Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование специфических малых РНП клеток печени крыс

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование специфических малых РНП клеток печени крыс"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ВОЛКОВА Ирина Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАЛЫХ РНП КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС

Специальность:.03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1892

Работа выполнена в лаборатории биохимических основ репродукции клеток Института цитологии Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук И. М. Константинова.

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Г. И. Чи-хиржина; доктор биологических наук Г. П. Пинаев.

Ведущее учреждение: Институт экспериментальной медицины — РАМН.

сов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Защита состоится « .

Автореферат разослан « /3»

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

© Институт ЦИТОЛОГ!!!) РАН.

ч 3 ■ • . •

ОбЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Изучение механизмов регуляции глюкокортиковдными гормонами, вызывающими обратимые изменения экспрессии отдельных генов в тканях мишенях, является удобной и широкоиспользуемоя моделью в исследованиях на уровне транскрипции (Alien

et al. 1991; Beato, 1991) Yamanrato, 1991 ) .

Регуляция гормонами включает не только контроль / транскрипции и процессинга пре - мРНК, но и посггранскрипционные этапы i экспорт РНК из ядер, контроль стабильности информационных РНК и Эффективности их трансляции (Schaplro,1987} Petersen et al., 1989).ДЛЯ транскригггов'отдельных генов выявлены цис - регуляторные элементы в области Б' и 3' нетранслируемых нуклеотидных последовательностей, необходимые при,осуществлении контроля ■ стабильности и трансляции этих информационных РНК ishow a.Kamen, 1987,Petersen, 19В9). В ряде Случаев бЫЛО ПОКаЗЭНО,

что влияние стероидных гормонов связано с участием транс - Факторов, обратимо вэаимод е яствующих с цис -регуляторными нетранслируемыш элементами молекул информационных РНК Wilsen a Schapiro, 1990} ПЛОТНИКОВ, 1992 >.

Накапливаются косвенные данные о возможном участии малых РНП в качестве транс-действующих Факторов в процессах регуляции экспрессии генов на постгранскрипциониых этапах. В эукариотических нлэтказ обнаружены малые энтисмысловые РНК

tJellnek., l97Qj Hayword , 1987| КОНСТЭНТИНОВа И Др.

' 1934,'1988).-Помимо того, выявлены малые РНП, содержащие энтисмысловые РНК (Sarcai- et al., 198&|Scharrer et al., 1988 Константинова и др. 1984, t9ee>. .Обнаружение и исследование новых Функциональных- - специфических малых РНП-комплексов становится -все более актуальной задачей» особенно, в связи с ' появлением новых . данных касающихся участия малой РНК в качестве транс-регуляторного Фактора, который влияет на экспрессию генов (Усилд et al., 1991).

. Представляемая 'работа- является частью исследований,

проводимых по теме! "Изучение молекулярных механизмов регуляции различных • этапов экспрессии генов эукариот глюкокортикоидными гормонами на транскрипционном и госттранскршционном уровнях". • Данный этап работы посвящен изучению свойств и состава нового класса специфических малых РШ-комшвксов и составляющих их компонентов, обнаруженных ранее в ядрах клеток печени крыс в предадаших работах нашей лаборатории. Было показано, что эти комплексы, обозначенные наш -а-РНП, могут акцептировать глюкокортикоидныэ гормоны и содержат метаболически активную . низкомолекулярную РНК, способную вступать в комплементарные взаимодействия с гетерогенной ядерной и информационной • РЦК (Константинова и дрл^ш .

Цель и задачи исследования Цель данной работы заключается в исследовании состава и свойств специфических малых ядерных а-РНП-комплексов и их цитоалазматического аналога, выделенного из клеток взчечи крыс. В. работе поставлены следующий задачи I

1. Разработка способов выделения жнтактных специфических малых РШ-комплексов из ядер и цитоплазмы клеток печени крыс. ' ;

2.Получение основных характеристик специфических ' малых РШ-комплексов, способных акцептировать глкжокортико-

вдные гормоны.

3.Изучение состава и особенностей белковых компонентов ядерных а-РНП-комшшсов и их цитоплазматического аналога.

4.Анализ природы. нуклеиновых компонентов в составе специфических малых «-РНП-комплэксов из ядра и цитоплазмы.

