Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение разнообразия гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Изучение разнообразия гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНА ел V ШТАММОВ ВИЧ-1, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ГРУППАХ РИСКА В САНКТ-
03.01.04 - Биохимия 03.01.03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
На правах рукописи
ДУХОВЛИНОВА Елена Николаевна
ПЕТЕРБУРГЕ
004603.:
Санкт-Петербург 2010
004603300
Работа выполнена в лаборатории негосударственного научно-исследовательского учреждения «Биомедицинский центр», Санкт-Петербург.
Научный руководитель -
доктор биологических наук профессор
Козлов Андрей Петрович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Евтушенко Владимир Иванович
кандидат биологических наук доцент
Тищенко Людмила Ивановна
Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт гриппа СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук
Защита состоится « ю » 1-110 МсР 2010 г. в № часов на заседании Совета Д.212.232.09 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9, ауд. 90)
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. А. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.
Автореферат разослан «
Ш^уАЛ 2010 г.
Ученый секретарь кандидат биологических наук
Л.С. Курилова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В октябре 2009 года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 516167 [Федеральный центр СПИД, 2009].
В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Одной из проблем в создании эффективной вакцины против ВИЧ-1 является его высокий уровень генетического разнообразия. Высокие частоты мутационных и рекомбинационных процессов, высокая скорость размножения и большой размер вирусной популяции ведут к высокой изменчивости вируса в каждом инфицированном организме [Но et al., 1995, Ни et al., 1990, Roberts et al., 1988]. Создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены [Hanke et al., 2000]. ДНК-вакцина против ВИЧ, создающаяся исследовательской группой под руководством А.П. Козлова в Санкт-Петербурге, содержит ген белков оболочки ВИЧ-1 восточно-европейского варианта субтипа А, поскольку в момент разработки вакцины именно этот вариант доминировал в регионе [Мурашев и др., 2003]. Мониторинг генетического разнообразия ВИЧ-1 в популяции, а особенно в группах повышенного риска инфицирования ВИЧ, необходим для совершенствования профилактики, терапии и создания эффективной вакцины.
В момент инфицирования, за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма, происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции [Lawson et al,, 2002]. В настоящее время существует теория о передаче половым путем (гетеро- и гомосексуально) преимущественно единичных геномов ВИЧ [Wolfs et al., 1992, Derdeyn et al., 2004, Long et al., 2000, Sagar et al., 2003]. Наличие подобной избирательности при парентеральной передаче ВИЧ-1 ранее установлено не было.
Детальная генетическая и иммунологическая характеристика переданных изолятов может помочь в разработке эффективной вакцины против ВИЧ. [Derdeyn et al, 2004, Gottlieb et al, 2008, Keele et al, 2008]. Разработан новый подход лабораторной оценки эффективности кандидатной вакцины -определение иммунологических свойств белков оболочки ВИЧ и особенностей их взаимодействия с нейтрализующими антителами на стандартизованных панелях псевдовирусов, полученных на основе переданных изолятов ВИЧ [Mascola et al, 2005]. Изучение разнообразия гена env передаваемых изолятов ВИЧ и создание панели псевдовирусов на их основе является одним из
наиболее перспективных подходов к созданию эффективной вакцины против ВИЧ [Ы а а!, 2005].
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучить разнообразие гена епу штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге, для последующего использования полученной информации в целях разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД. Задачи исследования:
1) Определить нуклеотидные последовательности фрагмента гена ет штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге.
2) Сравнить генетическое разнообразие ВИЧ-1 в различных группах риска.
3) Определить нуклеотидные последовательности полноразмерного гена ет штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в крови ПИН с острой и ранней стадиями ВИЧ-инфекции.
4) Оценить количество вариантов ВИЧ-1, передаваемых парентерально.
5) Изучить свойства гликопротеина оболочки £р120 переданных штаммов ВИЧ-1.
6) Получить панель псевдовирусных конструкций, содержащих белки оболочки переданных изолятов ВИЧ-1 варианта А-ЕЕ для последующего изучения иммунологических свойств кандидатных вакцин против ВИЧ.
Научная новизна работы. Впервые показано особое положение штаммов субтипа В из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1. Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей рекомбинантной форме СКР06_срх , в Санкт-Петербурге, и показана его вторичная рекомбинация с восточно-европейским вариантом субтипа А.
Впервые секвенированием единичных копий полноразмерного гена ет штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в организме ПИН, установлено наличие т.н. «бутылочного горлышка», т.е. избирательности при передаче штаммов ВИЧ парентеральным путем.
Впервые создана панель псевдовирусных конструкций на основе переданных штаммов восточно-европейского варианта субтипа А для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-1.
Научно-практическая значимость работы. Показано наличие двух независимых эпидемий ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге в группах риска ПИН и МСМ. Среди ПИН было выявлено присутствие преимущественно штаммов восточно-европейского варианта субтипа А (А-ЕЕ), тогда как среди МСМ циркулировали штаммы субтипа В. Показано, что новые случаи ВИЧ-инфекции вызываются штаммами А-ЕЕ, и таким образом установлена целесообразность испытания кандидатных вакцин против ВИЧ-1, содержащих гены варианта А-
ЕЕ среди ПИН. В рамках данной работы получены фрагменты и полноразмерные копии гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди групп риска в Санкт-Петербурге. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности, которые депонированы в международную базу данных GenBank. Выявлено наличие «бутылочного горлышка» при парентеральной передаче ВИЧ-1. Получена панель псевдовирусных конструкций на основе штаммов субтипа А, которая будет использована для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ.
Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в России и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.
Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнялась в рамках финансирования ННИУ «Биомедицинский центр» по федеральному проекту, выполняемому в соответствии с распоряжением Правительства РФ №1905-р «Разработка ДНК-вакцины против ВИЧ и молекулярно-эпидемиологический мониторинг разнообразия ВИЧ в Санкт-Петербурге», а также по грантам Международного центра Фогарти (Fogarty International Center) «Подготовка специалистов и исследования по превенции ВИЧ-инфекции в России» (№ 5D43TW01028) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследования в области ВИЧ и туберкулеза» (№ RUB1-7000-ST-08).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16-й, 17-й и 18-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, Россия, в 2007, 2008 и 2009 годах; 14й, 15-й и 17-й конференциях по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, США, в 2007, 2008 и 2010 годах; 4-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Сидней, Австралия, 2007; Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, Россия, 2009. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками, 10 таблицами и 2 приложениями. Список литературы содержит 314 литературных источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сыворотки крови. В данной работе использовались образцы сыворотки крови, полученные от участников различных исследований, проводившихся в Биомедицинском центре с 2002 по 2009 год. Образцы сывороток хранились при температуре -80°С и использовались для данного исследования с письменного
согласия участников. Все образцы крови были протестированы на антитела к ВИЧ-1 и маркеры гепатита С и ИППП (сифилис, гонорея, ВПГ-2).
Для анализа разнообразия гена ет в группах риска использовали образцы сыворотки крови, полученные в Санкт-Петербурге в 2005-2008 годах от : (1) Потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) - активные наркопотребители и те, кто имел опыт использования иньекционных наркотиков в течение жизни. (2) Половые партнеры ПИН, никогда не употребявшие наркотиков. (3) Мужчины, имеющие секс с мужчинами (МСМ). Среди 127 ВИЧ-положительных участников мы выявили 26 случаев недавней (до полугода) ВИЧ-инфекции и 16 случаев хронической инфекции ВИЧ.
Для анализа популяции ВИЧ-1 в крови ПИН в начальной фазе инфекции использовали образцы сыворотки крови, полученные с 2002 по 2008 год от участников с т.н. острой и ранней ВИЧ-инфекцией в соответствии с классификацией по Фибигу [Ке!^ е1 а1, 2003] (см. табл. 2)
Таблица 1.
Демографические, клинические и и поведенческие характеристики участников с острой и
ранней ВИЧ-инфекцией.
Номер участника Пол Возраст (годы) Стаж употребления наркотиков (годы) Я 5Г о Э. я <га !. а 2 К S, - Стадия ] ВИЧ-инфекции по Фибигу Способ употребления 2-3 Наличие маркеров ИППП Использование презерватива Путь заражения (парентеральный или половой)
Н386 Ж 27 п/а 5.8 IV 2 _, HSV Иногда Оба
Н408 М 21 п/а 5.4 III 2 HSV Нет Оба
Н410 М 24 п/а 5.8 III 2 Нет Нет Оба
К08 М 30 16 6.2 VI 2 Нет Не было секса 3 мес Парент-й
К84 М 18 4 5.4 IV 3 Нет Да Парент-й
R053 Ж 35 10 5.6 IV 2 Сифилис ВПГ-2 Иногда Оба
R163 Ж 32 16 5.5 I-II 2 Сифилис ВПГ-2 Да Парент-й
R392 м 41 25 5.7 IV 2 Нет Нет Оба
R497 м 22 8 5.6 IV 2 Нет Да Парент-й
R526 м 30 7 5.7 I-II 2 Нет Иногда Оба
R575 м 22 3 5.8 IV 2 Нет Не было секса 3 мес Парент-й
R589 ж 29 9 4.8 VI 2 ВПГ-2 п/а Оба
SC1283 м 29 2 4.7 VI 3 Сифилис п/а Оба
1 ВН-вирусная нагрузка; " Рискованное использование наркотиков за счет использования нестерильного оборудования или чужих шприцев; 'Безопасное использование наркотиков в течение последних 30 дней.
Нуклеотидные последовательности фрагмента гена ет были получены матрице неразведенной кДНК и представляли собой консенсусные последовательности. Для полноразмерного гена епу были получены единичные ампликоны по методу АЕГ [Ба^гаг-Оошакг еЬ а1., 2008]
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Разнообразие субтипов ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге. В нашем исследовании мы обнаружили присутствие штаммов ВИЧ-1 восточноевропейского варианта субтипа А (А-ЕЕ) в 126 образцах крови, полученных от ПИН и их половых партнеров в Санкт-Петербурге в 2005-08 годах. Наличие данного варианта было показано с помощью секвенирования и филогенетического анализа коротких фрагментов гена ет (109 из 109 образцов) и полноразмерного гена ет (16 из 17 образцов) штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе ПИН. Полученные результаты соответствуют предыдущим наблюдениям нашей группы и других авторов о том, что в Санкт-Петербурге среди ПИН циркулирует и передается половым путем восточноевропейский вариант субтипа А, или А-ЕЕ.
Среди ПИН с ранней ВИЧ-инфекцией мы обнаружили одного участника, в крови которого циркулировали штаммы С№06_срх. Наличие ЦРФ СЯР0б_срх в крови данного участника было подтверждено секвенированием и филогенетическим анализом полноразмерного гена ет штаммов ВИЧ-1 этого пациента. Это первый случай выявления данной ЦРФ в Санкт-Петербурге. Помимо изолятов С1Ш)6_срх, которые доминировали в образце крови пациента 5С1283, мы обнаружили уникальные рекомбинанты между СКР06_срх и А-ЕЕ. Явление рекомбинации С1Ш36_срх/А-ЕЕ было подтверждено филогенетическим анализом (Рис.1) и сканирующим анализом генетического расстояния между нуклеотидными последовательностями (данные не представлены) участков единичных ампликонов. Отдельно штаммов А-ЕЕ в данном образце выявлено не было.
Секвенирование и филогенетический анализ коротких фрагментов гена ет штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска МСМ, показали, что из 18 проанализированных образцов 17 содержали штаммы ВИЧ-1 субтипа В (Рис.2). Филогенетический анализ выявил, что большинство штаммов ВИЧ-1, обнаруженных в Санкт-Петербурге, оказались родственными штаммам ВИЧ-1 из других регионов России и стран бывшего СССР. Это наблюдение свидетельствует о том, что эпидемия ВИЧ-1 субтипа В развивается в Санкт-Петербурге главным образом за счет распространения из других регионов России, а не только благодаря заносам из Западной Европы и США, как было раньше.
