Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли экстраклеточных рибонуклеаз на модели трансгенных растений табака

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли экстраклеточных рибонуклеаз на модели трансгенных растений табака"

804669114

На правах рукописи

САНГАЕВ СОДНОМ СЕРГЕЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ НА МОДЕЛИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА (МСОТММЛ ТАВАСиМЬ.)

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН

Новосибирск 2010

004609114

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент Кочетов А. В.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Першина Л. А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Беклемишев А.Б. Институт биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН, г. Владивосток

Защита диссертации состоится «312010 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «Ц» fl tru/c/ш 2010

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Функции экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз растений в настоящее время малоизучены. Известно, что экспрессия генов некоторых экстраклеточных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, при фосфатном голодании, в стареющих тканях растений, а также при инфекции.

Предполагают, что одна из функций этих ферментов может быть связана с механизмами неспецифической защиты от патогенов вирусной и грибковой природы (Galiana et al, 1997; Hugot et al., 2002; LeBrasseur et al, 2002). Это предположение основано, в частности, на том, что экспрессия некоторых генов S-подобных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, причем не только локально (в месте повреждения), но и системно (Ye and Droste, 1996; Lers et al, 1998; LeBrasseur et al, 2002). Для многих вирусов покровные ткани растения являются труднопреодолимым барьером, и поранение, вызванное механическим повреждением, позволяет им проникнуть в растение. Принимая во внимание тот факт, что у большинства вирусов растений генетический материал представлен РНК, можно предположить, что экстраклеточные РНКазы, индуцируемые поранением, являются одним из компонентов противовирусной защиты на начальных этапах инфекции. Однако причины повышения РНКазной активности и функциональная роль индуцированных РНКаз именно в вирусоустойчивости пока остаются неясными. Так, индукция рибонуклеаз может быть вызвана собственно повреждением тканей или их преждевременным старением и отмиранием и может быть необходима для ремобилизации фосфата (Green, 1994).

С другой стороны, в некоторых тестах in vitro и in planta показана противогрибковая активность экстраклеточной РНКазы табака (Hugot et al., 2002). Данных о противовирусной активности экстраклеточных РНКаз растений нет, однако показано, что экзогенное нанесение панкреатической РНКазы быка (РНКазы А) вместе с вирусным инокулюмом защищает растения от вируса табачной мозаики (ВТМ) (Galiana et al., 1997). Кроме того, трансгенные растения табака, экспрессирующие РНКазу А быка, характеризуются повышенной устойчивостью к ВТМ (Trifonova et al., 2007). Эти результаты не означают, что растительные рибонуклеазы также обладают противовирусной активностью, поскольку наблюдаемый эффект может быть связан со специфическими свойствами РНКазы А. Однако участие рибонуклеаз растительного происхождения в механизмах вирусоустойчивости весьма вероятно.

По-видимому, S-подобные рибонуклеазы растений могут выполнять и другие, не известные в настоящее время функции. Для некоторых экстраклеточных РНКаз показана экспрессия на ранних стадиях развития (Rogers and Rogers, 1999; Köck et al, 2004; Hillwig et al, 2008). Это дает основания полагать, что некоторые S-подобные РНКазы участвуют в контроле процессов роста и развития.

В целом, имеющиеся данные указывают на то, что S-подобные РНКазы могут быть задействованы в ряде важных биологических процессов (прорастание, развитие, ремобилизация фосфата, стрессоустойчивость, формирование

устойчивости к патогенам - особый интерес представляет возможное участие РНКаз в формировании неспецифической вирусоустойчивости). Большая часть из этих функций пока остаются недоказанными, что обусловливает актуальность проведения исследований в этом направлении.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в создании трансгенных растений табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз и исследовании на этой модели функциональной роли экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к патогенам, а также в процессах роста и развития.

Были поставлены следующие задачи:

1. создание генетических конструкций, обеспечивающих повышенный и сниженный уровень рибонуклеазной активности в апопласте;

2. получение трансгенных растений табака с увеличенным и сниженным уровнем рибонуклеазной активности в апопласте;

3. анализ вирусоустойчивости трансгенных и контрольных растений;

4. сравнительный анализ трансгенных и контрольных растений табака по морфологии и срокам развития.

Научная новизна. Создана новая генетическая модель - трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз (увеличенной и сниженной по сравнению с контролем). Показано, что в нормальных условиях трансгенные растения не проявляют значимых отличий от растений исходной линии по морфологическим параметрам. Впервые показано, что повышенный уровень РНКазной активности в апопласте вследствие конститутивной экспрессии РНКазы ZRNasell Zinnia elegans сопровождается повышенной вирусоустойчивостью растений, что подтверждает гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании вирусоустойчивости. Кроме того, результаты анализа полученных модельных растений позволяют предположить, что в нормальных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не влияет на процессы роста и развития растений.

Практическая ценность. Показано, что экстраклеточные рибонуклеазы растений могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с повышенной вирусоустойчивостью. Получен патент; Заявка 2009109530 Российская федерация. МПК C12N15/82. Рекомбинантная плазмида, обеспечивающая экспрессию гена экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans ZRNasell в трансгенных растениях (варианты) и способ получения вирусоустойчивых форм растений. / Авторы: Трифонова Е.А., Сангаев С .С., Романова A.B., Кочетов A.B., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И, Шумный В.К.; заявитель: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ СО РАН); приоритет 16.03.2009. решение о выдаче патента от 04.02.2010.

Положения, выносимые на защиту.

1. Генетическая конструкция pBi-Nk, несущая двуцепочечный РНК-супрессор гена экстраклеточной РНКазы Nkl Nicotiana tabacum, обеспечивает существенное снижение активности РНКазы Nkl.

2. Генетическая конструкция pBi-RNS, несущая кДНК экстраклеточной РНКазы ZRNasell Zinnia elegans под управлением промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, обеспечивает эффективную экспрессию РНКазы ZRNasell и существенное увеличение общей рибонуклеазной активности в апопласте табака.

3. Трансгенные растения, конститутивно экспрессирующие РНКазу ZRNasell, характеризуются повышенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики.

4. Трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз не проявляют существенных отличий от растений исходной линии по морфологическим характеристикам и параметрам развития.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007 г.); на Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007 г.); на Международной научной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2008 г); на Российско -Французской конференции "Problems and prospects in plant biotechnology" (Новосибирск, 2008 г.); на Германо - Российском биотехнологическом форуме (Новосибирск, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы в рецензируемых журналах и получен 1 патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Для получения кДНК гена ZRNasell использовались растения циннии Zinnia elegans. Для получения кДНК гена Nkl и для получения трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. в качестве исходного материала была использована линия табака (N. tabacum) SRI (2n=48).

Бактериальные штаммы. Для генно-инженерных работ использовали штамм Escherichia coli XL-1 Blue. Для трансформации растений использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGLO.

Плазмнды. При создании генетических конструкций использовались плазмиды pBluescript II SK (Fermentas) и pRT104 (Topfer et al., 1987), а также бинарные векторы для трансформации растений pBilOl и pBil21 (Jefferson, 1989).

Получение генетических конструкций. Для получения генетических конструкций использовали стандартные методы молекулярного клонирования (Маниатис и др., 1984).

Получение трансгенных растений табака. Трансформацию растений табака проводили путем кокультивирования листовых дисков с A. tumefaciens. Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS (Murashige and Scoog, 1962) с добавлением соответствующих растительных гормонов и селектирующего агента (канамицина). Для проведения экспериментов трансформанты размножали с помощью микроклонирования. Семена трансгенных растений поколения Т( получали путем самоопыления трансформантов. Семена поколения Т2 получали с помощью самоопыления растений поколения Ti, устойчивых к канамицину.

Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из листьев контрольных и трансгенных растений с использованием набора Genomic DNA purification kit (Fermentas). 15 мкг выделенной геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Hindlll, фракционировали в 0.75% агарозном геле и переносили на заряженную нейлоновую мембрану капиллярным способом. В качестве зонда использовался фрагмент Т-ДНК конструкции, использованной для трансформации.

Получение белковых экстрактов. В работе использовались грубые листовые экстракты и смывы апопластной жидкости. Грубые листовые экстракты получали согласно (Blank and McKeon, 1989) из пробирочных растений 4-6 недельного возраста, выращенных в стандартных условиях. Смывы апопластной жидкости получали по методике (Сапоцкий и др., 2001) из растений 8-12-недельного возраста, выращенных в условиях теплицы. В полученных белковых экстрактах и смывах апопластной жидкости определяли концентрацию суммарного растворимого белка по Брэдфорду (Bradford, 1976) и использовали их для дальнейших экспериментов.

Измерение уровня рибонуклеазной активности в белковых экстрактах производили путем измерения изменения количества кислоторастворимого материала в суммарной РНК дрожжей (Blank and McKeon, 1989). На каждую реакцию брали объем экстракта, содержащий 25 мкг суммарного растворимого белка.

Анализ спектра белков с рибонуклеазной активностью в белковых экстрактах из листьев первичных трансформантов и контрольных растений табака проводили по методике (Yen and Green, 1991) с модификациями. Аликвоты, содержащие 25 мкг суммарного растворимого белка, смешивали с буфером для нанесения белков, инкубировали при 95°С в течение 3 минут и проводили электрофорез в денатурирующих условиях, используя полиакриламидный гель с добавлением в состав разделяющего геля суммарной РНК дрожжей в концентрации 2 мг/мл. После электрофореза гель отмывали от SDS для ренатурации белков, инкубировали в буфере для ферментативной деградации субстрата, отмывали и окрашивали в растворе толуидинового голубого О. Окрашенный гель отмывали, при этом на синем фоне белки с РНКазной активностью проявлялись белыми полосами, интенсивность которых зависела от активности (в данных условиях) и количества белка.