Научная- новизна полученных результатов. Разработана оригинальная методика выделения специфических малых РШ-комплексов, акцептирующих глюкокортикоидаые гормоны, из "фэнольных" ядер печени крыс после' термического. Фракционирования суммарных клеточных РНК. Выделан их цитонлазматическии аналог. Получены отдельные характеристики подтверждающие, . что эти комплексы - истинные рибонуклвопротевды, и установлено свойство их чрезвычайной устойчивости по отношению к ряду воздействий : ' растворам

высокой ионной силы, слабым кислотам, денатурирующим агентам и детергентам. Исследован, состав белкового компонента выделенных комплексов. Показано, что он представлен группой из шести коровых белков, среди которых обнаружен белок семейства РНК-связывающих белков - 1-а антиген. Исследован нуклеиновый компонент • специфических малых ядерных РНП-комплексов, в состав которых входаг популяция молекул малых природных антисмысловых РНК, обладающих гомологией с короткими диспергированными повторяющимися

последовательностями ДНК •• В2, В1 й ю. Эти РНК способны вступать в комплементарные < антисмысовые > взаимодействия с гетерогенной ядерной и информационными РНК. Полученные данные могут служить косвенным свидетельством в пользу предположения о регуляторной роли специфических малых РНП на посттранскрипционном уровне. ,

Практическая ценность работы. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание свойств специфических малых РНП и их роли в клетке. Полученные данные и методические подходы могут быть использованы дай изучения механизмов регуляции экспрессии генов при диФФеренцировке и трансформации клеток. Выявление и исследование малых регуляторных специфических эукариогических а-РНК и а-РНП, участвующих в контроле экспрессии генов, помимо общенаучного теоретического значения, имеет и практическое значение для развитая методических, подходов в генной инженерии.

Разработанный нами штод выделения специфических малых РНП, содержащих антисшсловые РНК,Авторское свидетельство >1 1381059 ) 'используется в Инстута цитологии и в ряде нругих научно-йсследоватэльскиа: Институтов.

Апробация работе. Материалы диссертации были доложены за VI-ом двустороннем совещание СССР-ФРГ (Ленинград,1985>« !а IV-ом и VI-ом двусторонних СоЕетско-Ктальянскш ¡импозиумах "Макромолекулы в Функционирующей клетке" Киев,1984! Ленинград, 1688) : ез 1-ой и 2-ой Всесоюзных сонФеренииях "Геном человека" (Москва, 1990 и 1991)1 за Ьропеяском совещании по - эукэриотаческш РНП (Дэльфы, 'реция, 1990) « на научных семинарах лаборатории

биохимических основ репродукции клеток Института цитологи Российской Академии Наук.

Публикации I По материалам диссертации опубликованы восем] работ.

Структура и об'ем работы. В состав диссертации входа-введение, обзор литературы, материалы и метода исследования результаты, обсуждение, вывода и список литературы. 06'ei работы ILL страниц машинописного текста, содержит J_ рисунков и одну таблицу. Список литературы включает /' работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ-

В работе использовали самцов крыс линии Вистар, весо: 100 - 120г.. В качестве меченого предшественника РН использовали 14С -оротовую кислоту.

Ядра из печени крыс выделяли через 2,2 М сахарозу на буфере содержащем Mg &2 <Biobei a. potter, i *?£>&>, или Фенольны способом (Scherrer, Darnell,1762). Из предварительно ОТМЫТЫ ядер' растворами низкои . ионноя силы, экстрагировал кислоторастворимыа белки <1уроверова и др., 1978).

Для выделения ядерных 30 s РНП-частип, содержащих пре-мРНК, проводили экстракцию интактных ядер клеток печев крыс по методу Самаринои (Самарина и др., 19вб> •

ЭлэктроФорвтическое разделение белков проводили системе электрофореза с додецилсульФатом натрия по Лэмш

( Lemml1,1971 )

Электрофорез. РНП-частиц,. -из ядер 'клеток nocj Фракционирования их в градиенте плотности сахарозы 15 30 У- проводили в агарозном геле в 0,04 М трис-ацетатнс буфере pH 7,4.

