Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ РНК - СВЯЗЫВАЮЩИХ (ИНФОРМОСООБРАЗУЮЩИХ) БЕЛКОВ ЭКСТРАКТОВ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ РНК - СВЯЗЫВАЮЩИХ (ИНФОРМОСООБРАЗУЮЩИХ) БЕЛКОВ ЭКСТРАКТОВ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК"

ООСР : ; v

шашэии ордш лшш. и огш шдового

КРАСНОГО ЭВАМЕШ ГОСГДДРОТ£ВШЙ УШВЕРСНТЕХ

Л- гц 9$9s ;

: Hf Bff*WE PnfÇffl^T Степавої Алексаядр Семёяэши

ИЗПЕНИЕ ВД - СВШВШШ (ИШЮШОаяСОВРАЗПШХ) БЕМОВ ЗКСТШТОЕ КШЗХШІ КЛЕТОК '

{ оващильност* 03.00,04 - оялтямя )

Автореферат диссергвци на сожскаяже"учеаой степені кандидате Оиаяотескнх наух -

Москва - 1975

ОРДЕНІ Д ЗША ИНСТИТУТ гИПИВДИ ха. А.Н. ЕШ тдаюи НАУК СССР

ДОСЯОВСШШ OHÖSHA. ЛЕШ И ОРДЕНІ ТРГШВОГО КРАСНОГО ЯН1ИКНИ ГОСУДІРСТВЕаШЙ 7ШВЕКВДЕГ Ш. Ä.B. ЛМСВЭСОЭД

На ираааг отиошиа

Оіепавов Александр Семёнович

и.чшуша; рнк - СВВЭЫВЩЩ ( ЯШОВЮСОІЮОБРіаЛХІИХ) ЭКСТРАКТОВ ИВОТШІ нвкж

( епшааїьмсть 03.00.04 - бшш< )

Івтореферат диссертации на соискание учёной степеня гавдвдаха йнодогичесвих каух

Натчш* руководитель -доктор йжооюлпеваах няуж, академик A.C. Atroph»

Москва - 1Э75

.. .і- - .viívj. f

Работа шполяеяа в лаборатория белка ж нуменвдшх поют Ивстмтута ожсомяи ш. А. Н.Бага Аиадамии Нвух СССР а ва кафедре бяохшоа растений ШГУ ш. М.В.5омоносова.

ОфЕпжальше ошюввкш •

Викто р бмадогжчеспсх яатк,

член- юрресповдедт АН СССР Г.Е. Гворг*вв

Доктор иедшшБскях явух Н.В. Каверин

Ва официальный этзыв работа направлена в Институт атомной эаерии ш. И.В. Курчатова

Автореферат разослан 1975 г.

Занята двесертации состоятся на ¿аседашш Учёного совета Института бвооонп ян. А ЛЬ Баха АН СССР, 1к>сква, Ленинска! проспект, 33, ■ ^ЁЁйё^СЗ?5 г-

С дассертап*е4 шхво ознакомиться в бяйляотеве Инстатута.

УЧЙЕЫЙ СШРЕШЬ ОРДЕНА ганти азсХШТТА риптинртт да. А. В-БАХА АН СССР кянладат онологжчосхжх ваух

н.а. дьнчнов

В настоящэе вреия, со-видамому, осаовше скпв экспериментально! биологии обршпеш z проблеме белкового синтеза. Исследования нукдежношх кислот, а позже - комплексов щу -клеивоан кислот с белкшя, позволили установить пришзшж-альцув структуру я футаш дутаеиноад кислот х ашснкть некоторые ыехаяизьн белкового синтеза. Во о механизмах, обеспечивающие в клетке избирательны! балкошй синтез, о регуляции синтеза различных белков, известно очень мало. Предполагается, что в обеспечении регуляции биосинтеза белков ва всех »танах этого протеса в ахнув роль zrjorr сл*-пиальше белкоше молекулы, споеоонне взаимодействовать с определённнми участками нуклеиновых кислот. В частвоет*, регулировать синтез или функцию специфических мРВД могут специальные белхи-репрессорн.

В последние голв как генетически*», так к биохимическими экспериментами доказано наличие белвошх репрессоров, способна! блокировать синтез нестабильшх мРЕК, со глас вэ теорки регуляции ва уровне транскришши на$ориацвонша РИС ( ЖАКОВ, ЫОШ, 1961 ) для бактерщльных систем. Однако, в .дифференцированных клетках высших хквотаих, содержащих, в отлвчие от бактерия, метаболически стабильну» РНК, существенный вклад в общи регуляцао белкового сиятеза дадхна, очевидно, вносить регуляция на уровне процесса трансляции днфощашонянх РНК- Согласно гипотезе Спиркна ( СШШЕ, 1966 ), такая регуляция шкет осуществляться за счёт белков—репрессоров , блокирующих функционировании мРНЬ в качестве матрица, за счёт "маскирования" специфических авфор-мягдоввях РШС.Еефункциониррадая мРШ вяходится в клетке в ферме комплекса с белком - в форме вафорюсом.

