Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические механизмы адаптации и гетерозис

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы адаптации и гетерозис"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНУ

харьковский мелигккския институт

На правах рукописи

БОНКСВ Анатолий Иванович

НОЛЕКШРНО-ШЕТЙЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ И ГЕТЕРОЗИС

03. 00. Оч - блохимил

А Ь Т OPE i Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени, доктора биологических наук

j.afhKot - 1992

Работа выполнена в ШИ биологии. Харьковского государственного университета.

»ШАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТУ: чл..-корр. АН Украины -доктор медицинских наук, профессор A.M.Белоус

доктор'биологических наук, профессор А.В.Чечетхин

доктор биологических наук, профессор Н.И.Панченко

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ : Институт биохимии им. А.В.Палладина АН Украины

Задита состоится ">/" {^сЬрЛЭЭЗ г. в/^часов на заседании специализированного совета Д.088.23.04 при Харьковском медицинском институте по адресу: 310022, Харьков-22, пр. Ленина, 4, ауд. I I.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института.

Автореферат разослан "С" 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.А.Жубрикова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В процессе жизнедеятельности организмы непрерывно приспосабливается к окружающей среде. Эта среда все гремя изменяется не только в связи с геологическими и климатическими условиями, но к вследствие изменений в соотношениях между разными организмами (в биоценозах) и. вследствие изменения самих организмов, для которых тогда и среда становится иной /ймальгаузен, 1982/, Непрерывно изменяющиеся взаимодействия организма с многообразными факторами среды являются источником единства-и. борьбы таких противоположных процессов как устойчи-лос.» иэаекчкхасть. Адаптация чыступае? мерой едичотеа этих лрогйзозаяойН501Сй, результатом и средством разрешения внутоен-иих и внешних- противоречий жизни, а тем самым и одним из унигзр-сальных ее свойств /Шмальгаузен, 1982/. Проблема адаптации является одной из наиболее общих проблем биологии, над которой работают" специалисты разных направлений и исследования охватываю* от- молекулярного до популяционного и даже биосферного уровня.

Динамика изменений экологической обстановки нашей планетн вызывает обоснованную тревогу у многих специалистов, так как среда гбитаиия в широкой сяысле слога, лее бодьв» :« белья» пополняется вредными факторами фкзичеохой, химической я биологической природы /Бочкой. 1989; Дубинин и др», 1982/. Далеко не все возможные последствия новых факторов среди изучены и ослйуэ тревогу J3 этом отношения представляют генетические изменения, проявляющиеся из сразу it не чмеоше пороговых воздействий! /Боч-лов, 1989/. Исследование молехулярно-генетических иехакизков язаимодейстйия генока с разнообразными факторами пряди имеет огромное теоретическое и практическое значение.

Изучение молекулярных механизмов адаптации сопряжено с большими методическими трудностями» Как общебиологическая проблема адаптация связана о многими биологическими проблемами, в частности с. проблемой гетерозиса, проблемой возрастного развития и др. Так, показано, что в процессе индивидуального разнямя организма изменяются его способности адаптироваться к условиям среды /Фролькис, Т977; Бутенко и др., 1983/, зто в больоой степени зависит от генотипа организма /Дасхалов, I96S; Хаджкнов, 1980/, Большие адаптивна способности гибридных организмов по сравнению с чисголинейныии особями к экстремальным факторам среды, yK&s::~:i;T на непосредственную связь эффекта гетерозиса с меха-

низмами адаптации. Исследование устойчивости и адаптивности линейных и гибридных организмов к экстремальным факторам среда имеет значение как для понимания проблемы гетерозиса, так и для раскрытия генетических аспектов адаптации.

Б последние годы было обнаружено» что в ответ на действие таких факторов как температура, тяжелые металлы, голодание и другие стресс-фактори в клетках животных и. растений индуцируется транскрипция ряда генов, контролирующих синтез белков /Adams et al., l989;Steinext, 1988/, что доказывает участие генетической системы в механизмах адаптации организма. Однако, как передайся сигналы от внешней среды на геном, что является передатчиком этих сигналов, как изменяется функциональная активность генома у животных с разными генотипами на действия факторов среды к целый ряд других важных вопросов молекулярно-генетичес-ких механизмов адаптации оставтся нерешенными.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование причин, лежащих в основе разной адаптивности линейных и гибридных организмов к многообразным факторам среды в рамках изучения молекулярно-генетических механизмов адаптации.

В задачи исследования входило:

1. Исследовать ответную реакция системы реализации генетической информации линейных и гибридных животных на действие экзогенных факторов - радиации, гипертермии, тяжелых металлов, ксенобиотиков.

2. Исследовать взаимоотноиения между элементами система реализации генетической информации (транскрипции, процессинга, транспорта РНК) на фоне действия стресс-факторов.

3. Выявить эндогенные факторы, оказывавшие влияние на ответнуп реакции системы реализации генетической информации при действии разнообразных экзогенных факторов.

Исследовать временные характеристики системы реализации генетической информации при изменении функциональной активности органа.

5. Исследовать мембранный механизм регуляции системы реализации генетической информации на фоне действия разнообразных экзогенных факторов (гипертермия, ксенобиотики, частичная ге-патэктомия, тяжелые металлы).

6. Исследовать особенности структурно-функциональной организации мембран у животных с разными генотипами.

Научная новизна результатов,

1. Показано, что система реализации, генетической кнформации,

зклгзчакяая :?акие элементы ¡сак транскрипция, процессинг и транс-■хорт ?НК. «раквлялю реагирует на разнообразные экзогенные воз« деУспия кгк единое целое и монет рассматриваться как агнтраяь-;юо згено переработки озсгоггнкой информации,

2. Показана структурно-функциональная связь мембран ендопла-¿кяжчвекоб «г®?и <•' туккциоирльной активность» система реагиза-'««к геюгосмлои жцюрьэции л процессе адаптгцик,

3. Предложена гипотеза кембранно-гекетического механизма

':. , -то г сгггт ::а дгйстгис рагзэткж; $аяорог

среды (радиации, локальной гипертермии печени, тяжелых металлов и некоторых ксенобиотиков) система реализации генетической информации функционирует в ритмическом режиме, на временной хард-.сгер которого влияют не только внешние факторы, но и генотип организма.

5. Показано, что в интактных клетхах печени система реализации генетической информации функционирует э режиме околочаоово-

^эдекенкя адоденов*« органе прчяодя? *

.^д^ХйКйли:.. одл'с-к<:с?.ц;.»у! ЭЙЛОГьнкул рклиог...

О, •••УГ-.чсСНО КОГОрОЛ раМЬЧа*. ЛлЯС'ЛНЫЛ -■

»■ ^д.-к. о¡^г--..■го.:'ое ^ч^л г; фахтоьа.. ^рем; ийу V. -

о-гр^ч^-о-^р.чнянко.' .. йу^ЦлОлййьч^Г

ти-;кн;, камора;1.

'Г- ;1о:;аг»1нс,, что мет^л;. .'ясаз^айт й;::*.-:.-»:'? яр. срунй-

иг;йк£;...^;<ук »-Х'ГЛ/нустъ лО'П/и р генгтиче^хо;: лй.;:

ции, имеющую выраженный трехфазный характер: фазу стинулнции, тарнтуп фазу и фазу инг^бировяния- Высказано преяпаложение. что и^ист'с;'^ и^ь о^а^кзацпп гекетлЧ*лко." ¿¿х-Р'^1"'

'ирь^ ;><Л мгмбрепгуп ологе;.:;» лл •

' 8. Обосновано положение о том, что ответная реакция системы реализации генетической информации на экзогенное воздействие определяется структурно-временным и функциональным сосюякиен •гкз'гзми реа;^-:^¡-ц;;:-: ^е.^.е-г'.'.^ззкой хй^ормацкк "г мо'-.гнт

Твове1;:чд:лсд радеть.. Г'заулыаты работы укамгес?

на необх&ди^^огь и иер^яектквноо-г» ясалзхогажй, нялрзагекь'кх кг лозн&ниг мелак.1..;.,оь зьегмодейетрил оке.теин рганкзацлг генеткчес-

кой информации (а не отдельных ее элементов) о мкогообраэными факторами среды на основе структурно-временной организации генетических систем. Зто направление научных исследований объединяет молекулярную генетику, биохимическув экологию к биоритмологию на решение проблемы динамического взаимодействия системы реализации генетичеокой информации с факторами среды, взаимосвязь которых и определяет проявления биологических явлений ха-рактеризувцихся непрерывной изменчивость».

. Практическое значение результатов работы»

1. Разработана экспериментальная модель гепатита на осноге кратковременного действия локальной гипертермии печени (А. с. Ш1804 СССР, МКИ^ G 09 В 23/28), применявшаяся в фундаментальных исследованиях действия гипертермии на клетки в системе in vivo , а таюке в скрининге и испытании новых гепатозащитных препаратов, проводимых с Государственным научным центром лекарственных средств и Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов.