Один образец крови был получен от участника, который указал повышенный риск не только полового гомосексуального, но и парентерального заражения ВИЧ, и содержал штамм ВИЧ-1 варианта А-ЕЕ. Мы предполагаем,
что данный индивид, несмотря на принадлежность к группе риска МСМ, заразился ВИЧ-1 парентеральным путем.
Результаты, полученные в данной части нашего исследования,
Ч
к. Ви.2005.04Пи001,00400856
- 06 ср*.Е6.2001. ЕЕ035Э.А¥535659
32 06А1.ЕЕ.ао01.ЕЕ0369. АУ5356бО
ЕР589044
03207944 АР413982 00823361
АУ 500393
ЦРФ
СКР06_срх
и, Ампликоны с 2 точками рекомбинации
Вариант А-ЕЕ
Рис. 1. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей З'-концевого фрагмента ампликонов ЭС1283 с координатами 8330-9013 п.н. в геноме НХВ2. Исследуемые последовательности отмечены кружками, референсные -названиями в формате СепВапк.
свидетельствуют о том, что в Санкт-Петербурге среди ПИН циркулируют штаммы ВИЧ-1 варианта А-ЕЕ. Учитывая эти данные, а также высокий уровень заражаемости ВИЧ в данной группе риска [Ког1оу е1 а1., 2006, УегеуосЫип & а1., 2008], среди ПИН обосновано применение ДНК-вакцины против ВИЧ, несущей гены варианта А-ЕЕ. В группе риска МСМ обосновано применение ДНК-вакцины против ВИЧ, несущей гены субтипа В.
Генетическое разнообразие ВИЧ-1 внутри субтипов. Значения генетического расстояния, полученные для штаммов субтипа А, были достоверно ниже значений, полученных для штаммов субтипа В. Это наблюдение согласуется с историей развития эпидемии ВИЧ в России и в мире. Эпидемия ВИЧ-1 субтипа В в России началась на десятилетие раньше, чем эпидемия ВИЧ-1 субтипа А, и пути распространения этих субтипов различались. Давняя история эпидемии ВИЧ-1 субтипа В, половой путь передачи и множество заносов штаммов данного субтипа в страну из-за границы создали предпосылки для более высокой гетерогенности вируса.
Эпидемия ВИЧ-1 субтипа А среди ПИН имела «эффект основателя», т.е. началась с единичного случая, и за счет высокой заражаемости парентеральным путем за короткий промежуток времени охватила большое число людей. При этом вирус не успевал значительно дивергировать внутри отдельного
Л
В.иА.2001.01ЦАКУ259
- в.СЕ.гооэ.азсЕмапо
_ie.XJA.-UA4
' 1И)1 В.ЦА.-.ЦА2
£
- В. ид.2001.01ЦАКV167
В. ЦА.2001.01ЦАК V 252
кластер В-ЕЕ (1)
- В.ни.2004 04ГОЛ25005 -в.ЦА.-.иА5
- В. Ди.2004.04ЯШ 39089
-B.NL.00.S7t 00Т36.АУ423387 — В. №.2004.04ЙУ13909$
-все.гооз.озсЕмахй
-B.US.9S.I53M 1.00353463
«гСГи
еП-а
"-В.иА.19£
лилэвв.йишге
. ЦА. 1997.11А1216 13 в.иА.-.ЦКЯ121б
иА.1998.МК83
.Ви-.райеп» 3134
В. ЦА. 1998. N1X86 ——-B.ru.-.ра1»вп12341
— 0.йи.2ОО4.О4Я1)129ОО5
-В. иЭ .98.1058 11АУ33129$
в.1Н90.ВК132.А¥173951 -В.Ви.-.раШ* 2669
- В.Яи.-.райел! 2348
• В.РЙ.1983.Н)82Ч-АН1В-вЯи
В.ЦА.-.ЦА6 — В.иЛ.-.ЦА7
J кластер В-ЕЕ (2)
-AVKE.94.Q231?.АР004885 Ч-
Субтип В
у
Субтип А
Рис. 2. Результаты филогенетического анализа 17 нуклеотидных последовательностей фрагмента гена еп\>, полученных из группы риска полового инфицирования ВИЧ (МСМ). Кружками обозначены изучаемые последовательности. Черным цветом обозначены референсные последовательности ВИЧ-1, взятые из СепВапк. Референсная последовательность субтипа А использована в качестве внешней группы.
индивида, поэтому долгое время генетическое разнообразие ВИЧ-1 в популяции остается на относительно низком уровне.
При сравнении генетического расстояния в подгруппах ПИН с недавней (менее полугода) и хронической (более года) ВИЧ-инфекцией мы обнаружили статистически достоверные различия: в подгруппе ПИН с недавней инфекцией генетическое разнообразие было ниже, чем в подгруппе с хронической инфекцией (Рис. 3). Это может быть связано с тем, что большая часть заражения происходит от пациентов, находящихся в ранней стадии инфекции.
0,28 0,26 0,24 0,22 0,20 0,18 0,16 ■ 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
■ медиана □ 25%-75% ЗС мин - макс
Субтип А
Субтип В
0,08
0,06
* Медиана □ 25%-75% 1 мин - макс
ПИН(1)
Рис. 3. (А) Сравнительный анализ генетического разнообразия фрагмента гена еп\ для штаммов ВИЧ-1 субтипа А (ПИН) и субтипа В (МСМ). (Б) Сравнительный анализ генетического разнообразия фрагмента гена еп\ для штаммов ВИЧ-1 субтипа А из разных подгрупп ПИН. На оси абсцисс отмечены изучаемые подгруппы, на оси ординат - значения генетического расстояния, полученные при попарном сравнении нуклеотидных последовательностей.
Генетическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧ-инфицированных ПИН. С помощью секвенирования, анализа нуклеотидных различий и филогенетического анализа единичных копий полноразмерного гена env мы обнаружили множественную передачу вирусных вариантов (два и более) в 4 случаях из 13, что составило 30.7% (См. Табл.2). Это несколько больше, чем было обнаружено при передаче ВИЧ половым путем [Keele et al, 2008, Abrahams et al, 2009], хотя данное превышение не является статистически достоверным.
Таблица 2
Данные генетического разнообразия полноразмерного гена env изолятов ВИЧ-1, полученных от ПИН с острой и хронической инфекцией
Порядк. номер уч-ка Номер образца Стадия ВИЧ по Фибигу Кол-во ед. амшш-конов Макс, число нукл. различий Кол-во вариантов
Пациенты с острой и ранней ВИЧ-инфекцией
1 Н386-1 IV 26 5 L 1
Н386 -2 V 23 6 1
2 Н408 -1 Ш 24 3 1
Н408 -2 IV 20 36 2
3 Н410-1 III 27 36 3
Н410 -2 IV 24 24 2
4 К08 VI 23 7 1
5 К84-1 IV 29 5 1
К84-2 V 23 5 1
6 R053 -1 IV 22 12 2, реком-бинатны
R053 -2 V 20 12 2, реком-бинанты
7 R163 I-II 21 2 1
8 R392 IV 29 4 1
9 R497-1 IV 26 10 1
10 R526-1 I-II 28 3 1
R526 -2 V 19 10 1
11 R575 IV 18 5 1
12 R589 VI 29 10 1
13 SC1283 VI 24 97 2
Пациенты с хронической ВИЧ-инфекцией
R497-2 VI+ 25 82 Смесь
14 SC1233 VI+ 25 40 Смесь
15 SC1457 VI+ 21 101 Смесь
16 SC3208 VI+ 25 64 Смесь
17 SC3410 VI+ 23 99 Смесь
Таким образом, почти в 70% случаев мы наблюдали гомогенную вирусную
популяцию ВИЧ в крови ПИН с острой и ранней инфекцией (по Фибигу). Поведенческие данные участников
(отсутствие использования презервативов, большое число сексуальных партнеров или наличие ИППП) позволили нам полностью исключить половой путь передачи ВИЧ для пяти из тринадцати пациентов с острой/ранней ВИЧ-инфекцией (Ш63, 11497, 11575, К08 и К84, см. Табл 1). Для этих 5 пациентов анализ нуклеотидных различий и филогенетический анализ единичных ампликонов
показал наличие в крови единичных вариантов ВИЧ-1.
Образец крови 8С1283 содержал два типа изолятов, один из которых
соответствовал СКР06_срх, а другой - рекомбинанту по 3' участку между ЦРФ С1Ш)6_срх и вариантом А-ЕЕ (Рис 1). Участок 5', общий для ампликонов СЛК)б_срх и С1Ш)6_срх/А-ЕЕ, обладал высокой гомогенностью, и отдельно вариантов А-ЕЕ в образце обнаружено не было. Эти два наблюдения позволяют предположить, что
рекомбинация произошла в организме донора, и пациент 8С1283 заразился двумя указанными рекомбинантами ВИЧ от одного донора в один
Н410
А.
1000 2000
Б.
3000
"Л
Вар. 1
У
Вар. 3 Вар.2
Рис. 3.2.3. Генетическое разнообразие вирусной популяции в образцах Н410. (А) Диаграмма нуклеотидных различий, где ампликоны сортированы по наличию мутаций. (Б) Результат филогенетического анализа полученных ампликонов. Вирусные варианты отмечены скобками и стрелкой справа.
момент времени. Однако, мы не можем исключать версию того, что индивид SC1283 заразился двумя вирусными вариантами - варианта А-ЕЕ и CRF06_cpx, после чего на самых ранних стадиях инфекции произошла рекомбинация этих двух вариантов. Штаммы рекомбинантной формы CRF06_cpx могли оказаться более приспособлеными и размножились в организме, а штаммы субтипа А могли элиминироваться из организма за счет гипермутирования и нарушений репликации. Косвенно в пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что среди ПИН в Эстонии штаммы CRF06_cpx доминируют, практически вытеснив штаммы А-ЕЕ. Мы не можем полностью исключать и суперинфекцию, т.е. заражение уже инфицированного организма штаммами другого субтипа.
Хотя теоретически в когорте ПИН должна наблюдаться большая частота передачи нескольких вирусных вариантов при заражении ВИЧ по сравнению с когортами, где доминирует половой путь передачи, большинство инфекций в нашем случае было инициировано одним вирусным вариантом. Особенности использования наркотиков, частота половых контактов и распространенность ИППП влияют на число передаваемых при заражении ВИЧ вирусных вариантов в любой когорте. Кроме того, в популяции со столь высокой заражаемостью ВИЧ-1, какая наблюдается в Санкт-Петербурге [Kozlov et al., 2006], большинство доноров ВИЧ-инфекции могут находиться в стадии острой или ранней инфекции с низким уровнем генетического разнообразия вируса, и поэтому даже в случае передачи нескольких вариантов они будут не отличимы друг от друга. Мало что известно о вирусных популяциях в течение первых нескольких дней после передачи ВИЧ-1. Согласно одной из гипотез, единственная вирусная частица заражает одну клетку, после чего вирус успешно размножается и данное событие дает начало продуктивной инфекции. По другой гипотезе, в организм проникают многочисленные вирусы, но в результате отбора при размножении в клетках реципиента вирусная популяция становится гомогенной. [Learn et al, 2002] Мы обнаружили 2 примера, подтверждающих вторую гипотезу. В образцах крови Н410 мы наблюдали на стадии Ш - 3 вирусных варианта, а на стадии IV - только два, что было подтверждено анализом нуклеотидных различий и филогенетическим анализом единичных ампликонов env этих образцов (См. Рис 4). Для образцов R053 мы выяснили, что вирусный вариант, который в популяции на стадии V был минорным, на стадии IV стал доминировать (данные не представлены)
Мы изучили генетическую сложность вирусной популяции в крови ПИН с острой и ранней ВИЧ-инфекцией. Множественные вирусные варианты были представлены лишь в 30% (4 из 13 пациентов) случаев. Филогенетический анализ показал, что штаммы ВИЧ-1, обнаруженные у разных ПИН, не образуют эпидемиологический кластер, и генетическое разнообразие ВИЧ-1 внутри организма ПИН с хронической ВИЧ-инфекцией значительно выше, чем в случаях недавней ВИЧ-инфекции. Эти факты свидетельствуют о том, что низкая сложность вирусной популяции у недавно
инфицированных ПИН может объясняться передачей низких инфекционных доз при заражении среди ПИН. Однако более низкая общая сложность местной эпидемии вследствие начальной стадии ВИЧ-инфекции у доноров и высокой заражаемости в популяции также может быть причиной наблюдаемого эффекта «бутылочного горлышка».
Фенотипическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧ-инфицированных ПИН. При анализе аминокислотных последовательностей единичных ампликонов еп\\ полученных от ПИН с острой/ранней и хронической стадией ВИЧ-инфекции, мы обнаружили, что по правилу 11/25 и суммарному заряду УЗ-петли (Табл. 3) большинство вирусов имеют И5-фенотип.
Таблица 3.
Результаты анализа аминокислотной последовательности УЗ-петли __исследуемых изолятов.__
Номер образца Аминокислотная последовательность Правило 11\25 Правило заряда
Заряд 1фенотип
Пациенты с острой и ранней ВИЧ-инфекцией
Н386 С1НР0ШТЯТ31К1СРС12ТРУАТСОТ1СП11ЖАУС И5 3 1*5
Н408 сзкрсштнтзтаюрозтЕУАтсоутсотмнс 1*5 4 1*5
Н410 С1КРОШТ11ТЗ:№1СРС0ТРУАТСПУ1СП11ЖАНС К.5 4 1*5
КО8 аЯРОтТИТЗ^ЮРООТРРаТвШХСОТЯКАНС К5 4 1*5
К84 С1КР8ШТКТС1К1СРС0ТРУАТОНУ1СС1ККАУС 1*5 4 1*5
И053 СТКРОШТКТЗИиСРаОАРУАТС^ЮТИЖАНС 1*5 4 1*5
тез СIИРСШТИТЗIЯI бРСОТГУАТООТ ЮОI киж: 1*5 3 1*5
В392 С1КР(ЗШТКТ5ГКГСРС0ТРУАТИ)У1СШРККАНС 1*5 4 1*5
Я497 С1КР(^ТНТЗта1СРСОТОУАТС<3\т301М1АУС ИБ 4 1*5
И526 С1КРСЬМТ11Т31К1СРСС>ТРУАТС0У'1С01Ш1АУС 1*5 3 1*5
В575 С1ЕРСШТНТЗШийРС<ЭТРУАТСП\т301ЕКАУС 1*5 3 1*5
1=1589-2В10 С1КРБШТЯТ31ЕКРвОТРУАТСЕ\Л«Э11ККАУС 1*5 4 1*5
14589-А12 СИ^РЗМиТКТЗтЮРСОТРУАТСКУУОГПККАУС Х4 6 Х4
8С1283 СТКРУШТКК31Н1СРСдЗРУАТ0А11СП1Е<ЭАНС 1*5 5 1*5
Пациенты с хронической ВИЧ-иис >екцией
веч233 С1КРСШТКТО1НЮРС0ТЕРАТСАУ1СП1МСАНС 1*5 5 1*5
5С1457-В12 С1КРЗЗКТКА81К10Р0КТЭТАМ0<ЗТС(ЗМРККАУС 1*5 6 Х4
5С1457-СЗ СТКРСШТИКЭТН 1С РСС>ТРУТТОЕ11вШЯКАНС 1*5 5 1*5
везгов СХКРСММТКТЗУКЮРСОТРУАТСОУТСРтНАНС 1*5 4 1*5
8С3410 ОШРОШТНТБИиСРОЗАРУАТСЕУТССИЖАНС 1*5 4 1*5
В двух случаях в популяции ВИЧ внутри пациента мы обнаружили и 115-, и Х4~варианты, причем в случае пациента БС1457 результаты предсказания фенотипа двумя различными методам различались: фенотип Х4 в случае одного из изолятов определялся лишь по правилу заряда, которых был равен шести. Наличие вариантов, различных по фенотипу, в вирусной популяции одного пациента свидетельствует об эволюции вируса внутри хозяина.
Мы сравнивали число потенциальных сайтов гликозилирования между хронически инфицированными пациентами и пациентами с острой и ранней ВИЧ-инфекцией и выяснили, что достоверных различий в количестве сайтов между этими группами не наблюдается. При анализе количества потенциальных сайтов отдельных образцов мы заметили уменьшение числа сайтов на один при прогрессии инфекции в образцах 11497. Сайт отсутствовал в участке между У2 и УЗ петлями. Литературных данных, которые бы свидетельствовали о влиянии наличия сайта гликозилирования в данном положении на фенотип, на данный момент нет. В образце 5С1475-В12 помимо увеличения суммарного заряда наблюдалось отсутствие консервативного сайта гликозилирования в начале УЗ петли. Наличие этого сайта гликозилирования ассоциировано с Я5-фенотипом, а его отсутствие является дополнительным признаком фенотипа Х4 исследуемого варианта БС1457 [С^еП е1 а1, 2001, РоНаМв а а1, 2001]. Мы обнаружили два изолята, соответствующие ампликонам 8С1457-В12 и 11526, которые обладали двойным тропизмом и могли использовать как СС115-, так и СХСЯ4-корецепторы. Остальные изоляты имели фенотип 1X5. (Рис.5).
Рис. 5. Анализ тропизма вирусных изолятов в культуре клеток
тгм-ы в
присутствии ингибиторов корецепторов ССЯ5 (К5) и СХС114 (Х4).
Таким образом, теоретические методы предсказания использования корецептора, построенные на модели субтипа В, в нашем случае с изолятами субтипа А оказались неточными (см. табл. 3.2.3). Присутствие в образцах в основном вирусов фенотипа согласуется с тем фактом, что большинство образцов были получены на острой и ранней стадиях ВИЧ-инфекции. Отсутствие вирусов фенотипа Х4 в образцах с хронической инфекцией может быть связано с небольшой выборкой (4 образца). В данной части исследования мы получили панель псевдовирусов восточно-европейского варианта субтипа А, состоящую из 8 образцов с различными фенотипическими свойствами, которые выражались в использовании корецптора СС115 или ССН5/СХСЯ4.
Данная панель будет использована для будущего исследования эффективности кандидатных вакцин против ВИЧ-1.
ВЫВОДЫ
1) Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска парентерального заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует восточно-европейский вариант субтипа А с низким уровнем генетического разнообразия.
2) Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска гомосексуального полового заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует субтип В с высоким уровнем генетического разнообразия.
3) Сравнение попарных значений генетического расстояния фрагмента гена env в группе риска парентерального заражения ВИЧ показало, что генетическое разнообразие штаммов в подгруппе с недавней инфекцией было меньше, чем в подгруппе с хронической инфекцией.
4) Методом амплификации и секвенирования единичных копий полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди ПИН с острой и ранней инфекцией ВИЧ, в 70% случаев была показана парентеральная передача генетически однородных вирусных вариантов, т.е. впервые продемонстрирован эффект генетического «бутылочного горлышка» при передаче ВИЧ-1 у наркозависимых.
5) Анализ гликопротеина gpl20 оболочки штаммов ВИЧ-1 с использованием подходов биоинформатики и изучение тропизма псевдовирусных конструкций показал наличие в вирусной популяции ПИН, находящихся на стадиях острой и ранней ВИЧ-инфекции, преимущественно CCR5-Tporinbix вирусов.
6) В рамках данного исследования впервые получена панель псевдовирусных конструкций с охарактеризованным нуклеотидным и белковым составом гена env изолятов ВИЧ-1 восточноевропейского варианта субтипа А, которая будет использована для для доклинической оценки эффективности кандидатных вакциновых препаратов.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. Murashev B.V., Kazennova E.V., Kozlov A.A., Murasheva I.V., Dukhovlinova E.N., Galachyants Y.P., Dorofeeva E.C., Dukhovlinov I.V., Smirnova G.V., Masharsky A.E., Klimov N.A., Kozlov A.P. Immunogenicity
of candidate DNA vaccine based on subtype A human immunodeficiency virus type 1 predominant in Russia.// Вiotechnol. J. - 2007. - V.2. - P.871-878
2. Beyrer C., Baral S., Shaboltas A., Dukhovlinova E.. Masharsky A., Verevochkin S., Latkin C., Heimer R., Hoffman I., Kozlov A. The feasibility of HIV vaccine efficacy trials among Russian injection drug users. //Vaccine. -2007. - Vol. 25(41). -P.7014-7016.
3. Dukhovlinova E., Masharsky A., Solovjeva Т., Verevochkin S., Toussova O., Klimov N., Alexander L„ Heimer R., Kozlov AP. The Surveillance of HIV-1 Subtype Distribution in the Year 2005 to 2006 in Saint Petersburg, Russia.// Abstract #515 of the 15th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Boston, MA, USA. - 2008. - P.515.
4. Духовлинова E.H., Машарский, А.Э., Мерингоф M., Веревочкин С.В., Тюсова О.В., Климов Н.А., Волкова Г.В., Андерсон Дж., Сванстрём Р., Хаймер Р., Козлов А.П. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге в 2005-2008 гг.//Тезисы Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва. - 2009. -Т.2. - С.245.
5. Dukhovlinova Е., Masharsky A., Verevochkin S., Shevchenko A., Toussova О., Skochilov R„ Anderson J, Cohen M„ Swanstrom R., Kozlov A. A significant transmission bottleneck among newly and recently HIV-1 infected injection drug users in St. Petersburg, Russia.//Abstract #477 of the 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, san Francisco, CA, USA. - 2010. - P. 477.
Подписано в печать 27.04.2010 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 50 экз. Заказ № 1602.
Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Духовлинова, Елена Николаевна
ОГЛАВЛЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение разнообразия гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге"
Цель и задачи исследования.9
Научная новизна работы.10
Научно-практическая значимость работы.10
Форма выполнения диссертационной работы.И
Апробация работы.11
Объем и структура диссертации.12
1. 0. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.13
1.1. Характеристика эпидемии ВИЧ/СПИД в мире.13
1.2. Свойства ВИЧ-1.15
1.2.1. Общие свойства генома ВИЧ-1, характерные для ретровирусов.15
1.2.2. Основные гены ВИЧ-1 и их продукты.17
1.2.3. Структура генов gag и pol ВИЧ-1.18
1.2.4. Особенности гена env и его белков.20
1.2.5. Вспомогательные гены ВИЧ-1 и их продукты.22
1.3. Генетическое разнообразие ВИЧ-1.24
1.3.1. Мутационная изменчивость генома ВИЧ-1.24
1.3.2. Рекомбинационная изменчивость генома ВИЧ-1.28
1.4. Генетическое разнообразие вируса, передаваемого при инфекции.31
1.4.1.Влияние пути передачи на генетическое разнообразие вируса.31
1.4.2. Стадии развития ВИЧ-инфекции в организме человека.32
1.4.3. Метод амплификации единичных геномов ВИЧ (АЕГ).34
1.4.4. Генетическое разнообразие вируса, переданного половым путем.36
1.4.5. Генетическое разнообразие вируса, переданного парентерально.37
1.5. Филогенетическая классификация ВИЧ-1.38
1.5.1. История развития филогенетической классификации ВИЧ-1.38
1.5.2. Современная филогенетическая классификация ВИЧ-1.41
1.6. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1.45
1.6.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в мире.45
1.6.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в странах бывшего СССР.48
1.7. Фенотипические свойства штаммов ВИЧ-1.51
2.0 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.57
2.1. Сыворотки крови.57
2.1.1. Демографические характеристики участников, чьи образцы крови использовались для анализа генетического разнообразия ВИЧ-1 в группах риска.57
2.1.2. Демографические характеристики участников, чьи образцы крови использовались для анализа популяции ВИЧ-1 в крови ПИН в начальной фазе инфекции.59
2.2. Клеточные линии.60
2.2.1. Клеточная линия E.coli Stbl2.61
2.2.2. Клеточная линия 293Т/17.62
2.2.3. Клеточная линия TZM-bl.62
2.3. Лабораторное выявление и классификацияВИЧ-инфекции.63
2.3.1. Лабораторное выявление случаев ВИЧ-инфекции.63
2.3.2. Выявление случаев ранней ВИЧ-инфекции среди участников проекта SATH-CAP.63
2.3.3. Выявление стадий острой и ранней ВИЧ-инфекции по Фибигу.64
2.4. Выделение РНК из образцов сыворотки крови.64
2.5. Синтез кДНК и ПЦР коротких фрагментов генома ВИЧ.65
2.6. Метод амплификации единичных геномов (АЕГ).66
2.7. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле.68
2.8. Секвенирование ДНК.68
2.9. Получение клонов, содержащих полноразмерный ген env исследуемых изолятов.69
2.9.1. Получение ПЦР-фрагменгов для клонирования.69
2.9.2. Направленное встраивания ПЦР-фрагментов в плазм ид ный вектор.70
2.9.3. Скрининг колоний E.coli методом ПЦР.71
2.9.4.Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.73
2.10. Получение псевдовирусных частиц, содержащих полноразмерный ген env исследуемых изолятов.73
2.10.1. Получение клеток 293Т/17.73
2.10.2. Трансфекция клеток 293Т/17.74
2.10.3. Сбор псевдовирусных частиц.75
2.11. Изучение тропизма псевдовирусных частиц.76
2.11.1. Получение клеток TZM-bl.76
2.11.2. Инфекция клеток TZM-bl псевдовирусными частицами.76
2.11.3. Измерение активности люциферазы в клетках после инфекции псевдовирусными конструкциями.77
2.12. Компьютерные методы анализа данных.77
2.12.1. Первичный анализ нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1.77
2.12.2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1.78
2.13. Статистический анализ полученных результатов.82
3.0.РЕЗУЛЬТАТ Ы.83
3.1. Анализ генетического разнообразия штаммов ВИЧ-1 в группах риска.83
3.1.1. Получение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена env для последующего анализа.83
3.1.2. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка гена епу пггаммов ВИЧ-1 из разных групп риска.85
3.1.3. Сравнительный анализ генетического разнообразия ВИЧ-1 в разных группах риска и подгруппах ПИН с недавней и хронической ВИЧ-инфекцией.90
3.2. Анализ генетического разнообразия штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в крови ПИН с острой и ранней стадиями ВИЧ-инфекции.92
3.2.1. Результаты амплифицирования участка генома ВИЧ, содержащего полноразмерный ген епу.92
3.2.2. Результаты секвенирования полноразмерного гена епу ВИЧ-1.94
3.2.3. Изучение нуклеотидных различий вирусной популяции в образцах крови ПИН .95
3.2.4. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей полноразмерного гена епу ВИЧ-1.101
3.2.5. Анализ генетического разнообразия ВИЧ-1 в образце крови пациента
8С1283.103
3.2.6. Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности гликопротеинов оболочки переданных изолятов ВИЧ-1.107
3.2.7. Клонирование полноразмерного гена епу в векторе рсБКАЗ. Ш У5-Шз-ТОРО.1110
3.2.8. Изучение тропизма псевдовирусов, полученных на основе изучаемых изолятов.113
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.114
4.1. Разнообразие субтипов ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге.114
4.2. Генетическое разнообразие ВИЧ-1 внутри субтипов.117
4.3. Генетическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧ-инфицированных ПИН.119
4.4. Фенотипическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧинфицированных ПИН.124
5.0. ВЫВОДЫ.128
6.0. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.130
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.157
ПРИЛОЖЕНИЕ 2.164
БЛАГОДАРНОСТИ.173
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
APOBEC3G apolipoprotein В mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like-3G (фермент, редактирующий мРНК аполипопротеина В) восточно-европейский вариант субтипа А восточно-европейский вариант субтипа В circulating recombinant form (циркулирующая рекомбинантная форма) дцРНК-аденозин-дезаминаза former Soviet Union (страны бывшего СССР) human immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита человека) heteroduplex mobility assay (гетеродуплексный анализ) hepatitis С virus (вирус гепатита С) herpes simplex virus II (вирус простого герпеса 2 типа) long terminal repeat (длинный концевой повтор) negative regulatory element (элемент негативной регуляции) phosphate-buffered saline (натрий-фосфатный буфер: 150 мМ NaCl, 20 мМ Na2HP04/NaH2P04 pH 7.6) RBF-2 Ras-responsive binding factor 2
SIV simian immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита обезьян)
ТАЕ 40 мМ трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА pH 8.0
TAR trans-activating response element
TBE 89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА pH 8.0
UNAIDS Joint United Nations Program on HIV/AIDS (объединенная программа
Организации Объединенных Наций по ВИЧ/СПИД) UNG урацил-ДНК-гликозидаза а/к аминокислота
БСА бычий сывороточный альбумин
ВИЧ вирус иммунодефицита человека дАТФ дезоксиаденозин трифосфат
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ дезоксинуклеозид трифосфат 5
А-ЕЕ В-ЕЕ CRP dsRAD
FSU
HIV
HMA
HCV
HSV-II
LTR
NRE
PBS дТтф дезокситимидин трифосфат дУТФ дезоксиуридин трифосфат дцРНК двуцепочечная РНК
ДЦГФ дезоксицитидин трифосфат
ИППП инфекции, передающиеся половым путем
ИФА иммуноферментный анализ кДа килодальтон мкпк мононуклеарные клетки периферической крови мРНК матричная РНК мсм мужчины, имеющие секс с мужчинами п.н. пара нуклеотидов
ПИН потребители инъекционных наркотиков
ПЦР полимеразная цепная реакция
РЖ рибонуклеиновая кислота спид синдром приобретенного иммунодефицита т.п.н. тысяча пар нуклеотидов трис трис(гидрокиметил)аминометан тРНК транспортная РНК
УФ ультрафиолет
ЦРФ циркулирующая рекомбинантная форма
ЦТЛ цитотоксические Т-лимфоциты
ЭДТА этилендиаминотетраацетат
Однобуквенные обозначения аминокислот:
А аланин I изолейцин
С цистеин К лизин
Б аспарагиновая кислота Ь лейцин
Е глутаминовая кислота М метионин
Б фенилаланин N аспарагин
Э глицин Р пролин
Н гистидин Я аргинин
Q глутамин S серии T треонин
V валин
W триптофан
Y тирозин
ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы
В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В октябре 2009 года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 516167 (Федеральный центр СПИД, 2009).
В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Одной из проблем в создании эффективной вакцины против ВИЧ-1 является его высокий уровень генетического разнообразия. Высокие частоты мутационных и рекомбинационных процессов, высокая скорость размножения и большой размер вирусной популяции ведут к высокой изменчивости вируса в каждом инфицированном организме (Но et al., 1995, Ни et al., 1990, Roberts 1988). Создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены (Hanke et al, 2000). ДНК-вакцина против ВИЧ, создающаяся исследовательской группой под руководством А.П. Козлова в Санкт-Петербурге, содержит ген белков оболочки ВИЧ-1 восточно-европейского варианта субтипа А, поскольку в момент разработки вакцины именно этот вариант доминировал в регионе (Мурашев и др., 2003). Мониторинг генетического разнообразия ВИЧ-1 в популяции, а особенно в группах повышенного риска инфицирования ВИЧ, необходим для совершенствования профилактики, терапии и создания эффективной вакцины.
В момент инфицирования, за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма, происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции (Lawson et al., 2002). В настоящее время существует теория о передаче половым путем (гетеро- и гомосексуально) преимущественно единичных геномов ВИЧ (Wolfs et al, 1992, Derdeyn et al, 2004, Long et al, 2000, Sagar et al, 2003). Наличие подобной избирательности при парентеральной передаче ВИЧ-1 ранее установлено не было.
Детальная генетическая и иммунологическая характеристика переданных изолятов может помочь в разработке эффективной вакцины против ВИЧ. (Derdeyn et al, 2004, Gottlieb et al, 2008, Keele et al, 2008). Разработан новый подход лабораторной оценки эффективности кандидатной вакцины — определение иммунологических свойств белков оболочки ВИЧ и особенностей их взаимодействия с нейтрализующими антителами на стандартизованных панелях псевдовирусов, полученных на основе переданных изолятов ВИЧ (Mascóla et al, 2005). Изучение разнообразия гена env передаваемых изолятов ВИЧ и создание панели псевдовирусов на их основе является одним из наиболее перспективных подходов к созданию эффективной вакцины против ВИЧ (Li et al, 2005).
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования являлось изучить разнообразие гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге, для последующего использования полученной информации в целях разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.
Задачи исследования:
1. Определить нуклеотидные последовательности фрагмента гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге.
2. Сравнить генетическое разнообразие ВИЧ-1 в различных группах риска.
3. Определить нуклеотидные последовательности полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в крови ПИН с острой и ранней стадиями ВИЧ-инфекции.
4. Оценить количество вариантов ВИЧ-1, передаваемых парентерально.
5. Изучить свойства гликопротеина оболочки £р120 переданных штаммов ВИЧ-1.
Научная новизна работы
Впервые показано особое положение штаммов субтипа В из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1. Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей рекомбинантной форме СЯРОбсрх , в Санкт-Петербурге, и показана его вторичная рекомбинация с восточно-европейским вариантом субтипа А.
Впервые секвенированием единичных копий полноразмерного гена ет? штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в организме ПИН, установлено наличие т.н. «бутылочного горлышка», т.е. избирательности при передаче штаммов ВИЧ парентеральным путем.
Впервые создана панель псевдовирусных конструкций на основе переданных штаммов восточно-европейского варианта субтипа А для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-1.
Научно-практическая значимость работы
Показано наличие двух независимых эпидемий ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге в группах риска ПИН и МСМ. Среди ПИН было выявлено присутствие преимущественно штаммов восточно-европейского варианта субтипа А (А-ЕЕ), тогда как среди МСМ циркулировали штаммы субтипа В. Показано, что новые случаи ВИЧ-инфекции вызываются штаммами А-ЕЕ, и таким образом установлена целесообразность испытания кандидатных вакцин против ВИЧ-1, содержащих гены варианта А-ЕЕ среди ПИН.
В рамках данной работы получены фрагменты и полноразмерные копии гена епу штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди групп риска в Санкт-Петербурге. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности, которые депонированы в международную базу данных GenBank.
Выявлено наличие «бутылочного горлышка» при парентеральной передаче ВИЧ-1.
Получена панель псевдовирусных конструкций на основе штаммов субтипа А, которая будет использована для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ.
Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в России и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.
Форма выполнения диссертационной работы
Работа выполнялась в рамках финансирования ННИУ «Биомедицинский центр» по федеральному проекту, выполняемому в соответствии с распоряжением Правительства РФ №1905-р «Разработка ДНК-вакцины против ВИЧ и молекулярно-эпидемиологический мониторинг разнообразия ВИЧ в Санкт-Петербурге», а также по грантам Международного центра Фогарти (Fogarty International Center) «Подготовка специалистов и исследования по превенции ВИЧ-инфекции в России» (№ 5D43TW01028) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследования в области ВИЧ и туберкулеза» (№ RUB1-7000-ST-08).
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 16-й, 17-й и 18-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, Россия, в 2007, 2008 и 2009 годах; 14й, 15-й и 17-й конференциях по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, США, в 2007, 2008 и 2010 годах; 4-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного
11
Общества по СПИДу, Сидней, Австралия, 2007; Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, Россия, 2009. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками, 10 таблицами и 2 приложениями. Список литературы содержит 314 литературных источников.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Духовлинова, Елена Николаевна
5.0. ВЫВОДЫ
1. Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена ет штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска парентерального заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует восточно-европейский вариант субтипа А с низким уровнем генетического разнообразия.
2. Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена ет штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска гомосексуального полового заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует субтип В с высоким уровнем генетического разнообразия.
3. Сравнение попарных значений генетического расстояния в группе риска парентерального заражения ВИЧ показало, что генетическое разнообразие штаммов в подгруппе с недавней инфекцией было меньше, чем в подгруппе с хронической инфекцией.