Резудьтаан исследований, нлюяненид в различных лаборатория!, неизменно шказквавт, что иафорыосош являются, по-виддаому, характерна» компонентом хивотнах клеток. Тем не менее вопрос о биологической роди шфорюсом, а точнее белка нн^юрмэсои, остаётся по-прежнему открытым; более того, в связи с трудностями шдаленин жядияидуялт. тт идфорюсом, практически не известны элементарные физико-химические ха-

рактеристиха- иафощосоиного белка. Во возможен более пряной подход к изучения белков ЕЕфориосом; к шясвенвкма биологической родя. Очевидно, что на определённых эталшГ функционирования белок иафорюсои додхеа присутствовать в аивотнвх клетках ¿в только в составе комплексов с мРНК, во такхе в в свободной состоянии, В таком случае, изучение этих белsos я вддеяение их в вдтившм состоянии значительно упрощается.

В связи с вшеяздожевош ггря выполнении дайной рабош ш исштапюь решить следующие задачи: -

1) Отработать метод, позволяющий внтзднть белки, взаи-шдейстэупдае с РВЕ.

2) Изучить некоторое физико-химические свойства белков, взаниодействуцщдх с Н&.

3) Изучить ■ реакцию хоииексяроваяия »тих белков с РНК.

Объект од исследования бнл* шбраш дифференцированные клетки печени белых bjhc в выбрионадьвые клетки зародышей вьнаа. Клетки разрушали, полученный гоиогенат центрифугировали дан осаждения неразношенных клеток, ядер, митохондрий, а надосадочвую жидкость использовали в качестве клеточного экстракта. Для получения Оезрибосоцнкх экстрактов рибосома осаждали центрифугирование» при 36 ООО об/миа 90 юл. Для приготовления экстрактов обычно использовали буферный раствор, содеркащий 0,0X11 триэтаводамина (Tai), pH ?,В, 0,0111 KCl, О.ООШ MgCLj и 0,0QXM меркадто этанола {стандартный буфер); црв фильтровании проб через иембранше нитроцеллвдозше фвльтрк (средний диаметр шр около 0,5 кк) применяли буферный раствор, содержащий 0,01М Ш, р0 7,8, 0.01Ы KCl 2 0,00511 UgCI2 {буфер Л г). Спедаальшми оштаих~бнло установлено, что применение буфера & 2 обеспечивает избирательную сорбщт рибояуклео -•протеидов ( РШ ) на фильтрах. В работе использовали немеченую РЖ, шделевдув S3 рибосом E.OOÜ, а такхе следующие препарата - ЕНК : рвбосоыадьнуя РНК £.coIf с

удельной радиоактивностью 3 х Ю6гап/ішаЛіГ, иРНК Е- coli с ул. акт. 2 - 3 х 1Q5 шд/мин/ш1 я иРШ выжа с уд. акт. I - 2 х ICr 'шп/шн/ыг ,

х. ОБНАРУЖЕНИЕ РНК-СЖЗЫВШШПЗ НЕЖОВОГО ФАКТОРА В ЭКСТРАКТАХ ДИВОТШХ КЛЕТОК

Факт взаимодействия некоторых компонентов клеточные экстрактов с нуклеиновой кислотой четко уст анавливается про фильтровании через мембранные шпроцелдшозше фильтры смесей экзогенной радиоактивной РНК с экстрактами животных клеток. Значительная часть добавленной.РШС задерживается на фильтре, хотя условия опыта такош, что на фильтрах должкн сорбироваться только РШ - комплексы, а свободная РШ долхна была бн полностью оказаться в фильтрате. Отсвда следует, что в экстрактах животных клеток присутствует фактор, который, взаимодействуя с добавленной РЫК, образует коюїдекш,, сорбирующиеся на ыоыОраншх фильтрах; такое свойство ш називаєш РНК - свааывахнцей акпгв-лостьо.

При центрифугировании безрибосомшх клеточных экстрактов в градиенте концентрации сахарозы РНК-связываицай фактор распределяется в узкой зове градиента (около 8-Ю ед. Свед5ерга) , не совпадающей с зоной сєдимєнт8цоі основ— ной ыассы клеточных белков С іяс. I ). В результате обработки клеточного экстракта провазой полностью исчезает РНК - связывающая активность экстракта, что объясняется разрешением S - 10 £ РНК-связывающего фактора протесиштя-чесшаш ферментами"'( рве. 26 ). Седиментанионные свойства, а также профиль алюции bjh гель-хроматография на Сефадексе Г-200, свидетельствует, что РЕК-связывающай фактор является спешальюй фракцией шсокомслекулярншс клеточных белков; молекулярный вес РШ—связав ающего белкового факторе Должен бать не менее 200 ООО.