2. Разработан способ оценки мембранотропности ксенобиотиков, основанный на оценке структурно-функциональных изменений мембран £ системе in vitro.(А. с. 1749835 СССР, MKS15 G 01 И 39/68).

3. Разработан способ оценки активности противовоспалительных средств на основе их влияния ка структурно-функциональные характеристики лизосомальных мембран, надедиий применение как при оценке активности ксенобиотиков, так и и сравнительных исследованиях структуры дизосом.

h. Разработан способ оценки генотоксичности. тяжелых металлов, основанный на оцешсе активности системы реализации генетической информации инфузория к водорослей, который применяется при оценки токсичности сточных вод.СА.с. Г755194 СССР,(i01 а33/48).

5. Выполненные методические разработки оценки функционального состояния смотемы реализации генетической информации и положения мембранно-генетической гипотезы адаптации навли широкое применение в исследованиях механизмов действия новых медицинских препаратов в совместных работах с Государственным научным центром лекарственных средств и Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов, а такке Харьковским фармацевтическим институтом.

Основные положения, которые выносятся на защиту.

I. Система реализации генетической информации является цект-

- г,

бработви экзогенной информации о состоянии среды, измз-сиетечы PTi' коррелирует с перестройкой структурно-функцио-сгс состояния внутриклеточных мембран. Различия линейных и гибридных организмов s адаптивности, к образным факторам среды обусловлены различием в структурно-нной и Функциональной организации системы реализации гене-кой информации и мембран клетхк.

Функционирование системы реализации генетической информа-сущ-зствляется s околочасзвом ритме, который является ондо-.м ритмом биологических систем, влияющий на результат Езаи-.ствия факторов среды с метаболической системой клетки.

Отзоткзя реакция ои№геик реализации генехачесЕОЗ ;а экзогенные аоздеЯстъия onределяегсл се структуряо-зре-1М. и функциональным состоянием з момент воздействия, фобация и публикации материалов диссертации. Материалы ¡ртации докладывались. и обсуждались на 1У съезде генетиков акционеров Украины (Киев, 1981); XI съезде Украинского физического общества им. И.П.Павлова (Киев, 1982); 1У съезде )взного общества генетиков я селекционеров им. Н.И.Вавилова гнев, 1982); 1У Всесоазном съезде геронтологов и гериатров =, 1982); Бсеасвзной научной конференции по взпочсгатглык!! щев-тическим веществам (Харьков, 1982); Республиканском ззк-уме "Ядепнае бедки к экспрессия генсма" СКиев, 1963); гьегде Укрчинекого физиологического обаества им. Л.П.Павло-Яьгов, 1986); У съезде генетиков и селекционеров Украякы .<•., 19?6); IX Всеооизком симпозиуме "Структура н функция очного ядра" (Черноголовка, I3S7); У сгезда БиесоЕзього сб-га генI'.оз и селекционера* «м. Н.Л.Зшзклсьа (Москва,

Всесоюзное симпозиуме "Молекулярные и £уихц»эн»ыше ке-змы онтогекеэаЧХарькоЕ, I9S7); У Всесоюзном съезде г-ероп-гсе гвпиатр-:- (Тбнт.и;;:, I98S); ТТ Вовсоизном симпозиуме

"СГ'И? М0ПСК'/:<" И ПреОНСМДКЫХ ЛрОСТЗЙЕИХ" 'viîpjc.ii'uiii, 7S°S, ;

овзноа конференции "лвгоделох'йя зхсасгйческогр нор^ировани*'1 ьхое, 1990); X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция очного ядрз" (Гродко, 1990); II Всесоюзной конференции по х j ? п с тт. гнпо" гокакол огии (Санкт-Петербург, 1991); У1

дя V.-: оэ и на.ofcsctri г?:-:ет/...;с;:'; геле?, jwciiepor чл.

ygpYKTYPa и объем диссертации. Диссертационная работа изло-на 321 странице машинописного текста. Состоит из введения, описания объектов и методов исследования и 6 глав собственных исследовании, заключения и выводов, списка литературы, содержащего 403 источника и иллюстрирована 90 рис.. 10 табл.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ

Материалы и методы исследования. Исследования проводились на крысах, мылах, инфузориях и. водорослях. Крысы линий Вистар, Август и их гибриды (^В х ¿А) и мыши линий ¿kr, CS7BL и их гибриды (^C5?BL x^AKR) содержались в стандартных условиях вивария на полноценном рационе. Инфузории Tetiatjnens pjiifoimis штамм w выращивались в термостате при 28 °С на среде следующего состава: пептон - 20; глюкоза - 5,0; дрожжевой экстракт - 1,0; натрий хлористый - 1,0 г; вода дистиллированная до 1,0 л, pH. 7,1. Водоросли Chlorella vulgaris Beiyer выращивали на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2 000 лк.

Для мечения РНК животным вводили по 1,1 МБк ^С-оротовоЙ кислоты на 100 г массы тела. Ядра из клеток печени выделяли по методу /Biobei et ai., 1968/. Экстракция яРКП-частиц из ядер проводили по методу /Самарина и др., 1967/. Разделение рибосом на мембраносвязанные и свободные проводили как описано / Арбузов, 1979/. Из хроматина, РШ-частиц и рибосом экстрагировали РНК /Трудолабова, 1974/, концентрацию определяли на спектрофотометре /Спирин, 1958/, а радиоактивность на сцинтилляционном , счетчике "Beсклад", США.

При определении скорости обмена предсуществовавших и вновь образованных РНК в хроматине РНК метили двойной меткой - 3Н-оротовой кислотой (1,1 МБк/100 г массы тела) в течение 12 часов и 1 С-оротовой кислотой (1,1 МБк/100 г массы тела) в течение 40 мин, и определяли соотношение PHK-3H/PHK-I2lC в РНК хроматина.

ДНК метили 3Н-тимидином (.3 МБк/100 г массы) в течение 45 мин. Ядра выделяли ках описано и после экстракции яРНП-частиц и РНК хроматина, ДНК гидролизовали 5 % хлорной кислотой при 90 °С в течение 20 мин. Концентрацию определяли /Спирик, 1958/ и радиоактивность так, как и FHK.

Микросомы из клеток печени выделяли дифференциальным.центрифугированием. Липиды экстрагировали как описано /Грибанов и др.,

£975/, Разделений их н» фракции осуществляли методом «оюсослсй-íioil хромагагра|ик. При. определении скорости синтеза и о^ненг»

ипвди мети.« i- 1 V.~au(stvtQH чатрпя (5,55 йБк/ТОО г.) и течении 30 -i 90 мину/".

Спектпч флуоресценция т-пдот эятаснаали на ииектрофлуорине?-ре 'тгасл!',' <1swk«ík при «коровти разаер-пш оаектрк 120

»«/кия Я КИЙ 2 £-.14.

&ххиэнооть Рлвкчао-г-фоофатазн ллреде*<«и хяя ояисако М1гп (977/

.Для определения скорости синтеза ДНК» РЖ к белка a клевсах wHfcysow» " ivjsfWzzZjZ 150 »u ¿¿лыуип лноеичи по Mb> "п-тмчм.ниио. -УТ? " -Из -гидролизаia «5еака я кшаубировали пра 23 ^ в течение часа» Синтез нуклеиновых кисло? и белков останавливали охлаждением и добавлением я культуры хлорной а колоты до 5 £ концентрации. ДНК, РНК к белки выделяли как описано /Кеннел, 1970/. Концентрации я радиоактивность, определяли как; н в случае РНК, хроматина,

Все результаты обрабатывали статистически е использованием параметрических и непараметрических методов анализа /Урбаха 196>г, Губя ср. Т<37СУ.

Гдавл ) Устозичвоить и ¡матшшмт * •.хстремалькик фаг-т'гоач

предн ¿им««йяул и гябрианы» орглнизмол ¡O о ¿ ек./ лиг s о -г ¿ь т; ¡ч вг^и к аспект проявления гетерозиса, (íip^-хгурнке осисъи .гетерогиса, проявлявшегося % превосходст-

ве гибрадо* чад ¿киейшаю форма;.:;! по масел ?елаг репродуктивным я адггттйгяым k-íwoskootíuí. рсрмирувуоя как специфический результат генетической разис&зчезтвапнос-ги «аздиняещихоя родительских гамет /йезцоз, [92 V. Понять механизмы взаимодействуя насдедст--¿енных факторов (доминирование, сверхдомкнированяе, эпистаз и др.), лежащих в псноче многиу бислогичзга;;:х явлений и гегероэи--•.а в го!.', чколв, ite¿o?'4o»ii& Зйз знаний механизмов регуляции ак-гчэноотк генов и процесса р»аякзацки генетической информации ЧТИ), схематично отраженной в центральной догме молекулярной биологии: ДЩ^РНй—белок.