Выделение РНК из малых специфических. а-РНП-комплексс проводили посредством Фвнольно-детергентноя депротеинизащ этих комплексов после предварительной обработки лис проназоя ( 300 икг/мл » в 0,14 М маСт, лиЗо протеиназой <250 мкг/мл)4в 0,01 М трис-HCl буфере pH 7,0, содержа« 0.2* додецилсульФат натрия в течение трех часов при зо°с.

Мочение препаратов малых РНК по 5' концам проводили i

(Маниатис и др. 1984) с некоторыми модификациями. Использовали радиоактивную метку по смРз АТФ. '

ЭлекгроФорети чвское разделение малых специфических РНК из ядра и цитоплазмы клеток печени крыс проводили при денатурирующих условиях: в 7,5 % полиакриламидном гелэ в 0,4 * трис-боратном буфере рН 8,3 в присутствии 7 М мочевины.

Олигонуклеотидный анализ шалых РНК проводили по методу I Рей »г ее г» ( На9в1Ь1 па, 19В0> ЭТИ <*-РШ ГЦЩХШЗОВаЛИ

зийонукяеазоя Т1 < 1 ед/мкг4 РНК ) в присутствии щелочной юсФатазы е. сон < 4 х 10 ед/мкг РНК) в течение 1,Б часов, фи 42°с. Полученные олигонуклеотиды метили по 5* концам и шзделяли в двумерном эяэктрмюрэзе в полйакриламидном голе! -ое направление в Ш-ном геле в 0,025 М цщратном буфере )Н 3,5 в присутствии в И мочевины) 1500-1700 В, 2-3 ч. 2-ое управление - в 22,8^-ном геле в 50 ^М трис-боратном буфере,-Н 8,3. 1000-2000 В, 6-7 ч. В качестве маркеров использовали ра сите ли бромФеноловый сяния и ксиленцианол' рр. Полиакриламидные гели радиоавтограФировали.

. Дат ги5рвдизационныя анализ проводили по < Маниатис и р. ,1984).

Электрофорез Фрагментов, содержащих клонированные эзторявдиеся последовательности ю, аг, в! и т.I,проводили Г/.-пом агарозном геле в 0,04 М трис-ацэтатном буфере 17,2. После электрофореза Фрагменты ДНК переносили на , «троцзллголозныа Фильтр, с которым осуществляли »дгибридизацюо в в-ти кратном б'бс и двукратном растворе »нхардга. Для гибридизации добавляли пробы малых РНК, »чейые эгР АТФ в том же растворе инкубировали при 60°С 40 После гибридизации Фильтры отмывали три раза раствором >укратного езо с 0,156-ным додацилсульФатом наггрия при 52°С один ч. и, окончательно, раствором• 156-ого додецилсульФата ария, 0,1 эзс при бо°с 20-мин. Фильтры экспонировали на нтгеновсков пленке фириы Кодак.

Антигенные свойства малых специфических оРИП-комплексов белков, входящих в кх состав, изучали с помощью муно-блот метода; Белки, разделенные в ' пластинах лиакриламидного геля (8 - 10%) в системе электрофореза по

Лэммли с додецилсульратом натрия, сорбировали на нитроцэллюлозных Фильтрах цри помощи злектрогореноса в буфере, содержащем 20%-тш метанол, в течение 2-3 ч. при 1 В/CM (TowUin a Gordon, 1934).- После шреноса фильтр обрабатывали соответствуюцими антителами и затем проявляли с использованием вторичных антител, меченых тароксидазой хрена. Антитела были любезно предоставлены д-ром Матьюсом.

Значение плавучей плотности малых специфических РШ-комплексов определяли при ультрацзнтриФугированш е градиентах плотности хлористого цезия <0стерман,1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ

С целью освоения ряда приемов и методов, используемы: при выделении из ядер клеток зукариот 30 s РНП-частиц J малых ядерных уридин богатых РНП, обнаруженных в разньс лабораториях (Георгиев и Самарина, 1966 i steitr, 1979 проводился анализ состава экстрактов интактных яде; клеток печени крыс при гаксщи градиента плотности сахарозы.