Посадка молекул РНК-связывающвх белков на РНК идёт независимо, во всяком случае не строго кооперативно, е дхя

Рас. I Центрифугирование безшЗосовшого экстракта идеток сэчэян в гредаеяте 10-20? сахарозы. Центрифугирование в роторе jw-39, 36 -000 об/юв, 20 часов.

1 - профиль РКК-свазывавдей активности;

2 - поглощение при 4X0 шк, отражающее распределение

геиэгдэбхва.

copinzii РНЕ яа фвльтре достаточно, до-ввдшому, присоеда-аекия к иаднвулв РЖ одной иолзкуди ¿елка (иди небольшой. кооператжваой гэужш белков). Эта выводы слёдум из анализа вржшх насыщения РВЕ РН&- связкваюшш йелкаш экстракта клеток печени E.JUCH { рис.3 ). Зааа точнай молекулщу-ный sec е количество добавляемой ГНК, а также количество РНК, задергавшейся яа фильтре, г допуская, что вся ШЕЕ, задержяваяеанся да фильтрах, вплоть до виода кривей на злато )(рис.3) зходзге в состав комплексов с одной молекулой ¿елка, ш определили абсолютное количество РШ-сэязы-завшлх белков с молекулярным весок 200 ООО. Количество этой специальной. белковой фракии составляет около 0,5% от

0.10«

tuso

t »

фрікци*

JOU»

| iodo

«5Í

) 10

(№90

1

-3 I

Рио.2 фракшюшровшше беэриЗосошюго экстракте, обработашю<Хі пронаэоА, в сахарозной градивам. .

а) екстракт клеток печени вндуОировала 30 мин пій 35° без добавленая проназн; 0) экстракт ияхубвровали о проназой ( 2,6 иг/ид ). ■ Условщ- центрифугирования квк на peo. I,

I - РНК-связываадая актнвмость; 2 - соглоідение при 110 ымк ; 3 - поглощение ар* 260 ммк .

Рис.З Завнсивасть связывания 1Ш на ыанйрадвщ: фильтрах от количества - добавившего беарибооомного экстракта клеток печени. К различным развадеяазм экстракта добавляли по 0,02 ед. опгжчвсхой плотности (ОШ 1$$ как 235 радоадтдввой рШ-- В.сох!. Пробы жнку-бароваго 16 иия и еатеи иаяосяди на фальцы.

Кахдал точка на крива - среднее из пяти параллелей.

I- кривая с 23$ рШ; 2- кривая с 165 рШ.

ой ще го количества растворимых клетошшх белков беэрибо -соидого экстракта клеток печеш; на каждув едянщу оптической плотности, измеренной при 260 дак, дриходатся не более 3 мег РНК-связывающих белков/

ii. гетерогенность рнк - связывавдего фактора

сашрошмтажая даракгешлжа

* рнк - гивздцщд белков)

Чётко выраженная способность изучаемой белковой $рак-^ к взаимодействию с РНК - РНК-связывеищая антивность-- служит надёжным тестом на присутствие ЕНК-связывающих белков б различных фракциях экстрактов клеток. Чтобы ш-ясилть является ли ЕЖ-свяэывающая фракция гомогенной со заряду йелкошх иоленуа, входящих в её состав, экстракты животных клеток фракционировали на ионообменных целдгао-

-ІО-

зах s изучали распределение РШ-связнвающей активности по фрахидЕіі экстрактов.

црв іроиатогіяфаи на даэталамдноэтид (ДЗІЗ) - целлюлозе Pffiv—связыБасщвИ фактор разделяется àa основной а несколько кислых компонентов. Гетерогенность РШС-связн-вашцеї фрагаззш оодтверндается результатами хроматографии экстрактов на катиовообменнике - карбоксиметид (Ш)-цед-лидозе, врикция чётко делится на два компонента: * квелый (не заде ржав аешй sa колонке с уатионообмевкитоы) а слабо-основної ( рис.4). Шрв центрифугировании в градаенте сахарозы как кислый, так г основной РНК-связываюгае компоненты седаментирурт в зоне S - 10 ед. Сведберга, то есть oda типа РНК-связиваюшп: белконес иоле кул ( рис.5 ) является высокомолекулярными белкаиа с молекулярным весом не менее 200 ООО.

