович Лацис

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Кандидат биологических наук,

Татьяна Клеониковна Дубовая

Анастасия Петровна Григоренко

старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «30» ноября 2009 года в «_» часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан «_» октября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор

А.И. Щёголев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Поликистозная болезнь почек (ПБП) -врождённое заболевание человека, характеризующееся образованием и ростом множественных кист в обеих почках. ПБП связана с нарушением дифференцировки и пролиферации эпителиальных клеток в собирательных канальцах почек. В норме эпителий канальцев почек относится к типу медленно обновляющихся клеточных популяций, характеризующихся очень низким темпом пролиферации, и представленных долгоживущими клетками, участвующими преимущественно в реабсорбции питательных веществ во внутриканальцевые капилляры. При ПБП начинается неконтролируемая пролиферация эпителия собирательных канальцев почек, сопровождающаяся утратой клетками поляризации и нарушением дифференцировки, что неизбежно приводит к формированию кист. Молекулярный механизм таких нарушений дифференцировки и как следствие формирования кист во многом не изучен, и в настоящее время лечение ПБП остается только симптоматическим, заключающимся в коррекции проявлений болезни (Игнатова М.С. и др., 1996, Harris P. et al., 2009, Igarashi P. et al., 2002).

ПБП развивается в случаях появления инактивирующих мутаций в генах PKD1 или PKD2, кодирующих трансмембранные белки полицистин-1 и полицистин-2, соответственно. Полицистин-1 является интегральным мембранным белком, который связывается с кальциевым каналом, сформированным из шести субъединиц белка полицистина-2, образуя комплекс, контролирующий дифференцировку и пролиферацию клеток почечного эпителия в сенсорном сигнальном пути (Harvvood L et al., 2004). Показано, что комплекс полицистина-1 и полицистина-2 локализуется в плазмолемме первичных ресничек (Bae Y. et al., 2006). Неподвижная первичная ресничка представляет собой выдающеюся в просвет канальца покрытую цитоплазматической мембранной оргаиеллу. В ее основании находится базальное тело, а собственно ресничка образована девятью дуплетами периферических микротрубочек без двух центральных (в отличие от классической реснички, у которой обязательно присутствует центральный дуплет). Есть все основания полагать, что первичные реснички, находящееся на поверхности почечных эпителиальных клеток, являются механосенсорными органеллами, которые инициируют широкий спектр передачи Са2'-опосредованных регуляторных сигналов, причем в данном случае реснички «отслеживают» скорость тока мочи через канальцы и собирательные трубочки. В результате воздействия на первичную ресничку механических стимулов происходит инициация входа Са2+ в цитоплазму, что запускает каскад сигналов, регулирующих пролиферацию клеток (Nauli S. et al., 2004). При вступлении клетки в митоз происходит потеря первичной реснички благодаря тому, что

базальное тело, находящееся в ее основании, учавствует в формировании центросомы (диплосомы) (Marshall W. et al., 2008). Было показано, что одним из признаков опухолевых или трансформированных клеток как раз является потеря первичной реснички. Эти и другие данные, демонстрирующие, что в первичной ресничке локализовано большое количество таких митотических белков, как семейство NEK-киназ, участвующих в регуляции митоза, позволяет предположить, что первичная ресничка играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Более того, полученные в последние годы данные указывают, что развитие ПБП часто сопровождается утратой первичной реснички почечным эпителием (Plotnikova О. et al., 2008).

Таким образом, нарушение функционирования или полная потеря первичной реснички, сопровождающаяся нарушением восприимчивости почечного эпителия к току мочи и нарушением гомеостаза Са2+, способствует расстройству регуляции клеточного цикла, что ведет к неконтролируемой пролиферации клеток и формированию кист. Хотя этапы гистогенеза кист изучены достаточно подробно, остаются неясными вопросы, связанные с механизмом нарушения контроля пролиферации и дифференцировки эпителия почечных канальцев. В настоящее время картина молекулярных механизмов, контролирующих функции дифференцированных клеток в почке постепенно проясняется. Интересно, что Aurora A (AurA) хорошо изученная как митотическая киназа, располагающаяся на полюсах веретена деления начиная с профазы и до окончания телофазы и участвующая в регуляции клеточного цикла (Bolanos-Garcia V. et al, 2005) может являться одним из ведущих белков, контролирующих пролиферацию почечного эпителия. Ген АигЛ картируется в областях хромосом, часто нарушаемых при опухолях (например, 20ql3.2—q.13.3) и избыточно экспрессируется во многих первичных опухолях. Избыточная экспрессия или несвоевременная активация киназы AurA вызывает нарушение регуляции прохождения клетки по клеточному циклу, что сопровождается увеличением количества центросом и анеуплоидией, в отдельных случаях ведущих к трансформации клеток млекопитающих (Katayama Н. et al., 2003). Следует отметить, что одним из начальных этапов развития кист является как раз нарушение в регуляции нормальной пролиферации клеток с появлением мультицентросомных клеток с последующим изменением их структуры (Burtey S. et al., 2008), что, скорее всего, может свидетельствовать о существенной роли киназы AurA в этих процессах. Недавно было обнаружено, что киназа AurA локализована в базальном теле первичной реснички и была показана ее ключевая роль в инициации разборки и последующей потери клеткой этой структуры (Pugacheva Е. et al., 2007). Выше описанная роль киназы AurA в инициации разборки первичной реснички и регуляции клеточного цикла позволяет нам рассматривать киназу AurA как новый маркер ПБП, которая, безусловно вовлечена в патогенез ПБП.

Цель исследования

Изучение роли митотической киназы Aurora А в нарушении пролиферации клеток почечного эпителия при развитии наследственной поликистозной болезни почек человека.

Задачи исследования:

1. Продемонстрировать локализацию киназы AurA в нормальной почечной ткани и изучить возможность гиперактивации киназы AurA у больных поликистозной болезнью почек с использованием иммуногистохимических методов.

2. Выбрать модель, позволяющую изучать роль киназы AurA в регуляции полицистинов, белков, мутированных при ПБП, с применением биохимических методов, и приемлемую для дальнейших функциональных исследований.

3. Ответить на вопросы: взаимодействует ли киназа AurA с полицистином-1 и полицистином-2 и регулирует ли их активность путем фосфорилирования?

4. Оценить функциональную значимость взаимодействия AurA с полицистинамн и показать роль ингибитора AurA в регуляции этих белков.

Научная новизна работы

Работа содержит новые данные о роли киназы AurA в ПБП. AurA известна как киназа, участвующая в регуляции митоза и прохождения клеткой через G2/M фазы клеточного цикла. Ранее не было известно о локализации киназы AurA в клетках почечного эпителия и, тем более, не была изучена роль этой киназы в ПБП. В данной работе впервые показано, что уровень активированной путем фофсоршшроваиия киназы AurA повышен в эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП в отличие от интактного эпителия. Выявлен механизм участия киназы AurA в нарушении регуляции пролиферации почечного эпителия, что является одной из первичных причин формирования кист при ПБП.

В данном исследовании было обнаружено, что AurA может рассматриваться как один из ключевых белков, вовлеченных в патогенез ПБП, ннгибирование этой киназы может являться потенциальным и эффективным терапевтическим подходом в лечении ПБП.

Практическая значимость диссертации

При отсутствии терапевтических средств для лечения ПБП, в настоящее время активно ведется поиск и изучение белков, вовлеченных в процесс нарушения клеточной пролиферации при формировании кист у больных ПБП. В данной работе была установлена новая роль киназы AurA в развитии данной патологии и показано, что в эпителии кист уровень фосфорилирования киназы AurA повышен у больных ПБП. Также было

продемонстрировано, что использование ингибиторов AurA ведет к восстановлению нарушенного гомеостаза кальция при ПБП, что может способствовать ингибированию пролиферации кистозного эпителия. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о потенциальной возможности использования ингибиторов киназы AurA в качестве терапевтических агентов в лечении ПБП.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований и ряд примененных в работе методов внедрены в учебный процесс на кафедре молекулярной биологии и биотехнологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация результатов диссертационной работы

Результаты работы были представлены на международных конференциях: "13th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference" (Филадельфия, США, 2008), "Forefronts Symposium on Polycystic Kidney Disease" (Монреаль, Канада, 2008), "The American Society for Cell Biology, 48th Annual Meeting" (Сан-Франциско, США 2008), "14th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference" (Филадельфия, США, 2009), II Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2009" (Пермь, 2009), 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), "The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting" (Сан-Диего, США 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 171 источник (6 отечественных и 165 зарубежных). Работа содержит 43 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании использовались образцы тканей почек, полученных от 25 здоровых людей и от 25 больных с диагнозом «наследственная поликистозная болезнь почек» либо после смерти, либо при биопсии почек. Возраст пациентов варьировал от 20 до 40 лет. Образцы были получены из Национальной коллекции тканей и органов (NDRI, США).

В данной работе были использованы клеточные культуры НЕК-293, НК2 и кистозные эпителилальные клетки. НЕК-293, эмбриональные клетки печени человека (АТСС, США) и кистозные эпителилальные клетки, полученные от больных ПБП, культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning, США) в стандартной среде DMEM (Gibco, США), содержащей 10% бычьей сыворотки (Invitrogen, США). НК2, почечные эпителиальные клетки человека, полученные из эпителия проксимальных канальцев (АТСС, США), культивировали в среде GIBCO Keratinocyte-SFM (Invitrogen, США).

Методы исследования. Иммунохимическое окрашивание для выявления тотальной и фосфорилированной киназы AurA у больных ПБП и здоровых индивидов проводили на депарафинированных срезах образцов тканей почек с использованием моноклональных антител, против киназы AurA или только к ее фосфорилированной форме (Bethyl, США). Микроскопическое исследование образцов проводили на микроскопе Nikon Eclipse Е600 (Nikon, Япония).

Трансфекцию клеток НЕК-293 проводили с использованием плазмидных векторов, несущих гены AurA, PKD1 и PKD2 и с совместным использованием реагентов Lipofectamine и Reagent plus в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen, США).

Изучение взаимодействия AurA и полицистина-1 и 2 проводилось методом непрямой коиммунопреципитации с последующим разделением белков на полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях и проведением Вестерн Блота. Белки выявляли методом усиленной хемилюминесценции (ECL, Pierce Biotechnology, США).