А 30 S . д >А ймп/ МН£ В ' . liilll 0 ш < - ®2

V J v...; —21кД

3056 ' 15Ж ■ 1 2

Рио.1 А - Распределение материала, экстрагированного из ад клеток печени крыс по методу Самариной в градиенте плотное

сахарозы. 15-3056. ' --оптическая шютност:

---- включение С-оротовой кислот

В - Схема электрофореза коровьи белков 30 э Рнп-част из ядер клеток шчени крыс. 1 - в • контроле и и - п действии гидрокортизона.

Местоположение пика 30 s РНП-частиц определяли по экспериментальным таблицам Мак Ивана (Мс iven,i97a).

Известно, что в составе 30 s РНП-частиц из ядер клеток печени крыс, • очищенных в градиенте. плотности сахарозы, основная доля белковой массы приходится на Фракции со значением молекулярного веса равным 38 и 41 кД (Культускин, 1977). Исходя из общепринятое номенклатуры секстета коровьи белков, характерных для этих частиц у эукариот (Beyer ot al. , t*?77| Economidee .,et al, 1983),ЭТИ

Фракции соответствуют B2 и <Рис,1, 3-1) Остальные Фракции коровых белков представлены в минорных количествах.

При сравнении картин электрофореза белков 30 s РНП-частиц, выделенных . из ядер клеток печени крыс, в контроле и после введения гидрокортизона видно, что действие гормона вызывает Количественные изменения в содержании белка С2 (44кД), доля которого в составе коровых белков 30 8 РНП-частиц из контрольных животных . была минимальна. Количество этого белка существенно возрастает при действия гормона. (Ряс.1,В-2) Поскольку, белки дублета С участвуют в реакции сплайсинга пре-мРНК (swaneon * orey-fuea, 1988), естественно предположить,что увеличение доли одного из этих белков, может быть связано с изменением в интенсивности сплайсинга при действии глюкокортикоидных гормонов.

Особенности выделения малых ядерных «-РНП-комплексов.

В предыдущих работах группы И.М.Константиновой был обнаружен в хроматине клеток печени крыс кислоторастворимыя комплекс, который активно включает "С-оротовую кислоту и способен акцептировать эН-дексаметазон (Туроверова' и др.1987). Характерной особенностью этого а-РНП-компяекса является его чрезвычайная устойчивость к денатурирующим воздействиям, используемым при электрофорезе (додецилсульФат натрия, слабые' кислоты, 6 М мочевина). Эти и другие свойства а-РНП-компяекса были учтены при выборе условии его выделения и анализа.

. ' Первоначально а-РНП-комплекс был выделен из материала общего гистона, экстрагированного из ядер печени крыс и

фракционированного посредством препаративного электрофоре в системе с додецилсульфатом натрия . (Константинова и д 1870) Впоследствие нами был разработан другой спос выделения этого специфического малого ядерно а-рш-комплекса из хроматина с использовани принципиально нового подхода. Было обнаружено, что « рн комплексы сохраняются в ядрах во время выделения Фракц гетерогенной ядерноя и риЗосомнои РНК горячим Фвноло используемым при термическом фракционировании клеточной Р (Георгиев, 1968). После этой процедуры из слоя "Фенольны ядер, образующэгося на граница водаои и Фенольнои Фазы пос центрифугирования, можно было экстрагировать а-РНП из яд водонасыщенным Фенолом при кислом рН=2-4 в присутств О.БЖ-ного додецилсульФата натрия. Подробное обсужден характеристик «-РНП, выделенного каждым из вышеупомянут способов, представлено в материалах заявки, на котор получено авторское свидетельство "Способ выделен малого ядерного РНП" - N 1391059 <1985-1987). Необходим этапом очистки а-РНП от сопутствующего материала ядерных экстрактов является использование препаративно электрофореза с последующая экстракцией соответствующей зо из полиакриламвдного геля. Наиболее чистые препараты «-Р комплексов были получены в • результа ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористо цезия в присутствии 136-ного саркозила без фиксаи Формальдегидом.