4. Методом амплификации и секвенирования единичных копий полноразмерного гена ет штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди ПИН с острой и ранней инфекцией ВИЧ, в 70% случаев была показана парентеральная передача генетически однородных вирусных вариантов, т.е. впервые продемонстрирован эффект генетического «бутылочного горлышка» при передаче ВИЧ-1 у наркозависимых.
5. Анализ гликопротеина gpl20 оболочки штаммов ВИЧ-1 с использованием подходов биоинформатики и изучение тропизма псевдовирусных конструкций показал наличие в вирусной популяции ПИН, находящихся на стадиях острой и ранней ВИЧ-инфекции, преимущественно ССЯ5-тропных вирусов.
6. В рамках данного исследования впервые получена панель псевдовирусных конструкций с охарактеризованным нуклеотидным
128 и белковым составом гена ет> изолятов ВИЧ-1 восточноевропейского варианта субтипа А, которая будет использована для доклинической оценки эффективности кандидатных вакциновых препаратов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Духовлинова, Елена Николаевна, Санкт-Петербург
1. Бобков А.Ф. Генетическая характеристика вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа, вызвавших эпидемию среди наркоманов в странах СНГ / А.Ф. Бобков, В.В. Покровский, JI.M. Селимова и др. // Вопросы вирусологии. 1998. — Т.43. — С.253-6.
2. Бобков А.Ф. Субтипы ВИЧ-1 в России в 1987-1998 гг. / А.Ф. Бобков, Е.В. Казеннова, JI.M. Селимова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1999. - №1. — С.43-5.
3. Бобков А.Ф. Эпидемиологическая и генетическая характеристика первых 40 случаев ВИЧ-инфекции на территории Пермской области / А.Ф. Бобков, С.Я. Зверев, М.Р. Бобкова и др. // Вопросы вирусологии. — 2000. — Т.45. — С. 18-21.
4. Бобкова М.Р. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика основных очагов эпидемии ВИЧ-инфекции среди наркоманов в России / М.Р. Бобкова,
5. A.Ф. Бобков, Е.В. Буравцова и др. // Вопросы вирусологии. 1999. - Т.44. -С.220-4.
6. Гашникова Н.М. Молекулярно-эпидемиологический анализ распространения ВИЧ-инфекции в Новосибирской области / Н.М. Гашникова, Е.Ф. Бочаров, П.А. Гладкий и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 2004. — №3. — С.30-4.
7. Информационный бюллетень Федерального центра СПИД. — 2009. http://www.hivrussia.ru/stat/2009/10.shtml
8. Козлов А.П. Выявление первых случаев инфицирования вирусом иммунодефицита человека в Ленинграде / A.B. Емельянов, А.Г. Малых,
9. B.В. Касаткин и др. // Иммунология. 1990. - №5. - С.9-11.
10. Козлов А.П. Закономерности ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД / А.П.130
11. Козлов, А.В. Емельянов, С.В. Веревочкин, Э.В. Карамов // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 1997. - Т. 1. - №1. - С.5-28.
12. Онищенко Г.Г. ВИЧ-инфекция, развитие эпидемии в Российской Федерации / Г.Г. Онищенко, М.И. Наркевич, А.Т. Голиусов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1997. -№6. - С.47-50.
13. Покровский В.В. Эпидемиологическое исследование первого случая СПИДа, обнаруженного у гражданина СССР / В.В. Покровский, З.К. Янкина, В.И. Покровский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1987. —№12. - С. 8-11.
14. Покровский В.В., Ермак Т.Н., Беляева В.В., Юрин О.Г. ВИЧ-инфекция. Клиника, диагностика и лечение. -М.: Гэотар-Мед, 2003.
15. Щелканов М.Ю. Серотипическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов на юге/юге-востоке Украины / М.Ю. Щелканов, Н.Г. Ярославцева, А.А. Набатов, А.Э. Машарский и др. // Вопросы вирусологии. 1998. - Т.43. - С. 176-82.
16. Abebe A. Identification of a genetic subcluster of HIV type 1 subtype С (С1) widespread in Ethiopia / A. Abebe, G. Pollakis, A.L. Fontanet et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. - V.16. - P.1909-14.
17. Alaeus A. Most HIV-l genetic subtypes have entered Sweden / A. Alaeus, T.1.itner, K. Lidman et al. // AIDS. 1997. - V.l 1. - P. 199-202.
18. Alizon M. Molecular cloning of lymphadenopathy-associated virus / Alizon M., Sonigo P., Barre-Sinoussi F., Chermann J.C., Tiollais P., Montagnier L., Wain-Hobson S. // Nature. 1985. - 312. - P. 757-60.
19. Alizon M. Genetic variability of the AIDS virus: nucleotide sequence analysis of two isolates from African patients / M. Alizon, S. Wain-Hobson, L. Montagnier et al. // Cell. 1986. - V.46. - P.63-74.
20. Anderson J.A. Correlated template-switching events during minus-strand DNAsynthesis: a mechanism for high negative interference during retroviral recombination / J.A. Anderson, R.J. Teufel, P.D. Yin et al. // J. Virol. 1998. -V.72.-P.1186-94.
21. Ayouba A. HIV-1 group N among HIV-1-seropositive individuals in Cameroon / A. Ayouba, S. Souquieres, B. Njinku et al. // AIDS. 2000. - V.14. - P.2623-5.
22. Ayouba A. HIV-1 group O infection in Cameroon, 1986 to 1998 / A. Ayouba, P. Mauclere, P.M. Martin et al. // Emerg. Infect. Dis. 2001. - V.7. - P.466-7.
23. Balode D. Rapid epidemic spread of HIV type 1 subtype Al among intravenous drug users in Latvia and slower spread of subtype B among other risk groups / // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. - V.20. - P.245-9.
24. Barabitskaya O. Molecular epidemiology of HIV-1 in St. Petersburg, Russia / O. Barabitskaya, A. Malykh, A. Emeljanov et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1995.-V.ll Suppl 1. -P.S145.
25. Beer B.E. Diversity and Evolution of Primate Lentiviruses / B.E. Beer, E. Bailes, P.M. Sharp, V.M. Hirsch // Human Retroviruses and AIDS 1999. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1999. - P.460-74.
26. Berger E.A. A new classification for HIV-1 / E.A. Berger, R.W. Doms, E.M. Fenyo et al. //Nature. 1998. - V.391. - P.240.
27. Beyrer C. Characterization of the emerging HIV type 1 and HCV epidemics among injecting drug users in Dushanbe, Tajikistan / C. Beyrer, Z. Patel, J. A. Stachowiak et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2009. - V.25. - P.853-60.
28. Bobkov A. Identification of an env G subtype and heterogeneity of HIV-1 strainsin the Russian Federation and Belarus / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, M. Garaev et al. // AIDS. 1994. - V.8. - P. 1649-55.
29. Bobkov A. Genetic heterogeneity of HTV type 1 in Russia: identification of H variants and relationship with epidemiological data / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, L. Selimova et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - V.12. -P. 1687-90.
30. Bobkov A. An HIV type 1 epidemic among injecting drug users in the former Soviet Union caused by a homogeneous subtype A strain / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, L. Selimova et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. — 1997. -V.13.-P.1195-201.
31. Bobkov A. HIV type 1 subtype E in Russia / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, L. Selimova et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1997. - V.13. - P.725-7.
32. Bobkov A. HIV type 1 gag D/env G recombinants in Russia / A. Bobkov, E. Kazennova, L. Selimova et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. - V.14. -P. 1597-9.
33. Bobkov A.F. Silent mutation in the V3 region characteristic of HIV type 1 env subtype B strains from injecting drug users in the former Soviet Union / A.F. Bobkov, V.V. Lukashov, J. Goudsmit et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2000. V.16. -P.291-4.
34. Bobkov A.F. An HIV type 1 subtype A outbreak among injecting drug users in Kazakhstan / A.F. Bobkov, E.V. Kazennova, A.L. Sukhanova et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. - V.20. - P. 1134-6.
35. Bobkov A.F. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A / A.F. Bobkov, E.V. Kazennova, L.M. Selimova et al. // J. Med. Virol. -2004. V.74. - P. 191 -6.
36. Bouhamdan M. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr protein binds to the uracil DNA glycosylase DNA repair enzyme / M. Bouhamdan, S. Benichou, F. Rey et al. // J. Virol. 1996. - V.70. - P.697-704.
37. Boyd M.T. A single amino acid substitution in the VI loop of human immunodeficiency virus type 1 gpl20 alters cellular tropism / M.T. Boyd, G.R. Simpson, AJ. Cann et al. // J. Virol. 1993. - V.67. - P.3649-52.
38. Briggs D.R. Envelope V3 amino acid sequence predicts HIV-1 phenotype (co-receptor usage and tropism for macrophages) / D.R. Briggs, D.L. Tuttle, J.W. Sleasman et al. // AIDS. 2000. - V.14. - P.2937-9.
39. Carr J.K. Full-length sequence and mosaic structure of a human immunodeficiency virus type 1 isolate from Thailand / J.K. Carr, M.O. Salminen, C. Koch et al. // J. Virol. 1996. - V.70. -P.5935-43.
40. Carrillo A. Human immunodeficiency virus type 1 tropism for T-lymphoid cell lines: role of the V3 loop and C4 envelope determinants / A. Carrillo, L. Ratner // J. Virol. 1996. - V.70. - P.1301-9.
41. Cassan M. Translational frameshifting at the gag-pol junction of human immunodeficiency virus type 1 is not increased in infected T-lymphoid cells / M. Cassan, N. Delaunay, C. Vaquero et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.1501-8.
42. Center R.J. Oligomeric structure of the human immunodeficiency virus type 1 envelope protein on the virion surface / R.J. Center, R.D. Leapman, J. Lebowitz et al. // J. Virol. 2002. - V.76. - P.7863-7.
43. Chaix M.L. Stable prevalence of genotypic drug resistance mutations but increase in non-B virus among patients with primary HIV-1 infection in France / M.L. Chaix, D. Descamps, M. Harzic et al. // AIDS. 2003. - V.17. - P.2635-43.
44. Charneau P. Isolation and envelope sequence of a highly divergent HIV-1 isolate: definition of a new HIV-1 group / P. Charneau, A.M. Borman, C. Quillent et al. // Virology. 1994. - V.205. - P.247-53.
45. Chen R. Roles of uracil-DNA glycosylase and dUTPase in virus replication / R. Chen, H. Wang, L.M. Mansky // J. Gen. Virol. 2002. - V.83. - P.2339-45.
46. Coffin J.M. Genetic variation in AIDS viruses / J.M. Coffin // Cell. 1986. -V.46.-P.1-4.
47. Coffin J.M. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy / J.M. Coffin // Science. 1995. - V.267. - P.483-9.
48. Coffin J.M. Structure, replication, and recombination of retrovirus genomes: some unifying hypotheses / J.M. Coffin // J. Gen. Virol. 1979. - V.42. - P. 1-26.
49. Collman R. An infectious molecular clone of an unusual macrophage-tropic and highly cytopathic strain of human immunodeficiency virus type 1 / R. Collman, J.W. Balliet, S.A. Gregory et al. // J. Virol. 1992. - V.66. - P.7517-21.
50. Connor R.I. Change in coreceptor use coreceptor use correlates with disease progression in HIV-1—infected individuals / R.I. Connor, K.E. Sheridan, D. Ceradini et al. // J. Exp. Med. 1997. - V. 185. - P.621-8.
51. Demirov D.G. The late domain of human immunodeficiency virus type 1 p6 promotes virus release in a cell type-dependent manner / D.G. Demirov, J.M. Orenstein, E.O. Freed // J. Virol. 2002. - V.76. - P.105-17.
52. Deng H. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1 / H. Deng, R. Liu, W. Ellmeier et al. //Nature. 1996. - V.381. -P.661-6.
53. Derdeyn C.A. Envelope-constrained neutralization-sensitive HIV-1 after heterosexual transmission / C. A. Derdeyn, J. M. Decker, F. Bibollet-Ruche et al. // Science. 2004. - V.303. -P.2019-22.