Для проведения киназной реакции in vitro была использована рекомбинантная киназа AurA (Millipore, США), а в качестве субстрата, коныогированные с глютатион S-трансферазой (GST) С-терминальные домены белков полицистин-1 и 2, выделенные из Е. coli линии BL21. В качестве отрицательного контроля на специфичность фосфорилирования использовали белок GST. Фосфорилирование рекомбинантных белков in vitro проводили в течение 30 мин при 37СС в реакционной смеси объемом 50 мкл, содержащей реакционный буфер, 37 кБк [у-32Р]АТФ, 1 мкг киназы AurA (1711 ед/мг) и 1 мкг одного из двух субстратов. Пробы наносили на гель и после электрофореза в ПААГ гель экспонировали с рентгеновской пленкой.

Иммунофлюоресцентный анализ для выявления различных участников изучяеммых процессов проводили по единой схеме: клетки выращивали на покровных стеклах клеток. После фиксации 4%-ным формалином клетки окрашивали сначала первичными антителами, а затем - вторичными. ДНК окрашивали красителем DAPI (4 мкг/мл). Образцы анализировали при помощи конфокального микроскопа Nikon CI Spectral с объективом Iris 100х/1.4 или 40х/1.3 (Nikon, США).

Для измерения внутриклеточного кальция клетки выращивали на покровных стеклах в течение 2-х суток, затем нагружали флуоресцентным зондом Fluo-4AM (Invitrogen, США) и помещали в перфузионную камеру (FC2, Bioptechs, США). Освобождение Са2+ из эндоплазматического ретикулума инициировалось добавлением в перфузионную камеру 100 нМ аргинин-вазопрессина (Sigma, США). Уровень Са2+ в клетках измеряли по флуоресценции зонда Fluo-4AM с помощью конфокального микроскопа Nikon CI Spectral (Nikon, Япония).

Для анализа и статистической обработки результатов использовали программы Метаморф и Метафлоу (Metamorph and Metafluor softwares (Molecular Devices, США)). Во всех случаях достоверными считались различия при Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Н ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Присутствие киназы AurA в почечном эпителии. Киназа AurA известна как киназа, участвующая в регуляции митоза и прохождения клеткой по клеточному циклу (Andrews P.D. et al., 2003). Недавно было показано, что у пигментных клеток ретины человека киназа AurA сконцентрирована в базалыюм теле в основании первичной реснички, и что ее активация ведет к разборке первичной реснички (Pugacheva E.N. et al., 2007). Ранее не было известно о локализации киназы AurA в клетках почечного эпителия и, тем более, не была изучена роль этой киназы в ПБП.

Иммуногистохимические исследования показали наибольшую концентрацию киназы AurA в проксимальных, дистальных и собирательных канальцах здоровых почек человека (Рис. 1А, верхняя панель). В то же время уровень активированной путем аутофосфорилирования киназы AurA (P-AurA) (Рис. 1А, нижняя панель) значительно снижен по сравнению с уровнем общего белка AurA. В качестве контроля специфичности антител к общей киназе AurA данные антитела инкубировали с блокирующим пептидом, который был использован для продукции антител против киназы AurA при иммунизации кролика, и наблюдали полное блокирование гистохимического окрашивания канальцев здоровых почек человека. Иммуногистохимический анализ образцов почечных тканей, полученных от пациентов с ПБП (Рис. 1Б, верхняя панель) показал, что киназа AurA

Присутствует » значительном количестве в видоизмененном эпителии почечных кист. Наблюдается также повышение количества активированной Р-АигА в эпителии кист срезов, полученных от больных 11Ы1 (Рис. 1Б. нижняя панель).

А нормальная почечная ткань

корковый спой мозговой спой корковый слой

АигА

Р-АигА

Р-АигА

АигА

почечные кисты

Рисунок 1. Иммуиш'нстпхиничсгкос выявление кнппи АигА к ее фосфори.мфоинщш» формы (Р-АигЛ) в почечном эпнтелнн человека, Д.Б - сре'■> почечной IКЭДОД, полученные от здорового человека и больного ПВП, соответственно.

Таким образом, повышенное количество активированной киназы Лиг А в эпителии, почечных кист по сравнению с морфологи1тески нормальным эпителием почек указывает па ее возможную роль в индукции неконтролируемой пролиферации эпителия, что в свою очередь, ведет к образованию ки ей

2. Выбор моде,in, позволяющей изучать роль кии азы ЛигЛ в регуляции полицистииов. На сегодняшний день известно, что AtirA участвует в активации митотических белков в процессе инициации прохождения клетки по фазам клеточного цикла. Но исследования последних лет продемонстрирован! важную роль AurA в индукции разборки первичной реснички (Pugacheva Е. et al., 2007). Известие» что на поверхности Эпителиальных почечных клеток человека находится первичная ресничка, которая выдается й просвет канальца, где она играет роль мехакосенсора тока мочи и участвует а поддержании нормального пролиферативного состояния эпителия почки. Соответственно, одним из главных критериев выбора клеточной модели для исследования ИБП являлось присутствие первичной реснички на поверхности почечных клеток. После анализа различных почечных клеточных линий мы остановила свой выбор на линии i!K2 -эпителиальные почечные клетки человека (Ryan, М. et al„ 1494}. Мы покачали, что эти клетки формируют первичную ресничку при достижений 100% конфяюентноегги ид» поедс 48 часов роста в бессывороточной среде (Рис. 2А). Более того, методом непрямой иммунофлуоресценции мы выявили, что почечный белок, полицистмн-1, функции которого нарушены при ИБП, локализован в первичной ресничке этих клеток (Рис. 2В). Ii то же время киназа AurA присутствует в базальном теле первичной реснички (Рис, 2Б).

Первичные реснички КиназаАигА Пог*ицистин-1 (РС1

Рисунок 2. i bi м у и офлул р с с ц с нт н oî выявление первичном реснички в клетках HKÏ и локализованных » ней белков; А и г Л н PCI. А - Окрашивание первичной реснички антителами прочив ацетилированнйго тубулина (AeTub) Б - Локализация АнгЛ в базальном геле первичной реснички В - локализация РС1 в первичной ресничке- DAPI - окрашивание ДНК. Merge -совмещение всех 3-х маркеров, масштаб -20 мкм

3. Связывание и фосфорилнронанне кинитн ЛигЛ С-термннального (СГ) домена почечного Gc,ik:< no;iiiuHCTinra-l (PC'l). Было исследование возможное участие киназы АигА в регуляции PC I - интегрального мембранного белка, локализованного в первичной ресничке, мутация или нарушении функции которого ведут к развитию 11БП (Сш Y. el ai... I999). Поскольку киназа AurA является цнтогишматическим белком, была йзучекна возможность связывания АигА с цитоплазматическим СТ доменом РС1. С этой целью мы клонировали кДНК киназы АигА н СТ домена PC I в плазмидные векторы для экспресии данных генов в клетках млекопитающих. Затем полученные конструкции были временно трансфецированы г? культуру почечных клеток человека ÍÍÍÍ2, После проведения коиммунопреципитацин с антителами к АигА и последующего иммуноблотинга белков преципитата с антителами против Flag-эпитопа, прикрепленного к СТ домену PC I мы наблюдали, что киназа АитА действительно образует комплекс с СТ доменом PC I (Рис. ЗА).

КИП

РС1-СТ

КЛ АигА

-30

. -46

О

О ся о. о

,32

-46

КМ

АигА 1

-26 -46

-26 -46

Рисунок 3. А. Коы м му нор рец и п нтацы я СТ нпк'ия 14 I с киiiНи>и АигА. Верхняя панель --иммунтюлотинг СТ д Оме на PCI (PCI-CT) после коимиуно! i рецеп итаця и (КИП) с кннаэой АигА (левая дорожка), правам, - контроль специфичности коиммунопреципитацин, те вместо СТ домена PCI была взята пустая плазм и да Нижняя панель - детекция кнначы АигА н клеточных .iinaiax (О) методом иммуноблотинга. Б. Фосфорилириваиие квназон АигА СТ домена PCI in vitro. Верхняя панель — радиоавтограф (Р ) после разделения в ПАЛI продуктов кинвзной реакции с использованием к качестве субстратов РС1-СТ (левая дорожка) или белка GST (негативный контроль) (правая дорожка). Средняя и нижняя панели - окрашивание белков реакционной смеси после разделения в ПЛЛГ кум ас и синим (КМ). Указаны размеры маркера молекулярной массы в килодальтонах.

AurA является серин-треониновой киназой, регулирующей белки путем их фосфорилирования (Walter A. et al., 2000). С целью изучить возможность регуляции РС1 киназой AurA путем фосфорилирования, мы провели киназный анализ in vitro с использованием рекомбинантной киназы AurA и рекомбинантного СТ домена РС1 в качестве субстрата. Показано, что киназа AurA фосфорилирует in vitro СТ домен РС1, но не белок GST, использованнный в качестве негативного контроля на специфичность фосфорилирования (Рис. ЗБ, верхняя панель).

Таким образом, с помощью коиммунопреципитации и киназной реакции in vitro мы показали, что киназа AurA связывает и фосфорилиреут РС1, белок, нарушение функции которого ведет к развитию ПБП.

4. Создание модели для изучения регуляции кнназой AurA функцнн кальциевого канала, образованного полпцнсгином-2 (РС2). Помимо мутаций гена PKDI, приводящих к развитию ПБП, были так же обнаружены мутации и в гене PKD2, кодирующего белок полицистин-2 (РС2). РС2 локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), где функционирует как кальциевый канал, через который происходит освобождение запасов Са2+ из ЭР в цитоплазму клетки в ответ на различные внеклеточные стимулы, в том числе на ростовые факторы. Таким образом, белок РС2 играет важное значение в контроле дифференцировки и пролиферации клеток почечного эпителия. Было показано, что активация кальциевого канала РС2 происходит при стимуляции клеток млекопитающих различными соединениями, вызывающими увеличение внутриклеточного кальция. Наиболее часто для активации РС2 in vitro используют пептидный гормон аргинин- вазопрессин (AVP). В данной работе для дальнейшего изучения регуляции функции РС2 был разработан метод измерения цитоплазматического Са2+ на модели выше описанной клеточной линии НК2, экспрессиирующей экзогенный РС2 (Рис. 4).