Особенности выделения шггоплазматического аналога мал а-РНП-комплекса из клеток печени крыс. 1 ~

Малые • а—РНП-комплэксы, . способные акцэптирова глюкокортикощщые гормоны, и обладающие такоя злвктрофорогическоя подвижностью в полиакриламвдном геле аналогичными свойствами, обнаружены не только в ядре, и в цитоплазме клеток печени крыс во Фракции свободных I или ШФормосом. Материал этой Фракции последовател! центрифугировали, сначала в первом градиенте плотное сахарозы (5-5056), а затем материал, седиментирующии от 10 До 80 б первого градиента, наслаивали на мениск вторе

я

градиента плотности сахарозы (б-ЗОЖ) и снова центрифугировали 24 часа при 70000g в 0,05 М трис-HÖl буфера pH 7,4 в присутствии 0,5 М KCl и 1% -ного саркозила (Рис.3 А).

-комплексов или инФормосом в т-ом и во II-ом градиентах плотности сахарозы (5-50/Б и 5-30Ж ) Цитоплазматическия а-РНП седамеятирует при 10 е. - Фракция -т. — включение "Н-дэксаметазояа.

В - Схема распределения материала- Фракций п-го градиента при электрофорезе с додецилсульФатом натрия. (1-у)-Номера Фракций, взятых для электрофореза.

Цитоплазматическия аналог '<*- РНП был обнаружен во Фракции ш второго градиента, который седиментирует при 10 э' и включает 9Н-дексаметазон и 14С-оротовую кислоту, и имеет такую' же" элэктроФоретическую подвижность как и ядерный а-РНП-комплекс. При ультрацэнтриФугировании малых РНП-комплексов как из ядра, так и из цитоплазмы в градиентах концентрация хлористого цезия получэно значение плавучей шютнооти равное 1,4 V см9, что соответствует отношению РНК и бедка 1:4, соответственно. Несмотря на то, что а-РНП -комплексы исследовали в градиентах хлористого цезия без предварительной Фиксации.и в присутствии 1% -ного саркозила они сохраняют радиоактивную метку и по "С-оротовой кислоте,

в по "Н-дексаметаэону, что свидетельствует о стабильности комплексов И о прочности СВЯЗИ С гормоном. Кроме ТОГО, С.-РНП сохраняют целостность и электрофорэтическую подвижность в полиакридамидном геле даже при повторном электрофорезе, когда, например, после электрофореза в системе уксусная кислота-мочевина проводили электрофорез во втором направлении в системе с додецилсульФатом натрия. Отдельные перечисленные свойства «-РНП-комллексов присущи различным классам.РНП : некоторым комплексам малых и РШ (steitz et ai , i?aa), про сомам (scherrer. et ai , 19B4-), рибонуклеазе P (Brunei et.al ,1985). ПОВИДИМОМУ, ИЗ ИЗВ6СТНЫХ СеЙЧЭС

классов малых РНП только малые с.-РНП-комшвксы обладают такими характеристиками в полном об■ема.

Фракционный состав белкового компонента а-РНП-комплексов

"Из препаратов а-РНП. комплексов после всех этапов очистки, включая центрифугирование в градиенте плотности солея цезия, удалось выделить белки этих ■ комплексов и разделить их на ряд фракций в системе электрофореза с додецилсульФатом натрия. Для этого потребовалась обработка комплексов горячим водокасыщенным Фенолом рН 4 при 65°с с 0,5% додецилсульФатом натрия в течение 15-30-ти минут. Затем реакционную смесь осаждали спиртом с эфиром, для, ' полного удаления Фенола. Оказалось, что в состав белкового компонента а-РНП-комплексов входит не менее шести коровых белков с молекулярной массой равной 29, 31, 41, 44 и 46 кД и несколько минорных компонентов, среди которых наиболее представительны Фракции 67 и 94 кД. Сравнение состава белков а-РНП-комплексов,. выделенных из ядра • и цитоплазмы показало различие в количественном содержании белка с молекулярным весом равным 44-46 кД (Рис. ЗА).

Проводились исследования по обнаружению в составе белков а-РНП-комплексов антигенных детерминант к антителам,. выработанным на ряд известных ядерных и цитоплазматических РНП-комплексов. Исследования, проведенные с антителами, выработанными против sm -антигена,, который содержится щ белках малых ядерных уродин содержащих РНП и антителами на белки цитоплазматических просом - дали отрицательный

ю

А __ — -43кД В _ _ Ч-а

— — антиген

— -ЗОкД

-21кД

I и I 11

результат. Оказзлось, что как целые «-РНП-комплвксы, так и отдельная Фракция одвого Из коровьи белков с молекулярным весом равным 46 кД, взаимодействуют с антителами на иа антиген. Результаты, полученные с помощью иммуноблоттинга, представлены на (Рис. 3 Б).