Определение содержания вирусного антигена в листовых экстрактах проводили согласно (Сапоцкий и др., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание генетических конструкций. В данной работе нас интересовали экстраклеточные РНКазы, индуцируемые при поранении, в связи с их возможной ролью в формировании устойчивости к вирусам. Согласно литературным данным, для генов РНКаз ZRNasell Zinnia elegans и Nkl Nicotiana tabacum характерна индукция экспрессии в ответ на поранение (Ye and Droste, 1996; Ohno and Ehara, 2005). Кроме того, для гена РНКазы Nkl N. tabacum показана индукция в ответ на вирусную инфекцию.

Для получения растений табака с измененной активностью экстраклеточных РНКаз были получены две генетические конструкции на базе бинарных векторов pBilOl и pBil21 для трансформации растений (Jefferson, 1989) (рис. 1). Конструкция pBi-RNS содержит белок-кодирующую последовательность гена РНКазы ZRNasell Zinnia elegans под управлением промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Конструкция pBi-Nk содержит двуцепочечный РНК-супрессор гена экстраклеточной РНКазы Nkl Nicotiana tabacum. Мы называем этот супрессор «двуцепочечным», потому что он содержит фрагменты кДНК РНКазы Nkl в виде инвертированного повтора (Nk-s и Nk-as). При экспрессии такой конструкции синтезированная РНК будет самокомплементарна и сможет образовывать протяженный двуцепочечный участок. Согласно литературным данным, использование двуцепочечного супрессора эффективнее использования антисмыслового супрессора для подавления активности генов (Wang and Waterhouse, 2000).

RB NoS Pro NoS Тег 35S CaMV C.MV po»rt L„

promoter siflnaJ

A -^j ЙРТГ~ -ИЩ—{ >-) ZRNasell -ДД-^

KB NoS Pro NcfiTer 35s CaMV NoSTer LB

promoter

Б 4 rirnT^ Ш ' v I NK-s ^Ч^ГЩ^

Рисунок 1. Области Т-ДНК полученных генетических конструкций (А - pBi-RNS; Б -pBi-Nk): ZRNasell - белок-кодирующая последовательность гена ZRNasell Zinnia elegans; Nk-s Nk-as - смысловой и антисмысловой фрагменты кДНК РНКазы Nkl Nicotiana tabacum; 35S CaMV promoter - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; NPTII - ген неомицинфосфотрансферазы II Е. coli, CaMV polyA-signal, NoS Ter - сигналы полиаденилирования; NoS Pro - промотор гена нопалинсинтазы А. mmefaciens; RB и LB - повторы, ограничивающие область Т-ДНК.

Получение трансформантов табака и подтверждение наличия генетической конструкции в геноме. Полученными конструкциями трансформировали компетентные клетки A. tumefaciens методом прямой трансформации. Трансформация N. tabacum была проведена методом агробактериальной трансфекции листовых дисков. Были получены 24 независимых трансформанта табака, несущих конструкцию pBi-RNS, и 35 независимых трансформантов табака, несущих конструкцию pBi-Nk.

Первичный скрининг и отбор трансформантов проводили, измеряя суммарную РНКазную активность в белковых экстрактах с помощью пробирочных тестов (Blank and McKeon, 1989). Прямой отбор растений с желаемым уровнем РНКазной активности позволил не проводить молекулярно-генетический анализ всех трансформантов. Тем не менее, у ряда трансформантов наличие полной встройки трансгена было подтверждено с помощью ПЦР, а также с помощью Саузерн-блот гибридизации (рис. 2).

■Ф- эоооан.

Рисунок 2. Доказательство присутствия трансгенных конструкций в геноме полученных трансформантов:

А. Электрофореграмма ПЦР со специфическими праймерами на белок-кодирующую часть гена РНКазы ZRNasell с геномной ДНК трансформантов табака, несущих конструкцию pBi-RNS (№1, №2, №5, №10). В качестве положительного контроля использовалась плазмида pBi-RNS, в качестве отрицательного - ДНК нетрансгенного растения табака линии SRI.

Б. Саузерн-блот гибридизация: 1,4- геномная ДНК нетрансгенных растений исходной линии SRI (контроль); 2, 3, 5, 6- геномная ДНК трансформантов, несущих конструкцию pBi-Nk (Nkl 1, Nk8, Nk4 и Nk2, соответственно). В качестве зонда использовался участок Т-ДНК, содержащий ген неомицинфосфотрансферазы (прПГ) и терминатор из гена нопалинсинтазы (NoS Ter).

Рибонуклеазная активность и спектр белков с РНКазной активностью у трансформантов. Уровень РНКазной активности определяли как в грубых листовых экстрактах, содержащих белки различной локализации (внутриклеточные и экстраклеточные), так и в смывах апопластной жидкости, содержащих преимущественно экстраклеточные белки. Апопласт, или свободное пространство - это часть внеклеточного объема ткани, содержимое которой может легко обмениваться с внутриклеточным содержимым (Чиков, 1998).

Трансформанты табака, несущие РНКазу ZRNasell, характеризуются высоким уровнем РНКазной активности в грубых экстрактах (рис. ЗА) и в смывах апопластной жидкости (рис. ЗБ). При этом в спектре белков с РНКазной активностью (рис. 4А) имеются два дополнительных сигнала, интенсивность которых коррелирует с уровнем РНКазной активности (рис. 4Б). Эти результаты показывают, что в трансформантах табака РНКаза ZRNasell Zinnia elegans эффективно экспрессируется и локализована в апопласте.

Были отобраны трансформанты №1, №2, №5, №10, №16 и №23, условно подразделенные на 3 группы по уровню экспрессии трансгенной РНКазы -высокий (№1 и №2), средний (№5 и №10) и низкий (№16 и №23). В серии измерений уровень рибонуклеазной активности у отобранных трансформантов был определен точнее. Результаты этих измерений приведены в таблице на рисунке 4В. У отобранных трансформантов рибонуклеазная активность в грубых листовых экстрактах в 5-15 раз превышает таковую у нетрансгенных растений.

У трансформантов табака, несущих двуцепочечный супрессор РНКазы Nkl, уровень РНКазной активности в апопласте приблизительно в два раза ниже, чем у контрольных растений (рис. 5А). Анализ спектра белков с рибонуклеазной активностью у трансформантов показал, что у этих растений отсутствует или значительно снижена активность одной из РНКаз (рис. 5Б).

А Б

Рибонуклеазная активность в грубых листовых экстрактах трансфоршнтов табака, 0 несущих конструкцию pBi-RNS

I

ЕШ

Ш

SR) 1)2 3 < 5 )б Т е 9! 10 '11 12 13 И

растения

>18 ,17 1в (9 20 21 22 23 !2*

Рибонуклеазная активность в смывах апопластной жидкости трансформантоа табака, ооясе несущих конструкцию pBi-RNS

И

RNS1 RMS2 RNS5 RNS10 RNS23 SR 1

растения

Рисунок 3. РНКазная активность в грубых листовых экстрактах (А) и в смывах апопластной жидкости (Б) у трансформантов, несущих конструкцию pBi-RNS. На рисунке А приведен первичный скрининг трансформантов. Кружками выделены отобранные трансформанты. На рисунке Б - анализ ряда отобранных трансформантов. В качестве контроля использовались нетрансгенные растения табака линии SRI.

RNS1

RNS5

SR1

OD2fo

—i—

—t—

г—,

RNS1

RNS5

SR1

Линии растений Средняя OD2a>, грубый листовой экстракт Среднеквадр. отклонение

pBi-RNS1 17.9 1.39

pBi-RNS2 18.8 0.76

pBi- RNS5 8.6 1.03

pBi-RNS10 12.5 2.60

pBi-RNS16 4.6 1.45

pBi-RNS23 5.5 1.22

SRI 1.3 0.43

Рисунок 4. А. Спектр белков с рибонуклеазной активностью в грубых экстрактах трансформантов №1 и №5, несущих РНКазу ZRNasell Z. elegans (стрелками указаны сигналы, соответствующие трансгенной РНКазе). Б, В. Рибонуклеазная активность в грубых листовых экстрактах трансформантов, экспрессирующих РНКазу ZRNasell 2. elegans. В качестве контроля использовались нетрансгенные растения табака линии SRI.

Nk4 NkS Nk11

растения

RNS5

. ZRNasell . NK1

Рисунок 5. А. Рибонуклеазная активность в смывах апопластной жидкости трансформантов табака, несущих конструкцию pBi-Nk. Б. Анализ спектра белков с рибонуклеазной активностью в грубых экстрактах трансформантов табака, несущих супрессор Nkl Nicotiana tabacum. В качестве контроля использовались нетрансгенное растение табака SRI и трансформант, экспрессирующий РНКазу циннии ZRNasell (RNS5).

RNS5 SR1 NK11 SR1 RNS5

•*— ZRNasell

pH 6.0 pH 7.0

Рисунок 6. Сравнение спектра белков с рибонуклеазной активностью в грубых экстрактах растений табака при pH 6.0 и pH 7.0. На каждую дорожку нанесено по 25 мкг суммарного растворимого белка. Использовались нетрансгенное растение табака (SRI), трансформант, несущий супрессор гена Nkl fNkll), и трансформант, экспрессирующий РНКазу циннии ZRNasell (RNS5).

РНКаза, инактивируемая у растений, несущих супрессор гена Nkl, в норме (у нетрансгенного растения табака линии SRI) выделяется на фоне остальных РНКаз своей довольно высокой активностью при pH 6.0, однако не детектируется при pH 7.0 (рис. 6). Такая зависимость ферментативной активности от pH характерна для других экстраклеточных S-подобных РНКаз (Yen and Green, 1991; Kariu et al„ 1998; Okabe et ed., 2005).