Клетки линии НК2 сажали на покровные стекла и на следующий день трансфецировали плазмидой, несущей ген PKD2 или контрольной «пустой» плазмидой. Затем клетки инкубировали с флуоресцентным зондом FIuo-4AM, связывающим цитоплазматический Са2+ и помещали в перфузионную камеру. Измерения проводились с использованием конфокального микроскопа, сначала измерялась базальная флюоресценция до добавления AVP (F0), затем регистрировалось AVP-индуцированное изменение флюоресценции со временем, отражающее высвобождение Са2+ через канал PC2(Fj). Разработанный выше подход для клеток линии НК2 в дальнейшем был использован для анализа регуляции функции РС2 киназой AurA.

Посев H К 2 клеток на покровные стекла

Тра нефе ц и рсван и е плазм идой, несущей ген PKD2 или пустой плазм идой (mock)

Тра нсфециро ванные НК2 клетки

График изменений флюоресценции а зависимости от времени (отражает высвобождение Са1')

PKD2

mock

-AVP

+AVP

¡-Й^Нв^^цпк] АНЭЛ143

результатов л

щ т

Инкубация с флюорисцентным зондом FILO-4AM

Трансфецированные НК2 клетки + FIU0-4AM

Измерение 6а зальной и AVP-индуцированной флюоресценции

ï' tUyn.'JK j. Мвд^лъ И 14 'НИ НЯ pervjlllHB» imv I |)ИК. Ht (14 mil It урон H я С Я В НОЧОИЫ! клетках.

I la графике: F„ - базальная к i: - А VP-индуцирован пая флюоресценция.

На панели: флюоресценция клеток, тралефецированных либо ллазмилой для экспрессии PKDI или пустой плаэмндой (mock) до (-AVP) или после (+А VP) добавления стимулятора Л VP

5. Кнназа ЛигЛ негашено регулирует кальциевый канал РС2, понижая содержание Са:+ в ни топ.чазме. 15 результате анализа клеточных линий m кист, полученных от больных ПБП. было выявлено снижение уровня и итоп л an магического C'a"' и эпителий кист. что играет большую роль в нарушении регуляции клеточного цикла этих клеток, ведущее к нарушению механизмов их пролиферации (Anyatonwu G. et al., 2004),

[3 данной работе МЫ продемонстрировали, что активация киназы Ли г А может стимулироваться увеличением уровня щггоплазматического Са". Например, добавление AVI1, акгивируюшего РС2 и вызывающего освобождение Са'* в цитоплазму вызывает увеличение активированной путем фосфорилирования AtirA в 1Ж2 клетках. Следовательно, можно предположить, что кнназа АигА иг рает роль в поддержании гомеосгаза Са"* через регуляцию кальциевого канала РС2. С целью проверить данную гипотезу, мы воспользовались описанной

выше моделью, допои.....тельно трансфепировав штазмиду для экепреши гена АшА в клетки

IIK2, и затем измери™ ЛУР-нндуцирйвадаое- освобождение Off1 через канал РС2 в цитоплазму.

Результаты эксперимента выявили, что избыточная экспрессия АигА к клетках МК2 прмнодит к снижению выброса Са"' через канал РС2. что способствует понижению цитоплазматического С;Г4 (Рис. 5А). Затем мы провели аналогичный эксперимент, только вместо увеличения уровня киназы АигА в клетках она была ннактивирована путем обработки клеток ингибитором АигА РНА-680632 (Ыегу(апо \1edical 5вмепее$ Бг!, США) (Рис, 5Б). Надо заметить, что согласно с полученными в этой работе результатами, уровень актннпой киназы Л и г Л увеличен в кистоЗном эпителии больных ПБП. Соответственно. мы продемонстировали. что черезмерная активация киназы АигА может приводит к резкому уменьшению выброса Са" через канал, образованный пол ицистином-2, н нарушению гомеостаза Са" . что характерно для эпителия кист. 11 то же время йигибирование киназы АигА увеличивает активность кальциевого канала, ведущее к повышению уровня Са"' I) клетке.

50 75 100 125 150 Время, с

1.5 0 5

50 75 100 125 150 Время, с

I 2 < ,

■

Й

РС2

UU

Рисунок 5. АигА негатив во регулирует РС2-завнснмо6 освобождение Са . А. Измерение Са" в клетка* ПК2, трапсфецированных плаэмидами длн экспрессия РС2 или для совместной экерпрессии PC 2 я АигА (левая панелЩ В. Клетки НК2, трансфецированные либр плазмидой для экспрессии PC2 либо «пустой» контрольной плазмидой (mock). Измерение Са'* проводилось после преинкубации клеток либо с ингибитором ДигД РНА-680632 (РИА) либо с контрольным вешестов, использованным для растворение PHA (DMSO) (левая панель). ИммуннофлюорисцентныЙ сигнал был измерен до и после добавления AVP (момент добалеиия AVP отмечен стрелкой). Данные представлены о виде зависимости отношения l-'/P,, от времени, где Fo - бааальная флуоресценция ло добавлейия стимулятора Дня обоих графиков была подсчитана амплитуда флуоресцентного сигнала A(F/F0) (правая панель).

(i. Kanáia AurA взаимодействует с PC 2 и регулирует его путем фосфорилнрования, С целью понять, каким образом происходит регуляция киназой АнгА канала РС2, мы провели эксперименты, позволяющие изучить возможность связывания AurA с РС2 и его регуляции путем фосфорилнрования. Методом коиммунопреципитации и последующего денатурирующего ПААГ электрофореза и Вестерн блоттинга было показано, что АнгА взаимодействует с РС'2 в клетках IIK2 (Рис. 6А).

Рисунок 6 А Коим м у поп ре цн питания СТ домена вали цвети ня-2 с кннязой ЛцгА. Верхняя панель - иммунноблогпнг PC2 после конммунопрсцепитаиин (КИП) с киназой ЛигЛ (левая дорожка), правая. - контроль специфичности коимму но преципитаций, где вместо антител против АигЛ неполЬзавалИСЬ йЬспецифические иммуноглобулины Нижняя панель - детекция киназы AurA в клеточных лизатах (KJ1). S Фосфор ил к ровен не киназой АвгА СТ домена РГ2 in vitro. Верхняя панель - радиоавтограф (Р'") после разделения в ПААГ продуктов киназноЙ реакции с использованием s качестве субстратов РС2-СТ дикого типа (WT) (левая дорожка) или с мутацией S829A (правая дорожка) Средняя н нижняя панели - окрашивание белков реакционной смеси после разделения в ПААГ кумасн синим (КМ). Указаны размеры маркера молекулярной массы в кили Дальтонам.

АнгА, являясь серин/трерниновой протеин киназой, обычно регулирует белки путем их фосфорилнрования в стандартном консесусном мотиве R/K/N-R-x-S/T-B (х-любая аминокислота. В - любая аминокислота за исключением пролина) (Ferrari S. et al. 2005). Такой мотив был обнаружен на С-торминальном (СТ) домене поййциспша-2 PROS! (S=S829). Для подтверждения, возможности фосфорилнрования киназой AurA РС2 в этом мотиве, мы провели киназный анализ in vitro с использованием рекомбинантной киназн AurA и рекомбииашмого СТ домена РС2 в качестве субстрата. Показано, что киназа АнгА фосфорилирует in vitro СТ домен РС2 дикого типа (WT), но не СТ домен РС2 с введенной мутацией в данный сайт фосфорилнрования (S829A). Следовательно, мы показали, что кииаза AurA негативно регулирует функцию кальциевого канала PC2 путем связывания с ним и фосфорилнрования его СТ домена в сайте S829 (Рис, 6Б}.

7. Изучение приложения .....ибитора кнназы AurA в терапии lililí. На .........

момент нет эффективных лекарственных средств для лечения ПБП. Как уже было показано.

мутации в генах PKDI и PKD2 ведут к уменьшению функциональной активности кальциевого канала РС2 я уменьшению содержания С а" в цитоплазме. (Igaraslii I1, et al..

2002). Соответствен но, продемонстрированная нами способность ингибитора ЛигА увеличивать активность РС2. может найти приложение в терапии ИБП.

С целыо продемонстрировать, что ингибитор ЛигЛ оказывает активирующий эффект на кальциевый канал РС2 в физиологическом контексте, мы испильчонати две кистозные клеточные линии, полученные из эпителия кист больных Г1Ы1 (Loghman-Adham М. et а!..

2003). Одна клеточная линия была получена от больного, несущего мутацию Q255GX в гене PKD1. вторая от больного МНИ с мутацией AI302S в том же гене, В результате проведения измерения базалышго уровня Са в данных клеточных линиях, предварительно обработанных ингибитором йшазь) AlirA РНА-680632, мы обнаружили, что ингибнроианий А иг А ведет к повышению в них уровня внутриклеточного Са"4 (Рис. 7).

Инкубация с DMSO (контроль)

1

г*-

DMSO DMSO РНА

РНА

PKDI Q2556X

PKDI A1302S

РисунокТ. Ингибитор АвгА РИА-681.163 2 (РНА) повышает бшмьпый уровень Са1* в кнетошм\ »пегелнальных шткё\, калучеииык оI больных ]11ЛI. Левая панель: пример измерения баэального уровня С а"', преобладай« темного цвета отражает более низкий уровень С а" к клетке, а его повышение отражается переходом от темного к светлому. Правам панель -представление измерения уровня внутриклеточного Са"' в виде гистограммы, в качестве контроля использовался ОМУО. который служил растворителем для РНА I - интенсивность флуорисценцни Са"*-свызывающего зонда Пш)-4АМ. Г., - фоновая флуоресценция РНА-680632 (РНА) - ингибитор АигА

li результате изучения развития ПБП у экспериментальных животных и людей было выявлено, что потеря или редукция длины первичной реснички ведет к развитию кист (Pan J. et al., 2005). Соответственно, нарушение интегральной функции полицистинов. участвующих п регуляций механооенсорных функций реснички, ведет к утрате контроля восприимчивости почечным эпителием потока мочи, что н свою очередь способствует нерегулируемой пролиферации эпителия и в конечном итоге приводит к формированию КЙСТ. Недавно была показана новая ключевая роль кипам АцгА в инициации разборки к последующей потери клеткой первичной реснички (Pugacheva Е. et al. 2007), Исходя из утих данных мы изучили возможность воздействия путем ингибирования AurA ма количество и длину первичных ресничек на поверхности выше описанных кистозпых клеток, полученных от больных с ПБП. Иммунофлуорссцентный анализ Этих клеток показал, что они имеют то же количество первичных ресничек, что и нормальная клеточная линия НК2. но их длина значительно сокращена (Рис. 8).