Гетерогенность ШК-связывавщего фактора по заряду белковых молекул была шявлена такхе методом нзоэлектриче-свого фокусауования. В процессе фокусирования безрибосом-ных экстрактов клеток печени РЖ-свяацвачіїиЯ Фактор делится на несколько компонентов, различающихся величин ями изоэлзктрическех точек.

Результаты, полученные двумя разными методами, хорошо согласуется и свидетельствуют о гєтєеогєнноств РНК-связы-ваюшх белков по заряду. В состав изучаемой белковой фракции входят белки как кислого, так я основного характера; их молекулярный вес одинаков ( иди сочтя одинаков ) и составляет не менее 200 ООО.'

ш. хшктЕшстт. вашюдЕйствия рна - cbbewww еедков ~с рве

очевидно, для выяснения биологической роли специальной PHK-связываащей белковой фракции основное внимание должно быть уделено изучению процесса РБК - белкового взаимодействия. Реаллеи проводили в условиях избытка молекул РНК, чтобы в изучаемой реакционной cueca с каждой молекулой РНК могла бы комплевсароватьса только одна молекула, ідо-

! Ю

Номр фрмшм

I

(ко. б. Свдимвнтешошюв свспределвиив в градиенте сахаровк а) - квелого а Е) - основного шс-связивашос конвоневтов. Шятгафугаровакие в 10 - 20 % градиенте сахарозы в роторе 39, 3& ООО оо/шш» 20 чамв. -Посга центрифугирования во фрахцеяг овр»йе-дш • ■РНК-смэывяаду» активность.

- 12 -

дшцая в состав гетерогенной РНК-связывающей белковой фракции. Стабильность ассоциация Задков с РНК определяла, добавляя в комплексам, содераашлм радиоактивную избытки немеченой гомологично! РНК, после чзго смеси фильтровали через иеыбраяные фильтры- Оказалось, что комплексы различаются по стабильности связи белков с ЭД£: большая часть 14С - рРНН, входящей в состав комплексов, бистро обменивается на немеченую рРВК, ¡ю 20 - 30Й заметно ее обиешвается даа» ара 60 -кратно» избытке немеченой рНИ по отношению в 14С - рШС (рис.6, кривая I).

Наблюдаемое различие можно объяснить как гетербгевно -стыо РНК-связыващих белков, так в гетерогенность*) участков РЕК, с которімз белов реагирует. Чтобы выбрать одну из альтернатив, бил поставлен следующий опыт. К без -рибосомному экстракту клеток печена добавляла сначала немеченую рРЫК Б.coli .затем 14С - рРНК г наконец избыток немеченой рРНК, после чего пробы наносили на мембранные фильтра (рис.6, кривая 2 ). Кривая 2 отличается от кривой I и отражает равновероятное распределение белка между - рРНК в - рРЙК. Такой результат мож-

но объяснить только гетерогенностью РНК-саязывавдшс белков по стабильности асоциащш с РНК. Очевидно, в состав изучаемой фракции входах как белки, прочно ассоциирующие с РНК (оставшеся в составе кошлексоа с первоначально добавленной 12с _ ppgg )> так И белка, связывающиеся с PHÜ нестабильно (переходящие на меченую рРШ, а затеи на немеченую, добавляемую в избыточном количестве),

Разделив предварительно ЕНК-связываицув фракцию на кислый (белок I ) я слабоосаовноа (белок II > компоненты хроиатографией на Кк - целлюлозе,* получали отдельно для белка I а.отдельно для белка II комплексы, содержащие но одной молекуле РНЕ и белка. К комплексам добавляла 100 -кратный избыток немеченой pfHK в вайявДаш за кинетикой распада комплексов, образовании двумя типами ' РНК-свяшвающх белков. Оказалось, что РНК-саязывающий фактор готерогенев по стабильности ассоциации белков с

Е1ИкС-,РНК/£!и"с-рРНК

IrWàz «ïïp—» -«««а« -к

FHK в строго* соответствии с гетерогекяостьг по заряду белковиг молекул:" кислые я основные РЖ-связывати& ^ белки реагирую с РНК по-развому. Время полужизни комплексов РНК с кислым воипояентоы равно примерно 30 минутам. тогда как аналогичные комплексы с основными 0елками распадаются менее чей за 10 секунд.

В насей случае развое время жизни отражает разницу в териодинзщтче сдой стабильности комплексов. Дня измерения констант стабильности были сайты 'зависимости связывании HIS белками от количества добавляемой РБК (количество белка X иди белка II оставалось постоянным) . 'Из проведённых рассчётов следует, что коастанта стабильности комплексов РНК с белком I примерно ва два порядка шше, чей с белком II, и ею свидетельствует о каксы-то специфическом, во всякой случае не чисто электростатической, взаимодействии кислых белков с РНК ( К. = - Ю^3 4Г ). Впрочем, значение К м для основного компонента такие очень высоко, то есть связь РНК-связа-вшцвх белков с РНК чрезвычайно прочна.