В целом, результаты анализа РНКазной активности в апопласте и спектра белков с РНКазной активностью в грубых экстрактах растений табака, несущих двуцепочечный супрессор РНКазы Nkl, показывают, что у этих растений происходит эффективное снижение активности этой РНКазы.

Стабильность экспрессии трансгенных конструкций в поколениях.

Стабильность экспрессии трансгенных конструкций в поколениях оценивали с помощью анализа наследования маркерного гена nptll, обеспечивающего устойчивость к канамицину (у растений табака, не имеющих к нему устойчивости, развивается хлороз). Семена, полученные от самоопыления трансформантов, высаживали на среду MS с добавлением канамицина (200 мг/л). Если в геноме трансформанта (поколение Т0) имеется единичная инсерция гена nptll, то соотношение между числами зеленых и хлоротичных проростков (поколение Ti) должно составлять 3:1. Соответственно, двум копиям трансгена должно соответствовать соотношение 15 : 1. Однако если имеет место генетический сайленсинг, то наблюдаемое соотношение будет отличаться от стандартного.

Потомки (поколение Tt) двух из пяти взятых для анализа трансформантов, несущих конструкцию pBi-RNS, проявляли замолкание экспрессии маркерного гена. Такая высокая степень замолкания, по-видимому, объясняется применением сильного конститутивного промотора вирусной природы (промотор 35S РНК ВМЦК), а также, возможно, наличием нескольких инсерций трансгенной конструкции (Arciello et al., 2003). Потомки трансформантов №1 и

№5 характеризуются стабильной экспрессией nptll как минимум в двух поколениях (Ti и Т2). При этом согласно результатам сегрегационного анализа, эти трансформанты несут единичную инсерцию генетической конструкции. Наблюдаемая стабильность экспрессии единичных инсерций Т-ДНК (несущих кодирующие последовательности ДНК в смысловой ориентации) согласуется с литературными данными (Arciello et al., 2003).

Анализ стабильности экспрессии гена nptll в конструкции pBi-Nk в поколении Т) показал, что в большинстве случаев также наблюдается та или иная степень замолкания маркерного гена. Такое замолкание является вполне закономерным при применении двуцепочечных РНК-супрессоров, так как часто происходит генетический сайленсинг не только гена-мишени, но и конструкции, обеспечивающей его индукцию. Этот феномен затруднил получение и анализ гомозигот по встройке конструкции pBi-Nk.

В то же время стоит отметить, что замолкание маркерного гена не отражает неэффективной работы генетической конструкции, несущей супрессор. Наоборот, по-видимому, существует положительная корреляция между замолканием маркерного гена nptll и эффективностью инактивации гена-мишени Nkl.

Морфология и вирусоустойчивость трансгенных растений. Для

сравнительного анализа всхожести и скорости прорастания семян растений, экспрессирующих РНКазу ZRNasell Zinnia elegans, были использованы семена (поколение Т2) линий RNS 1.5, RNS 1.6 и RNS 5.4, гомозиготных по инсерции конструкции pBi-RNS, и семена исходных нетрансгенных растений линии SR1. Обнаружено, что при проращивании в стерильных условиях на среде MS при t = 22°С семена трансгенных и контрольных линий не отличаются друг от друга по энергии прорастания (рис. 7А).

Проростки поколения Т2 линий RNS 1.5, RNS 1,6 и RNS 5.4 и проростки линии SR1, использованные при сравнительном анализе всхожести и скорости прорастания семян, были пересажены в горшки и выращивались при t = 22°С до наступления стадии цветения. У растений была измерена длина стебля и был произведен подсчет числа листьев (рис. 8). Полученные результаты показывают, что по морфологическим параметрам трансгенные растения табака, экспрессирующие РНКазу ZRNase II Z elegans, не проявляют видимых отличий от контрольных растений табака. Кроме того, трансгенные растения, экспрессирующие РНКазу ZRNase II, не отличаются от контрольных растений по срокам цветения.

Сравнительный анализ всхожести и скорости прорастания семян растений, несущих супрессор рибонуклеазы Nkl Nicotiana tabacum, проводили на семенах поколения Tj, полученных при самоопылении первичных транформантов. В этом случае должно наблюдаться расщепление (в зависимости от копийности T-ДНК инсерции). И если супрессия гена Nkl приводит к морфофизиологическим отличиям, проростки на чашке должны были бы быть неодинаковы. Однако при проращивании в стерильных условиях на среде MS при t = 22°С проростки поколения Т, не отличаются от контрольных по всхожести и скорости прорастания (рис. 7Б). Кроме того, при

работе с первичными трансформантами табака, несущими генетическую конструкцию рВьКк, не было обнаружено существенных морфологических отличий от нетрасгенных растений табака.

RNS 1.5 SRI SRI Nk 8

.и

Ж : W

W >№

Рисунок 7. Сравнительный анализ всхожести и скорости прорастания растений, несущих конструкции pBi-RNS и pBi-Nk:

А. RNS 1.5 - потомки трансформанта №1 (поколение Тг), гомозиготные по инсерции Т-ДНК pBi-RNS;

Б. Nk 8 - потомки трансформанта №8, несущего конструкцию pBi-Nk (поколение Ti), полученные самоопылением.

В качестве контроля использовались нетрансгенные семена табака линии SRI.

• ••

SR1 RNS 1.5 RNS 1.6 RNS 5.4 растения

RNS 1.5 RNS 1.6 RNS 5.4 растения

Рисунок 8. Сравнительный морфометрический анализ контрольных (линия SRI табака) и трансгенных растений поколения Тг, несущих РНКазу ZRNasell Zinnia elegans: А. Длина стебля; Б. Число листьев.

Эти результаты указывают на то, что в нормальных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не оказывает заметного влияния на процессы роста и развития. Однако остается открытым вопрос о влиянии уровня РНКазной активности в апопласте на развитие растений в условиях, отличающихся от тепличных или in vitro.

Этот результат находится в согласии с данными, полученными при анализе трансгенных растений Lycopersicon esculentum, несущих антисмысловой супрессор внутриклеточной S-подобной РНКазы LX (Lers et al., 2006). Растения, характеризовавшиеся пониженной экспрессией РНКазы LX, не проявляли существенных фенотипических отличий от нетрансгенных растений при выращивании на стандартной среде в условиях in vitro.

Нами также была протестирована вирусоустойчивость микроклонированных первичных трансформантов, экспрессирующих РНКазу ZRNasell Zinnia elegans. Из проанализированных четырех независимых трансформантов три (№1, №5 и №10) продемонстрировали значительную задержку в развитии симптомов болезни в зависимости от концентрации вируса табачной мозаики (ВТМ) в инокулюме и при этом характеризовались пониженным накоплением вирусного белка (табл. 1). Тот факт, что трансформант №2 не отличался от контрольных растений по вирусоустойчивости, по-видимому, объясняется Т-инсерционным мутагенезом -вероятно, встройка Т-ДНК привела к мутации, ослабившей устойчивость этого трансформанта к ВТМ.

Полученные результаты показывают, что высокий уровень активности РНКазы ZRNasell Zinnia elegans повышает устойчивость трансгенных растений табака к ВТМ, и подтверждают гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в механизмах защиты от патогенов. Эти результаты согласуются с данными, полученными при анализе вирусоустойчивости растений табака, экспрессирующих панкреатическую РНКазу быка (Trifonova et al., 2007).

В настоящее время механизмы противовирусного действия экстраклеточных РНКаз остаются неясными. Вероятно, экстраклеточные РНКазы могут повреждать геномную РНК вирусов на тех стадиях инфекционного процесса, когда она открыта для внешнего воздействия. Также можно предположить, что во время инокуляции при поранении тканей РНКазы из апопласта могут проникать в поврежденные клетки и убивать их (разрушая пул клеточных мРНК), что не дает вирусу возможности размножиться (Trifonova et al., 2007). Последний механизм может действовать и в естественных условиях: проникновение вирусов в растение, как правило, связано с механическим повреждением тканей растения, что, в свою очередь, позволяет экстраклеточным РНКазам проникать в клетки и должно вызывать гибель поврежденных клеток вследствие цитотоксического действия этих белков.

Таблица 1. Проявление симптомов болезни* и содержание вирусного антигена в листьях контрольных и трансгенных растений табака (То) (мкг/см2 поверхности листа)

Растения Концентрация BTM в инокулюме, мкг/мл

0.01 0.10 1.00 10.00

7ДПИ

SRI «—» 0 «-» 19.Ш.2 «-»33.4±2.1 «-» 93.4±2.6

RNSI «-» 0 «-»0 «-» 12.7±2.6 «-» 22.9±2.2

RNS2 «-» 0 «-» 0 «-»41.4±1.9 «-» 56.1 ±2.8

RNS5 «-» 0 «-» 0 «-» 1.3±1.1 «-» 3.9±2.3

RNS10 «-»0 «-» 0 «-» 14.0±2.3 «-»20.1±1.4

14ДПИ

SRI «-»0 «+» 59.9±4.4 «+» 100.0±4.2 «+» 162.4±2.5

RNSI «-»0 «-»0 «-» 18.5±2.0 «-»2б.1±2.0

RNSZ «-»0 «+» 64.0±2.7 «+» 140.0±4.2 «+» 179.0±4.0

RNS5 v-» 0 «—» 0 «-»3.3± 2.1 «-» 4.2±2.3

RNS10 «-»0 «—» 0 «-» 26.0±2.0 «-» 29.4±1.4

21ДПИ

SRI «+» 29,3±3,6 «+» 146,5±6,4 «+» 125,8±8,4 «+» 191,1±5J

RNSI «-»0 «-»0 «+» 30.5±2.3 «+» 39.0±4.3

RNS2 «-»0 «+» 116,1 ±2,4 «+» 131,о±м «+)> 200,8±4,0

RNS5 «-»0 «-»0 «-» 6.4±2.4 «-» 10.4±2.4

RNS10 «-»0 «-» 0 «-»36.1 ±2.1 «+»39.2i2.3

•Наличие фенотипических симптомов болезни определялось на 7, 14 и 21 день после инокуляции (ДЛИ): «-» - симптомы отсутствовали; «+» - симптомы присутствовали.