Клетки НК2 Кистозные клетки

/ V ^ t

/ • . f V * f1

Рщунокв Пыяяление первичных ресничек методом иммунофлуоресценцни в нормальных ¡точечных клетках У1К2 и кисютных клетках, полеченных от больных с (1Б11 Для детекции ресничек использовали антитела к их структурному белку, ацпги. и:т:>ваиному тубулину Масштаб -20 мкм. I |ервичные реснички отмечениы стрелками

В связи с этим результатам возник вопрос, может ли ингибирование активности АитА влиять на размер первичной реснички? Для этого мы инкубировали кистозные клетки с ингибитором А и г Л Р11А-6 80632 в течение 24 часов и затем провели иммунофлуоресцентный анализ первичных ресничек на поверхности этих клеток. В параллельном контрольном эксперименте эти же клетки растили 24 часа в отсутствии ингибитора. В результате было показано, что ингибирование киназы АигА ведет к восстановлению нормальной длины

первичной реснички (Рис. 9). 11риинмая во внимание описанную ранее роль А и г Л в разборке первичной реснички (Ри^асЬеуа Е. с1 а!. 2007) и устанновленное нами увеличение активности АигА в кистозных тканях, можно заключить, что черезмернно активированная АигА вносит вклад в укорочение первичной реснички. Соответственно, ннгибирование киназы АигА способствует восстановлению нормальной длины первичной реснички.

- РНА-680632 + РНА-680632

AcTubiDAPt __ АсТцЬГОАР! _

55 "Г к л

г -

2 ■

1 ■

о ■

Л

■РИА

+РНА

Рисунок 9, I [ м м унофлуоресцеитяое выявление увеличения размера первичной реснички после обработки клеток ингибитором АигА РНА-680632. Антитела претив ацетилированного тубулина (АсТиЬ) - окрашивание реснички, ОАР1 - окрашивание ДНК. масштаб - 20 мкм (левая панель). Правая панель - график, отражающий длину первичной реснчки до (-Р11А) или после (+РНА) Обработки клеток ингибитором АигА РНА-680632 (РИА) Ось У - длина первичной реснички (мкм).

Таким образом, используя почечные клетки из кисг, мы показали, что применение ингибитора АигА способствует восстановлению таких нарушений при ПЫ1, гаки* как снижение уровня ци то плазматического С;Г в клетках и изменение длины первичной реснички, что дает нам возможность рассматривать ингибиторы АигА как потенциальные терапевтические средства и лечении ИБП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Основываясь на изложенных выше наблюдениях, мы продемонстрировали, что киназу АигА можно рассматривать в качестве нового маркерного белка ПБП, который играет роль в патогенезе ПБП. Основным патологическим процессом, лежащим в основе формирования кист при ¡Ш1. является инициация неконтролируемой пролиферации и нарушение дифференцировки в норме медленно размножающегося эпителия почечных канальцев (Harris P. et а],, 2004, Igarustii P. et at., 2002). Тот факт, что в образцах почечной ткани, полученных от больных с ПБП, активированная киназа АигА представлена в большом количестве в эпителии, выстилающем просветы кист, указывает на ее возможную роль в индукции неуправляемой пролиферации эпителия и образовании кист. Киназа АигА

регулирует прохождение клетки по клеточному циклу через активацию как циклинов В, так и циклин-зависимых киназ (CDK) (Andrews P. et al., 2003). Соответственно, повышение уровня активированной киназы AurA запускает каскад реакций, ведущих к гиперфосфорилированию и активации циклинов, что в свою очередь ведет к запуску неконтролируемой пролиферации клеток через активацию соответсвующих CDK и нарушению регуляции вступления в митотическую фазу клеточного цикла, что может иметь место в почечном эпителии.

В исследованиях последних лет была показана важная роль первичной реснички в развитии ПБП. В ней локализовано множество митотических белков и эта органелла играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Было выявлено, что повышение киназной активности фосфорилированной киназы AurA ведет к разборке первичной реснички (Pugacheva et al., 2007), что также может иметь место в эпителии кист больных ПБП. С другой стороны, первичные реснички выполняют как роль механосенсоров, улавливающих ток мочи в почечных канальцах и участвующих в регуляции диаметра просвета канальца, так и поддерживающих нормальный уровень пролиферативной активности почечного эпителия. Белок полицистин-1, встроенный в плазмолемму первичной реснички, функционирует как механосенсорный рецептор, который улавливает сигналы тока мочи, движущейся через канальцы, и является источником сигналов, контролирующих пролиферацию клетки (Nauli S. et al., 2004). В соответствии с нашими данными, гиперактивация киназы AurA в эпителии кист увеличивает уровень фосфорилированного полицистина-1, что может быть одной из главных причин изменения функционирования эпителия и его неспособности нужным образом реагировать на изменения потока мочи, что сопровождается нарушением регуляции диаметра канальца с последующей инициацией пролиферации почечного эпителия.

Далее мы показали, что цитоплазматическая киназа AurA негативно регулирует кальциевый канал, образованный белком полицистином-2, трансмембранные домены которого пронизывают мембрану ЭР, что ведет к снижению выброса Са2+ из ЭР в цитоплазму. Поддержание постоянного гомеостаза С а2' необычайно важно для обеспечения нормального пролиферативного состояния клеток почечного эпителия (Berridge М. et al., 2003). В частности, было зарегистрировано понижение уровня цитоплазматического кальция в клетках, выстилающих протоки кист у больных ПБП, что может быть связанно с гиперактивацией киназы AurA и угнетением функции кальциевого канала полицистина-2. Ниже представлена схема, обобщающая описанные в данной работе наблюдения (Рис. 10).

Киназа АигА

Гиперактивация АигА в эпителии, выстилающем просвет кисту больных ПБП

Гиперактивэция митотических белков, таких как циклин В и СОК-киназ

Нарушение регуляции клеточного цикла

Утрата почечными клетами первичной реснички и нарушение ее функционирования. Нарушение регуляции полицистина-1.

I

Нарушение восприимчивости эпителия к току жидкости, нарушение регуляции диаметра канальцев

Супрессия функции кальциевого канала полицистина-2

Нарушение гомеостаза кальция в клетках

Нерегулируемая пролиферация клеток почечного эпителия

Формирование кист

Рисунок 10. Роль кииизм ЛигЛ и рэтннтни ПЕЛ I человека.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что киназа АигА присутствует в эпителии почечных канальцев у здоровых индивидов, однако содержание фосфорилнрованной киназы АигА в этом случае минимально, В эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП по сравнению со здоровыми донорами, уровень фосфорилнрованной киназы АигА существенно повышен.

2. Отработана оптимальная модель на основе нормальных почечных клеток человека лилии НК2, позволяющая изучать роль киназы ЛигА в регуляции пОлицистина-1 и полицистина-2 в норме и в условиях, моделирующих патологию.

3. В норме активированная киназа AurA взаимодействует с полицистинами, регулируя их путем фосфорилирования. Гиперактивация киназы AurA приводит к резкому уменьшению выброса кальция через канал, образованный полицистином-2, что характерно для эпителия кист.

4. Ингибирование киназы AurA увеличивает активность кальциевого канала, препятствуя избыточному фосфорилированию полицистина-2, что способствует повышению уровня цитоплазматического кальция, пониженному в кистозном эпителии почек больных ПБП.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Материалы диссертационной работы могут быть использованы для диагностических целей в практике лечебных учреждений при характеристике пролиферативных изменений, происходящих в кистозном эпителии при развитии ПБП. Описанная в данной работе способность ингибитора AurA корректировать такие патологические изменения при ПБП, как снижение уровня цитоплазматического кальция и редукции длины первичной реснички, может способствовать дальнейшему изучению приложения этого ингибитора в терапии ПБП.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Olga Plotnikova and Erica Golemis. Roles for AurA and HEF1 as cilia-associated signaling regulators in PKD. Abstract book of «Fox Chase Cancer Center 13th Annual Postdoctoral and Graduate Student research Conference»; Philadelphia, USA. - 2008. - P. 70.

2. Erica Golemis, Olga Plotnikova and Elena Pugacheva. NEDD9, Aurora A, and PKD. «Abstract book of Forefronts Symposium on Polycystic Kidney Disease»; Montreal, Canada. - 2008. - P. 161.

3. Olga Plotnikova, Elena Pugacheva and Erica Golemis. Aurora A and HEF1 regulate polycystin 2. II The American Society for Cell Biology, 48th Annual Meeting, Meeting Abstracts. A supplement to Molecular Biology of the Cell; San Francisco. - 2008. -Volume 19.-P. 571.

4. Olga Plotnikova and Erica Golemis. Aurora A regulates polycystin 2 calcium channel activity. // Abstract book of «Fox Chase Cancer Center 14th Annual Postdoctoral and Graduate Student research Conference»; Philadelphia, USA. - 2009. - P.30

5. O.B. Плотникова, Э.А. Големис, P.B. Лацис. Роль киназы Aurora А в развитии поликистозной болезни почек. // Сборник материалов конференции «Симбиоз Россия 2009», г. Пермь. - 2009. - С. 238.

6. О.В. Плотникова, Р.В. Лацис, Э.А. Големис. Киназа Aurora А и поликистозная болезнь почек. // Сборник материалов 13-ой международной Путинской школы-конференции молодых ученых «биология - наука XXI века», г. Пущино. - 2009. - С. 36.

7. Olga Plotnikova, Elena Pugacheva and Erica Golemis. Aurora-A kinase regulates the PKD2 calcium channel. // The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting, Meeting Abstracts. A supplement to Molecular Biology of the Cell; San Diego. - 2009. -Volume20.-P. 371.

8. О.В. Плотникова, Р.В. Лацис. Значение киназы Aurora А в развитии поликистозной болезни почек. // Вестник МГОУ. Серия: Естественные науки. - 2009. - №4. - С. 77-80.