54. Derdeyn C.A. Viral characteristics of transmitted HIV / C.A. Derdeyn, E. Hunter // Current Opinion in HIV and AIDS. 2008. - V.3. - P.16-21.
55. Derdeyn S. Viral characteristics of transmitted HIV / S. Derdeyn, E. Hunter // Current Opinion in HIV and AIDS. 2008. - Vol.3. - P.16-21
56. Dhalla S. HIV vaccine preparedness studies in the non-Organization for Economic Co-operation and Development (non-OECD) countries / S. Dhalla, K. Nelson, J. Singer, G. Poole // AIDS Care. 2008. -V.21. - P.335-48.
57. D'Souza M.P. Chemokines and HIV-1 second receptors. Confluence of two fields generates optimism in AIDS research / M.P. D'Souza, V.A. Harden // Nat. Med. -1996. V.2. - P.1293-300.
58. Dumitrescu O. Characterization of human immunodeficiency virus type 1 isolates from children in Romania: identification of a new envelope subtype / O. Dumitrescu, M.L. Kalish, S.C. Kliks et al. // J. Infect. Dis. 1994. - V.169. -P.281-8.
59. Eckert D.M. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition / D.M. Eckert, P.S. Kim//Annu. Rev. Biochem. -2001. V.70.-P.777-810.
60. Eigen M. On the nature of virus quasispecies / M. Eigen // Trends Microbiol. -1996. V.4. - P.216-8.
61. Erickson J.W. Protease inhibitors: resistance, cross-resistance, fitness and the choice of initial and salvage therapies / J.W. Erickson, S.V. Gulnik, M. Markowitz // AIDS. 1999. - V.13 Suppl A. - P.S189-S204.
62. Eyzaguirre L.M. Genetic characterization of HIV-1 strains circulating in
63. Kazakhstan / L.M. Eyzaguirre, I.B. Erasilova, Y. Naday et al. // J Acquir Immune Defic Syndr. 2007. - V.46. - P. 19-23
64. Felsenstein J. Phylogenies from molecular sequences: inference and reliability / J. Felsenstein // Annu. Rev. Genet. 1988. - V.22. - P.521-65.
65. Feng Y. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor / Y. Feng, C.C. Broder, P.E. Kennedy et al. // Science. 1996. - V.272. - P.872-7.
66. Fenyo E.M. Distinct replicative and cytopathic characteristics of human immunodeficiency virus isolates / E.M. Fenyo, L. Morfeldt-Manson, F. Chiodi et al. // J. Virol. 1988. -V.62. -P.4414-9.
67. Ferdats A. An HIV type 1 subtype A outbreak among injecting drug users in Latvia / A. Ferdats, V. Konicheva, I. Dievberna et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1999.-V. 15.-P. 1487-90.
68. Fiebig E.W. Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors: implications for diagnosis and staging of primary HIV infection / E.W. Fiebig, DJ. Wright, B.D. Rawal et al. // AIDS. 2003. - V.17. - P.1871-9.
69. Fitzgibbon J.E. A new type of G~>A hypermutation affecting human immunodeficiency virus / J.E. Fitzgibbon, S. Mazar, D.T. Dubin // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1993. - V.9. - P.833-8.
70. Fouchier R.A. Phenotype-associated sequence variation in the third variable domain of the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 molecule / R.A. Fouchier, M. Groenink, N.A. Kootstra et al. // J. Virol. 1992. - V.66. - P.3183-7.
71. Frankel A.D. HIV-1: fifteen proteins and an RNA / A.D. Frankel, J.A. Young // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V.67. - P. 1-25.
72. Fujita K. Rapid degradation of CD4 in cells expressing human immunodeficiency virus type 1 Env and Vpu is blocked by proteasome inhibitors / K. Fujita, S. Omura, J. Silver// J. Gen. Virol. 1997. - V.78. -P.619-25.
73. Galkin A.N. Full-length genomic sequencing and analysis of four HIV type 1 subtype B isolates circulating in the territory of Russia / A.N. Galkin, E.Y. Gagarina, N.S. Lukyanova, T.V. Danilova // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2006. V.22. - P. 1192-7.
74. Gallay P. HIV-1 infection of nondividing cells through the recognition of integrase by the importin/karyopherin pathway / P. Gallay, T. Hope, D. Chin et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1997. - V.94. - P.9825-30.
75. Gao F. A comprehensive panel of near-fiill-length clones and reference sequences for non-subtype B isolates of human immunodeficiency virus type 1 / F. Gao, D.L. Robertson, C.D. Carruthers et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.5680-98.
76. Gao F. Evidence of two distinct subsubtypes within the HTV-1 subtype A radiation / F. Gao, N. Vidal, Y. Li et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001.- V.17. — P.675-88.
77. Gao F. Molecular cloning and analysis of functional envelope genes from human immunodeficiency virus type 1 sequence subtypes A through G. The WHO and NIAID Networks for HIV Isolation and Characterization / F. Gao, S.G. Morrison,
78. D.L. Robertson et al. // J. Virol. 1996. - V.70. - P. 1651-67.
79. Gao F. Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes / F. Gao,
80. E. Bailes, D.L. Robertson et al. //Nature. 1999. - V.397. - P.436-41.
81. Gao F. The heterosexual human immunodeficiency virus type 1 epidemic in Thailand is caused by an intersubtype (A/E) recombinant of African origin / F. Gao, D.L. Robertson, S.G. Morrison et al. // J. Virol. 1996. - V.70. - P.7013-29.
82. Gao F. Unselected mutations in the human immunodeficiency virus type 1 genome are mostly nonsynonymous and often deleterious / F. Gao, Y. Chen, D.N. Levy et al. // J. Virol. 2004. - V.78. - P.2426-33.
83. Glickman B.W. International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. Working paper no. 2. Spontaneous mutations in mammalian cells / B.W. Glickman, V.A. Saddi, J. Curry // Mutat. Res. 1994. -V.304. - P. 19-32.
84. Goodenow M. HIV-1 isolates are rapidly evolving quasispecies: evidence for viral mixtures and preferred nucleotide substitutions / M. Goodenow, T. Huet, W. Saurin et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1989. - V.2. - P.344-52.
85. Gottlinger H.G. HIV-1 Gag: a Molecular Machine Driving Viral Particle Assembly and Release / H.G. Gottlinger // HIV Sequence Compendium 2001. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2001. - P.2-28.
86. Gratton S. Highly restricted spread of HIV-1 and multiply infected cells within splenic germinal centers / S. Gratton, R. Cheynier, M.J. Dumaurier et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2000. - V.97. - P. 14566-71.
87. Greenway A. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein inhibits activation pathways in peripheral blood mononuclear cells and T-cell lines / A. Greenway, A. Azad, D. McPhee // J. Virol. 1995. - V.69. - P. 1842-50.
88. Guo X. Suppression of an intrinsic strand transfer activity of HIV-1 Tat protein by its second-exon sequences / X. Guo, M. Kameoka, X. Wei et al. // Virology. 2003. -V.307.- P. 154-63.
89. Gurtler L.G. A new subtype of human immunodeficiency virus type 1 (MVP-5180) from Cameroon / L.G. Gurtler, P.H. Hauser, J. Eberle et al. // J. Virol. -1994. V.68. - P.1581-5.
90. Haaland R.E. Inflammatory genital infections mitigate a severe genetic bottleneck in heterosexual transmission of subtype A and C HIV-1 / R.E. Haaland, P.A. Hawkins, J. Salazar-Gonzalez et al. // PLoS Pathogens. 2009. - Vol.5. -el 000274.
91. Hahn B.H. AIDS as a zoonosis: scientific and public health implications / B.H. Hahn, G.M. Shaw, K.M. De Cock et al. // Science. 2000. - V.287. - P.607-14.
92. Hahn B.H. Genetic variation in HTLV-III/LAV over time in patients with AIDS or at risk for AIDS / B.H. Hahn, G.M. Shaw, M.E. Taylor et al. // Science. 1986.- V.232. P.1548-53.
93. Hajjar A.M. Modification of retroviral RNA by double-stranded RNA adenosine deaminase / A.M. Hajjar, M.L. Linial // J. Virol. 1995. - V.69. -P.5878-82.
94. Hanke T. Design and construction of an experimental HIV-1 vaccine for a year-2000 clinical trial in Kenya / T. Hanke, A J. McMichael // Nat Med. 2000. - V.6. — P.951-5.
95. Harris R.S. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection / R.S. Harris, K.N. Bishop, A.M. Sheehy et al. // Cell. 2003. - V.113. - P.803-9.
96. He J. Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R (Vpr) arrests cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2 activity / J. He, S. Choe, R. Walker etal.//J. Virol. 1995. - V.69. - P.6705-11.
97. Hillis D.M. Analysis of DNA sequence data: phylogenetic inference / D.M. Hillis, M.W. Allard, M.M. Miyamoto // Methods Enzymol. 1993. - V.224. -P.456-87.
98. HIV Molecular Immunology Database / Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. http://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/index.html.
99. HIV-1 Circulating Recombinant Forms. HIV Sequence Database / Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/CRFs/CRFs.html
100. Ho D.D. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection / D.D. Ho, A.U. Neumann, A.S. Perelson et al. // Nature. 1995. -V.373. — P.123-6.
101. Hoffman N.G. Variability in the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 Env protein linked to phenotype-associated changes in the V3 loop / N.G. Hoffman, F. Seillier-Moiseiwitsch, J. Ahn et al. // J. Virol. 2002. - V.76. -P.3852-64.
102. Holguin A. HIV-positive immigrants in the Canary Islands, Spain: implications for public health in Europe / A. Holguin, A. Alvarez, M.J. Pena et al. // HIV. Clin. Trials. 2003. - V.4. - P. 184-92.
103. Hu W.S. Genetic consequences of packaging two RNA genomes in one retroviral particle: pseudodiploidy and high rate of genetic recombination /W.S.
104. Hu, H.M. Temin// Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1990. - V.87. -P. 1556-60.
105. Hu W.S. Retroviral recombination and reverse transcription / W.S. Hu, H.M. Temin // Science. 1990. - V.250. - P.1227-33.
106. Huang H. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance / H. Huang, R. Chopra, G.L. Verdine et al. // Science. 1998. - V.282. - P. 1669-75.
107. Huvent I. Interaction and co-encapsidation of human immunodeficiency virus type 1 Gag and Vif recombinant proteins / I. Huvent, S.S. Hong, C. Fournier et al. // J. Gen. Virol. 1998.- V.79. - P. 1069-81.
108. Hwang S.S. Identification of the envelope V3 loop as the primary determinant of cell tropism in HIV-1 J S.S. Hwang, T.J. Boyle, H.K. Lyerly et al. // Science. -1991.-V.253.-P.71-4.
109. Jain C. Structural model for the cooperative assembly of HIV-1 Rev multimers on the RRE as deduced from analysis of assembly-defective mutants / C. Jain, J.G. Belasco // Mol. Cell. 2001. - V.7. - P.603-14.
110. Janssens W. Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa / W. Janssens, L. Heyndrickx, K. Fransen et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - V.10. - P.877-9.
111. Jarmuz A. An anthropoid-specific locus of orphan C to U RNA-editing enzymes on chromosome 22 / A. Jarmuz, A. Chester, J. Bayliss et al. // Genomics. 2002. -V.79. - P.285-96.
112. Javaherian K. Broadly neutralizing antibodies elicited by the hypervariable neutralizing determinant of HIV-1 / K. Javaherian, A.J. Langlois, G.J. LaRosa et al. // Science. 1990. - V.250. - P. 1590-3.
113. Jetzt A.E. High rate of recombination throughout the human immunodeficiency virus type 1 genome / A.E. Jetzt, H. Yu, G.J. Klarmann et al. // J. Virol. 2000.1. V.74.- P. 1234-40.
114. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS. AIDS Epidemic Update: December 2009 / UNAIDS. 2009. http://www.unaids.org/wad2009/report.html.
115. Jorgensen L.B. Prevalence of drug resistance mutations and non-B subtypes in newly diagnosed HIV-1 patients in Denmark / L.B. Jorgensen, M.B. Christensen, J. Gerstoft et al. // Scand. J. Infect. Dis. 2003. - V.35. - P.800-7.