Исследования содержания и метаболизма нукяегаових яисасг в клетках линейных и гибридных организмов /Шер8везс»саа, 1965; Че-чевскн, I96S й др, / лоэгояили сформулировать положение о аьязи гетерозиса с *;вйличением содержания РНК а на основании этого была досказана дереяреосоркая гипотеза /1-ердышев, 1971/, Даль-

_ с

нейиее глубокое и всестороннее изучение этого вопроса показало противоречивость и неоднозначность получаемых результатов. Так, проведенные нами исследования скорости синтеза РНК в клетках печени, линейных и гибридных крыс показали, что гибриды занимали промежуточное положение между крысами линий Вистар и Август. Удельная радиоактивность (уд. рад.) предшественников мРНК в печени гибридов была ниже линейных форм, а тРНК и низкомолекулярные РНК цитоплазмы превосходила родительские формы.

О промежуточном положении гибридных форм кукурузы по сравнения с родительскими формами по синтезу рРЙК, мРНК и тРНК указывали /Конарев и др. , 1971/.

Проведенное нами исследование содержания и метаболизма нуклеиновых кислот у гибридных животных с использованием различных методов анализа, а разных тканях и органоидах клеток позволило прийти к ьаводу о зависимости этих показателей от методов выделения нуклеиновых кислот, исследуемой ткани, методов разделения клеточных структур. Кроме этих методических причин в основе ой-наруки5аемых разными авторами различий лежат многообразные механизмы регуляции процеааов РГй к их специфики, у линейных и гибридных организмов, и и частности, влияния на них факторов среды ..

Проявление эффекта гетерозиса есть результат взаимодействия генома а разными факторами среды и aro взаимодействие непостоянно в течение онтогенеза особи, suadakova /1978/ отмечает, что доминирование - это результат исторического процесса адаптации генома к конкретным факторам среди к, степень доминирования зависит не только от сачогс аллзля, но и целого ряда средовых факторов, которые могут изменить этот оффект. 'именно через влияние среды на функциональные системы метаболизма клетки и может регулироваться генное взаимодействие. В этом отношении является целесообразным исследование влияния разнообразных факторов среды на систему РГй у линейных и гибридных организмов.

Влияний гамма-лучей на скорость синтеза ДНК з кроветворных органах ннбоедных и гибридных мыаей

Известно, что степень лучевого поражения и процессы репарации связаны а генетическими особенностями организма /Нуждин и др., 1965/. Одним из условий процесса восстановления после облучения является репопуляция клеток и репарация повреждений ДНК.

Физиологическое состояние животных после облучения опре-

леляе-тоя е на'.падьпей мере ра/.лгиузетЕИтелъкостьк кооветворикх орпчог но:;Гч, оел^йьнки, с-- /Тсрахтий 1&53/

¿л "

Исследование в'лиячи« 'С" ч* ^н^ику о/.нсйз» ¿К*

тс гкбрилк оскала!;" наибов кы .т.. о рамекад о ¿л-рор'--.^.:;'. '-увст-кител^поотыи чао эффекту ингибирования

^ин"!?".'-! ~НгГ туот,- т? ч.зсо;. ас,;;;; 1 ьг.мс-

о. к о-.: 'лшт^Эа .¿Л К кл селе зек;;;:, кос-

ного мозга и тимуоа чере* 360 чего" тзсг<- -5л «ч«и (

■■ ■■ ■ ■ ^

у-сиозенки а ч'и.куеа в течение 3 часов посля еог<-

'К;-

содержания нуклеиновых кислот (рис. 2).

и ЛЧЧ Г<5; £>

I . 1, , -гтус; Г

с

■О

I

Л / \

Г \

ь. Д

V \т

1 т Ч'

т

^ 4 .т г,". 1

Ъ'Чз "-Г

7ас

Обнаруженные ритмические изменения этих показателей были различны у линейных и гибридных организмов. Можно полагать, что врс-менные различия особенностей формирования процесса лимфопоэза у иивотных с разными генотипами лежат в основе различной чувствительности линейных и гибридных животных к стрессовым факторам срзды.

В процессах адаптации к факторам среды важнейшую роль играет печень, как центральный орган гомеостаза у'млекояигонких. С этой точки зрения печень является наиболее подходящим объектом при изучении особенностей взаимодействия генома с факаорами среды, В ответ на действие локальной гипертермии печени выявляются функциональные изменения системы РГИ, выражающиеся в ритмическом изменении синтеза и транспорта РНК из ядра в цитоплазму, временной характер которых был различен у разных генетических форм (рис. 3).

¿яяи, tac

Рис. 3. Влияние локальной гипертермии печени (45 сС,

10 мин) на динамику уд. рад. РНК хроматина (а) и пула меченых предшественников (б) у крыс, линии Зистар (I), Август (2) и гибрида (3)

Обнаружено, что е ответ на действие локальной гипертермии устанавливаются ноЕые функциональные соотношения между элементами системы РГ'Л, что может иметь важное значение при адаптации клеток к изменившимся условиям среды. ■ Временные особенности реализации генетической информации е клетках печени линейных и гибридных крыс после частичной гепатоктомии

На основании полученных результатов можно высказать предположение о том, что генетическая обусловленность устойчивости и адаптивности реализуется через временной контроль метаболических звеньев, принимавших непосредственное участие в адаптации. Временные процессы в биологических системах выявляются в форме ритмов. Одним из основных ритмических процессов в клетке является временная организация клеточного цикла. Частичная гепатек-томид, синхронизирующая прохождения гепатоцктов по клеточному цксду, приводила а временным различиям прохождения цикла у гибридов по сравнению с линейныйи формами. Временные различия фун-кцясгаллкеа э?:тг*#1«?н скетея» ?П1 линеЯгнх а гк?рвдшх после частичной гепатзхтомии служат подтверадением генетического контроля клеточных ритмов.

Следовательно, если структурные оснозы эффекта гетерозиса заложены в механизмах взаимодействия генов, то его проявление осуществляется в результате динамичного- взаимодействия факторов среды с оиатекой РГЯ, которая может рассматриваться как центральное звено в системе метаболической адаптации клетки.

■ Глава 2. 5.тпян::е йлясв тягелнх нзталзоз на футвдксиалькр .««'.•'кость гекй^кчесчэге аппарата предстагитслей р2?!кх таксоне«:': 20г.:tx групл

негаалс-х- ьа dgcoyops» сьоаессг: pcs.\7.i¿¿..:.i

i клетках эодоро'-г.;7; lio.;. -w.r^v алалта'^е-П, .-сак пр.-.^ило, rio.i'.v.evr

кис ¿ r:ni дочетг;^; Çi/.riy.;.-

.''i...;- ( ' . ' ^. . i r M^Wc'ü'-'M 'lA : 0': >'.?"* -

д^оцк: рл^л.ч;.!.,: с-г его Функцио^-лькс/. a: :. -

Û.I, 1230/. ¡¡Oaóáááv), Vi О âSTiiSHO rpûiiOSpnOKpyiuiiiricÛA i с tí» ку»»р/-ат чеве. чем зееативнне /Ильина и др., 1987/. Исходя кз этого.

'.j.^'^y^i:..1.. - -. : sirr. Tvv:;.. ;;у>. - ..;.

-.го . : : р. л.ркс-;-... Г ¿-Tier л.гЛгуьмь :<:; ■-.;-. факторов ерздн «слет измениться $ункциокагьнгя активность генетического аппарата, которая монет служить предпосылкой его структурных itsrfer.cHrtS.

Т.'.лс." -л ■-..:. pry::., .с. ': .-..'А- - ;

ы.ьт. r-ni- ; т:;.. . :-

ДС,ТЧ>?г?Р. Ï5» ВС?Х Я<>С.*еде?5ЯНХ »»"»SfS™!» «ppejrAeouurt

OÏ.'-Î^'OV. РЯгГ.ц:*.1. г^-нстстеско:-. CVCTÍ;:-.-: Г-'-1 or.::-;' - -гхриггд фаьа /. фаз^. Срл-- ч,'.

Выявлены видовые различия в ответной реакции системы РГИ на • действие ионов меди у водорое- § лей рода Duaaliella Teed., вы- S ражающееся в изменении содержа- ^

ния РНК и белка. |

«

Рис. 4. Влияние ионов меди .

(0,1 мг/л) на уд. рад. ДНК. (I) | и белка (2) в клетках **

Chlorella vulgaris

Влияние ионов меди на процессы реализации генетической информации в клетках инфузорий и млекопитающих Ионы меди (0,1-1,0 мг/л) угнетали интенсивность репликации, транскрипции и трансляции в клетках инфузорий, коррелирующее с численностью клеток в культуре.

Исследование действия ионов меди в системе выделенных ядер печени крыс позволило обнаружить такой же трехфазный характер их действия на активность РНК-полимерах, как и для клеток водорослей. Однако, если эффект ингибирования в клетках водорослей и инфузорий не превышал 50-60 % даже при больших концентрациях меди, то в системе ^ыделеных ядер наблюдается практически полное ингибирование активности РНК-полинераз, т. ё. в системе выделенных ядер не проявляются адаптивные реакции, характерные для водорослей и инфузорий (рис. 5).

Рио. 5. Влияние ионов меди на активность РНК-пол.II в интакт-ной (I) и регенерирующей печени (2) к активность РНК-пол.1+1II в ин-тактной (3) и регенерирующей (4) печени крыс.