9. О.В. Плотникова, Р.В. Лацис, Э.А. Големис. Киназа Aurora А и поликистозная болезнь почек. // Вестник РГМУ. -2009. -№6. - С. 57-62.

10. Olga V. Plotnikova, Elena N. Pugacheva and Erica A. Golemis. Primary cilia and the cell cycle. // Methods in cell biology. - Elsevier Academic Press, San Diego. - 2009. -Volume 94. - Chapter 7. - P. 133-155.

Список сокращений

ПБП - поликистозная болезнь почек

ПААГ - полиакриламидный гель

ЭР - эндоплазмотический ретикулум

AcTub - ацетилированный а-тубулин (acetylated tubulin)

AurA - Aurora A

AVP - аргинин-вазопрессин (arginine vasopressin) CDK - циклин-зависимые киназы (cyclin-dependent kinase)

DAPI - 4',6-диамидино-2-фешшиндол (4',6-diamidino-2-phenylindole) - краситель ДНК

GST - глутатион S-трансфераза (glutathione S-transferase)

NT - N-терминальный (N-terminal)

CT - С-терминальный (C-terminal)

PCI -Полицистин-l (polycystin-1)

PC2 - Полицистин-2 (polycystin-2)

Подписано в печать 26.10.2009 г. Заказ 21. Тираж 100 экз. 117105, Москва, Варшавское шоссе, 8, ВНИИгеосистем

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плотникова, Ольга Викторовна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1 Общие представления о поликистозной болезни почек.

1.2 Клинические и гистологические особенности ПБП.

1.3 Механизмы развития ПБП.

1.4 Структура и функция полицистина-1 и полицистина-2 — белков, мутированных при ПБП.

1.5 Кальций и клеточная пролиферация. Роль полицистинов в поддержание гомеостаза кальция в почечном эпителии.

1.6 Локализация полицистина-2 в почечной клетке определяет его функции.

1.7 Первичная ресничка и ее роль в патогенезе ПБП.

1.8 Направления в лечении ПБП.

1.9 Киназы семейства Aurora (Aur).

1.10 Структура и регуляция киназы Aurora A (AurA).

1.11 Роль киназы AurA в регуляции пролиферации клеток.

1.12 Роль киназы AurA в индукции разборки первичной реснички.

1.13 Активатор киназы AurA NEDD9 (HEF1).

Глава II. Материалы и методы исследования.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Реактивы.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Клонирование.

2.3.2 Клеточные культуры и трансфекция.

2.3.3 Получение лизатов, коиммунопреципитация и иммуноблотинг.

2.3.4 Получение рекомбинантных белков.

2.3.5 Анализ киназной активности in vitro.

2.3.6 Иммунохимическое исследование.

2.3.7 Иммунофлуоресцентный анализ.

2.3.8 Измерение концентрации внутриклеточного кальция.

2.3.9 Индукция формирования первичной реснички.

2.3.10 Измерение цитотоксичности РНА-680632.

2.3.11 Исследование последовательности фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуорометрии.

2.3.12 Статистическая обработка результатов.

Глава III. Результаты и обсуждение.

3.1 Локализация и активность AurA в почечном эпителии.

3.2 Экспрессия киназы AurA в кистозном эпителии и определение уровня фосфорилированной AurA у больных ПБП.

3.3 Выбор модели для изучения регуляции почечных белков полицистина-1 и 2.

3.4 Изучение роли киназы AurA в регуляции полицистина-1 в первичной реснички почечных клеток линии НК2.

3.5 Выбор модели для изучения регуляции киназой AurA функции кальциевого канала, образованного РС2.

3.6 Активация AurA в ответ на стимулы, ведущие к увеличению концентрации внутриклеточного Са2+.

3.7 Киназа AurA негативно регулирует функцию кальциевого канала РС2, снижая содержания Са2+ в цитоплазме почечных клеток.

3.8 Связывание и фосфорилирование киназой AurA С-терминального домена полицистина-2.

3.9 Функциональный анализ мутаций в сайте фосфорилирования AurA S829.

3.10 Изучение приложения ингибитора киназы AurA в терапии ПБП.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли митотической киназы Aurora A в развитии наследственной поликистозной болезни почек человека"

Актуальность темы исследования

Поликистозная болезнь почек (ПБП) - врождённое заболевание человека, характеризующееся образованием и ростом множественных кист в обеих почках. Кисты могут располагаться в кортикальном или мозговом слоях почек [1]. ПБП связана с нарушением пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток в собирательных канальцах почек [2]. В норме эпителий собирательных канальцев почек относится к медленно обновляющемуся типу клеточных популяций, характеризующихся очень низким темпом пролиферации, и представлен долгоживущими клетками, участвующими преимущественно в реабсорбции питательных веществ во внутриканальцевые капилляры. При ПБП начинается неконтролируемая пролиферация эпителия канальцев почек, сопровождающаяся утратой клетками поляризации и нарушением дифференцировки, что неизбежно приводит к формированию кист [152]. Молекулярный механизм таких нарушений дифференцировки и как следствие формирования кист во многом не изучен, и в настоящее время лечение ПБП остается только симптоматическим, заключающимся в коррекции проявлений болезни [3].

ПБП развивается в случаях появления инактивирующих мутаций в генах PKD1 или PKD2 [4,5], кодирующих трансмембранные белки полицистин-1 и полицистин-2, соответственно. Полицистин-1 является интегральным мембранным белком, который связывается с кальциевым каналом, сформированным из шести субъединиц белка полицистина-2, образуя комплекс, поддерживающий дифференцировку и контролирующий пролиферацию почечного эпителия при участии сенсорного сигнального пути [6].

Показано, что комплекс полицистина-1 и полицистина-2 локализуется в плазмолемме первичных ресничек [5,7]. Неподвижная первичная ресничка представляет собой выдающеюся в просвет канальца покрытую плазматической мембранной органеллу [62]. В ее основании находится 6 базальное тело, а собственно ресничка образована девятью дуплетами периферических микротрубочек без двух центральных (в отличии от классической реснички, у которой обязательно присутствует центральный дуплет) [8]. Есть все основания полагать, что первичные реснички, присутствующие на поверхности почечных эпителиальных клеток, являются механосенсорными органеллами, которые инициируют широкий спектр передачи Са2+-опосредованных регуляторных сигналов, причем в данном случае реснички «отслеживают» скорость тока мочи через канальцы и собирательные трубочки [8,9].

В результате воздействия на первичную ресничку механических стимулов происходит инициация входа Са2+ в цитоплазму, что запускает каскад сигналов, регулирующих пролиферацию клеток [164]. При вступлении клетки в митоз происходит потеря первичной реснички вследствии того, что базальное тело, находящееся в ее основании, участвует в формировании центросомы (диплосомы) [126]. Было показано, что одним из признаков опухолевых трансформированных клеток как раз является потеря первичной реснички [122]. Эти и другие данные, демонстрирующие, что в первичной ресничке локализовано большое количество различных групп митотических белков, например, таких как семейство NEK-киназ, участвующих в регуляции митоза [114], позволяет предположить, что целостная первичная ресничка играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Более того, полученные в последние годы данные указывают, что развитие ПБП часто сопровождается уменьшением или полной утратой первичной реснички почечным эпителием [170].

Таким образом, нарушение функционирования или полная потеря первичной реснички, сопровождающаяся нарушением восприимчивости почечного эпителия к току мочи и нарушением гомеостаза Са2+, способствует расстройству регуляции клеточного цикла, что ведет к неконтролируемой пролиферации клеток и формированию кист. Хотя этапы гистогенеза кист изучены достаточно подробно, остаются неясными вопросы, связанные с механизмом нарушения контроля пролиферации и дифференцировки эпителия почечных канальцев. В настоящее время картина молекулярных механизмов, контролирующих функции дифференцированных клеток в почке постепенно проясняется. Интересно, что Aurora A (AurA) хорошо изученная как митотическая киназа, располагающаяся на полюсах веретена деления начиная с профазы и до окончания тело фазы и участвующая в регуляции клеточного цикла [11], может являться одним из ведущих белков, контролирующих пролиферацию почечного эпителия. Ген АигА, картируется в областях хромосом, часто нарушаемых при опухолях (20ql3.2-q.l3.3) и избыточно экспрессируется во многих первичных опухолях [77]. Избыточная экспрессия или несвоевременная активация киназы AurA вызывает нарушение регуляции прохождения клетки по клеточному циклу, что сопровождается увеличением количества центросом и анеуплоидией, в отдельных случаях ведущих к трансформации клеток млекопитающих [77,103].

Следует отметить, что одним из начальных этапов развития кист является как раз нарушение в регуляции нормальной пролиферации клеток с появлением мультицентросомных клеток с последующим изменением их структуры [19], что, скорее всего, может свидетельствовать о существенной роли киназы AurA в этих процессах. Недавно было обнаружено, что киназа AurA локализована в базальном теле первичной реснички и была показана ее ключевая роль в инициации разборки и последующей потери клеткой этой структуры [126]. Выше описанная роль киназы AurA в инициации разборки первичной реснички и регуляции клеточного цикла позволяет нам рассматривать киназу AurA как новый маркер ПБП, которая безусловно вовлечена в патогенез ПБП.

Цель исследования

Изучение роли митотической киназы Aurora А в нарушении пролиферации клеток почечного эпителия при развитии наследственной поликистозной болезни почек человека.

Задачи исследования

1. Продемонстрировать локализацию киназы AurA в нормальной почечной ткани и изучить возможность гиперактивации киназы AurA у больных поликистозной болезнью почек с использованием иммуногистохимических методов.

2. Выбрать модель, позволяющую изучать роль киназы AurA в регуляции полицистинов, белков, мутированных при ПБП, с применением биохимических методов, и приемлемую для дальнейших функциональных исследований.

3. Ответить на вопросы: взаимодействует ли киназа AurA с полицистином-1 и полицистином-2 и регулирует ли их активность путем фосфорилирования?

4. Оценить функциональную значимость взаимодействия AurA с полицистинами и показать роль ингибитора AurA в регуляции этих белков.