116. Jung A. Multiply infected spleen cells in HIV patients / A. Jung, R. Maier, J.P. Vartanian et al. // Nature. 2002. - V.418. - P. 144.
117. Junghans R.P. Retroviral DNA H structures: displacement-assimilation model of recombination / R.P. Junghans, L.R. Boone, A.M. Skalka // Cell. 1982. -V.30. - P.53-62.
118. Kalish M.L. Early HIV type 1 strains in Thailand were not responsible for the current epidemic / M.L. Kalish, C.C. Luo, B.G. Weniger et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - V.10. - P. 1573-5.
119. Kam J. Tat, a novel regulator of HIV transcription and latency / J. Karn // HIV Sequence Compendium 2000. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2000. - P.2-18.
120. Keele B.F. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection / B.F. Keele, E.E. Giorgi, J.F. Salazar-Gonzalez et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2008. - V.105. -P.7552-7.
121. Keele B.F. Low-dose rectal inoculation of rhesus macaques by SIVsmE660 or SIVmac251 recapitulates human mucosal infection by HIV-1 / B.F. Keele, L. Hui, G.H. Learn et al. // The Journal of Experimental Medicine. 2009. - V.206. -P.l 117-34.
122. Khan M.A. Human immunodeficiency virus type 1 Vif protein is packaged into the nucleoprotein complex through an interaction with viral genomic RNA / M.A. Khan, C. Aberham, S. Kao et al. // J. Virol. 2001. - V.75. - P.7252-65.
123. Kim T.A. HIV-1 Tat-mediated apoptosis in human brain microvascular endothelial cells / T.A. Kim, H.K. Avraham, Y.H. Koh et al. // J. Immunol. -2003. V.170. - P.2629-37.
124. Klatzmann D. Selective tropism of lymphadenopathy associated virus (LAV) for helper-inducer T lymphocytes / D. Klatzmann, F. Barre-Sinoussi, M.T. Nugeyre et al. // Science. 1984. - V.225. - P.59-63.
125. Kondo E. A conserved LXXLF sequence is the major determinant in p6gag required for the incorporation of human immunodeficiency virus type 1 Vpr / E. Kondo, H.G. Gottlinger // J. Virol. 1996. - V.70. - P. 159-64.
126. Koot M. Prognostic value of HIV-1 syncytium-inducing phenotype for rate of CD4+ cell depletion and progression to AIDS / M. Koot, I.P. Keet, A.H. Vos et al. // Ann. Intern. Med. 1993. - V.l 18. - P.681-8.
127. Kostrikis L.G. Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1 strains from patients in Cyprus: identification of a new subtype designated subtype I / L.G. Kostrikis, E. Bagdades, Y. Cao et al. // J. Virol. 1995. - V.69. -P.6122-30.
128. Kotler M. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protein Vif inhibits the activity of HIV-1 protease in bacteria and in vitro / M. Kotler, M. Simm, Y.S. Zhao et al. //J. Virol. 1997. - V.71. -P.5774-81.
129. Kozlov A.P. Epidemiology of HIV infection in St. Petersburg, Russia / A.P. Kozlov, G.V. Volkova, A.G. Malykh et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. -1993.-V.6.-P.208-12.
130. Krokan H.E. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA / H.E.
131. Krokan, R. Standal, G. Slupphaug // Biochem. J. 1997. - V.325. - P. 1-16.
132. Kuiken C. Maps of HIV and SIV Genomes / C. Kuiken, B. Foley, B. Hahn et al. // HIV Sequence Compendium 2000. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2000. - P.iv.
133. Kurbanov F. Human immunodeficiency virus in Uzbekistan: epidemiological and genetic analyses / F. Kurbanov, M. Kondo, Y. Tanaka et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2003. -V.19. -P.731-8.
134. Lamb R.A. Do Vpu and Vpr of human immunodeficiency virus type 1 and NB of influenza B virus have ion channel activities in the viral life cycles? / R.A. Lamb, L.H. Pinto // Virology. 1997. - V.229. - P. 1-11.
135. Laukkanen T. Virtually full-length sequences of HTV type 1 subtype J reference strains / T. Laukkanen, J. Albert, K. Liitsola et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. - V.15. -P.293-7.
136. Laure F. Genomic diversity of Zairian HIV isolates: biological characteristics and clinical manifestation of HIV infection / F. Laure, R. Leonard, K. Mbayo et al. //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1987. - V.3. - P.343-53.
137. Lazouskaya N.V. The HIV type 1 epidemic in Belarus: predominance of Eastern European subtype A strains and circulation of subtype B viruses / N.V. Lazouskaya, V.F. Eremin, K.W. Adema et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2005. V.21. - P.830-3.
138. Learn G.H. Virus population homogenization following acute human immunodeficiency virus type 1 infection / G.H. Learn, D. Muthui, S J. Brodie, T. Zhu, K. Diem, J.I. Mullins, L. Corey // J. Virol. 2002. - 76. -P. 11953-9.
139. Lecrossier D. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein / D. Lecrossier, F. Bouchonnet, F. Clavel et al. // Science. — 2003. V.300. -P.1112.
140. Leitner T. Biological and molecular characterization of subtype D, G, and A/D recombinant HIV-1 transmissions in Sweden / T. Leitner, D. Escanilla, S. Marquina et al. // Virology. 1995. - V.209. - P.136-46.
141. Leitner T. Genetic Subtypes of HIV-1 / T. Leitner // Human Retroviruses and AIDS 1996. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1996. - P.III-28-40.
142. Leitner T. Molecular epidemiology and MT-2 cell tropism of Russian HIV type 1 variant / T. Leitner, G. Korovina, S. Marquina et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - V.12. - P.1595-603.
143. Leitner T. Yet another subtype of HIV type 1? / T. Leitner, A. Alaeus, S. Marquina etal. //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1995. -V.ll. -P.995-7.
144. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-1 vaccine / N.L. Letvin // Science. 1998. -V.280. - P. 1875-80.
145. Li W.H. Rates and dates of divergence between AIDS virus nucleotide sequences / W.H. Li, M. Tanimura, P.M. Sharp // Mol. Biol. Evol. 1988. - V.5. -P.313-30.
146. Liitsola K. Genetic characterization of HIV-1 strains in the Baltic countries and Russia / K. Liitsola, T. Laukkanen, A. Denisova et al. // Scand. J. Infect. Dis. -1996. V.28. -P.537-41.
147. Liitsola K. HIV-1 genetic subtype A/B recombinant strain causing an explosive epidemic in injecting drug users in Kaliningrad / K. Liitsola, I. Tashkinova, T. Laukkanen et al. // AIDS. 1998. - V.12. - P.1907-19.
148. Linton M.F. Reading-frame restoration by transcriptional slippage at long stretches of adenine residues in mammalian cells / M.F. Linton, M. Raabe, V. Pierotti et al. // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - P. 14127-32.
149. Long E.M. Gender differences in HIV-1 diversity at time of infection / E. M. Long, H.L. Martin Jr., J.K. Kreiss et al. // Nature Medicine. 2000. - V.6. -P.71-5.
150. Loussert-Ajaka I. Variability of human immunodeficiency virus type 1 group O strains isolated from Cameroonian patients living in France /1. Loussert-Ajaka, M.L. Chaix, B. Korber et al. // J. Virol. 1995. - V.69. -P.5640-9.
151. Louwagie J. Genetic analysis of HIV-1 isolates from Brazil reveals presence of two distinct genetic subtypes / J. Louwagie, E.L. Delwart, J.I. Mullins et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - V.10. -P.561-7.
152. Louwagie J. Genetic diversity of the envelope glycoprotein from humanimmunodeficiency virus type 1 isolates of African origin / J. Louwagie, W. Janssens, J. Mascola et al. // J. Virol. 1995. - V.69. - P.263-71.
153. Louwagie J. Phylogenetic analysis of gag genes from 70 international HIV-1 isolates provides evidence for multiple genotypes / J. Louwagie, F.E. McCutchan, M. Peeters et al. // AIDS. 1993. - V.7. - P.769-80.
154. Lukashov V.V. Extreme founder effect in an HIV type 1 subtype A epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus / V.V. Lukashov, E.V. Karamov, V.F. Eremin et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. - V.14. - P.1299-303.
155. Lukashov V.V. Simultaneous introduction of distinct HIV-1 subtypes into different risk groups in Russia, Byelorussia and Lithuania / V.V. Lukashov, M.T. Cornelissen, J. Goudsmit et al. // AIDS. 1995. - V.9. - P.435-9.
156. Mangeat B. Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts / B. Mangeat, P. Turelli, G. Caron et al. // Nature. 2003. - V.424. - P.99-103.
157. Mansky L.M. Lower in vivo mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 than that predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase / L.M. Mansky, H.M. Temin // J. Virol. 1995. - V.69. - P.5087-94.
158. Mansky L.M. The interaction of vpr with uracil DNA glycosylase modulates the human immunodeficiency virus type 1 In vivo mutation rate / L.M. Mansky, S. Preveral, L. Selig et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P.7039-47.
159. Mansky L.M. The mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 is influenced by the vpr gene / L.M. Mansky // Virology. 1996. - V.222. - P.391-400.
160. Marquina S. Coexistence of subtypes B, F, and as B/F env recombinant of HIV type 1 in Buenos Aires Argentina / S. Marquina, T. Leitner, R.D. Rabinovich et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - V.12. - P.1651-4.
161. Martinez M.A. Hypermutagenesis of RNA using human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and biased dNTP concentrations / M.A. Martinez, J.P. Vartanian, S. Wain-Hobson // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. -1994.-V.91.-P.11787-91.
162. Masharsky A.E. Molecular cloning and analysis of full-length genome of HIV type 1 strains prevalent in countries of the former Soviet Union / A.E. Masharsky, N.A. Klimov, A.P. Kozlov // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. — V.19. - P.933-9.
163. Mathews C.K. DNA precursor asymmetries, replication fidelity, and variable genome evolution / C.K. Mathews, J. Ji // Bioessays. 1992. - V.14. - P.295-301.
164. McCune J.M. Endoproteolytic cleavage of gpl60 is required for the activation of human immunodeficiency virus / J.M. McCune, L.B. Rabin, M.B. Feinberg et al. // Cell. 1988. - V.53. - P.55-67.
165. Mehle A. Vif overcomes the innate antiviral activity of APOBEC3G by promoting its degradation in the ubiquitin-proteasome pathway / A. Mehle, B. Strack, P. Ancuta et al. // J. Biol. Chem. 2004. - V.279. - P.7792-8.
166. Milich L. V3 loop of the human immunodeficiency virus type 1 Env protein: interpreting sequence variability / L. Milich, B. Margolin, R. Swanstrom // J. Virol. 1993. - V.67. - P.5623-34.
167. Miller M.D. The human immunodeficiency virus-1 nef gene product: a positive factor for viral infection and replication in primary lymphocytes and macrophages / M.D. Miller, M.T. Warmerdam, I. Gaston et al. // J. Exp. Med. -1994. V.179. - P.101-13.
168. Miller V. International perspectives on antiretroviral resistance. Resistance to protease inhibitors / V. Miller // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2001. - V.26 Suppl 1. — P.S34-S50.
169. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1987 / G. Myers // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM.- 1987.
170. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1988 / G. Myers, S.F. Josephs, A.B. Rabson et al. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National1.boratory, Los Alamos, NM. 1988.
171. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1992 / G. Myers, B. Korber, S. Wain-Hobson et al. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1992.
172. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1993 / G. Myers, B. Korber, S. Wain-Hobson et al. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1993.
173. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1994 / G. Myers, B. Korber, S. Wain-Hobson et al. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1994.
174. Naganawa S. First report of CRF03 AB recombinant HIV type 1 in injecting drug users in Ukraine / S. Naganawa, S. Sato, D. Nossik et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002. - V. 18. - P. 1145-9.