Трансгенные растения как модель для изучения функций S-подобных РНКаз. Насколько нам известно из литературных данных, число работ, посвященных изучению функциональной роли S-подобных рибонуклеаз и связанных с созданием трансгенных растений, невелико. При этом большинство из них включает в себя анализ активности промоторов исследуемых генов с помощью генов-репортеров (Gross et al., 2004; Kock et al., 2004; Kock et al., 2006; Hillwig et al., 2008). Получение трансгенных растений с измененной активностью S-подобных РНКаз - один из перспективных подходов для изучения их функций на белковом уровне. Из литературы нам известны две работы, связанные с получением и анализом растений со сниженной активностью изучаемой РНКазы. В работе Bariola et al. (1999) были получены растения арабидопсиса с пониженной экспрессией экстраклеточной РНКазы

RNS1 и внутриклеточной RNS2. Работа Lers et al. (2006) была посвящена анализу трансгенных растений Lycopersicon esculentum с пониженной экспрессией гена внутриклеточной РНКазы LX.

Таким образом, до настоящего времени растения арабидопсиса с пониженной экспрессией экстраклеточной РНКазы RNS1 были единственной генетической моделью с пониженной активностью экстраклеточной S-подобной РНКазы. Следовательно, полученные в данной работе трансгенные растения табака с пониженной активностью РНКазы Nkl - еще одна модель такого рода, пригодная для изучения функций экстраклеточных РНКаз растений. Стоит отметить, что трансгенные растения, полученные в рамках данной работы, характеризуются более эффективным снижением активности экстраклеточной РНКазы по сравнению с растениями арабидопсиса, что, по-видимому, связано с использованием двуцепочечного супрессора.

Что касается трансгенных растений с повышенной активностью растительных секреторных РНКаз, то в литературе мы не нашли упоминания о таких моделях, и полученные нами растения представляют собой единственный пример такого рода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках диссертационной работы было проведено исследование влияния повышенного и пониженного уровня активности экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз на процессы роста и развития растений, а также на их вирусоустойчивость. С этой целью были созданы 2 генетические конструкции для трансформации растений (pBi-RNS и pBi-Nk), получены трансгенные растения табака и проведен анализ их морфологических, биохимических и физиологических характеристик.

В ходе анализа трансгенных растений были получены следующие результаты. В трансформантах табака, несущих конструкцию pBi-RNS, РНКаза ZRNasell Zinnia elegans эффективно экспрессируется и локализована в апопласте. В трансформантах табака, несущих конструкцию pBi-Nk, происходит существенное снижение активности экстраклеточной РНКазы Nkl. Семена трансгенных растений не отличаются от контрольных по всхожести и скорости прорастания при проращивании в стерильных условиях на стандартной среде MS, а взрослые трансгенные растения не проявляют видимых отличий от нетрансгенных растений по морфологии и срокам цветения. При этом высокий уровень активности РНКазы ZRNasell Z elegans повышает устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.

Полученные результаты подтверждают гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к вирусам. Также они позволяют предположить, что в использованных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не влияет на процессы роста и развития. Кроме того, результаты, полученные в данной работе, показывают, что экстраклеточные рибонуклеазы растений могут

использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной вирусоустойчивостью.

Полученная модель может быть в дальнейшем использована для изучения роли Б-подобных рибонуклеаз.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и созданы две генетические конструкции, обеспечивающие в растениях табака а) сверхэкспрессию экстраклеточной РНКазы ZRNasell Zinnia elegans; б) эффективную инактивацию гена собственной экстраклеточной РНКазы Nkl Nicoliana tabacum;

2. Получена новая генетическая модель - линии трансгенных растений табака Nicotiana tabacum SRI, характеризующихся модифицированным уровнем активности экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз: а) увеличенным по сравнению с контрольными растениями; б) сниженным по сравнению с контрольными растениями.

3. Показано, что растения табака с повышенной активностью экстраклеточной рибонуклеазы характеризуются увеличенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики. Это подтверждает гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к вирусам.

4. Установлено, что трансгенные растения табака не проявляют отличий от контрольных нетрансгенных растений по морфологии и параметрам развития. Это указывает на то, что в нормальных условиях экстраклеточные рибонуклеазы растений не играют существенной роли в контроле процессов роста и развития.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С.Е. Романова А.В., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В., Шумный В.К. Эффективная экспрессия гена экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans в растениях табака Nicotiana tabacum SRI // Генетика. 2007. Т. 43. № 2. С. 1002-1005.

2. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С. Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В. Инактивация гена Nkl в растениях табака Nicotiana tabacum SRI за счет РНК-интерференции // Генетика. 2010. Т. 46. № 1. С. 131-134.

3. Сангаев С.С., Кочетов А.В., Ибрагимова С.С., Левенко Б.А., Шумный В.К. Роль экстраклеточных рибонуклеаз в физиологических процессах высших растений II Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 2. С. 232-242.

4. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С.Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Кочетов А.В., Шумный В.К. Супрессия гена экстраклеточной рибонуклеазы Nkl в растениях табака Nicotiana tabacum SRI // Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 16-19 сентября 2007. С. 240-242.

5. Сангаев С.С., Трифонова Е.А., Титов С.Е., Романова А.В., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В., Шумный В.К. Изучение роли экстраклеточных рибонуклеаз, индуцируемых поранением, на модели трансгенных растений // Материалы Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 18-24 июня 2007. Часть 3. С. 266-267.

6. Сангаев С.С., Трифонова Е.А;, Романова А.В., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И., Кочетов А.В. Трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз как модель для изучения молекулярных механизмов защиты от вирусов // Тезисы Международной научной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Москва, 8-12 декабря 2008. С. 63.

7. S.S. Sangaev, A.V. Romanova, Е.А. Trifonova, M.V. Sapotsky, V.I. Malinovsky and A.V. Kochetov. Transgenic plants with a modified level of extracellular ribonuclease activity as a new genetic model // Russian-French Conference "Problems and Prospects in Plant Biotechnology", Novosibirsk, October 21-24,2008. http://www.bionet.nsc.ru/meeting/rus_france2008/Theses/

8. S.S. Sangaev, A.V. Romanova, E.A. Trifonova, M.V. Sapotsky, V.I. Malinovsky and A.V. Kochetov. Transgenic plants with a modified level of extracellular ribonuclease activity as a new genetic model // Abstracts of the German-Russian Forum Biotechnology GRFB'09, Novosibirsk, June 15-19,2009. P. 44.

Подписано к печати 17.06.2010 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ № 59

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сангаев, Содном Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системы неспецифической защиты растений от патогенов.

1.1.1. Система распознавания патогенов.

1.1.2. Системная приобретенная устойчивость (SAR).

1.1.3. Индуцируемые белки, связанные с защитой.

1.1.4. Белки, индуцируемые при поранении растений.

1.2. Секреторные рибонуклеазы растений.

1.2.1. Роль S-РНКаз в генерации гаметофитной самонесовместимости.

1.2.2. S-подобные РНКазы.

1.3. Способы повышения вирусоустойчивости растений с помощью трансгенеза.

1.3.1. Устойчивость патогенного происхождения.

1.3.2. Устойчивость непатогенного происхождения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли экстраклеточных рибонуклеаз на модели трансгенных растений табака"

Актуальность проблемы. Функции экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз растений в настоящее время малоизучены. Известно, что экспрессия генов некоторых экстраклеточных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, при фосфатном голодании, в стареющих тканях растений, а также при инфекции.

Предполагают, что одна из функций этих ферментов может быть связана с механизмами неспецифической защиты от патогенов вирусной и грибковой природы (Galiana et al., 1997; Hugot et al., 2002; LeBrasseur et al., 2002). Это предположение основано, в частности, на том, что экспрессия некоторых генов S-подобных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, причем не только локально (в месте повреждения), но и системно (Ye and Droste, 1996; Lers et al., 1998; LeBrasseur et al., 2002). Для многих вирусов покровные ткани растения являются труднопреодолимым барьером, и поранение, вызванное механическим повреждением, позволяет им проникнуть в растение. Принимая во внимание тот факт, что у большинства вирусов растений генетический материал представлен РНК, можно предположить, что экстраклеточные РНКазы, индуцируемые поранением, являются одним из компонентов противовирусной защиты на начальных этапах инфекции. Однако причины повышения РНКазной активности и функциональная роль индуцированных РНКаз именно в вирусоустойчивости пока остаются неясными. Так, индукция рибонуклеаз может быть вызвана собственно повреждением тканей или их преждевременным старением и отмиранием и может быть необходима для ремобилизации фосфата (Green, 1994).

С другой стороны, в некоторых тестах in vitro и in planta показана противогрибковая активность экстраклеточной РНКазы табака (Hugot et al., 2002). Данных о противовирусной активности экстраклеточных РНКаз растений нет, однако показано, что экзогенное нанесение панкреатической РНКазы быка (РНКазы А) вместе с вирусным инокулюмом защищает растения от вируса табачной мозаики (ВТМ) (Galiana et al1997). Кроме того, трансгенные растения табака, экспрессирующие РНКазу А быка, характеризуются повышенной устойчивостью к ВТМ (Trifonova et al., 2007). Эти результаты не означают, что растительные рибонуклеазы также обладают противовирусной активностью, поскольку наблюдаемый эффект может быть связан со специфическими свойствами панкреатической РНКазы А. Однако участие рибонуклеаз растительного происхождения в механизмах вирусоустойчивости весьма вероятно.