Научная новизна работы

Работа содержит новые данные о роли киназы AurA в развитии поликистозной болезни почек (ПБП). AurA известна как киназа, участвующая в регуляции митоза и прохождения клеткой через G2/M фазы клеточного цикла [11]. Ранее не было известно о локализации киназы AurA в клетках почечного эпителия и, тем более, не была изучена роль этой киназы в ПБП. В данной работе впервые показано, что уровень активированной путем фофсорилирования киназы AurA повышен в эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП в отличие от интактного эпителия. Выявлен механизм участия киназы AurA в нарушении регуляции пролиферации почечного эпителия, что является одной из первичных причин формирования кист при ПБП.

В данном исследовании было обнаружено, что AurA может рассматриваться как один из ключевых белков, вовлеченных в патогенез ПБП, ингибирование этой киназы может являться потенциальным' и эффективным терапевтическим подходом в лечении ПБП.

Практическая значимость диссертации

При отсутствии терапевтических средств для лечения ПБП, в настоящее время активно ведется поиск и изучение белков, вовлеченных в процесс нарушения клеточной пролиферации при формировании кист у больных ПБП. В данной работе была установлена новая роль киназы AurA в развитии данной патологии и показано, что в эпителии кист уровень фосфорилирования киназы AurA повышен у больных ПБП. Также было продемонстрировано, что использование ингибиторов AurA ведет к восстановлению нарушенного гомеостаза кальция при ПБП, что может способствовать ингибированию пролиферации» кистозного эпителия. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о потенциальной возможности использования ингибиторов киназы AurA в качестве терапевтических агентов в лечении ПБП.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований и ряд примененных в работе методов внедрены в учебный процесс на кафедре молекулярной биологии и биотехнологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация результатов диссертационной работы

Результаты работы были представлены на международных конференциях: "13th Annual Postdoctorial and Graduate Student Research Conference" (Филадельфия, США, 2008), "Forefronts Symposium on Polycystic Kidney Disease" (Монреаль, Канада, 2008), "The American Society for Cell Biology, 48th Annual Meeting",(Сан-Франциско, США 2008), "14th Annual Postdoctorial

10 and Graduate Student Research Conference" (Филадельфия, США, 2009), II Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2009", (Пермь, 2009), 13-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «биология — наука XXI века» (Пущино, 2009), "The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting" (Сан-Диего, США 2009),

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 171 источников (6 отечественных и 165 зарубежных). Работа содержит 43 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Плотникова, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что киназа AurA присутствует в эпителии почечных канальцев у здоровых индивидов, однако содержание фосфорилированной киназы AurA в этом случае минимально. В эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП по сравнению со здоровыми донорами, уровень фосфорилированной киназы AurA существенно повышен.

2. Отработана оптимальная модель на основе нормальных почечных клеток человека линии НК2, позволяющяя изучать роль киназы AurA в регуляции полицистинов -1 и -2 в норме и в условиях, моделирующих патологию.

3. В норме активированная киназа AurA взаимодействует с полицистинами регулируя их путем фосфорилирования. Гиперактивация киназы AurA приводит к резкому уменьшению выброса кальция через канал, образованный полицистином-2, что характерно для эпителия кист.

4. Ингибирование киназы AurA увеличивает активность кальциевого канала, препятствуя избыточному фосфорилированию полицистина-2, что способствует повышению уровня цитоплазматического кальция, пониженному в кистозном эпителии почек больных ПБП.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Материалы диссертационной работы могут быть использованы для диагностических целей в практике лечебных учреждений при характеристики пролиферативных изменений, происходящих в кистозном эпителии при развитии ПБП. Описанная в данной работе способность ингибитора AurA корректировать такие патологические изменения при ПБП, как снижение уровня цитоплазматического кальция и редукции длины первичной реснички, может способствовать дальнейшему изучению приложения этого ингибитора в терапии ПБП.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плотникова, Ольга Викторовна, Москва

1. Берман Р. Е., Воган В. К. Руководство по педиатрии. М.: Медицина, 1994.-Т. 6.

2. Жажан П. М. Первичная ресничка как механосенсор // Сенсорные системы. 2008. - Т. 22. - №2. - С.99-111.

3. Игнатова М.С., Вельтищев Ю.Е. Детская нефрология. М.: Медицина, 1982.

4. Игнатова М.С., Вельтищев Ю.Е. Эпидемиология хронических болезней почек и других органов мочевой системы. В кн.: Профилактическая и превентивная нефрология (генетические и экопатогенные факторы риска развития нефропатий). М.: Медицина, 1996: 5-10.

5. Осипов И. Б., Колесникова И.Ф. Поликистоз почек у детей (классификация, этиопатогенез, клиника, диагностика, лечебная тактика) // Нефрология. 2000. - № 4. - Р. 97-103.

6. Тареева И.Е. Нефрология. Руководство для врачей, М.: Медицина, 2000.

7. Afzelius В. A. Cilia-related diseases. // J. Pathol. 2004. - № 204. - P. 470477.

8. Agnes B. Fogo J. А. В., Arthur H. Cohen, Robert B. Colvin, J. Charles Jennette. Fundamentals of Renal Pathology. // Springer Science + Business Media, 2006. 2006. - P.

9. Alexandrescu D. Т., Kauffman C. L., and Dasanu C. A. The cutaneous epidermal growth factor network: Can it be translated clinically to stimulate hair growth? // Dermatol Online J. 2009. - № 15. - P. 1

10. Andrews^ P. D., Knatko E., Moore W. J., and Swedlow J. R. Mitotic, ' mechanics: the auroras .come into view; // Curr Opin Cell Biol. 2003.15. P. 672-683. ' ; V

11. Andrews P. D. Aurora kinases: shining lights on the therapeutic horizon? // Oncogene. 2005. № 24. - P. 5005-5015.

12. Anyatonwu G. I., and- Ehrlich B. E. Calcium signaling/and polycystin-2.7/ Biochem Biophys Res Commun. 2004. - №'322: - P: 1364-1373;

13. Berridge M. J., Bootman M. D;, and Roderick H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. -№4.-P. 517-529.

14. Bolanos-Garcia V. M. Aurora kinases. // Int J Biochem Cell Biol. 2005. -№ 37. — P. 1572-1577.

15. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding • //Anal.Biochem. 1976. - № 72. - P.: 248-254.

16. Burtey S., Riera M., Ribe E., Pennenkamp P:, Ranee R., Luciani J., Dworniczakv B.,:.Mattei M: G;, and Fontes Ш. Centrosome overduplication; and mitotic instability in PICD2 transgenic lines. // Cell Biol Int: 2008. -№32.-P. 1193-1198.

17. Cantiello H. F. Regulation of calcium signaling by polycystin-2. // Am J Physiol Renal Physiol. 2004. - № 286. - P. F1012-1029.

18. Cantiello H. F., Montalbetti N., Timpanaro G. A., and Gonzalez-Perrett S. Polycystin-2 as a signal transducer. // Adv Exp Med Biol. 2004. - № 559. -P. 235-244.

19. Carmena M., and Earnshaw W. C. The cellular geography of aurora kinases. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. - № 4. - P. 842-854.

20. Carpinelli P., and Moll J. Aurora kinases and their inhibitors: more than one target and one drug. // Adv Exp Med Biol. 2008. - № 610. - P. 54-73.

21. Cavalier-Smith T. Basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii. // J. Cell Sci. 1974. -№ 16.-P. 529-556.

22. Celic A., Petri E. Т., Demeler В., Ehrlich В. E., and Boggon T. J. Domain mapping of the polycystin-2 C-terminal tail using de novo molecular modeling and biophysical analysis. // J- Biol Chem. 2008. - № 283. -P. 28305-28312.

23. Charron A. J., Nakamura S., Bacallao R., and Wandinger-Ness A. Compromised cytoarchitecture and polarized trafficking in autosomal dominant polycystic kidney disease cells. // J Cell Biol. 2000. - № 149. -P. 111-124.

24. Cheetham G. M., Knegtel R. M., Coll J. Т., Renwick S. В., Swenson L., Weber P., Lippke J. A., and Austen D. A. Crystal structure of aurora-2, anoncogenic serine/threonine kinase. // J Biol Chem. 2002. - № 277. -P. 42419-42422.

25. Cheung С. H., Coumar M. S., Hsieh H. P., and Chang J. Y. Aurora kinase inhibitors in preclinical and clinical testing. // Expert Opin Investig Drugs. -2009.-№ 18.-P. 379-398.

26. Chin D., and Means A. R. Calmodulin: a prototypical calcium sensor. // Trends Cell Biol. 2000. - № 10. - P. 322-328.

27. Choi J., and Husain M. Calmodulin-mediated cell cycle regulation: new mechanisms for old observations. // Cell Cycle. 2006. - № 5. - P. 21832186.

28. Clapham D. E. TRP channels as cellular sensors. // Nature. 2003. - № 426. -P. 517-524.

29. Coumar M. S., Cheung С. H., Chang J. Y., and Hsieh H. P. Advances in Aurora kinase inhibitor patents. // Expert Opin Ther Pat. 2009. - № 19. -P. 321-356.

30. Crane R., Gadea В., Littlepage L., Wu H., and Ruderman J. V. Aurora A, meiosis and mitosis. // Biol Cell. 2004. - № 96. - P. 215-229.

31. Dayanithi G., Viero C., and Shibuya I. The role of calcium in the action and release of vasopressin and oxytocin from CNS neurones/terminals to the heart. // J Physiol Pharmacol. 2008. - № 59 Suppl 8. - P. 7-26.

32. Deane J. A., and Ricardo S. D. Polycystic kidney disease and the renal cilium. // Nephrology (Carlton). 2007. - № 12. - P. 559-564.

33. Defilippi P., Di Stefano P., and Cabodi S. pl30Cas: a versatile scaffold in signaling networks. // Trends Cell Biol. 2006. - № 16. - P. 257-263.

34. Dirksen E. R. Centriole and basal body formation during ciliogenesis revisited.//Biol Cell. 1991.-№72.-P. 31-38.

35. Doxsey S., Zimmerman W., and Mikule K. Centrosome control of the cell cycle. //Trends Cell Biol.- 2005. -№ 15.-P. 303-311.

36. Eggenschwiler J. Т., and Anderson К. V. Cilia and developmental signaling. // Annu Rev Cell Dev Biol. 2007. - № 23. - P. 345-373.

37. Eyers P. A., and Mailer J. L. Regulation of Xenopus Aurora A activation by TPX2. // J Biol Chem. 2004. - № 279. - P. 9008-9015.