Во всех проводимых нами опытах с равшш успехом доя реакции комштексироваядя с РНК-свяэывающими белками экстрактов можно использовать как собственную гомологичную мРНК, так к чужеродную РНЕ, даже такую, как рибосомальная РНК Е. coli. Таким образом, изучаеше нами белки реагируют одинаково с любой НК в произвольно выбранных условиях опыта, so вероятнее всею втж условия не отвечают реальным. Действительно, сам факт обнаружения РШ-связыва-ющвх белков свидетельствует об избыточном количестве в экстрактах а тих белкоз, во не РНК. В связи с этим логично предположить, что ИК-свазнвашцкй белхош* фактор образует в условиях избытка над РНК зоодхекск, содержаще не одну, а гораздо больше молекул белка.

17, ОБРАЗОВАНИЕ ИВЮЙЮСОЫО - ШЩБДД ЧАСТИЦ

та - сишмшии евдошнодоокш

х

X І

с X ж

л

г-

8

з г

4100

-4000

800

600

400

«00 >ЙНК

23$ \

400

І

І (

!І

! !

•200

х *

400

200

19

25

Номер фракции

Рис.7 Доказательство участия ИК-свяагвагждаго фактора экстракта клеток печени в "утяталенжг" экзогенво* ГИК.

С а ) — распределение ИЗК-с называние го фактора носке фракционирования беэрдбосомшго экстракта я сахарозном градиенте; ( б ) - распределение смеси рШС с оезш-босомньш экстрактом; ( в ) - распределение РИК-связн-важщего фактора после центрифугирования смеси РНК с экстрактом.

Центрйугироваяие в градиенте 10 - 20 % сахасош орв 36 Ооо об/кия а течение 5,5-часов,-

Зтойа ооесзечлть избнтоя РЕК-связываюаего фактора в эеагаыа азісдексгрозаны с РНК, учзкввая стноссхельяо низкое содержание свободного фактора в клеточках экстрактах, необходимо добавлять к экстрактам очень небольшое количество ЙЖ. Про соблвдании этого условия з сие си образуются аскусственже ШІ-содеіяазае комплексы, седиментируюсве а 1,5 - 2,5 раза быстрее добавленной РНК, причем эти комплексы сорЗвруются за мембраншх фильтрах в условиях избирательной сорбиди рибоауклеопротеидяп (ЇШ) чаптш { рис. 76 }. Образование РШ-комплексов сопровождается ргзкш умеяызензем РЖ-связываюдеЗ активности в эоае 8 --1С ед. Сзедйерга ( ріс. 7 а,а ), то есть умекьаенаем количества свободного' РЕК-свазывающаго фактора» Очевидно, увеличение хоэффшиентов седаментазда ("ут¡деление") экзогенной РЕК объясняется взаимодействием РН& с РЙК--связкваяскми белками, присутствующая. в экстракте.

Правомерность этого шэода подтверждается тем, что Ттязаление РНК наблюдается е при смедгавяяии её на с шлам экстрактом, ас 8 - IDS фракцией, выделенной из сахарозного градиента после центрифугирования экстракта клеток печени ejuch. Более того, разделив РНК-связывавсий фактор ta кяслый и основной компонент (хроматографией аа ЩІ -цедлслоэе), ш показали, что способность к утяжелешао небольших количеств РЫК является характерным свойством как кислих, так и основных РНК-связызающих белков.

йлотностное распределение в градиенте хлористого цезия чистил, образовавшихся при взаимодействии РНЕ с кислым либо с основным РНК-связываюцшш компонентаыи, хотя и гетерогенно, но характерно для РШ -комплексов. Зная величину плавучей плотности в CsCI, можно вычислить про -Еезтное ссдврзсаже бедка в рибонуклеопротеидах по следую-319£ эьсзрЕяегкой формуле (Овчинников и др., IS69 ) :

% белка = Л —

0,006

Зеличины плавучих плотностей 1,45 г/см 3 для частиц.

Рно.е Плотноеїдое распределение в градиенте CsCI часгіщ, образовании кошіоаеяташ РШ-свяаи&иэдзго белкового фактора.

Снеся - рРНК с препаратами кислого ( а ) или слабоосновшго ( б ) коїшолентов фактора фиксирован! фощаль-дагвдм і цевтшіугировает в градиенте плотности в роторе sw~ 39 вря 36 ÛÙQ об/ман, 24 часа.

' yw -

X - радиоактивность ; Z - плотиость.