иидь. М.

Генетическая система млекопитающих защищена от действия металлов в большей степени, чем у одноклеточных зукариот. Однако, большие дозы ионов меди в организме крыс (0,625-3,15 мг/ЮО г) также оказывают влияние на оистему РГИ, выражающееся в установлении новых соотношений.между синтезом, процессингом и транспортом РНК. Очевидно, структура одноклеточного организма не обес-

печивает надежной защита при существенных изменениях факторов среды и это. затрагивает функциональные характеристики генома, т. е. они адаптируются за счет изменения своей индивидуальности. Напротив, у высших организмов сохранение генетической индивидуальности обеспечивается специальными защитными механизмами, что соответствует принципу сохранения гомеостаза. . .

Следовательно, вое исследованные нами факторы (радиация, локальная гипертермия, частичная гепатэктония, тяжелые металлы) оказывайт влияние яа функциональные характеристики системы РГК, что является первым этапом в .генетической адаптации. Факторы, определяющие чувствительность генетической системы к экстремальным условиям среды

Ответная реакция биологической системы определяется не только фактором действувщим на систему, но и особенностями метаболизма биологической системы в момент воздействия. Исследование ответной реакции системы РГй на разнообразные факторы позволило прийти к заключение, что ответ этой системы на действия экзогенных факторов' определяется функциональным состоянием системы РГИ в момент воздействия.

Изменение функциональной активности системы РГИ инфузорий температурный и око* и последующее внесение а эту културу ионов моди показало, что медь з этом случае ;:е угнетала функциональную активность этой системы как это происходило при выращивании клеток в стандартных условиях, а напротив, усиливала скорость синтеза РНК з белка при концентрации меди 0,5 мг/л (рис. в).

Рис. б. Влияние ионов меди на удедьнув ЩК

(I), РНК (2) и белка (3) в . клетках 2. pyriforais после шести температурных шоков.

Обнаруженный .эффект можег бить связан о тем, что увеличение количества белков теплового шока и возможно других стрзсс-бел-ков приводит к ввязывание ионов меди к при определенной концентрации металла происходит' новая индукция подобных бдосог, что колет выражаться в усилении синтеза РНК. » белке. Кезезксг"» ос :г.схай.".змг ?того явления получении? результат"! укаэчэаят ча то. что ответная реакция нь уровне окстеш ?;"Л определяется зе сос-

тоянием в момент воздействия. В пользу этого свидетельствуют и данные полученные по совместному действию инсулина и меди на систему РГИ у инфузорий.

Инсулин (26 -ИГ® М) усиливает скорость синтеза нуклеиновых кислот и белка в клетках инфузорий. Биологический эффект инсулина на функциональную активность системы РГИ зависит от стадии культивирования инфузорий. Совместное внесение в культуру меди и инсулина приводит в случае трехсуточной культуры к проявлению действия инсулина (стимуляция системы РГИ), а в случае семисуточ-ной культуры к проявлению действия меди (мигрирование системы РГИ).

Следовательно, система РГИ отвечающая на разнообразные экзогенные воздействия как единое целое, является центральным звеном метаболической адаптации и исследование особенностей регуляции ее функционирования является необходимым этапом исследования проблемы адаптации.

Глаза 3. Система реализации генетической информации как центральное звено при метаболической адаптации Изменение интенсивности репликации в ответ на клеточный стресс

Способность клеток поддерживать высокую, упорядоченность своей организации (гомеоотаз) зависит от^енетической информации, которая реализуется, сохраняется, воспроизводится, а иногда и совершенствуется в четырех генетических процессах - репликации, тран- . скрипции, трансляции и генетической рекомбинации /Албертс я др., 1936/. Центральный постулат молекулярной биологии указывает только направление передачи генетической информации в клетке, но не дает ответа на вопрос о механизмах регуляции этих процессов, между которыми существует сложная цепь регуляторных взаимодействий. Мало исследованными остаются процессы регуляции системы РГИ в ходе адаптации.

Локальное повышение температуры в части печени до 41-45 °С в течение 10 минут приводит к развитию гепатита /Божков и др.,

1988/. Обнаружено, что локальная гипертермия печени индущфует систему адаптивных компенсаторных реакций, затрагивающих РГИ, что выражается в усилении скорости синтеза РНК спустя 3 часа после воздействия, перехода вновьсинтезированнсй РНК в состав яШ-частиц, коррелирующее о увеличением скорости транспорта РНК в цитоплазму.

В основе принципов структурного обеспечения реакций адаптации и компенсации нарушенных функция лежат, прежде всего, увеличение числя активно функционирувщих рабочих единиц, их репарация и гиперплазия /Саркксов, 1977/. О регенерации печени после действия гипертермии судили по интенсивности синтеза ДНК. Обнаружено, что гепатит индуцируемый гипертермией сопровождается регенерацией части печени, причем, чем больше повреждена паренхима печени, тем больший эффект усиления пролиферации наблв-дается в неповрежденной части печени (рис. 7),

Рис. 7. Изменение уд. рад. ДНК в юнактнов зсне печени Са) кг зоне печён», подвергнутой действии локальной температуры (<5). -41-42 (I). 4344 (2) и 47-48 ЧС (3).

& я -Г . )в (Г Вили тгмлф: лшн.

Таким образом, компенсаторные реакции клетки, возникаете в ответ на. стреосовое воздействие, состоят из изменений метаболизма РНК к, если эти изменения достаточно существенны, они могут сопровождаться усилением пролиферации клеток.

Динамкна синтеза РНК в клетках регенерирующей печена крыс Исследование динамики уд. рад. РНК хроматина (РНКхр) в инта-ктной и регенерирующей печени позволило выявить существенные различил этого показателя (рис. 8).

Рис. 8. Динамика уд.. рад. РНКхр в ¡штактной (I) и регенерируп-дей (2) печени крис.

Анализ причин, определяющих величину уд. рад. РНКхр показал, что она зависит : I - уровня меченая пула предшественников

РНК; 2 - активности РНК-иол. и 3 - скорости обмена предсушес вовазшис ?Н» (нгмгченых) к энэгьгюн езчровгипшх РНК ишеннх

Исследоваклг гасйяоотчоаевкП

пул..

виков и уд. рад. РНКхр в интактной и регенерирующей печени (13 часов после операции) показало, что кривые регрессии существенно различаются между собой по тангенсу угла наклона кривой к по отрезку, отсекаемому на оси абоциос (рис. 9).

Рис. 9. Зависимость изменения уд. рад. РНКхр от изменения уд. рад. пула предшественников РНК в ин-тактной (I) и регенерирующей (2) печени крыс.

Уравнение регрессии в случае ин-

• • • | ■ | | ■ ■■ I | -

тактнсй печени имеет вид: У " 7.27Х + 160,4, а для регенерирующей - У * 2,IIX + 316,1. Полученные результаты указывают на большее влияние неучтенных факторов на результативный признак в регенерирувщей печени по сравнению с интактной.

Определение динамики изменения активности РНК-аслимераз в ядрах интактной и' регенерирующей печени показало, что активность РНК-пол. 1*111 и. РНК-пол. II в ядрах регенерирующей печени увеличена в 2,0-2,7 раза по сравнению с интактной печенью. Зти результаты свидетельствуют о том, что через 13 часов поело операции синтез рРНК и мРНК увеличивается более чем в 2 раза, в то время как уд, рад РНКхр увеличена в 5-7 раз. 2ти различия могут быть связаны с различной скоростью обмена РНК. Еыло обнаружено, что скорость обмена предсуществовавоей и вновьсинтезированной Piüi в клетках регенерирующей печени крыс отличалась от таковой интактной. Оценивая относительный "вклад" каждого из трех факторов с использованием целевой функции :F= vrlu^ + w2tt2 + w^u,, где w^u^ - весовой множитель, определяющийся характеристикой пула меченых предпествеиников, w2u2 - весовой множитель, определяющийся активностью РНК-полимераз и w^u^ - весовой множитель, определяющийся скоростью обмена РНК, привеловии нормировки:

-1, получим: у »(0,4-0,5) ♦ (0,3-0,4) + (0,1-0,2). "" Таким образом, в клетках индуцируемых^пролкферации происходит установление новых соотношений между факторами, о&азнваодих влияние на величину уд. рад. РНКхр. Можно полагать, что различные стресс-факторы оказывают влияние на разные метаболические звенья, обеспечивающие транскрипции, однако результирующим признаком во всех случаях будет изменение уд. рад. РНК, т. е. система КМ является центральным зьеном метаболической адаптации.

Процессинг и транспорт РЖ в цитоплазму регенерирую ней печени крыс

В процессе синтеза РНК связывается с комплексом белков, формируя ядерные РНП-частицы (яРНП-частицы). Синтезированный транскрипт претерпевает серив ковалентных модификаций. Так, 5-конец молекулы кэпируется, а к 3-концу присоединяется от 100 до 200 остатков адениловой кислоты /Humphrey, 1988/, и б дальнейшем осуществляется процессинг РНК /Sittler,I9S7/. Сплайсинг РНК - ото не просто особенность созревания эукариотической РНК, а новый уровень регуляции реализации генетической информации в клетках эукариот. Анализ судьбы яРНП-частиц несет в себе информации о пооттрансляционной регуляции РГй. Однако допроса динамики нзме-ниния вновьсинтезирааанной РНК в составе яРНП-частиц в ответ на действие стресс-факторов не изучались.