38. Ferrari S., Marin O., Pagano M. A., Meggio F., Hess D., El-Shemerly M., Krystyniak A., and Pinna L. A. Aurora-A site specificity: a study with synthetic peptide substrates. // Biochem J. 2005. - № 390. - P. 293-302.

39. Ferrari S. Protein kinases controlling the onset of mitosis. // Cell Mol Life Sci. 2006. - № 63. - P. 781-795.

40. Fisk H. A., Mattison C. P., and Winey M. Human Mpsl protein kinase is required for centrosome duplication and normal mitotic progression. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. № 100. - P. 14875-14880.

41. Flory M. R., Moser M. J., Monnat R. J., Jr., and Davis T. N. Identification of a human centrosomal calmodulin-binding protein that shares homology with pericentrin. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. № 97. - P. 5919-5923.

42. Fogo A. B. Progression versus regression of chronic kidney disease. // Nephrol Dial Transplant. 2006. - № 21. - P. 281-284.

43. Fu X., Wang Y., Schetle N., Gao H., Putz M., von Gersdorff G., Walz G., and Kramer-Zucker A. G. The subcellular localization of TRPP2 modulates its function. // J Am Soc Nephrol. 2008. - № 19. - P. 1342-1351.

44. Fukuda M., Hiraoka N., and Yeh J. C. C-type lectins and sialyl Lewis X oligosaccharides. Versatile roles in cell-cell interaction. // J Cell Biol. -1999. -№ 147. -P. 467-470.

45. Garuti L., Roberti M., and Bottegoni G. Small molecule aurora kinases inhibitors. // Curr Med Chem. 2009. - № 16. - P. 1949-1963.

46. Gay N. J., Packman L. C., Weldon M. A., and Barna J. C. A leucine-rich repeat peptide derived from the Drosophila Toll receptor forms extended filaments with a beta-sheet structure. // FEBS Lett. 1991. - № 291. -P. 87-91.

47. Gazzano-Santoro H., Ralph P., Ryskamp Т. C., Chen А. В., and Mukku V. R. A non-radioactive complement-dependent cytotoxicity assay for anti-CD20 monoclonal antibody. // J Immunol Methods. 1997. - № 202. -P. 163-171.

48. Geng L., Burrow C. R., Li H. P., and Wilson P. D. Modification of the composition of polycystin-1 multiprotein complexes by calcium and tyrosine phosphorylation. // Biochim Biophys Acta. 2000. - № 1535. -P. 21-35.

49. Geng L., Okuhara D., Yu Z., Tian X., Cai Y., Shibazaki S., and Somlo S. Polycystin-2 traffics to cilia independently of polycystin-1 by using an N-terminal RVxP motif. // J Cell Sci. 2006. - № 119. - P. 1383-1395

50. Giamarchi A., Padilla F., Crest M., Honore E., and Delmas P. TRPP2: Ca2+-permeable cation channel and more. // Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). -2006.-№52.-P. 105-114.

51. Giet R., McLean D., Descamps S., Lee M. J., Raff J. W., Prigent C., and Glover D. M. Drosophila Aurora A kinase is required to localize D-TACC to centrosomes and to regulate astral microtubules. // J Cell Biol. 2002. -№ 156.-P. 437-451.

52. Haimo L. Т., and Rosenbaum J. L. Cilia, flagella, and microtubules. // J Cell Biol. 1981. -№91. -P. 125s-130s.

53. Hanaoka K., Qian F., Boletta A., Bhunia A. K., Piontek K., Tsiokas L., Sukhatme V. P., Guggino W. В., and Germino G. G. Co-assembly of polycystin-1 and -2 produces unique cation-permeable currents. // Nature. -2000. № 408. - P. 990-994.

54. Harrell F. E. (2001) Chapter 2. in Regression Modeling Strategies, Springer, New York. P. 123-508.

55. Harris P. C., and Torres V. E. Polycystic kidney disease. // Annu Rev Med. -2009.-№60.-P. 321-337.

56. Harwood L., and Wilson B. Genetics and polycystic kidney disease. // CANNT J. 2004. - № 14. - P. 37.

57. Hidaka S., Konecke V., Osten L., and Witzgall R. PIGEA-14, a novel coiled-coil protein affecting the intracellular distribution of polycystin-2. // J. Biol Chem. 2004. - № 279. - P. 35009-35016.

58. Honda K., Mihara H., Kato Y., Yamaguchi A., Tanaka H., Yasuda H., Furukawa K., and Urano T. Degradation of human Aurora2 protein kinase by the anaphase-promoting complex-ubiquitin-proteasome pathway. // Oncogene.-2000.-№ 19.-P. 2812-2819.

59. Hu J., Bae Y. K., Knobel К. M., and Barr M. M. Casein kinase II and calcineurin modulate TRPP function and ciliary localization. // Mol Biol Cell. -2006.-№ 17.-P. 2200-2211.

60. Hughes J., Ward C. J., Peral В., Aspinwall R., Clark K., San Millan J. L., Gamble V., and Harris P. C. The polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene encodes a novel protein with multiple cell recognition domains. // Nat Genet.- 1995.-№ 10.-P. 151-160.

61. Igarashi P., and Somlo S. Genetics and pathogenesis of polycystic kidney disease. // J Am Soc Nephrol. 2002. - № 13. - P. 2384-2398.

62. Ikezoe T. Aurora kinases as an anti-cancer target. // Cancer Lett. 2008. -P.

63. Kahl С. R., and Means A. R. Regulation of cell cycle progression by calcium/calmodulin-dependent pathways. // Endocr Rev. 2003. - № 24. -P. 719-736.

64. Katayama H., Brinkley W. R., and Sen S. The Aurora kinases: role in cell transformation and tumorigenesis. // Cancer Metastasis Rev. 2003. - № 22.-P. 451-464.

65. Kottgen M., and Walz G. Subcellular localization and trafficking of polycystins. // Pflugers Arch. 2005. - № 451. - P. 286-293.

66. Koulen P., Cai Y., Geng L., Maeda Y., Nishimura S., Witzgall R., Ehrlich В. E., and Somlo S. Polycystin-2 is an intracellular calcium release channel. //Nat Cell Biol. 2002. - № 4. - P. 191-197.

67. Kumar S., Tomooka Y., and Noda M. Identification of a set of genes with developmentally down-regulated expression in the mouse brain. // Biochem Biophys Res Commun. 1992.-№ 185.-P. 1155-1161.

68. Lambert. Polycystic disease of the kidney. // Arch Pathol -1947. -P. 44:34-58.

69. Law S. F., O'Neill G. M., Fashena S. J., Einarson M. В., and Golemis E. A. The docking protein HEF1 is an apoptotic mediator at focal adhesion sites. // Mol Cell Biol. 2000. - № 20. - P. 5184-5195.

70. Leuenroth S. J., Okuhara D., Shotwell J. D., Markowitz G. S., Yu Z., Somlo S., and Crews С. M. Triptolide is a traditional Chinese medicine-derived inhibitor of polycystic kidney disease. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2007. -№ 104.-P. 4389-4394.

71. Li J., Chen L. A., Townsend С. M., Jr., and Evers В. M. PKDl, PKD2, and their substrate Kidins220 regulate neurotensin secretion in the BON human endocrine cell line. // J Biol Chem. 2008. - № 283. - P. 2614-2621.

72. Lina F., and Satlinb L. M. Polycystic kidney disease: the cilium as a common pathway in cystogenesis. // Curr Opin Pediatr. 2004. - № 16. — P. 171-176.

73. Littlepage L. E., and Ruderman J. V. Identification of a new APC/C recognition domain, the A box, which is required for the Cdhl-dependent destruction of the kinase Aurora-A during mitotic exit. // Genes Dev. -2002.-№ 16.-P. 2274-2285.

74. Littlepage L. E., Wu H., Andresson Т., Deanehan J. K., Amundadottir L. Т., and Ruderman J. V. Identification of phosphorylated residues that affect theactivity of the mitotic kinase Aurora-A. // Proc Natl Acad Sci U S A. -2002. -№99. -P. 15440-15445.

75. Loghman-Adham M., Nauli S. M., Soto С. E., Kariuki В., and Zhou J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. // Am J Physiol Renal Physiol. 2003. - № 285. - P. F397-412.

76. Lu K. P., and Means A. R. Regulation of the cell cycle by calcium and calmodulin. // Endocr Rev. 1993. - № 14. - P. 40-58.

77. Ma C., Cummings C., and Liu X. J. Biphasic activation of Aurora-A kinase during the meiosis I- meiosis II transition in Xenopus oocytes. // Mol Cell Biol.-2003.-№23.-P. 1703-1716.

78. Ma R., Li W. P., Rundle D., Kong J., Akbarali H. I., and Tsiokas L. PKD2 functions as an epidermal growth factor-activated plasma membrane channel. // Mol Cell Biol. 2005. - № 25. - P. 8285-8298.

79. Ma Z., Kanai M., Kawamura K., Kaibuchi K., Ye K., and Fukasawa K. Interaction between ROCK II and nucleophosmin/B23 in the regulation of centrosome duplication. // Mol Cell Biol. 2006. - № 26. - P. 9016-9034

80. Marshall W. F. Basal bodies platforms for building cilia. // Curr Top Dev Biol.-2008.-№85.-P. 1-22.

81. Masyuk Т., Masyuk A., and LaRusso N. Cholangiociliopathies: genetics, molecular mechanisms and potential therapies. // Curr Opin Gastroenterol. -2009.-№25.-P. 265-271.

82. Matsumoto Y., and Mailer J. L. Calcium, calmodulin, and CaMKII requirement for initiation of centrosome duplication in Xenopus egg extracts. // Science. 2002. - № 295. - P. 499-502

83. Means A. R. Calcium, calmodulin and cell cycle regulation. // FEBS Lett. -1994.-№347.-P. 1-4.

84. Means A. R. The Year in Basic Science: calmodulin kinase cascades. // Mol Endocrinol. 2008. - № 22. - P. 2759-2765.

85. Meraldi P., Honda R., and Nigg E. A. Aurora-A overexpression reveals tetraploidization as a major route to centrosome amplification in p53-/- cells. //EMBO J.-2002.-№21.-P. 483-492.