образованных кислим компонентой ( рис. 8а) в 1,56 г/см3 для комплексов с" основным компонентом ( pttc. 86 )0ЇВЄ5£-ют весошм соотношениям FBK J белок в' 3TZX частицах, равным 1/2 к І/ I , соответственно. Количество белка в частицах строго фиксировано z не превышает указавша se-лечин даже про 100 -кратном избытке шлежул белка* над РНК в анализируемой смеси.

Частицы, содержащие большее количество балка, образуются при кошлексяроваякд РЕК со смесью обоих коїшояентов РВК-связнваицего фактора. Разумеется,-аналогичные комплекса получаются а при смешивании РНК с 8 - 10 S зоной экстракта и, тем более, о делим экстрактом. Образующееся в этих случаях частиш, ' независимо от се диме нтадиоиных свойств, характеразуются узким плотностшм распределением при центрифугировании в градиенте CsCI ( ріс,9а ). Величина плавучей плотности составляет около' 1,4 г/см3, то есть соотношение РНК / белок в этих комплексах, вычисленное по шшепрзведёнвой формуле, равно 1/3. Для образования такгх частиц необходим избыток РНК -связывашего . фактора над ПІК в реакционной смесх. В том случае, когда количество белка в пробе оказывается достаточней дай образования частиц о плавучей плотностью около 1,4 г/см® , дальнейшее добавление белка не меняет соотношения РНК/белок в частицах, то .есть реакция взаимодействия РНЕС о фактором строго стехиометрична.

Но седимевтавдоншм и шготностшм характеристикам искусстве вше стехиометричше РНП-частжш не отличимы от инфорюсан, естественных м£Ш - комплексов. Ыохаэ предположить, что ШС-сглзнвввдій фактор, образуй®! искусст-венше квфорюсош - подобные частиш, являете* свободным белком шфэрюсом, то есть "жафориосомооорааупамм" белком. По-видимому, ШС-связввашиі - (кафорюсоиообраэупщЕЗ) белок является обязательной белковой фракцией экстрактов - животных клеток. Во всяком случаз, ивфорюсомо-аодобные частиш были 'получены при добавлении чужерэдаой И2С к да-топдазматичееким экстрактам всех изучаема вами клеток, в

той числе а клеток зародашей вьюна, являющихся классический объектом изучения ннформосом.

У. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИВЮРЛХШО -- шлшш ЧАСТИЦ И ИНЮОШОСОМ

Если биологической функцией ЩС-связывающих белков действительно является образование инфордосоы, то есть , согласно гипотезе ( Спирин, 1966 ), специфическая репрессия трансляции некоторых мРЩ£ и одновременно защита этих мРНК. от деградации, то предстевляется изловероятшш, чтобы ги^орюсомообразуищий белок одинаково реагировал с любыми РНК, как с гомологичной мРНК (образуя ин^орлосош), так и с чужеродной бактериальной рРНК.

В связи с этим принципиальное значение приобретает поиск признака, надёжно отличающего искусственные комплексы, об^зованше с чужеродной РЖ, от естественных инфорюсом. Результаты поставленных с этой целы) опытов показали, что реакция взаимодействия РНК-связываюдах белков с чужеродной ЙЗК обратима, и существует равновесие РНК + белок

РШ, смешённое в сторону кодалексообразованая. Степень ббратишсти реакции в сторону диссоциации (стабильность РНП-комплекса) шкет служить дополнительной' искомой ха -рактерастакой РШ-частиц.

Сместить положение равновесия в сто£ону диссоциащш можно лсбнм способом, удаляющим из реакции белок; в частности, белок диссоциирует от искусственных Ш1-частид при центрифугировании в сахарозном градиенте без формальдегида, при повышении ионной сизы, пщ добавлении к образованным частицам избытка РЫК. Врезультате подобных обработок плавучая плотность искусственных частиц в С*СХ резко возрастает ( рис.96 ), в отличие от '^трякяш^^гу свои плотшстные характеристики { см. таблицу ).

КІС. 9 Плотшстное распределение в градиенте СІСІ частиц, образованна бактериальной рРНК в безрийосомнои экстракте печени на холоду ( а ) и обработанншс из -сыткоы аеыеченоа рШ£ ( й }. ЦентриЬутироваше в роторе при 36000 об/ыив, 24 час.

I - радио активное?!»}- 2 - плотность.