По-видимому, S-подобные рибонуклеазы растений могут выполнять и другие, не известные в настоящее время функции. Для некоторых экстраклеточных РНКаз показана экспрессия на ранних стадиях развития (Rogers and Rogers, 1999; Kock et al, 2004; Hillwig et al., 2008). Это дает основания полагать, что некоторые S-подобные РНКазы участвуют в контроле процессов роста и развития.

В целом, имеющиеся данные указывают на то, что S-подобные РНКазы могут быть задействованы в ряде важных биологических процессов (прорастание, развитие, ремобилизация фосфата, стрессоустойчивость, формирование устойчивости к патогенам - особый интерес представляет возможное участие РНКаз в формировании неспецифической вирусоустойчивости). Большая часть из этих функций пока остаются недоказанными, что обусловливает актуальность проведения исследований в этом направлении.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в создании трансгенных растений табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз и исследовании на этой модели функциональной роли экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к патогенам, а также в процессах роста и развития.

Были поставлены следующие задачи:

1. создание генетических конструкций, обеспечивающих повышенный и сниженный уровень рибонуклеазной активности в апопласте;

2. получение трансгенных растений табака с увеличенным и сниженным уровнем рибонуклеазной активности в апопласте;

3. анализ вирусоустойчивости трансгенных и контрольных растений;

4. сравнительный анализ трансгенных и контрольных растений табака по морфологии и срокам развития;

- Научная новизна. Создана новая генетическая модель — трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз (увеличенной и сниженной по сравнению с контролем). Показано, что в нормальных условиях трансгенные растения не проявляют значимых отличий от растений исходной линии по морфологическим параметрам. Впервые показано, что повышенный уровень РНКазной активности в апопласте вследствие конститутивной экспрессии РНКазы ZRNasell Zinnia elegans сопровождается повышенной вирусоустойчивостью растений, что подтверждает гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании вирусоустойчивости. Кроме того, результаты анализа полученных модельных растений позволяют предположить, что в нормальных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не влияет на процессы роста и развития растений. Практическая ценность.

Показано, что экстраклеточные рибонуклеазы растений могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной вирусоустойчивостью.

Получен патент: Заявка 2009109530 Российская федерация. МПК C12N15/82. Рекомбинантная плазмида, обеспечивающая экспрессию гена экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans ZRNasell в трансгенных растениях (варианты) и способ получения вирусоустойчивых форм растений. /

Авторы: Трифонова Е.А., Сангаев С.С., Романова А.В., Кочетов А.В., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И, Шумный В.К.; заявитель: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ СО РАН); приоритет 16.03.2009. решение о выдаче патента от 04.02.2010.

Положения, выносимые на защиту.

1. Генетическая конструкция pBi-Nk, несущая двуцепочечный РНК-супрессор гена экстраклеточной РНКазы Nkl Nicotiana tabacum, обеспечивает существенное снижение активности РНКазы Nkl.

2. Генетическая конструкция pBi-RNS, несущая кДНК экстраклеточной РНКазы ZRNasell Zinnia elegans под управлением промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, обеспечивает эффективную экспрессию РНКазы ZRNasell и существенное увеличение общей рибонуклеазной активности в апопласте табака.

3. Трансгенные растения, конститутивно экспрессирующие РНКазу ZRNasell, характеризуются повышенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики.

4. Трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз не проявляют существенных отличий от растений исходной линии по морфологическим характеристикам и параметрам развития.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Сангаев, Содном Сергеевич

6. ВЫВОДЫ

1. Разработаны и созданы две генетические конструкции, обеспечивающие в растениях табака а) сверхэкспрессию экстраклеточной РНКазы ZRNasell Zinnia elegans; б) эффективную инактивацию гена собственной экстраклеточной РНКазы Nkl Nicotiana tabacunv,

2. Получена новая генетическая модель - линии трансгенных растений табака Nicotiana tabacum SRI, характеризующихся модифицированным уровнем активности экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз: а) увеличенным по сравнению с контрольными растениями; б) сниженным по сравнению с контрольными растениями.

3. Показано, что растения табака с повышенной активностью экстраклеточной рибонуклеазы характеризуются увеличенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики. Это подтверждает гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к вирусам.

4. Установлено, что трансгенные растения табака не проявляют отличий от контрольных нетрансгенных растений по морфологии и параметрам развития. Это указывает на то, что в нормальных условиях экстраклеточные рибонуклеазы растений не играют существенной роли в контроле процессов роста и развития.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках диссертационной работы было проведено исследование влияния повышенного и пониженного уровня активности экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз на процессы роста и развития растений, а также на их вирусоустойчивость. С этой целью были созданы 2 генетические конструкции для трансформации растений (pBi-RNS и pBi-Nk), получены трансгенные растения табака и проведен анализ их морфологических, биохимических и физиологических характеристик.

В ходе анализа трансгенных растений были получены следующие результаты. В трансформантах табака, несущих конструкцию pBi-RNS, РНКаза ZRNaseil Zinnia elegans эффективно экспрессируется и локализована в апопласте. В трансформантах табака, несущих конструкцию pBi-Nk, происходит существенное снижение активности экстраклеточной РНКазы Nkl. Семена трансгенных растений не отличаются от контрольных по всхожести и скорости прорастания при проращивании в стерильных условиях на стандартной среде MS, а взрослые трансгенные растения не проявляют видимых отличий от нетрансгенных растений по морфологии и срокам цветения. При этом высокий уровень активности РНКазы ZRNaseil Zinnia elegans повышает устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.

Таким образом, полученные результаты показывают, что созданные генетические конструкции обеспечивают в растениях табака: а) сверхэкспрессию экстраклеточной РНКазы ZRNaseil Zinnia elegans; б) эффективную инактивацию гена экстраклеточной РНКазы Nkl Nicotiana tabacum. Далее, полученные результаты подтверждают гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к вирусам. Также они позволяют предположить, что в использованных условиях экстраклеточные рибонуклеазы не играют существенной роли в контроле процессов роста и развития. Кроме того, результаты, полученные в данной работе, показывают, что экстраклеточные рибонуклеазы растений могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной вирусоустойчивостью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сангаев, Содном Сергеевич, Новосибирск

1. Аравин А.А., Кленов М.С., Вагин В.В. и др. Роль двуцепочечной РНК в подавлении экспрессии генов эукариот//Мол. биол. 2002. 36. 240-251.

2. Котельников Р.Н., Шпиз С.Г., Калмыкова А.И., Гвоздев В.А. Белки, связывающие РНК, в процессах РНК-интерференции // Мол. биол. 2006. 40. 595-608.

3. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н. и др. Генетика развития растений П Санкт-Петербург: Наука. 2000. 539 с.

4. Малиновский В.И. PR-белки и фитовирусы // Успехи совр. биол. 2009. 129. 1-9.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии II Пер. с англ.; Под ред. Т. Маниатиса. Москва: Мир. 1984. - 480 с.

6. Трифонова Е.А., Кочетов А.В., Шумный В.К. Роль Нуклеаз в Физиологических Процессах Высших Растений // Успехи совр. биол. 2000. 120. 395-405.

7. Трифонова Е.А., Кочетов А.В., Шумный В.К. Молекулярные механизмы системной устойчивости растений к вирусным инфекциям и способы повышения вирусоустойчивости путем трансгенеза // Успехи совр. биологии. 2007. 127. 13-24.

8. Чиков В.И. Клеточная стенка растений и окружающая клетку среда // Соросовский образовательный журнал. 1998. 2. 66-72.

9. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция И Уфа: Гилем. 2001. — 160 с.

10. Abramovitch R.B. and Martin G.B. Strategies used by bacterial pathogens to suppress plant defenses // Curr. Opin. Plant Biol. 2004. 7. 356-364.

11. Anderson M.A., McFadden G.I., Bernatzky R. et al. Sequence variability of three alleles of the self-incompatibility gene of Nicotiana alata I I Plant Cell. 1989. 1. 483-491.

12. Andreeva I.V., Burtseva Yu.V., Malinovsky V.I. and Zvyagintseva T.N. The effect of soybean mosaic virus on the activity of carbohydrases in leaves of sensitive and resistant soybean plants // Acta Phytopathol. Entomol. Hung. 2002. 37. 335-345.

13. Antoniw J.F., Ritter C.E., Pierport W.S. et al. Comparison of three pathogenesis-related proteins from plants of two cultivars of tobacco infected with TMV // J. Gen. Virol. 1980. 47. 79-87.

14. Arciello S., Corrado G., Rao R. Nptll gene silencing in transgenic tobacco plants // Advances in horticultural science. 2003. 4. 231-235.

15. Audenaert K., De Meyer G.B., Hofte M.M. Abscisic acid determines basal susceptibility of tomato to Botrytis cinerea and suppresses salicylic acid-dependent signaling mechanisms // Plant Physiol. 2002. 128. 491-501.

16. Babitha M.P., Prakash H.S., Shetty H.S. Induction of lipoxygenase in downy mildew resistant seedlings of pearl millet in response to inoculation with Sclerospora graminicola II International Journal of Agriculture and Biology. 2006. 8. 560-564.

17. Bariola P.A., Howard C.J., Taylor C.B. et al. The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation // Plant J. 1994. 6. 673-685.

18. Bariola P.A., Macintosh G.C., Green P.J. Regulation of S-Like ribonuclease levels in arabidopsis. Antisense inhibition of RNS 1 or RNS2 elevates anthocyanin accumulation//Plant Physiol. 1999. 119. 331-342.

19. Barna В., Ibenthal W.D., Heitefuss R. Extracellular RNase activity in healthy and rust infected wheat leaves // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1989. 35. 151-60.

20. Baulcombe D.C., Saunders G.R., Bevan M.W. et al. Expression of biologically active viral satellite RNA from the nuclear genome of transformed plants // Nature. 1986. 446-449.