86. Michael L. Watson V. E. T. Polycystic Kidney Disease (Oxford Clinical Nephrology Series) // OUP Oxford -1996. P.50-123.

87. Miedel M. Т., Weixel К. M., Bruns J. R., Traub L. M., and Weisz O. A. Posttranslational cleavage and adaptor protein complex-dependent trafficking of mucolipin-1. // J Biol Chem. 2006. - № 281. - P. 1275112759.

88. Montell C., Birnbaumer L., and Flockerzi V. The TRP channels, a remarkably functional family. // Cell. 2002. - № 108. - P. 595-598.

89. Mountzios G., Terpos E., and Dimopoulos M. A. Aurora kinases as targets for cancer therapy. // Cancer Treat Rev. 2008. - № 34. - P. 175-182.

90. Nauli S. M., and Zhou J. Polycystins and mechanosensation in renal and nodal cilia. // Bioessays. 2004. - № 26. - P. 844-856.

91. Nauli S. M., Kawanabe Y., Kaminski J. J., Pearce W. J., Ingber D. E., and Zhou J. Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1. // Circulation. -2008. № 117. - P. 1161-1171.

92. Newby L. J., Streets A. J., Zhao Y., Harris P. C., Ward C. J., and Ong A. C. Identification, characterization, and localization of a novel kidneypolycysticl-polycystin-2 complex. // J Biol Chem. 2002. - № 277. - P. 20763-20773.

93. O'Neill G. M., Fashena S. J., and Golemis E. A. Integrin signalling: a new Cas(t) of characters enters the stage. // Trends Cell Biol. 2000. - № 10. -P. 111-119.

94. Otto E. A., Trapp M. L., Schultheiss U. Т., Helou J., Quarmby L. M., and Hildebrandt F. NEK8 mutations affect ciliary and centrosomal localization and may cause nephronophthisis. // J Am Soc Nephrol. 2008. - № 19. - P. 587-592.

95. Pan J., Wang Q., and Snell W. J. An aurora kinase is essential for flagellar disassembly in Chlamydomonas. // Dev Cell. 2004. - № 6. - P. 445-451

96. Pan J., Wang Q., and Snell W. J. Cilium-generated signaling and cilia-related disorders. // Lab Invest. 2005. - № 85. - P. 452-463.

97. Paredes R. M., Etzler J. C., Watts L. Т., Zheng W., and Lechleiter J. D. Chemical calcium indicators. // Methods. 2008. - № 46. - P. 143-151.

98. Patel V., Li L., Cobo-Stark P., Shao X., Somlo S., Lin F., and Igarashi P. Acute kidney injury and aberrant planar cell polarity induce cyst formation in mice lacking renal cilia. // Hum Mol Genet. 2008. - № 17. -P. 1578-1590.

99. Patel V., Chowdhury R., and Igarashi P. Advances in the pathogenesis and treatment of polycystic kidney disease. // Curr Opin Nephrol Hypertens. -2009.-№ 18. -P. 99-106.

100. Plotnikova О. V., Golemis E. A., and Pugacheva E. N. Cell cycle-dependent ciliogenesis and cancer. // Cancer Res. 2008. - № 68. - P. 2058-2061.

101. Pugacheva E. N., and Golemis E. A. The focal adhesion scaffolding protein HEF1 regulates activation of the Aurora-A and Nek2 kinases at the centrosome. // Nat Cell Biol. 2005. - № 7. - P. 937-946.

102. Pugacheva E. N., and Golemis E. A. HEF1-aurora A interactions: points of dialog between the cell cycle and cell attachment signaling networks. // Cell Cycle.-2006.-№5.-P. 384-391.

103. Pugacheva E. N., Roegiers F., and Golemis E. A. Interdependence of cell attachment and cell cycle signaling. // Curr Opin Cell Biol. 2006. - № 18. -P. 507-515.

104. Pugacheva E. N., Jablonski S. A., Hartman T. R., Henske E. P., and Golemis E. A. HEF1 -dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.//Cell. 2007. - № 129.-P. 1351-1363.

105. Quarmby L. M., and Parker J. D. Cilia and the cell cycle? // J Cell Biol. -2005.-№ 169.-P. 707-710.

106. Ramsey I. S., Delling M., and Clapham D. E. An introduction to TRP channels. // Annu Rev Physiol. 2006. - № 68. - P. 619-647.

107. Rieder C. L., Jensen C. G., and Jensen L. C. The resorption of primary cilia during mitosis in a vertebrate (PtKl) cell line. // J Ultrastruct Res. 1979. -№68.-P. 173-185.

108. Rodat-Despoix L., and Delmas P. Ciliar functions in the nephron. // Pflugers Arch.-2009.-№458.-P. 179-187.

109. Roderick H. L., and Cook S. J. Ca2+ signalling checkpoints in cancer: remodelling Ca2+ for cancer cell proliferation and survival. // Nat Rev Cancer. 2008. -№ 8. - P. 361-375.

110. Rodrigues-Martins A., Riparbelli M., Callaini G., Glover D. M., and Bettencourt-Dias M. From centriole biogenesis to cellular function: centrioles are essential for cell division at critical developmental stages. // Cell Cycle.-2008.-№7.-P. 11-16.

111. Ryan M. J., Johnson G., Kirk J., Fuerstenberg S. M., Zager R. A., and Torok-Storb В. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. // Kidney Int. 1994. - № 45. - P. 48-57.

112. Sagara Y., and Inesi G. Inhibition of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport ATPase by thapsigargin at subnanomolar concentrations. // J Biol Chem. 1991. - № 266. - P. 13503-13506.

113. Santos N., and Reiter J. F. Building it up and taking it down: the regulation of vertebrate ciliogenesis. // Dev Dyn. 2008. - № 237. - P. 1972-1981.

114. Schneider L., Clement C. A., Teilmann S. C., Pazour G. J., Hoffmann E. K., Satir P., and Christensen S. T. PDGFRalphaalpha signaling is regulated through the primary cilium in fibroblasts. // Curr Biol. 2005. - № 15. - P. 1861-1866.

115. Schumann F., Hoffmeister H., Bader R., Schmidt M., Witzgall R., and Kalbitzer H. R. Ca2+-dependent conformational changes in a C-terminalcytosolic domain of polycystin-2. // J Biol Chem. 2009. - № 284. -P. 24372-24383.

116. Shiba D., Takamatsu Т., and Yokoyama T. Primary cilia of inv/inv mouse renal epithelial cells sense physiological fluid flow: bending of primary cilia and Ca2+ influx. // Cell Struct Funct. 2005. - № 30. - P. 93-100.

117. Singh M., Cowell L., Seo S., O'Neill G., and Golemis E. Molecular basis for HEF1/NEDD9/Cas-L action as a multifunctional co-ordinator of invasion, apoptosis and cell cycle. // Cell Biochem Biophys. 2007. - № 48. -P. 54-72.

118. Sutters M. The pathogenesis of autosomal dominant polycystic kidney disease. // Nephron Exp Nephrol. 2006. - № 103. - P. el49-155.

119. Toftgard R. Two sides to cilia in cancer. // Nat Med. 2009. - № 15. - P. 994-996.

120. Torres V. E., and Harris P. C. Mechanisms of Disease: autosomal dominant and recessive polycystic kidney diseases. // Nat Clin Pract Nephrol. 2006. -№2.-P. 40-55; quiz 55.

121. Torres V. E., and Harris P. C. Polycystic kidney disease: genes, proteins, animal models, disease mechanisms and therapeutic opportunities. // J Intern Med.-2007.-№261.-P. 17-31.

122. Torres V. E., and Harris P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. // Kidney Int. 2009. - № 76. - P. 149-168.

123. Tsiokas L., Arnould Т., Zhu C., Kim E., Walz G., and Sukhatme V. P. Specific association of the gene product of PKD2 with the TRPC1 channel. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. № 96. - P. 3934-3939.

124. Tsiokas L., Kim S., and Ong E. C. Cell biology of polycystin-2. // Cell Signal. 2007. - № 19. - P. 444-453.

125. Tucker R. W., Pardee А. В., and Fujiwara K. Centriole ciliation is related to quiescence and DNA synthesis in 3T3 cells. // Cell. 1979. - № 17. -P. 527-535.

126. Vader G., and Lens S. M. The Aurora kinase family in cell division and cancer. // Biochim Biophys Acta. 2008. - № 1786. - P. 60-72.

127. Veland I. R., Awan A., Pedersen L. В., Yoder В. K., and Christensen S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. // Nephron Physiol. 2009. - № 111. - P. 39-53.

128. Venkatachalam K., Hofmann Т., and Montell C. Lysosomal localization of TRPML3 depends on TRPML2 and the mucolipidosis-associated protein TRPML1. // J Biol Chem. 2006. - № 281. - P. 17517-17527.

129. Vergarajauregui S., and Puertollano R. Two di-leucine motifs regulate trafficking of mucolipin-1 to lysosomes. // Traffic. 2006. - № 7. - P. 337353.

130. Walter A. O., Seghezzi W., Korver W., Sheung J., and Lees E. The mitotic serine/threonine kinase Aurora2/AIK is regulated by phosphorylation and degradation. // Oncogene. 2000. - № 19. - P. 4906-4916.

131. Watson T. L. Polycystic Kidney Disease. // Oxford University Press. 1996. -P. 345-670.

132. Watson T. L. Polycystic Kidney Disease. // Oxford University Press. 2006. -P. 23-78.

133. Wiederhold M. L. Mechanosensory transduction in "sensory" and "motile" cilia. // Annu Rev Biophys Bioeng. 1976. - № 5. - P. 39-62.

134. Wilson P. D. Polycystic kidney disease: new understanding in the pathogenesis. // Int J Biochem Cell Biol. 2004. - № 36. - P. 1868-1873.

135. Wilson P. D. Polycystic kidney disease. // N Engl J Med. 2004. - № 350. -P. 151-164.

136. Wilson P. D. Mouse models of polycystic kidney disease. // Curr Top Dev Biol.-2008.-№84.-P. 311-350.

137. Yoder В. K. Role of primary cilia in the pathogenesis of polycystic kidney disease.//J Am Soc Nephrol. 2007. - № 18.-P. 1381-1388.

138. Особую благодарность автор выражает своим родным и близким за любовь, понимание и терпение.