ТАБЛИЦА І

Елаїучаа плотность в С*СХ искусственных РШ - частиц, обрс-зовешш: ррНК бактерий иди «РЕК вьша в цато-гиазы этических экстракта* клеток зародышей вьша, в естественных ЕШ - комплексов, инфорлосом

Тжя чадтжц у в 1 о в ■ Я

С, 01 11 0.2 К 0.01 К аде 0.14 И К«

жябыток РНК избыток гак

4° С 4*С го°с го°с 20° 0

рЛї-бвдої 1,40 >1,60 >1,50 1,43 1,41 > 1,60

мГОС-СеЛОЕ 1,40 1,43 1,48 1,40—1,48 1,$9 :,45

гнфоркосокы 1,39 :,4і 1,43 - --- --

Дальнейшие опыты показали, что реакция яомплексирова-ш сильно зависит от тенпёратуры, и полно получить ис-KyccTçeHHO РШ-коиплекот, не отличимые от идфорыосом и по стабильности. ДЛя этого необходимо прогревание реакционной смеси до физиологической температуры того организма, чей белов участвует в реакции, то есть, как ыохно думать, до температуры образования естественных РШ-комплексов, ив^орыосом, m vivo ( cu. табличные данные }.

Эти результаты усиливают предположение об иифоцюсош-обраэужвдей функции РНК-свазывагщих белков. С друто2 стороны полученные данные подчёркивают как важно для "ера -вильной" сборки РШ~частта хотя бы приблизительное вое -произведение условна, существующих in vivo . Учитывая вышесказанное, степень стабильности РШ-ксыплексов, очевидно, iнохно использовать доя установления различил между комплексами РЩ-связывающх белков с различными типами РЫК при соблюдении некоторых условий реакции in vitro .

71. СДЩШЧНОСГЬ ВШМОДЕйИВИа РЫС- связшшго ( ШЮВЮ(ХЦООБРАЗУШЕГО ) БЕДНА С РЖ

В нашей случае под специфичностью следует, вероятно, подразумевать не отсутствие взаимодействия вообце, а взаимодействие "правильное" и "неправильное", образование комплексов стабильных и нестабильных. Для определения стабильности' комплексы, образованные ШС-связывающэш бед -ками экстрактов клеток зародашей вьюна пря добавлении разных РНК, обрабатывали избытком недочета рРЩ Е. colí, и такие смеси анализировали в градиенте плотности CsCI. Подобная операция представляется наиболее подходящим тестой на специфичность взаимодействия инфорюсожюбразутщих белков с FSK.

В первой серии опытов реакцию коыпдевсироваяия проводили в стандартных условиях, аа холоду. Шгатеостной анализ смесей показал, что комплексы, образованные с собственной

РЖ {«РНК вша) более стабидьш, чем комплексы, содер-хагдае бактериальные Щ£, как ивфоргашюнше, так 2 рабе-,, сомальже. Если с чужеродными РЕК необратимо связадо ляль 20 - 30i общего белка частиц, то г случае комплексов, содержащие собственную мРНК, удаётся двесоцкировать не более 505» белка, ¿нелогичные данные были получены и при замене избытка РНК другим диссоциирую исм агентом - пошшенныма концентрациями соли ( см. таблицу ). Эти результаты заставляю предполагать* определенное сродство РНй-связываю-щих белков к собственным мРЖ.

5 следующей серии опытов реакцию комллексообразования проводили при 20°С в присутствии 0,15 U KCl. Анализ смесей в градиенте плотности показывает, что в условиях,

цеятращя KCl, физиологическая температура) получить стабильные пифорюсоио - подобные часткда с чужеродными РЖ невозможно (таблица). Во если а реакцию взаимодействия с инфорыосомообразующими белками вступает собственная utPHK, то большая часть белка комплексируется стабильно. Плотноствое распределение таган частиц, обработанных избытком бактериальной гораздо более запоминает распределение ]ш$одаосому чем нестабильных комплексов, со -держащих чужеродную H3BL.

На основании полученных в пашей работе результатов ыояно,вероятно, считать, что в клетках животных кроме ин-форюсои присутствует избыточное количество свободного инфорюсомного белка, тестируемого по РНК-связывающеЙ активности.

ВЫВОДЫ

I. 5 экстрактах животвкі клеток обнаружена специальная фракция шсокошдекулярвых белков, котдексирупшхся с экзогенными РБК. Количество этих балков состагляет деся -тые доли процента от обшей массе растворимых белков tute -точннх экстрактов. Определены некоторые свойства РНК-сва-гткрдрпрт; белков экстрактов клеток печеш KpiCbi.

1) РВЕг-связывающга белки характеризуются гомогенним се-дийеагашоазим распределением в зоне 8 - 10 ед. СведЗерга, что типично) как и распределение при гедь^хроматогрвфии, ддя шсокоиолекударшх (иол. вес ае менее 200000) белков.

2) В состав РНК-связывй1)«е2 фракции входят шсокомоле -кулярнве белки как кислого , так и основного характере; установлено различие в иэозлектрнческих точках этих белков.