. - Схема разделения коровья белков а-РЩ из 1-ядра и II - щгтоплазмы в электрофорезе с ДДСыа -Б - иммуногороксвдазное окрашивание белков аРШ соответствующих реплик на нкгроцеллвлозных Фильтрах антителами к ии-антигену

Белки а-РНП-комплексов после электрофореза в системе с додецилсульФатом натрия и после электропереноса сорбировали на нитроцэллшозныи Фильтр, который инкубировали с антителами против 1-а-антигена. Фильтр после инкубации с антителами проявляли при использовании вторичных кроличьих антимаус антител, меченых пвроксидазоа.

В клетках эукариот ».л-антигея обычно обнаруживается в комплексе с продуктами транскрипции РНК полимеразы Ш, в составе 1-а или р»о комплексов, причем, большинство транскрвотов РНК полимеразы не транслируются и ие имеют на 5' концах кэп стр.укгуру.

Нуклеиновый компонент а-РНП-комплексов из ядер и цитоплазмы был выделен посла" удаления белков посредством переваривания протеолигическия Ферментом - протвиназои Н, с последующими Фвнольно-детергентвыми обработками. После депротеинизации молекулы малых а-РНК метили с"Р] АТф посредством «жирования 9 концевого нуклоотвдв полинуклеотидкдаазои после дефосфорилирования • щелочной зюсфетазой . Е.сои. При электрофорезе меченых препаратов «алых а-РКК в денатурирующих условиях 0% шлиакриламиднья чэль с 7 М мочевиной, 0,05 Ы трис-боратный буфер рН 8,3) ?ыло обнаружено шесть Фракций, низкомолокуляркшс «-РНК

размером от 40 до 120 нуклеотидов как в ядерных, так и в

Рис. 4. Схема радиоавтографа электрофореза популяции малья антисмысловьгх <*-РНП в денатурирующих условиях : 1 -а-РНП из ядер и 2 - из цитоплазмы клеток печени крыс.

малых РЖ, выделанных из ядерных а-рш-комплексов, была показана^ также методом олигонуклеотидаого картирования Педерсена и Хазелгина

(Peder-,seo a. Hasal tin 1962). При Сравнении

Т1-олигонуклеотидных карт, полученных . двумерным электрофорезом дяя ядерных a-РНК и' для препарата малых комплементарных РЕК цитоплазмы, которые • вступают в антисмыс. новые взаимодействия с информационными ■ РНК (Константинова и др.,1989), было установлено сходство качественного состава этих двух популяций низкомолэкулярных РНК. Небольшие различия наблюдаются • только. по количественному представительству отдельных олигонуклеотвдов Популяция малых а-РНП качественно изменяется при действии глшокортиковдньп гормонов. Эта изменения ранее также регистрировались и при анализе Фингерпринтов а-РНК, выделенной из а- рнп из ядер печени нормальных и стимулированных гормоном -животных (Константинова и др.,1886). Представленные жэ на Рис. 5 результаты дот гибридизационного анализа ядерных и цитоплазматическшс «-РНК в норме и при действии гормона, как с пре-мРНК . и информационной РНК,' подтверждают вывод о специфическом изменении -набора, синтезирующихся при действии гормона молекул «-РНК, Кроме того, сравнение результатов прямой . и перекрестной гибридизации молекул этих специфических a-РНК в контроле и при-действии гормона с пре-мРНК и информационной РНК, показывает, что, собственно, гибридазуемость а- РНК обладает ярко выраженной специфичностью. Популяция а- РНК, выделенных из клеток печени крый, стиму.яировавдых гормоном.

цигопдазматических ос-РНК. ---120нт

- ---80нт

---40НТ

Гетерогенность состава

гибридизуотся с информационными РНК, выделенными из клеток

печени этих т стимулированных животных с большей степени

эффективности,чем с информационными РНК из клеток контрольных животных (Рис. 5).