21. Beffa R.S., Hofer R.-M., Thomas M. and Meins F. Jr. Decreased susceptibility to viral disease of P-l,3-glucanase-deficient plants generated by antisense transformation//The Plant Cell. 1996. 8. 1001-1011.

22. Bendahmane M., Fitchen J.H., Zhang G. and Beachy R.N. Studies of coat protein-mediated resistance to tobacco mosaic tobamovirus: correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance // Virology. 1997. 71. 7942-7950.

23. Blank A. and McKeon T.A. Single-strand-preferring nuclease activity in wheat leaves is increased in senescence and is negatively photoregulated // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. 86.3169-3173.

24. Bol J.F., Linthorst H.J.M., Cornelissen B.J.C. Plant pathogenesis-related proteins induced by virus infection // Annu. Rev. Phytopathol. 1990. 28. 113-138.

25. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. 72. 248-254.

26. Bradley D.J., Kjellbom P. and Lamb C.J. Elicitor and wound-induced oxidative cross-linking of a proline-rich plant cell wall protein: a novel, rapid defense response //Cell. 1992. 70.21-30.

27. Brisson L.F., Tenhaken R. and Lamb C.J. Function of oxidative cross-linking of cell wall structural proteins in plant disease resistance // Plant Cell. 1994. 6. 17031712.

28. Broekaert W.F., Terras F.R.G., Cammue B.P.A. Induced and preformed antimicrobial proteins // Annu. Rev. Phytopathol. 2000. 133. 371-477.

29. Broglie K., Chet I., Holliday M. et al. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani II Science. 1991. 254. 11941197.

30. Buchanan-Wollaston V., Earl S., Harrison E. et al. The molecular analysis of leaf senescence a genomic approach // Plant Biotechnology. 2003. 1. 3-22.

31. Bucher E., Lohuis D., van Poppel P.M.J.A. et al. Multiple vims resistance at a high frequency using a single transgene construct // Journal of General Virology. 2006. 87. 3697-3701.

32. Carzaniga R., Sinclair L., Fordham-Skelton A.P. et al. Cellular and subcellular distribution of saporins, type 1 ribosome-inactivating proteins, in soapwort (Saponaria officinalis L.) // Planta. 1994. 194. 461-470.

33. Casalongue C. and Pont-Lezica R. Potato lectin: a cell-wall glycoprotein // Plant Cell Physiol. 1985. 26. 1533-1539.

34. Chakravorty A.K., Shaw M., Scrubb L.A. Ribonuclease activity of wheat leaves and rust infection // Nature. 1974. 247. 577-580.

35. Cooper В., Lapidot M., Heick J.A. et al. A defective movement protein of TMV in transgenic plants confers resistance to multiple viruses whereas the functional analog increases susceptibility//Virology. 1995. 206. 307-313.

36. Croft K.P.C., Juttner F., Slusarenko A.J. Volatile products of the lipoxygenase pathway evolved from Phaseolus vulgaris (L.) leaves inoculated with Pseudomonas syringae pv. phaseolicola II Plant Physiol. 1983. 101. 13-24.

37. Custers J.H.H.V., Harrison S.J., Sela-Buurlage M.B. et al. Isolation and characterization of a class of carbohydrate oxidases from higher plants // Plant J. 2004. 39. 147-160.

38. Cutt J.R., Harpster M.H., Dixon D.C. et al. Desease response to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco plants that constituvely express the pathogenesis-related PRlb gene//Virology. 1989. 173. 89-97.

39. Dangl J.L., Dietrich R.A., Richberg M.H. Death don't have no mercy: Cell death programs in plant-microbe interactions // Plant Cell. 1996. 8. 1793-1807.

40. Dangl J.L. and Jones J.D.G. Plant pathogens and integrated defense responses to infection // Nature. 2001. 411. 826-833.

41. Dasgupta I., Malathi V.G. and Mukheijee S.K. Genetic engineering for virus resistance//Current Science. 2003. 84. 341-354.

42. Datta K., Tu J.M., Oliva N. et al. Enhanced resistance to sheath blight by constitutive expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars // Plant Sci. 2001. 160. 405-414.

43. Davis H. A., Daniels M.J., Dow J.W. Induction of extracellular matrix glycoproteins in Brassica petioles by wounding and in response to Xanthomonas campestris II Mol. Plant Microbe Inter. 1997.10. 812-820.

44. Deblaere R., Reynaerts A., Hofte H. et al. Vectors for cloning in plant cells 11 Meth. Enzymol. 1987. 153. 277-292.

45. Deshpande R.A., Shankar V. Ribonucleases from T2 family // Crit. Rev. Microbiol. 2002. 28. 79-122.

46. Dodds P.N., Clarke A.E. and Newbigin E. Molecular characterization of an S-like RNase of Nicotiana alata that is induced by phosphate starvation // Plant Mol. Biol. 1996.31.227-238.

47. Durrant W.E. and Dong X. Systemic acquired resistance // Annu. Rev. Phytopathol. 2004. 42. 185-209.

48. Edreva A. Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15 years // Gen. Appl. Plant Physiol. 2005. 31. 105-124.

49. Fokunang C.N., Beynon J.L., Watson K.A. et al. Advancement in genetic modification technologies towards disease resistance and food crop production // Biotechnology. 2004. 3. 1-20.

50. Fraser R.S.S. Are 'pathogenesis-related' proteins involved in acquired resistance of tobacco plants to tobacco mosaic virus? // J. Gen.Virol. 1982. 58. SOS-SB.

51. Fu H., Feng J., Liu Q., Sun F., Tie J., Zhu J., Xing R., Sun Z., Zheng X. Stress induces tRNA cleavage by angiogenin in mammalian cells // FEBS Letters. 2009. 583. 437-442.

52. Gaffney Т., Friedrich L., Vernooij B. et al. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance // Science. 1993. 261. 754-56.

53. Galiana E., Bonnet P., Conrod S. et al. RNase activity prevents the growth of a fungal pathogen in tobacco leaves and increases upon induction of systemic acquired resistance with elicitin//Plant Physiol. 1997. 115. 1557-1567.

54. Goldraij A., Kondo K., Lee C.B. et al. Compartmentalization of S-RNase and HT-B degradation in self-incompatible Nicotiana //Nature. 2006. 439. 805-810.

55. Golemboski D.B., Lomonosoff G.P. and Zaitlin M. Plants transformed' with tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. 87. 6311-6315.

56. Gray J.E., McClure B.A., BonigJ. et al. Action of the style product of the self-incompatibility gene of Nicotiana alata (S-RNase) on in vitro-grown pollen tubes // Plant Cell. 1991.3.271-283.

57. Green P.J. The Ribonucleases of Higher Plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994. 45. 421-445.

58. Gross N.3 Wasternack C. and Коек M. Wound-induced RNase LE expression is jasmonate and systemin independent and occurs only locally in tomato {Lycopersicon esculentum cv. Lukullus)//Phytochemistry. 2004. 65. 1343-1350.

59. Grosset J., Marty I., Chartier Y. and Meyer Y. mRNAs newly synthesized by tobacco mesophyll protoplasts are wound-inducible // Plant Mol. Biol. 1990. 15. 485496.

60. Grover A. and Gowthaman R. Strategies for development of fungus-resistant transgenic plants // Curr. Sci. 2003. 84. 330-340.

61. Hammond-Kosack K.E. and Jones J.D.G. Resistance gene-dependent plant defense responses // The Plant Cell. 1996. 8. 1773-1791.

62. Heath M.C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses // Curr. Opin. Plant Biol. 2000.3.315-319.

63. Heitz Т., Geoffroy P., Fritig В., Legrand M. Two apoplastic a-amilases are induced in tobacco by virus infection // Plant Physiol. 1991. 97. 651-656.

64. Hillwig M.S., LeBrasseur N.D., Green P.J. and Macintosh G.C. Impact of transcriptional, ABA-dependent, and ABA-independent pathways on wounding regulation of RNS1 expression//Mol. Genet. Genomics. 2008. 280. 249-261.

65. Hillwig M.S., Rizhsky L., Wang Y., Umanskaya A., Essner J.J., Macintosh G.C. Zebrafish RNase T2 genes and the evolution of secretory ribonucleases in animals // BMC Evolutionary Biology. 2009. DOI: 10.1186/1471-2148-9-170.

66. Huang S., Lee H.-S., Karunanandaa В., Kao T.-H. Ribonuclease activity of Petunia inflata S-proteins is essential for rejection of self-pollen // Plant Cell. 1994. 6. 1021-1028.

67. Hugot K., Ponchet M., Marais A. et al. A tobacco S-like RNase inhibits hyphal elongation of plant pathogens IIMPMI. 2002. 15. 243-250.

68. Iakimova E.T., Michalchuk L., Woltering E.J. Hypersensitive cell death in plants its mechanisms and role in plant defense against pathogens // Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 2005. 13. 135-158.

69. Iglesias V.A. and Meins F. Jr. Movement of plant viruses is delayed in a beta-1,3 -glucanase-defi cient mutant showing a reduced plasmadesmatal size exclusion limit and enhanced callose deposition // Plant J. 2000. 21. 157-166.

70. Ishimoto M. and Crispeels MJ. Protective mechanism of the mexican bean weevil against high levels of a-amylase inhibitor in the common bean // Plant Physiol. 1996. 111.393-401.

71. Jefferson R.A. The GUS reporter gene system // Nature. 1989. 342. 837-838.

72. Johansson Т., Nyman P.O. A cluster of genes encoding major isozymes of lignin peroxidase and manganese peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor II Gene. 1996. 170. 31-38.

73. Jones J.D.G. and Dangl J.L. The plant immune system // Nature. 2006. 444. 323-329.

74. Jost W., Bak H., Glund K. et al. Amino acid sequence of an extracellular, phosphate-starvation-induced ribonuclease from cultured tomato (.Lycopersicon esculentum) cells //Eur. J. Biochem. 1991. 198. 1-6.