Исследование динамики уд. рад. РНК в яРНП-частицах показало, что в ядрах регенерирующей печени она ниже по сравнению а интак-тной печены) спустя 5,и 15 мин, а через 45 и 135 мин незначительно ее превосходит. Соотношения между уд. рад. РНКхр и РНК яРНП-частиц не изменяются в интактной печени в течение 45 минут. 3 клетках не регенерирующей печени эти соотношения изменяются во времени и значительно превосходят интактяый уровень. Зти результаты свидетельствуют об относительной автономности регуляции на уровне синтеза РНК и ее посттранскрипционкых модификаций.

Низкий уровень уд. рад. РНК яРНП-частиц при высокой скорости синтеза FHK е клетках регенерирующей печени может быть связан не только с, высокой скоростью процессинга РНК, но и с высокой скорость» траке порт из ядра в цитоплазму.

О скорости транспорта РНК из ядра в цитоплазму судили по изменению уд. рад. РНК мембраносвязанных рибосом клеток печени. Было обнаружено, что скорость транспорта РНК в рибосомы регенерирующей печени значительно превосходит таковую интактной печени.

Таким образом, соотношения между показателями процессинга и транспорта РНК достаточно лабильны, что указывает на возможность относительной автономности- регуляции этих процессов в ответ на функциональные изменения клетки, вызванные действием стресо-факторов.

Влияние ахтиноницина Д на процессы реализации генетической

информации в клетках регенерирующей печени крыс

При определении судьбы вновьсинтезированной РНК осуществляли.

ее печение в течение 15 минут, после чего интахтнш и оперированным животным вводили сублетальную дозу актиномицина 2, приводящую к ингибированию синтеза РНК на 94-97 % и определяли динамику уд. рад. РНК, входящей в состав хроматина, яРНП-частиц и рибосом цитоплазмы.

Обнаружено, что уд. рад. РНКхр в интактной в регенерирующей печени уменьшается, однако, это выражено в большей степени в регенерирующей печени. Определение уд. рад РНК яРНП-частиц показало, что она в регенерирующей печени была в 2,5 раза ниже, чем в интактаом органе через 15 минут после начала эксперимента и в дальнейшем этот показатель уменьшался о одинаковой скоростью в интактной и регенерирующей печени.

Определение динамики уд. рад. РНК рибосом показало, что если в интактных клетках печени РНК не транспортировалась в цитоплазму и не включалась в состав рибосом, то в клетках регенерирующей печени транспорт РНК продолжался к на фоне ингийирования синтеза РНК (рис. 10).

Рис. 10. Динамика уд. рад. РНК мембранных ри-.* босом (а), свободных V рибосом (б) и ни эк оно-декулярнсй РБК цатоила-^. змы (в) в интактной (1)^ и регенерирующей (2) I печени крыс при иигийи-ровании синтеза актино-мицином Д.

Эти результаты доказывают вариабельность регуляции РГИ на уровне процессинга и транспорта РНК. В клетках регенерирующей печени из ядра может транспортироваться очевидно та РНК, которая \в норме не переходит в цитоплазму, и; ото имеет важное значение в механизмах адаптации клетки. Кроне того, это подтверждает положение о том, что ответная реакция на стресс зависит от исходного состояния система РГИ.

Наличие связи типа предшественник продукт мевду элементами сиотемы РГИ и достаточно большая лабильность в соотношениях между транскрипцией, процессингом и транспортом РНК свидетельствует

о существовании автономных звеньев регуляции этих элементов, что а объясняет выоокув чувствительность системы РГ'Л на действия разнообразных факторов среды.

Глава Временная характеристика системы реализации генетической информации я адаптивность организма Исследование адаптивных возможностей организма, придавших специфику.живому, связано, с изучением организации биологических систем в пространстве и во времени. Основой временной организации биосистем является упорядоченность- биологических процессов во времени. К закономерностям течения времени в живых системах непосредственное отношение имеют периодические изменения деятельности и поведения этих систем названных биологическими ритмами / РоманоЕ, 1989/.

Анализ временной характеристики уд. рад. РНК яРНП-ксиялекс ов при равномерных коротких интервалах дискретизации позеолил обнаружить. ритмические изменения этого показателя (рис. II).

Рис. II. Временной характер изменения уд. рад. РНК яРНП-частиц, усредненная кривая из 8-ми экспериментов (а) и скорость изменения (йЗ) уд. рад. (б).

Определение уд. рад. РНК яРНП-комплексов при 5 минутном временном интервале позволило обнаружить ритмические изменения этого показателя с периодом 15-25 кинут. Ритм уд. рад. РНК яРШ1- -частиц регенерирующей печени обнаруживал некоторые отличия от такового интактной печени.

Следовательно, изменения уд. рад. РНК яРНП-частиц осуществляется в ритмическом режиме с периодом 15-25 минут, очевидно формирующие 40-80 минусный ритм, т. е. функционирование процессинга РНК осуществляется в окодочасовом ритме.

Анализ динамики синтеза РНК не позволил выявить выраженных ритмических изменений, характерных для я?НП-частиц. Однако, отклонение изменений уд. рад. РНКхр от линейности позволяет высказать предположение о наличие скрытых ритмов. 3 пользу этого свидетельствуют данные о динамике синтеза'иРНК и тРНК при ингибиро--

ваши синтеза р?НК, позвонившие обнаруа[ить ритмичность синтеза этих типов РНЕ с периодом около часа Срис. 12). ; , .

Рис. 12. Временная характеристика уд. рад. вновьоинтезированных мРНК. и тРНК в составе хроматина интакт-ной (I) и регенерирующей (2) печени крыс при ингибировании синтеза рРНК.

»/См, мим.

Сглаживание околочаоового ритма синтеза РНК может быть обусловлено наложением временных характеристик эндогенных факторов, влияющих на процеас синтеза РНК к прежде всего таких как уровень меченого пула, активность РНК-полимераз и скорость обмена РНК. Проведенные нами исследования временных характеристик этих факторов показали наличие ритмических изменений этих процессов и выявили, что ритмические изменения пуда предшественников РНК и скорости обмена предсущеотвовавших и вновьоинтезированных РНК находятся в противофазе, что и приводит к сглаживанию ритма результативного признака (синтеза РНК).

Транспорт мРНК в цитоплазму при ингибировании синтеза рРНК также осуществляется в режиме окоЛочаоового ритма (рис. 13).

Рис. 13. Временная характеристика уд. рад. мРНК рибосом в интактной (I) и. регенерируювей (2) печени Крыс. •

Таким образом, синтез, процессинг и транспорт РНК из ядра в цитоплазму

осуществляется в околочасовом, ритме. То Ъ ЛГ

Проведенные нами исследования *рем&, ми*.

функционирования системы РГй в ответ на действие разнообразных стресс,-факторов служат еще одним доказательством функционирования системы РГй в ритмическом режиме. Выявленные различия временных процессов на эти воздействия у линейных и гибридных организмов свидетельствуй о важной роля организации временных процессов функционирования, систе'мы РГЙ в устойчивости н адаптивности организмов к факторам ореды.

Гдава 5. Мембранный механизм регуляции реализации

генетической информации в процессе адаптации клеток к экстремальным факторам среды Синтез и обмен липидов мембран экдоплазматической сети клеток печени при регенерации и локальной гипертермии Способность клеток или организма к адаптации возможна благодаря их способности перерабатывать информацию, поступающую извне. Процесс переработки информации в клетке может быть разбит на три стадии: I) получение информации-рецепторами Св широком смысле); 2) передача информации в центр переработки; 3) передача обработанной информации к устройствам., способным, формировать ответ - эффекторам Дагава, 1985/. Как было нами показано центром переработки является система РГУ1.

Существование многоуровневой регуляции процесса РГЙ может осуществляться благодаря разгитию клеточных мембран. Если предположить, что координация элементов РГИ и их регуляция в процессе адаптации обеспечивается внутриклеточными мембранами к прежде всего мембраной зндоплазматической сети, то можно высказать представления о мембранно-генетическом механизме адаптации. Суть которого заключается в том, что система РГИ является центром переработки экзогенной информации, а клеточная мембрана - приемником, передатчиком и эффектором этой информации. Если это так, то можно ожидать, что : I - как приемник информации ЗПР будет изменять свое структурно-функциональное состояние в ответ на изменения экзогенных факторов; 2 - изменения структурно-функциональных овойств мембран ЗПР будут сопровождаться изменением функциональной активности системы РГИ; 3 - в процессе адаптации клеток будет происходить изменение в биогенезе мембран, что и лежит в основе устойчивости клеток в новых условиях.