а • • « • i • • • • ii в . . • • * i • • • • • ii

• • • • е ш • • • « ф . iv • • • • • iii • • • 0 ф iv

Рис. 5 Дот гибридизационный анализ популяции автисмысловых а- РНК с препаратами пре-мРНК (х и и) и шли А+ РНК m и IV), выделенных из клеток печени крыс контрольных животных (t и ш), и -стимулированных дексаметазонсм (и и iv).

Исследование возможности синтеза а-РНК в системе транскрипции РНК полимэразы JI1. Обнаружение в составе белков 5=~йЛ1 комплексов и-антигена, позволяет предположить, что а- Р1Е( может быть продуктом транскрипции РШ лолимеразы И. Для дальнейшей проверке вероятности синтеза малых а-РНК РНК полшеразои Р? были проведены опыты по исследованию вк-вочения " Н-уредина в молекулы РНК разных классов,- выделенных из клеток НТО в контроле и с применением ингибитора синтеза . молекул РШ Ферментами РКК полимиразами II и Л1 - а -аманитина В клетках этой линии также были обнаружены специфические РНП (неопубликованные данные), .а -аманктин - циклический полишптид, который прочно связывается с РНК полимеразоа Ц (константа диссоциации равна 2х10"вИ) и блокирует синтез пре-мРНК. РНК полимзраза И шгибируется а -аманитином при больших концентрациях (константа диссоциации равна 10"* М). В опыте была подобрана концентрация а-амаюгпиа, равная з мкг/мл, при которой в клетках НТО при концентрации клеток 1' - 2 юн/мл синтез продуктов транскрипции РНК тжмеразы II снижается до 10-15» от исходного уровня, а продуктов

транскрипции РНК полимеразы Ш остается на прежнем уровне и уровень синтеза а- РНК тоже не изменяется. Результаты опыта представлены в таблице и . свидетельствуют 8 пользу предположения о возможности сшгтэза а- РНК в системе транскрипции РНК полимеразы Ш.

' Включение "Н-уридана во Фракцию а- РНК клеток НТО в присутствии а-аманитина.

ТАБЛИЦА.

а-амаюггин прв-мРШ поли А+ РНК О- РНК

.1980 щ^рщ- 1090 имщин 1530

+ 200 ти/мт 150 дап/мин ' 1500 имп/мин

мкг MKT мкг

Исследование природа последовательностей «-РНК в составе а-РНП комплексов. : 5 !

В цредадущих работах (Константинова и др, 1978, 1984) при изучении кинетики гибридизации а РНК с ДНК в широком диапазоне значеия cot было установлено, что в наборе молекул специфических низкомолэкулярных а-РНК содержатся транскрипты, считанные с умеренно повторяющихся последовательностей ДНК. Для выяснения природа этих последовательностей ДНК проводили Саузерн блот-гибридизацис клонированных повторов sine и.line классов с мечеными с®2Рз АТф по 9 концам малых а-РНК.(Рис. 7). Аналогичные данные получены-как для. ядерных, так и' для цигоплазматичесюа .РНК. '

RL1

b2 bt jlp&tl

B2 B1 i/stl

Рис.6. Схема Саузерн блот-гибрвдизационного анализа антисмысловых « -РНК ■ с клонированными повторяющимися последовательностями ДНК - х .Электрофорез рестриктов клонов

' - IX .

Максимальная гийридазуемость молекул а-РНК, наблюдалась с ш повторяющимися последовательностями (клон р2А - 120), менее .интенсивная -с вг и bi элементами. С повторами класса line - rui - гибрвдизуемости на бьио обнаружено, хотя ■ зга последовательности активно гиЗридазукггся с суммарной исходной популяцией гетерогенной ядерной и ' информационной РНК. Ранее в печени не идентифицировала id - подобньрс молекул г РНК, вероятнее всего, поскольку, : обычно анализировали тотальную популяцию поли А- содержащих РКК, в наших we опытах исследовали специфическую 'Фракцию малых а-РНК, которая, как оказалось, обогащена; ю последовательностями. '

Представленные данные," 2сак нам .кажется,' служат дополнительным подтверждением в' пользу возможной регуляторнои рели ' малых специфических о-РИЛ на транскрипционном и на постгранскрипционнсм ' уровнял' экспрессии • генов при стимуляции ' глмкокортикоидными гормонами ■ .