75. Jung H.W., Tschaplinski T.J., Wang L. et al. Priming in systemic plant immunity// Science. 2009. 324. 89-91.

76. Kariu Т., Sano K., Shimokawa H. et al. Isolation and characterization of a wound-inducible ribonuclease from Nicotiana glutinosa leaves // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. 62. 1144-1151.

77. Kawata Y., Sakiyama F., Hayashi F., Kyogoku Y. Identification of two essential histidine residues of ribonuclease T2 from Aspergillus oryzae II Eur. J. Biochem. 1990. 187. 255-262.

78. Kearney C.M. and Wu J.H. p-l,3-glucanase and the spread of tobacco mosaic vims in Nicotiana and Phaseolus II Can. J. Bot. 1984. 62. 1984-1988.

79. Kim S.J., Lee S.J., Kim B.D. and Раек K.H. Satellite-RNA-mediated resistance to cucumber mosaic virus in transgenic plants of hot pepper {Capsicum annuum cv. Golden Tower) // Plant Cell Reports. 1997. 16. 825-830.

80. Коек M., Loffler A., Abel S. and Glund K. cDNA structure and regulatory properties of a family of starvation-induced ribonucleases from tomato // Plant Mol. Biol. 1995.27. 477-485.

81. Коек M., Gross N.3 Stenzel I. and Hause G. Phloem-specific expression of the wound inducible ribonuclease LE from tomato (Lycopersicon esculentum cv. Lukullus) // Planta. 2004. 219. 233-242.

82. Коек M., Stenzel I. and Zimmer A. Tissue-specific expression of tomato Ribonuclease LX during phosphate starvation-induced root growth // J. Exp. Botany. 2006. 57. 3717-3726.

83. Kolomiets M.V., Chen H., Gladon R.J. et al. A leaf lipoxygenase of potato induced specifically by pathogen infection // Plant Physiol. 2000. 124. 1121-1130.

84. Kragh K.M., Hendriks Т., De Jong A.J. et al. Characterization of chitinases able to rescue somatic embryos of the temperature-sensitive carrot variant tsl 1 II Plant Mol. Biol. 1996. 31. 631-645.

85. Kurata N., Kariu Т., Kawano S., Kimura M. Molecular cloning of cDNAs encoding ribonuclease-related proteins in Nicotiana glutinosa leaves, as induced inresponse to wounding or TMV-infection // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. 66. 391-397.

86. Langenberg W.G., Zhang L., Court D.C. et al. Transgenic tobacco plants expressing the bacterial rnc gene resist virus infection // Mol. Breeding. 1997. 3. 391399.

87. Lapidot M., Gafny R., Ding B. et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic vims that partially modifies the plasmodesmata and limits vims spread in transgenic plants // Plant J. 1993. 4. 959-970.

88. LeBrasseur N.D., Macintosh G.C., Perez-Amador M.A. et al. Local and systemic wound-induction of RNase and nuclease activities in Arabidopsis: RNS1 as a marker for a JA-independent systemic signaling pathway // The Plant Journal. 2002. 29. 393-403.

89. Lers A., Khalchitski A., Lomaniec E. et al. Senescence-induced RNases in tomato // Plant Mol. Biol. 1998. 36. 439-449.

90. Lers A., Sonego L., Green P.J. and Burd S. Suppression of LX ribonuclease in tomato results in delay of leaf senescence and abscission // Plant Physiol. 2006. 142. 710-721.

91. Leubner-Metzger G. j3-l,3-glucanase gene expression in low-hydrated seeds as a mechanism for dormancy release during tobacco after-ripening // Plant J. 2005. 41. 133-145.

92. Levine A., Tenhaken R., Dixon R. and Lamb С. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response // Cell .1994. 79. 583-593.

93. Linthorst H.J., Meuwissen R.L., Kauffmann S. and Bol J.F. Constitutive expression of pathogenesis-related proteins PR-1, GRP, and PR-S in tobacco has no effect on virus infection // The Plant Cell. 1989. 1. 285-291.

94. Liu J.-J. and Ekramoddoullah A.K.M. The family 10 of plant pathogenesis-related proteins: Their structure, regulation, and function in response to biotic and abiotic stresses // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2006. 68. 3-13.

95. Lodge J., Kaniewski W., Turner N. Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993.90. 7089-7093.

96. Loffler A., Abel S., Jost W. et al. Phosphate-regulated induction of intracellular ribonucleases in cultured tomato // Plant Physiol. 1992. 98. 1472-1478.

97. Loffler A., Glund K. and Irie M. Amino acid sequence of an intracellular, phosphate-starvation-induced ribonuclease from cultured tomato // Eur. J. Biochem. 1993.214. 627-633.

98. Lusso M. and Kuc J. Increased activities of ribonuclease and protease after challenge in tobacco plants with induced systemic resistance // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1995. 47. 419-428.

99. Luu D., Qin K., Morse D., Cappadocia M. S-RNase uptake by compatible pollen tubes in gametophytic self-incompatibility // Nature. 2000. 407. 649-651.

100. Lu В., Stubbs G. and Culver J.N. Coat protein interactions involved in tobacco mosaic tobamovirus cross-protection//Virology. 1998. 248. 188-198.

101. Ma R.-C. and Oliveira M.M. The RNase PD2 gene of almond (Prunus dulcis) represents an evolutionary distinct class of S-like RNase genes // Mol. Gen. Genet. 2000. 263. 925-933.

102. Macintosh G.C., Bariola P.A., Newbigin E., Green P.J. Characterization of Rnyl, the Saccharomyces cerevisiae member of the T2 RNase family of RNases: Unexpected functions for ancient enzymes? // PNAS. 2001. 98. 1018-1023.

103. Macintosh G.C., Hillwig M.S., Meyer A., Flagel L. RNase T2 genes from rice and the evolution of secretory ribonucleases in plants // Molecular Genetics and Genomics. 2010. DOI: 10.1007/s00438-010-0524-9.

104. Maldonado A.M., Doerner P., Dixon R.A. et al. A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signaling in Arabidopsis II Nature. 2002. 419. 399-403.

105. McGarvey P.B., Montasser M.S., Kaper J.M. Transgenic tomato plants expressing satellite RNA are tolerant to some strains of cucumber mosaic virus // Journal of the American Society for Horticultural Science. 1994. 119. 642-647.

106. Malyshenko S.I., Kondakova O.A., Nazarova J.V. et al. Reduction of tobacco mosaic virus accumulation in transgenic plants producing non-functional viral transport proteins // J. Gen. Virol. 1993. 74. 1149-1156.

107. Mauch F., Mauch-Mani В., Boiler T. Antifungal hydrolyses in pea tissue. II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and P-l,3-glucanase // Plant Physiol. 1988. 88. 936-942.

108. Mauch-Mani B. and Mauch F. The role of abscisic acid in plant-pathogen interactions // Curr. Opin. Plant Biol. 2005. 8. 409-414.

109. McClure B.A., Haring V., Ebert P.R. et al. Style self-incompatibility gene products of Nicotiana alata are ribonucleases // Nature. 1989. 342. 955-957.

110. McClure B.A., Gray J.E., Anderson M.A., Clarke A.E. Self-incompatibility in Nicotiana alata involves degradation of pollen rRNA // Nature. 1990. 347. 757-760.

111. McClure B.A. S-RNase and SLF determine S-haplotype-specific pollen recognition and rejection // The Plant Cell. 2004. 16. 2840-2847.

112. Melan M., Dong X., Endara M. et al. An Arabidopsis thaliana lipoxygenase gene can be induced by pathogens, abscisic acid, and methyl jasmonate // Plant Physiol. 1993. 101.441-450.

113. Melchers L.S., Stuiver M.H. Novel genes for disease-resistance breeding // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. 3. 147-152.

114. Morohashi Y. and Matsushima H. Development of P-l,3-glucanase activity in germinated tomato seeds //J. Exp. Bot. 2000. 51. 1381-1387.

115. Murashige Т., Skoog F. A Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. 15. 473-497.

116. Napoli C., Lemieux C. and Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in plants // The Plant Cell. 1990. 2. 279-289.

117. Niki Т., Mitsuhara I., Seo S. et al. Antagonistic effect of salicylic acid and jasmonic acid on the expression of pathogenesis-related (PR) protein genes in wounded mature tobacco leaves // Plant Cell Physiol. 1998. 39. 500-507.*

118. Nozu Y. and Okada Y. Amino acide sequence of a common Japanese strain of tobacco mosaic virus // Journal of Molecular Biology. 1968. 14. 643-646.

119. Niirnberger Т., Abel S., Jost W., Glund K. Induction of an extracellular ribonuclease in cultured tomato cells upon phosphate starvation // Plant Physiol. 1990. 92. 970-976.

120. Niirnberger T. and Brunner F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns // Curr. Opin. Plant Biol. 2002. 5. 318-324.

121. Ogava Т., Toguri Т., Kudoh H. et al. Double-stranded RNA-specific ribonuclease confers tolerance against Chrysanthemum Stunt Viroid and Tomato Spotted Wilt Virus in transgenic chrysanthemum plants // Breeding Science. 2005. 55. 49-55.

122. Ohno H. and Ehara Y. Expression of ribonuclease gene in mechanically injured or virus-inoculated Nicotiana tabacum leaves // Tohoku Journal of Agricultural Research. 2005. 55. 99-109.

123. Okabe Т., Iwakiri Y., Mori H. et al. An S-like ribonuclease gene is used to generate a trap-leaf enzyme in the carnivorous plant Drosera adelae // FEBS. 2005. 579. 5729-5733.

124. Park C.-J., Kim K.-J., Shin R. et al. Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper functions as a ribonuclease in an antiviral pathway // The Plant Journal. 2004.37. 186-198.