3) Иолекуяы кислого и основного РНК-связнвяювих компонентов различаются по стабильности ассоциации с РН£, причём константа стабильности комплексов с кислыми белками на ¡цва иорадка вше, чек с ос.ювшмя.

XI. Проведено изучение реакции кошлаксообразовандя в условиях избытка ШЬ-связываюших белков над экзогенными РШ. в экстрактах животных клеток.

1) Получена искусственные {ебонуклеопротеидше комплекси, не отлцчшеге от естественшх ыфэ&юсоы по седимента-циояшм и плотшстным характеристикам. Соотношение

РШ / белок в таких комплексах, вычисленное из величины их плавучей плотности в CsCl С-1,4 г/см3}, равно 1/3.

2) Дня образования стешюметрічннх инфо рюсомо-подобвых комплексов строго требуются как кислые, так и основные РВК-связываюшие белки.

3) Стабильность связи белков с РНК в составе комплексов неодинакова; часть белков перераспределяется на РНК, в избытке добавленную к комплексам. Если образование комплексов проводить при физиологической температуре (20°для вьюна и 37°діш Epjcu), то связь белка с BBS стабилизируется.

III. На примере цвтоплазматических акс трактов клеток зародазей въона показано, что в условиях, приближающихся к внутриклеточным (физиологическая температура в физиологическая концентрация KCl) стабильные РШ-коиыексы образуются только при добавлении собственной ыРШ вьюна, что говорит о специфичности РБК-связывающих белков.

IV. Из совокупности всех данных предполагается, что фунхцаеЬ РНК-связывавда белков в клетке, in vivo . является образование иыфэриосоы, з РНК-связывалдае белки пред -ставляят собою фракции ияфодооссшообразушох белков. Полученные даннае свидетельствуют, что свободный ивформосомо-образуюаШ белок, наряда с преформированными инфорыосома-ки, является характерным компонентой животных клеток.

СЛИСОК

опубликованных экспериментальных работ по материалам диссертации

1. Овчинников Л.О., Воронина A.C., Степанов A.C. .Белищша

Н.В., Спирин A.C., "Наформосомо-Еодобные кошлеяш, образуете при добавлении РНК к гомогенатам кквотных клеток". Молекулярная биология, т.2, Ä 5 , 752-763 (1968).

2. St*рано-» A.S., Voronlna A.S., Orchianlko» L.P., Spirln A.S., "RJtt-Mnding protei» factor of eunl«al «eil eatr-acta", PEBS Lottere, *.I8, Bo.I, 13 - 18 (Х97Г).

З.Степанов A.C., Воронина A.C., Овчинников Л.П., Спирин A.C., "Белковый FHK-связывакдпй фактор экстрактов животных клеток. I.Обнаружение и характеристика белкового РШ-связывающег0 фактора вкстрактов животных клеток" . Виохимшг, т. 3?, * I, 3-3 ( 1972 ).

4. Воронина A.C., Степанов A.C., Овчинников Д.й,»"Белковый

РБК-связывасщий фактор экстрактов животных клеток. II. Образование иафорюсоио-п&добвшс частиц РНК-связцваЪовм белкой клеток печена краса". Бвохшша, т.37, К, 10-16, (1^2).

5. Воронина A.C., Степанов i.e., ПреображевсгаД A.A.,

Овчинников Л.П., "ВелкошА нж-связвваици! фактор экстрактов животных клеток. III. Еешторае характеристики иафордасомо-подобякх частба к реаютши их образование". Биохимия, т. 37, & 2, 434-440 (1972).

Б. Воронина А,С., Степанов A.C., "Еедкошй ДЕ-свяаыва» -идй фактор экстрактов животных клеток, 17. Характера -стхка взаимодействия двух фракций ГЖ-свезывагщего белка с Ш'. Баохтгапя. т.37, £2, 441-446 (IS72).

7. Степанов A.C., Воронина A.C., "Образование стабилизированных ивфорюсомо-додобдих частиц при физиологических температурах". Доклады Академии Наук СССР, т. 203,

£ 6, I4I&-I42I (1972).

8. Степанов A.C., Воронина A.C., Преображенский A.A., Овчянвяхов А.П.,"Белковый РНЕ-связывающий фажтор ц*то-плазматжчеекцх экстрактов животных клеток", III Всесоюзны! бжохжмпеехкй съезд. Темен свшюзиальЕВХ докладов, стр. 38-39, Иал-во "Ешятне" Рига, 1974.

Иатераады диссертации были доложени яд ябижейноЯ жож-фереяпм Института белка АН СССР, посвященной ДОО-детив со д&ж рождения В.И.Аеяжя* <1970) и на III Воаеоюто* биохимическом съезде, Рига (1974).

Зм. 115 9,т-шр_2СХХ«а