вывода.

1 - Выявлены и охарактеризованы малые специфические ядерные а-РНП-комшюксы. прочно связанные в хроматине клеток печени крыс, и способные акцептировать глюкокорггиковдные гормоны. Установлена их устойчивость к ряду воздействии : растворам слабых кислот, высоким концентрациям солей цезия lí-ному додецилсульФа'гу натрия, 1Я5-ному саркозилу, Фенольноа депротеинизации и т.д. Показано, 'что а-РНП содержит набор белков с молекулярным весом' от 21 кД до 46 кД и несколько минорных Фракция.

2 - Дм а-РНП-комплексов в градиентах плотности хлористого цезия после равновесного центрифугирования получено значение плавучей плотности, которое равно 1,4г/см* Это значение характерйо для нуклеопротевдов .и составляет отношение РНК/белок = 1:4, соответственно.

3 - Нуклеиновые компоненты а-РНП представляют собой гетерогенный набор низкомолекулярных РНК размером от 40 до 120 нуклеотвдов . в составе которых обнаружены молекулы, обладающие гомологией с. диспергированными повторяющимися последовательностям bine класса.

4 - Разработан способ выделения малого специфического а-РНП из "Фенольиых ядер", образующих интерФазныи слои посла термического Фракционирования гетерогенной ядерной РНК, основгяши на способности а-РНП экстрагироваться водонасыщенным Фенолом при кислом рН и в присутствии додецилсульФата натрия. •

5 - Выделены и охарактеризованы специфические малые цитоплазмэтические а-РНП по составу и свойствам подобные ядерным а-РНП-комплексам, содержащие малые антисмысловые РНК В составе белков а- РНП как ядерных,. так • и цитоплазматических при помощи иммуноблоттинга обнаружен La -антиген..

Слисок работ, опубликованных по теме диссертации :

1.. Гаузе Л.Н., Волкова JO. Гомогенность Фракции ядерных 30 s РНП-частиц. Электрофорез интактных частиц // Молекул, биология - 1962 - т 16 :123-128.

2. ВОЛКОВА И.В. Изменения в белках РНП-частиц ядер печени крыс, стимулированных гидрокортизоном// Цитология - 1983 Т.25 - :214-216.

3. Konetantlnova I.H.| Turoverova L.V. , Petukhova О.ft., Volkova l.V. Cortisol ~ induced small RNP -

. tightly hound to chromatin// ir> Molecular in the functioning cell - 19ВЛ - i 122-127.

4. Константинова И.М., Куличкова В.А., Туроверова Л.В..Петухова О.А., Волкова И.В., Гаузе Л.Н., Козлов Ю.В. Воробьев В.И. Исследование малого РНП акцептора глюкокоргиноидов, связанного с хроматином клеток печени крыс и - Молекул, биология - 1987 - т21 - : 1360 -1386. •

5. Константинова И.М., Волкова И.В., Воробьев В.И. Способ выделения малого ядерного РНП// - 198В - Авторское свидетельство, n 1391059.

8. Константинова И.М., Волкова И.В., Куличкова В.А., Петухова О.А. Участие малых РНК, ассоциированных с поли А РНК цитоплазмы в гормональной регуляции экспрессии -генома // - 1989 - т. 23 - I 113&-1144.МолекулГвиодогйя.,

7. Konst'antlnova Г. П., Patukhova. О. A., Kulitchkova V. А., Volkova l.V. RNA in the hormonal regulation of gene expression. Charakterliatlcm of cytoplasmic low molecular ' mass RNA complementary asfcotiatad with poly A containing RNfl in rat liver // - Nuclear atractural and

■function. NV Plenum Pr&es? I 115-113,

B. Konatantlnovj I.«,, KuhtchKovs V.A,, Petukhova Q.A., Turoverova L.V. , Voll<ova I.V., Voi^ob'ev V.I. Small nuclear RNA tightley bound to chromatin i* ■ po««ibly involved In hormonal regulation of двп» енрге»»1оп // Moloc. Biol. Reports. - 1990 - v. 14, N 4/3 I 117-110,