125. Pasonen H.-L., Seppanen S.-K., Degefu Y. et al. Field performance of chitinase transgenic silver birches (Betula pendula): resistance to fungal diseases // Theor. Appl. Genet. 2004. 109. 562-570.

126. Porta H., Figueroa-Balderas R.E., Rocha-Sosa M. Wounding and pathogen infection induce a chloroplast-targeted lipoxygenase in the common bean {Phaseolus vulgaris L.) // Planta. 2008. 227. 363-373.

127. Powell-Abel P., Nelson R.S., De B. et al. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene // Science. 1986. 232. 738-743.

128. Preston G.M. Plant perceptions of plant growth-promoting Pseudomonas II Phil. Trans. R. Soc. bond. 2004. 359. 907-918.

129. Prins M., De Haan P., Luyten R. et al. Broad resistance to tospoviruses in transgenic plants by expressing three tospoviral nucleoprotein gene sequences // Mol. Plant-Microbe Interact. 1995. 8. 85-91.

130. Prins M., Laimer M., Noris E. et al. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants // Mol. Plant Pathol. 2008. 9. 73-83.

131. Pruss G.J., Lawrence C.B., Bass T. et al. The potyviral suppressor of RNA silencing confers enhanced resistance to multiple pathogens // Virology. 2004. 320. 107-120.

132. Raghothama K.G. and Karthikeyan A.S. Phosphate acquisition // Plant and Soil. 2005. 274. 37-49.

133. Reiss В., Sprendel R., Will H. et al. A new sensitive method for qualitative and quantitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell extracts // Gene. 30. 211-218.

134. Reymond P. and Farmer E.E. Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression // Curr. Opin. Plant Biol. 1998. 1. 404-411.

135. Reymond P., Weber H., Damond M., Farmer E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis // The Plant Cell. 2000. 12. 707-719.

136. Rezzonico E., Flury N., Meins F., Beffa R. Transcriptional down-regulation by abscisic acid of pathogenesis-related (3-1,3-glucanase genes in tobacco cell cultures // Plant Physiol. 1998. 117. 585-592.

137. Roberts W.K. and Selitrennikoff C.P. Zeamatin, an antifungal protein from maize with membrane-permeabilizing activity // J. Gen. Microbiol. 1990. 136. 17711778.

138. Roberts J.A., Whitelow C.A., Gonzalez-Carranza Z.H. et al. Cell separation processes in plants models, mechanisms and manipulations // Ann. Bot. 2000. 86. 223-235.

139. Rogers S.W. and Rogers J.C. Cloning and characterization of a gibberellin-induced RNase expressed in barley aleyrone cells // Plant Physiol. 1999. 119. 14571464.

140. Royo J., Kunz C., Kowyama Y. et al. Loss of a histidine residue at the active site of S-locus ribonuclease is associated with self-compatibility in Lycopersicon peruvianum II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91. 6511-6514.

141. Ryan C.A. Proteinase Inhibitors. In: Stumpf P.K. and Conn E.E. (ed.) The Biochemistry of Plants: A comprehensive treatise. 1981. 6. Academic Press: New York. 351-370.

142. Sano Т., Nagayama A., Ogawa T. et al. Transgenic potato expressing a double-stranded RNA-specific ribonuclease is resistant to potato spindle tuber viroid // Nat. Biotechnol. 1997. 15. 290-1294.

143. Seo S., Seto H., Yamakawa H., Ohashi Y. Transient accumulation of jasmonic acid during the synchronized hypersensitive cell death in Tobacco mosaic virus-infected tobacco leaves // Mol, Plant-Microbe Interact. 2001. 14. 261-264.

144. Sherwood J.L. The association of "pathogenesis-related" proteins* with viral induced necrosis in Nicotiana sylvestris II Phytopath. Z. 1985. 112. 48-55.

145. Shimomura T. and Dijkstra J. Effect of eosin Y on the formation of local lesions and on the accumulation of callose in 'Samsun NN' tobacco and French bean leaves inoculated with TMV // Neth. J. PI: Path. 1976. 82. 109-118.

146. Sudarshana M.R., Roy G., Falk B.W. Methods for engineering resistance to plant viruses. In: Plant-Pathogen Interactions. 2007. Humana Press. 183-195.

147. Tabei Y., Kitade S., Nishizawa Y. et al. Transgenic cucumber plants harboring a rice chitinase gene exhibit enhanced resistance to gray mold (Botrytis cinerea) II Plant Cell Rep. 1998. 17. 159-164.

148. Takahashi H., Chen Z., Du H. et al. Development of necrosis and activation of desease resistance in transgenic tobacco plants with severely reduced catalase levels //Plant Journal. 1997. 11. 993-1005.

149. Takahashi W., Fujimori M., Miura Y. et al. Increased resistance to crown rust disease in transgenic Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam.) expressing the rice chitinase gene // Plant Cell Rep. 2005. 23. 811-818.

150. Takatsu Y., Nishizawa Y., Hibi Т., Akutsu K. Transgenic chrysanthemum {Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura) expressing a rice chitinase gene shows enhanced resistance to gray mold {Botiytis cinerea) // Sci. Hortic. 1999. 82. 113-123.

151. Tavladoraki P., Benvenuto E., Trinca S. et al. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack //

152. Nature. 1993. 366. 469-472.i

153. Taylor C.B., Bariola P.A., delCardayre S.B. et al. RNS2: a senescence-associated RNase of Arabidopsis that diverged from the S-RNases before speciation //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. 90. 5118-5122.

154. Taylor C.B. and Green P.J. Genes with homology to fungal and S-gene RNases are expressed in Arabidopsis thaliana I I Plant Physiol. 1991. 96. 980-984.

155. Thomma B.P.H.J., Penninckx I.A.M.A., Broekaert W.F., Cammue B.P.A. The complexity of disease signaling in Arabidopsis II Curr. Opin. Immunol. 2001. 13. 6368.

156. Thompson D.M., Lu C., Green P.J., Parker R. tRNA cleavage is a conserved response to oxidative stress in eukaryotes // RNA. 2008. 14. 2095-2103.

157. Thompson D.M., Parker R. The RNase Rnylp cleaves tRNAs and promotes cell death during oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae И JCB. 2009. 185. 4350.

158. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn B. et al. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions //Nucleic Acids Res. 1987. 15. 5890.

159. Trifonova E.A., Sapotsky M.V., Komarova M.L. et al. Protection of transgenic tobacco plants expressing bovine pancreatic ribonuclease against tobacco mosaic virus // Plant Cell Rep. 2007. 26. 1121-1126.

160. Van Nerum I., Certal A.C., Oliveira M.M. et al. PD1, an S-like RNase gene from a self-incompatible cultivar of almond // Plant Cell Rep. 2000. 19. 1108-1114.

161. Vaughn S.F. and Gardner H.W. Lipoxygenase-derived aldehydes inhibit fungi pathogenic on soybean // Journal of Chemical Ecology. 1993. 19. 2337-2345.

162. Verberne M.C., Verpoorte R., Bol J.F. et al. Overproduction of salicylic acid in plants by bacterial transgenes enhances pathogen resistance // Nature Biotechnology. 2000. 18. 779-783.

163. Verma H.N., Varsha, Baranwai V.K. Endogenous virus inhibitors from plants: their physical and biological properties. In: Chessin M., DeBorde D., Zipf A. (eds) Antiviral proteins in higher plants. 1995. CRC Press, Boca Raton. 1-21.

164. Wang Y. and Fristensky B. Transgenic canola lines expressing pea defense gene DRR206 have resistance to aggressive blackleg isolates and to Rhizostonia solani // Molecular Breeding. 2001. 8. 263-271.

165. Wang Y., Nowak G., Culley D. et al. Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg (Leptosphaeria maculans) disease in transgenic canola (Brassica napus) //MPMI. 1999. 12. 410-418.

166. Wang Y., Wang X., Skirpan A.L., Kao T. S-RNase-mediated self-incompatibility // Journal of Experimental Botany. 2003. 54. 115-122.

167. Wang M.B. and Waterhouse P.M. High-efficiency silencing of a beta-glucuronidase gene in rice is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation // Plant Mol. Biol. 2000. 43. 67-82.

168. Watanabe Y., Ogava Т., Takahashi H. et al. Resistance against multiple plant viruses in plants mediated by double stranded-RNA specific ribonuclease // FEBS Letters. 1995. 372. 165-168.

169. White R.F. Acetylsalicylic acid (aspirin) induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco // Virology. 1979. 99. 410-412.

170. Wu C.-T., Leubner-Metzger G., Meins F., Bradford K.J. Class I (3-1,3-glucanase and chitinase are expressed in the micropylar endosperm of tomato seeds prior to radicle emergence II Plant Physiol. 2001. 126. 1299-1313.

171. Yamamoto Т., Iketani H., Ieki H. et al. Transgenic grapevine plants expressing a rice chitinase with enhanced resistance to fungal pathogens I I Plant Cell Rep. 2000. 19. 639-646.

172. Yamasaki S., Ivanov P., Hu G.-f., Anderson P. Angiogenin cleaves tRNA and promotes stress-induced translational repression // J. Cell Biol. 2009. 185. 35-42.

173. Ye Z.H. and Droste D.L. Isolation and characterization of cDNAs encoding xylogenesis-associated and wounding-induced ribonucleases in Zinnia elegans II Plant.Mol.Biol. 1996. 30. 697-709.

174. Yen Y. and Green P.J. Identification and properties of the major ribonucleases of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1991. 97. 1487-1493.

175. Zhang L., French R., Langenberg W.G., Mitra A. Accumulation of barley stripe mosaic virus is significantly reduced in transgenic wheat plants expressing a bacterial ribonuclease // Transgen. Res. 2001.10. 13-19.

176. Zhou L. and Thornburg R. Wound-inducible genes in plants. In: Reynolds P.H.S. (ed) Inducible Gene Expression. 1999. CAB International. 127-158.