Определение количества липидов в ыихросомах регенерирующей печени крыс показало, что спустя 13 часов после операции их количество увеличивается по сравнению с интактным органом, за счет увеличения нейтральных липидов (Н® на 39 %, а тряацилглице-дов - 28 %). Обнаружено, что увеличение содержания липидов в микросомах обусловлено изменениями в соотношении скорости синтеза и их обмена о другими структурами клетки. Скорость обмена вновьсинтезированных липидов в микрооомах регенерирующей печени с цитозолем была значительно выше контрольного уровня. Проведенный анализ синтеза и обмена отдельных фракций липидов в клетках

печени показал, что скорость обмена липидов оказывает влияние на окорость синтеза м как оледотвие на содержание липидов в кик-росомах. Однако, эти взаимосвязанные процессы имеют и автономные звенья регуляции, которые регулируются независимыми факторами, что может лежать в основе липидной саморегуляции структуры мембран ЭПР.

Содержание липидов 2 ыикрооомах через 96 часов после локальной гипертермии печени (45 °С, 10 мин), увеличивалось по сравнению с интактнай печенью, хотя и в меньшей степени, чем при регенерации. Однако, это обусловлено изменением в содержании фоофолипидов, а не нейтральных липидов как в случае регенерации. При гепертермии усиливается скорость синтеза НЖ, которые включаются в состав вковьсаатезировалных фракций липидов, а"старые молекулы" лкпвдов покидавт мембрану и накапливаются в цитозоле, т. е. в случае гипертермии происходит смена липидов в соотаве мембран на липиды о измененным жирнокиаяотным составом.

Структурно-функциональные изменения мембран ЭПР при регенерации печени, локальной гипертермии и действии аннкоцена Известно, что изменение содержания к сосгава липидов кикро-сом должно сопрововдатьск структурно-функциональными изменениями мембран. Определение некоторых характеристик, отрахагдах структурно-функциональные свойства мембран показало, что степень эксимеризации гглрсна з ижрооомах рвгзнер;:рувцей печени (13 час после операции)'уменьпается по сравнению с контролем, что указывает на изменение кикрозящ«»«: мембран л месте локализации зонда. Интенсивность. флуоресценции 1,8-АНЗ а нембранах регенери-рущ&И печени уиекьсаетс»:. Обнарукенюге структурные кзмезежк сопровождались снижением октивноота глксого-б-фосфатазм, что отражает функциональные изменения этих меабраз.

Зональная гипергерхкя печеш: пригодна к ецз больному умекь-сенщ степени зкеимернзацик пиренг, чем г случае регенерации, что сопровождалось и больпи:,: паданием активности глвхозо-6-фос-фе тази.

Введение экспериментальным тавотным препарата акниоцен такзз приводило к онивенш степени аевннаразациа пирона и падежа ах-тивноати гликозо-б-фоофгтазы.

Теккм образом, все иеслздус-пао зоздйог^йя, вршзодаЕие к ва-мснекиь метаболизма липидов, 2 ¿с" иза с; о Г. степени приводят к структурно-функциональным изменениям мембран ЭПР.

Блйянй» ионов меди и магния аа ¿трук

г.окон;;, гяясль-л' о:-,

ия-, РГ" к отмене «^гут обусловлены и«

на лтр\к', уру "^.юрчл. От,-р..--. о, ¡тс ьлейг1;^" меди ь систему микрисом о^«р0о0ядд;.00Ь ¿учв.; ¿.¿ь.'.ки:; ¿гздлчзил-л.

-'.с с;::: Оч.:ЧД К Г-'. :: -/'. . ;> ••

гогг-сг . ,->l:■^:n:JJ У.УУ^:- ■ е.. : мл.!. -¡Г''- 'О» •-. -'-

цией перекисного окисления липидов мембрал. О действии лонов ме~

в хультуральную среду клеток водорослей.

Обнаружено, что иены хагн-дя оказывает влияние на биогенез мембран ЭП?, что нокзт слухить сзидетзльством опосредоэансго действия магния на нуклеиновый обмен.

Передача информации о состоянии среды на геном может осушест-вляться несколькими способами: 1 - структурные изменения ЗП? на осноре неоперативности пепедавтея на .'¡оугие типы мембран и в ,тг = гку;; .и:1. ,. ■•гч'л/^.сигнн^

'Л'Ьлп'Л г ^.'.ОТ'™., .'Г.1,; • , -У. \ - ■> :О К';;» НА г

С г.1" ■■-} С,:- '"л;:'1 ; - 'У' У]У~■ рн-.с '■■>

Миненил ;,.',.бра.-' -. - ■-• у" чохилд па

•¡окме л^идагь, ? ".е::ор^не ¿Лг, цпр-'Ь чн-

;-ые ; лзно'^уа л.-и:...' ■>.■■...> ^ :.-■...: .'.л:..;; С^дут. с з--

ться нсмзпе.т'.шм ;: Г---— -" ' *-- -- - - - ■•■ ■■■ ■' ' ,-г^ ^л.т^.рт:;;

ДО-лГОра/. , ".ГА ХУ-. .-и! ?;: у,- •. ;г.Ц С .! 1:М = 3

«штаге л -грдаои^рг; гХ1 а щ.'.ои;

Характеристика бедоксинтезируацего аппарата регенерирусдей

что при регенерации количество связанных с мембраной рибосом больше по сравнению с интактной печенью (рис. 14). Разделение ьноеьобразозаннах рибосом-на свободные, непрочно связанные и

овя^инн-чг д "омос^нои м:;--; лил'- обнаружить, что г3

лосх.: г^.йг.г -.одичг!С1ьо свободных и узедп-

чн-'ется коля-гззггз нзг.рпчк? и прочно езязаннях рибосом 'оно.

на мембраносвяэанных г,иГ/С-оомах.ь клв-гй.ах регенерируы«еи печени превосходила интактную в 3, 2 и I,'- раза черес 5, 15, и 135 аднут после начала ме-

чения белков, а во фракции свободных рибосом в 1,6, 1,6, 1,5 и 8,5 pasa (рис, 15).

i и

м

1 на

Ч: и

Ч

а JL >

JL JL

i4j

Ч - :

s 41- т ш

.

% <>§

А §

■ю §

ai

■и I

ил-талж. рггенер-

•s »У as

ßpfju*,

Рис. 14. Количество РНК рибосом на мг белка мккросоы (а) в ин-тактной (И) и регенерируавей (Р) печени и соотношение между разными фракциями вновь образованных рибосом (б); свободных рибосом (I), непрочно связанных с мембраной (2) и прочно связанных с мембраной рибосом (?).

Рис. 15. Динамика уд. рад. белков, синтезированных на мембрано-связанных (а) и свободных (б) рибосомах в интактной (i) и регенерирующей (2) печени.

Можно полагать, что именно структурно-функциональные изменения мембран ЗПР в'регенерирующей печени и приводят к усилению скорости транспорта РНК из ядра в цитоплазму на фоне ингибиро-нания синтеза РНК актикзкадшом. Д. Очевидно, РНК транспортирующаяся в цитоплазму принимает участие в синтезе белков, связанных с устойчивостью клеток к экстремальным условиям среды. Было обнаружено, что при ингибировании синтеза РНК в клетках регенерирующей печени наблюдается усиленный транспорт вновьсинтезиро-ванных белков в ядерные структуры клетей. Эти изменения сопровождаются изменением структурно-функциональных характеристик Sil?.

Взаимосвязь активности белоксинтезируюаего аппарата клеток

печени с транспортом и синтезом РНК в

Если исходить, из многоуровневое?'.; регуляции РГЛ в клетках эукариот и того, что они взаимосвязаны, то кнгнбирование синтеза белка будет сказываться на накоплении РНК в цитоплазме, а уменьшение скорости транспорта РНК из ядра в цитоплазму может приводить к "запиранию" транскрипции к как следствие, ингибировани/.

синтеза РНК. йоходя из отого. мснно полагать, что изменение скорости транспорта РЖ из ядра л цитоплазму, м<жв-г регулироваться активность* белачсинтезярувсей системы, модулятором которой является структурное состояние мембран Шр.

'Iccjcлоганис таких сложных функциональных систем аспрязкено о больии^ трудностями, поэтому мы использовали ингибитор синтезе бедкь ■ тлклогйксимвд (5 мг/ïOO г ".азса тела). Было обнаружено. что ингибирозание синтеза белка в клетках регенерирующей печена приводило к "сглаживанию" или значительному уменьшении различия ; cscpocTi: zprutcmpra РНК из ядра » цитоплазму по «равнении о исходным уровнем. Эп» результаты, хотя я к осмеяно, но полги«])*-дают положение о тем, что активность белоксинтезируяшяго аппарата клеток в регенерирующей печени определяет интенсивность транспорта РНК в цитоплазму.

Определение уд. рад. РНК яРНП-частиц, иеченшх в течение 15 минут, на фоне действия ЦГИ показало, что уд. рад. их увеличивалась в яктактной печени, что свидетельствует о накоплении РНК в ядре. Скорость синтеза РКК s стих условиях в клетках интактяой г7".'---'гл у;1.*ля«и?акас0 чере? тяуи лс- соавнения с 15 ми" " ъ

да:; m г. t :-îî- .■'SMSHAj'tvCh

«'. ккшка* ¡(s рвганерлрувввй печени уд. ран« ftiK яШЬ-частш» ..•вскичлааяагх -ч леньсей степени ts-j сравнения с интактно* чече-ч;. .', J-,-I-, wo»e- .'.ы-. лвззюю с больвей скорость» тсансаовта РНК j ,ц\\ 1>яростг. 'жктваа ^Нл « uw* .»слоьанх не изменялась я ое-rr-ri^piip/oùeH печени,

Л'А лолг-ляя с/.итоз С* елка, приводи-» к значи.-гедькому замедлению скорости тпякспор-га РКК я цитоплазму, накоп-ленив РНК в состава яРШТ-чаотиц и угнетению скорости, синтеза гНл '.сл „•.;>< ]-' з'-or'j палата?» что структур кис изменение

■.гчйган ":.М , «износбр^спыми причинами, изменяя ак-

тивность белоксинтезируюцего аппарата, будут приводить к изменению зеей системы РГИ и как следствие к. формированию новых мембран. Следовательно, внутриклеточная мембрана - ЗПР воспринимает •:hl: ор/ши*г о состояния зчекнев среды клшъння езое структурно-py;ir:u:i0Ka.,:>ï"0e зссточние:. кговдьет ôa-y информации з центр переработки - РП1. И этих условиях осуществляющийся биогенез мембран прл&од;:* •роркароэакав мембран игке.кенным составом, т. s., ке-мйрпка в-8дя?т",ч мотором - уисройстзэм, форми.рувдям ответ. £ случае повторного воздействия зтих факторов не будет происходить

существенных изменений в стук туре мембран, что и является одним кз молекулярных механизмов адаптации.'

Глава 6, Генотип организма и структурно-функциональная организация мембран клеток печени

Как уже отмечалось, ответная реакция организма или клетки на стрессовое воздействие определяется состоянием метаболических систем, формирующих этот ответ, в момент воздействия. Мембрана, являясь приемником и передатчиком информации о состоянии внешней среды, играет важнуэ роль, в устойчивости и адаптивности клетки. Эндогенные факторы^ оказывающие влияние на структурно-функциональное состояние мембран, будут влиять и на адаптивность организма. доследование влияния генотипа на структуру мембран, с одной стороны, позволит получить дополнительную информацию в отношении мембранно-генеткческой гипотезы, а, с другой, объяснить, различия в адаптивности у животных с разными генотипами.

Проведенные нами исследования показали, что линейные и гибридные животные различаются между собой по содержанию и скорости обмена липидкых компонентов микросом печени. В частности, микросокы гибридных крыс имели наименьшее содержание фосфатидил-холина и фосфатидалэтанолакина, а также ШК по сравнению с линейными формами. Скорость обмена липкдов у них также была меньшей по сравнению с крысами линий Вистар и Август.

У линейных животных содержание липидов в микросомах было одинаково, но скорость обмена их у линии Август была Еыие по сравнению с. линией Вистар. Отсутствие прямой корреляции между активностью глюкозо-6-фосфатазы и содержанием липидов в мембранах печени крыс разных генотипов может быть связано с тем, что на этот показатель влияет и скорость обмена липидов. Содержание и скорость обмена фракций липидов формируют генетически обусловленный "липидный рисунок" мембран, определяющий функциональную активность этих мембран и в частности активность ферментов, и влияющий на адаптивность организма.

В пользу этого свидетельствуют данные по влиянию препарата амниоцен на липидный обмен микросом у крыс линий Вистар и Август. Введение крысам этого препарата, приводит к выраженным генетическим изменениям в содержании НЖ и отдельных фракций фосфолшт-дое, а также их удельной радиоактивности. Обнаруженные генетические различия в ответ на действие препарата обусловлены использованием у крыс линий Еистар и Август различных метаболических

путей формирования липидного состава микросом.

Имеющиеся результаты указывапт, что структура мембраны как оффектор экзогенной информации формируется в результате взаимодействия системы реализации генетической информации с факторами среды.

БУВОШ

1. 3 ответ на действие различных факторов среди (радиации, локальной гипертермии печени, тяжелых металлог и некоторых ксенобиотиков) система реализации генетической информации функционирует а ритмическом режиме, на временной характер которого влияет не только внешние фактора, но и генотип организма.

2. В интактных клетках печени система реализации генетической информации функционирует в режиме околочасового ритма, функциональные изменения активности органа, в частности частичная ге-патэктомик, приводят к. модификации временной организации этих эндогенных ритмов.

3. Ответная реакция системы реализации генетической информации на экзогенные воздействия определяется структурно-временным и функциональным состоянием сямой системы реализации генетической информации в момент воздействия.

4. Система реализации генетической информации, включающая такие элементы как транскрипция, процессинг, транспорт РНК и трансляция, реагирует на разнообразные экзогенные воздействия как единое целое и может рассматриваться как центральное звено переработки экзогенной информации в клетке.

5. В ответ на действие экзогенных факторов среды (локальная гипертермия, частичная гепатэктомия, тяжелые металлы, ксенобиотики) изменяются структурно-функциональные свойства мембран эн-допд* :атической сети клеток печени.

6. Изменения структурнэ-гункциснальных характеристик мембран эндоплазматической сети в ответ на дейстЕие экзогенных факторов согласованы о изменением функциональной активности системы реализации генетической информации.

7. Тяжелые металлы оказывают влияние на функциональную активность система реализации генетической информации, имеющую трехфазный характер: фазу стимуляции, скрытую фазу и фазу инги-бкрования. Действие металлов на систему реализации генетической информация мокет быть опосредовано через их действие на мембранную систему клетки.

8. Лизооомальные мембраны и мембраны эндоплазматической сети

у крыс с разными генотипами различаются между собой по структурно-функциональным характеристикам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Божков А. К., Шерепевская Ц.М., Мартннвк Н.М., Щукин А,Р. Реализация генетической информации при гетерозисе // Тез. докл. 1У съезда генетиков и селекционеров Украины.-Киев: На-укова думка, I98I.-4. I.-C. 84-86.

2. Шерешевская Ц.М., Божков А.И., Ходорова Н.В., Яковлева А.Н. Активность некоторых ферментов и содержание АТ5> в ядрыско-хроматиново-мембранном комплексе при гетерозисе // Тез. докл. 1У съезда генетиков и селекционеров Украины.-Киев: На-укова думка, I98I.-4. I.-C. 138-139.

3. Шерешевская U.M., Божков А.И., Мартынюк Н.М. Редупликация, транскрипция и транспорт РНК и негистоновых белков в органоидах клеток при гетерозисе // Тез. докл. 1У съезда Всесовзн. об-ва генетиков и селекционеров.-Кияенев, 1982.-Ч. 4.-С. 290.

4. Шерешевская Ц.М., Божков А.И. Редупликация, транскрипция и транспорт РНК в клетках печени животных разного возраста к генотипа.-// Тез. докл. 1У Всесоюзн. съезда геронтологов и гериатров.-Киев.-1982.-С. 432.

5. Воshb:ov A.I., Shere siievskaja Та.Ы. Siathesis of nucleic .acid? iß the fraction of chromatin of the nomal and regenerating liver of animals of different ages and genotype // Beouvenation.-1982-1963.-Vol. 10-11.-HK 4-1.-P. 22-236. Шерешевская Ц.М.. Божков А.И. Функциональная активность

ядерного аппарата клеток печени и ее регуляция при гетерозисе И Ядерные белки и экспрессия генома: Тез. докл. республ. симпоз.- Киев.-1983.-С. 146-147.

7. Шерешевская Ц.К., Божков А.И. Молекулярно-генетические особенности аффекта гетерозиса // Биохимия животных и человека: Респ. нежвед. сб. научных трудов.-Киев.-1984.-Был. 8.-С. 3039.

8. Шерешевская Ц.М., Божков А.И. Активность генома и его регуляция в интактных и рзгенерируюдих клетках печени // Тез. докл. У съезда генетиков и селекционеров Украины.-Киев.-198с.-С. 95-95.

9. Пахбазсв В.Г., Григорьева Н.Н., Волков А.И. Об изменении некоторых цитологических я биохимических показателей "Э меристеме корней бобов под действием постоянного электрического тока .// Вестник Харьк, ун-та.-Харьков: Вида шкета, 1585.-3 268.-С. 37-38.

10. ¡лерешевская Ц.М., Божкоэ А.И. Онтогенетические особенности .1/ХЛ£ияо2»ого обмена у зязотянх разного генотипа // йолшгу-дярдое и функциональные механизмы онтогенеза: Тез, докл. Всес-овзн. симпоз.-Харьков,- 198>7.-С. 210-211.

11. А «И,, Яерэя»2с:егя Ц.М., Скляр АЛ., Яахбяэоз В. Г. К»-^ РЧН "г«р ц ттг*топлазну в клерках ^ разной функциональной активностью // Структура и функция клеточного ядра: Тез. докл. IX Всесоюзн, симпозиума. -Черноголовка. -1987»-С. 257.

12. Шереаевская Ц.М., Еозххов А.И., Ходорова Н.В. Генетические и возрастные особенности транспорта вновь синтезированной РНК в полисомы клеток печени // Тез. докл. У Всесоозн. об-ва генетиков и селекционеров им. К.И.Вавилова.-М»-1987.-Т.. I.-С. 307.

■ '-ку'яегсхая Ц..Ч., ¿ахбазоз В.Г.. Еожкоа А.л, Злк^ппе гааа-лучей н.-л скорсоть синтеза ДНК в кроветворных органах

л габркдных // Ьестьик Харьк, уч-?а.-лапьхой. -

'»3-45-

•• вэ^сасчяч II. М., Бо;->соя А.Л., Ходырева Н.Э. код «нудя ояме зма старения оргаапимоз пазными Гзнотип.-лл // Таз. док.;;. У зсессззн. съезда геронтологов и гевкатроз.-Тбияксй. -Киез,-1968.1.-0. 731.

15. Загоруйко Г,Е., Божкоз А.й. Сравнительный анализ кинетики

зная я лсстнатаяьного развития кардиомксцктов кзыо ли-1т'.стар и Лг-густ / Тзз„ дскл. / '¿оессвзн. везда "эрон-тологов и гериатров, Тбилиси 19И8.-Киев.-1988,-Ч. 1.-С. 239 -240.

16. Длубовская Б.Л., Боахоз А.Я., Асадова М.К. Внутриклеточный транспорт липндсв з регензрирувке* печени крыс / Харьк. уп-т.-Деп. в ВЛН'ЛТЛ II.09 . 89, 5 5759-889.

17. Длуйсвская В.Л., Божков А.И. Динамика удельной паяиоактиз-иосш лигоедов субклеточных фракций клеток регзнорируюгагй аечвчи крас / Харьк. ун-т.-9 с.~Дзп. £ БШШ 15.11.89.

9 6904-589.

16. Усенко E.B., 'Божков А.И. Факторы, влияющие на чувствительность Tetrahymena pyriformis к ионкч меди // Тез. докл. • Всесоюзн. конференции: Методология экологического нормирования, ХарькоЕ, 16-20 аир. 1990г.-Харьков.-1990.-С. 153-154.

19. Божков А.И.,. Длубовская В.Л., Шерешевская Ц.М., Мензяно-ва Н.Г. Генетические различия в активности микросом у крыс // Цитология и генетика.-1990.-Т. 24.-I 2.-С. 5-10.

20. Божков А.И., Гопкалов В.Г., Скляр А.И., Шерешевская Ц.М., Асадова К.К. Влияние препарата амниоцена на метаболизм нуклеиновых кислот л клетках печени крыс // Вопр. мед. химии, -1990.-Т. 36.-К 2.-С. 39-41.

21. Божков А.И., Длубовская В.Л., Никитин E.H. Соотношение синтеза и. обмена липидов микросом как фактор, изменяющий структурное состояние мембран //Докл. АН СССР.-1990.-Т. 315»

5.-С. I 260-1 263.

22. Божков А.И., Скляр А.И., Шерешевская Ц.М. Ритмические изменении удельной радиоактивности РНК РНП-частиц ядер интагст-ной и регенерирующей печени // Структура и функция клеточ-ног.о ддра: Тез. докл. X Всесоюзн. симпоз., 10-14 октября 1990 .г. -Гродно. -1990. -С. 77.

. .23. ;Кал;".ман H.A., Усенко Е.В., Божков А.И., Абу-Бакари А. Возможный механизм действия ионов меди на процессы реализации '.генетической информации в клетках эукариот // Там зхе.-С. 94.

'■'2h., рожков А.И., Абу-Бакари А,, Калиман П.А. Динамика транспорта-PHK в цитоплазму интактной и регенерирующей печени крыс на фоне действия сублетальных доз актиномицина Д // Там ке. -С. 156.

."25. 3oziikov A.I., Bogadiaa E.V., Xyasherfco Т.Е., Usenka E.V. Effect of copper ions on the content of nucleic acids and proteins in green algae //Альгология.-1991. -T. I.-)f I.-C. 76-62.

-25. Усенко E.B., Божков А.И. Влияние тяжелых металлов на динамику роста и функциональную активность генетического аппарата Chlorella vulgaris Биологические науки.-1991.-Г* 3.-С. 69-76.

"27. Ляшекко Т.Е., Божков А.И., Догадана Т.В. Влияние ионов меди на содержание нуклеиновых кислот и белка е клетках Еодорос-лей рода Dunaliella Teod.// Биологические науки. -1991. -К 7. -С. 103-108.

28. Божков А.И., Длубовская В.Л., Шерешевская Ц.М. Изменения в ■ микросомах печени крыс, индуцируемые препаратом ачниоцен

/Ред. журн. "Вопр. мед. химии".-M., I99I.-T. 7. , 2.-С. 94,-Деп. в ВИНИТИ 07-06.90, í 3I56-B.

29. Божков А.И., Усенко Е.Б. Проявление генотскс • нести металлов в клетках водорослей и инфузорий П Тез. ок. . Еторой всесоюзн. конф. по рыбохозяйственной токсикоз., i освящ. 100-летию проблеме качества воды в России, нояб. /99/ г. - Санкт-Петербург.-I99T.-Т. Т.-С. 54-55.

30« Догадина Т.З. , Божков А.'Л. Использование фук . ио.-альных тестов в биоиндикации // Там »е.-С. I5S-I6Q.

31. Боаков А.И.. Абу-Бакари А. ..Богданов С.Д., Кг.дим&ч П.А. Динамика синтеза и транспорта РНК з интзягшсЯ тг peí ;керируг-щей печени на фоне действия сублетальных доз хтиномицина Л // Укр. биохим. журн.-1991.-Т. 63.-!? 5.-С. 33 39

32. Божков А.И., Длубовская В.Л. Влияние гкпертер.ии частичной гепатэктомии печени на струхтурно-функци <каль че характеристики мембран эндоплазматической сети /F --д. а "Билл, эксперим. биол. и мед. "-М., I99I.-Í 7.-С. Ш.-Д; : ВИНИТИ 23.10.90, S 5451-3.

33. Есхксв А.И., Шерэяевская U.M., Скляр А.'*. I нами з синтеза различных типов РНК в клетках печени линейн х и ибридных крыс на фоне гипертермия // Природа, проявл чие i прогнозирование гетерозиса: Сб. науч. тр.-Киев: Kay! ова цумка, 1992.-С. 62-67.

34. Усенко Е.Б., Божков А.'Л., Калиман П.А. Влия;;це д^ди и инсулина на синтез нуклеиновых кислот и белка в -_яег сах Tetrahy-meiia pyrixOEEiis , находящихся в разл'.г;них 'кц: *кзльных состояниях // Биологич. науки.-1991.-? 12.-С Зь 42.

35. Боксов А.И., Длубовская В. J1. ЛипидныЯ обмен î/î структуры о-функциональнее особенности мембран эндоялаз* .тич ского ре-тихулума регенерирующей печени крыс //Биохимия.-/992.-Т. 57.-Ьып. I.-G. 8-15.

36. Еерешевская Ц.М., Ходорова Н.В., Божков А.Й. iei-JTOTe локальной гипертермии печени на содержание РНК i им- гнокомпете-нтных клетках линейных и гибридных крас // Т^ докл. УТ съезда Укр. об-ва генетиков и селекционеров, Лолтава 1992. -КяеЕ.-1392.-Т. I.-C. 40-11.

37. Еоьлов А.И., Длубовская E.Ji., Асадова ÍÍ.К., ¿кляр А.И., Ие-* реаэЕскач Ц.М. Генетические особенности лили яого обмена и ' адаптация к гипертермии при гетерозисе // Таг же.-С. 150151.

38. Божкоц А. И Ляшенко Т.Е., Догадина Т.Е. Влияние ионов меди на шт нсивность. выделения белк'ов и фенолов в среду двумя виг .«к водорослей рода ПипаНеНа Твой- // Биологические науки -15:^2.1.-С. 126-132.

39. А. с. 1Ь\ 1.8С4 СССР, МИ4 6 09 Б 23/28: Способ моделирования гепат та ,'Бсжков А.И., Шахбазов В.Г., Гопкалов Ь.Г.,

Скляр А.Ц., Шерешевская Ц.М., Длубовскея В.Л., Асадова М.К,, Набок 'В Я. Л. (СССР).-Опубл.- 1988.-Бпл.К 27.

40. А. с. 17чЭ835 СССР, МЮР й 01 н 39/68. Способ оценки мемб-ранот' опности ксенобиотиков /Божков А.И., Длубовская В.Л. (СССР;. Опубл.-1992.-Бюл. № 27.

41. А. с "."55194 СССР, МКИ5 ь 01 л 33/48. Способ определения ген&гаи^ичности водорастворимых Ееществ /Усенко Е.В., Божков А Л.. Калибан П.А. (СССР).-Опубл.-1992.-Бюл. и 30.