175. Najera R. Genetic recombination and its role in the development of the HIV-1 pandemic / R. Najera, E. Delgado, L. Perez-Alvarez et al. // AIDS. 2002. -V.16 Suppl4. — P.S3-16.
176. Nasioulas G. Molecular analysis of the full-length genome of HIV type 1 subtype I: evidence of A/G/I recombination / G. Nasioulas, D. Paraskevis, E. Magiorkinis et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. - V.15. - P.745-58.
177. Neville M. The importin-beta family member Crmlp bridges the interaction between Rev and the nuclear pore complex during nuclear export / M. Neville, F. Stutz, L. Lee et al. // Curr. Biol. 1997. - V.7. - P.767-75.
178. Niederman T.M. Myristoylation-enhanced binding of the HIV-1 Nef protein to T cell skeletal matrix / T.M. Niederman, W.R. Hastings, L. Ratner // Virology. -1993. V. 197. -P.420-5.
179. Nkengasong J.N. Genotypic subtypes of HIV-1 in Cameroon / J.N. Nkengasong, W. Janssens, L. Heyndrickx et al. // AIDS. 1994. - V.8. - P. 140512.
180. Novitsky V.A. Molecular epidemiology of an HIV-1 subtype A subcluster among injection drug users in the Southern Ukraine / V.A. Novitsky, M.A. Montano, M. Essex // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. - V.14. - P.1079
181. O'Brien W.A. HIV-1 tropism for mononuclear phagocytes can be determined by regions of gpl20 outside the CD4-binding domain / W.A. O'Brien, Y. Koyanagi, A. Namazie et al. // Nature. 1990. - V.348. - P.69-73.
182. ONeil P.K. Mutational analysis of HIV-1 long terminal repeats to explore the relative contribution of reverse transcriptase and RNA polymerase II to viral mutagenesis / P.K. O'Neil, G. Sun, H. Yu et al. // J. Biol. Chem. 2002. - V.277. - P.38053-61.
183. Osmanov S. Estimated global distribution and regional spread of HIV-1 genetic subtypes in the year 2000 / S. Osmanov, C. Pattou, N. Walker et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2002. - V.29. - P. 184-90.
184. Ou S.H. Role of flanking E box motifs in human immunodeficiency virus type 1 TATA element function / S.H. Ou, L.F. Garcia-Martinez, E.J. Paulssen et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.7188-99.
185. Pandrea I. HIV type 1 genetic diversity and genotypic drug susceptibility in the Republic of Moldova / I. Pandrea, D. Descamps, G. Collin et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2001. -V.17. -P.1297-304.
186. Peeters M. Genetic diversity of HIV in Africa: impact on diagnosis, treatment, vaccine development and trials / M. Peeters, C. Toure-Kane, J.N. Nkengasong // AIDS. 2003. - V. 17. - P.2547-60.
187. Peeters M. Recombinant HIV sequences: Their role in the global epidemic / M. Peeters // HIV Sequence Compendium 2000. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2000. - P.I-39-54.
188. Pereira L.A. A compilation of cellular transcription factor interactions with the HIV-1 LTR promoter / L.A. Pereira, K. Bentley, A. Peeters et al. // Nucleic Acids Res. 2000. - V.28. - P.663-8.
189. Pillai S. A new perspective on V3 phenotype prediction / S. Pillai, B. Good, D. Richman et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. - P.145-9.
190. Pollakis G. N-linked glycosylation of the HIV type-1 gpl20 envelope glycoprotein as a major determinant of CCR5 and CXCR4 coreceptor utilization / G. Pollakis, S. Kang, A. Kliphuis et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. -P.13433-41.
191. Resch W. Improved success of phenotype prediction of the human immunodeficiency virus type 1 from envelope variable loop 3 sequence using neural networks / W. Resch, N. Hoffman, R. Swanstrom // Virology. 2001.1. V.288. P.51-62.
192. Ricchetti M. Reverse transcriptases and genomic variability: the accuracy of DNA replication is enzyme specific and sequence dependent / M. Ricchetti, H. Buc // EMBO J. 1990. - V.9. - P. 1583-93.
193. Rittner K. The human immunodeficiency virus long terminal repeat includes a specialised initiator element which is required for Tat-responsive transcription / K. Rittner, M.J. Churcher, M.J. Gait et al. // J. Mol. Biol. 1995. - V.248. -P.562-80.
194. Roberts J.D. The accuracy of reverse transcriptase from HTV-1 / J.D. Roberts, K. Bebenek, T.A. Kunkel// Science. 1988. - V.242. - P.l 171-3.
195. Roberts J.D. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1 / J.D. Roberts, K. Bebenek, T.A. Kunkel// Science. 1988. - V.242. - P.l 171-3.
196. Robertson D.L. HIV-1 Nomenclature Proposal / D.L. Robertson, J.P. Anderson, J.A. Bradac et al. // Human Retroviruses and AIDS 1999. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1999. - P.492-505.
197. Robertson D.L. HIV-1 nomenclature proposal / D.L. Robertson, J.P. Anderson, J.A. Bradac et al. // Science. 2000. - V.288. - P.55-6.
198. Robertson D.L. Recombination in HIV-1 / D.L. Robertson, P.M. Sharp, F.E. McCutchan et al. // Nature. 1995. - V.374. - P. 124-6.
199. Roos M.T. Viral phenotype and immune response in primary human immunodeficiency virus type 1 infection / M.T. Roos, J.M. Lange, R.E. de Goede et al. // J. Infect. Dis. 1992. - V.165. - P.427-32.
200. Roques P. Phylogenetic analysis of 49 newly derived HIV-1 group O strains: high viral diversity but no group M-like subtype structure / P. Roques, D.L. Robertson, S. Souquiere et al. // Virology. 2002. - V.302. -P.259-73.
201. Roques P. Phylogenetic characteristics of three new HIV-1 N strains and implications for the origin of group N / P. Roques, D.L. Robertson, S. Souquiere et al. // AIDS. 2004. -V. 18. - P. 1371-81.
202. Rosen C.A. The location of cis-acting regulatory sequences in the human T cell lymphotropic virus type III (HTLV-III/LAV) long terminal repeat / C.A. Rosen, J.G. Sodroski, W.A. Haseltine // Cell. 1985. - V.41. - P.813-23.
203. Saad M.D. Genetic forms of HIV type 1 in the Former Soviet Union dominate the epidemic in Azerbaijan / M.D. Saad, Q. Aliev, B.A. Botros et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2006. - V.22. - P.796-800.
204. Saag M.S. Extensive variation of human immunodeficiency virus type-1 in vivo / M.S. Saag, B.H. Hahn, J. Gibbons et al. // Nature. 1988. - V.334. -P.440-4.
205. Sabatier J.M. Evidence for neurotoxic activity of tat from human immunodeficiency virus type 1 / J.M. Sabatier, E. Vives, K. Mabrouk et al. // J. Virol. 1991. - V.65. - P.961-7.
206. Sabino E.C. Distribution of HIV-1 subtypes seen in an AIDS clinic in Sao Paulo City, Brazil / E.C. Sabino, R.S. Diaz, L.F. Brigido et al. // AIDS. 1996. -V. 10.-P. 1579-84.
207. Sagar M. Infection with multiple human immunodeficiency virus type 1 variants is associated with faster disease progression / M. Sagar, L. Lavreys, J.M. Baeten et al. // Journal of Virology. 2003. - V.77. - P. 12921-6.
208. Sagar M. Identification of modifiable factors that affect the genetic diversity of the transmitted HIV-1 population / M. Sagar, L. Lavreys, J.M. Baeten et al. // AIDS. 2004. - V.18. - P.615-9.
209. Samson M. Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene / M. Samson, F. Libert, B.J. Doranz et al. // Nature. 1996. - V.382. - P.722-5.
210. Sanchez J.L. Expanding epidemics of HIV-1 in states of the Former Soviet Union / J.L. Sanchez, J.K. Carr, R. Graham et al. // Abstracts 11th Conference on Retroviruses and Opportunictic Infections, San Francisco, USA, 2004. #867.
211. Sato A. Evidence for direct association of Vpr and matrix protein pl7 within the HIV-1 virion / A. Sato, J. Yoshimoto, Y. Isaka et al. // Virology. 1996.1. V.220. — P.208-12.
212. Scala G. The expression of the interleukin 6 gene is induced by the human immunodeficiency virus 1 TAT protein / G. Scala, M.R. Ruocco, C. Ambrosino et al.//J.Exp. Med. 1994.- V. 179.- P.961-71.
213. Schwartz O. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein / O. Schwartz, V. Marechal, S. Le Gall et al. //Nat. Med. 1996. - V.2. - P.338-42.
214. Selig L. Interaction with the p6 domain of the gag precursor mediates incorporation into virions of Vpr and Vpx proteins from primate lentiviruses / L. Selig, J.C. Pages, V. Tanchou et al. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.592-600.
215. Sheehy A.M. Isolation of a human gene that inhibits HIV-1 infection and is suppressed by the viral Vif protein / A.M. Sheehy, N.C. Gaddis, J.D. Choi et al. // Nature. 2002. - V.418. - P.646-50.
216. Sheehy A.M. The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV-1 Vif / A.M. Sheehy, N.C. Gaddis, M.H. Malim // Nat. Med. 2003. - V.9. - P. 1404-7.
217. Shioda T. Macrophage and T cell-line tropisms of HIV-1 are determined by specific regions of the envelope gpl20 gene / T. Shioda, J.A. Levy, C. Cheng-Mayer // Nature. 1991. - V.349. - P. 167-9.
218. Simmonds P. Analysis of sequence diversity in hypervariable regions of the external glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 / P. Simmonds, P. Balfe, C.A. Ludlam et al. // J. Virol. 1990. - V.64. - P.5840-50.
219. Simon F. Identification of a new human immunodeficiency virus type 1 distinct from group M and group O / F. Simon, P. Mauclere, P. Roques et al. // Nat. Med. -1998.-V.4.-P. 1032-7.
220. Smolskaya T. HIV Epidemiology in the Northwestern Federal District of Russia: Dominance of HIV Type 1 Subtype A. / T. Smolskaya, K. Liitsola, V. Zetterberg et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2006. - V.22. - P. 1074—80.
221. Snoeck J. Rising prevalence of HIV-1 non-B subtypes in Belgium: 1983-2001 / J. Snoeck, K. Van Laethem, P. Hermans et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. — 2004. V.35. - P.279-85.
222. Srinivasan A. Molecular characterization of human immunodeficiency virus from Zaire: nucleotide sequence analysis identifies conserved and variable domains in the envelope gene / A. Srinivasan, R. Anand, D. York et al. // Gene. —1987. V.52. - P.71-82.
223. Strebel K. The HIV 'A' (sor) gene product is essential for virus infectivity / K. Strebel, D. Daugherty, K. Clouse et al. //Nature. 1987. - V.328. - P.728-30.
224. Takahashi H. Induction of broadly cross-reactive cytotoxic T cells recognizing an HIV-1 envelope determinant / H. Takahashi, Y. Nakagawa, C.D. Pendleton et al. // Science. 1992. - V.255. - P.333-6.
225. Tang H. Lentivirus replication and regulation / H. Tang, K.L. Kuhen, F. Wong-Staal // Annu. Rev. Genet. 1999. - V.33. - P. 133-70.
226. Thomas M.J. Transcriptional fidelity and proofreading by RNA polymerase II / M.J. Thomas, A.A. Platas, D.K. Hawley // Cell. 1998. - V.93. - P.627-37.
227. Tramuto F. Detection of HIV type 1 non-B subtypes in Sicily, Italy / F. Tramuto, F. Vitale, F. Bonura et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. -V.20. - P.251-4.
228. Triques K. High diversity of HIV-1 subtype F strains in Central Africa / K. Triques, A. Bourgeois, S. Saragosti et al. // Virology. 1999. - V.259. - P.99-109.
229. Vanden Haesevelde M. Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immunodeficiency virus isolate / M. Vanden Haesevelde, J.L. Decourt, R.J. De Leys et al. // J. Virol. 1994. - V.68. -P.1586-96.
230. Vartanian J.P. Death and the retrovirus / J.P. Vartanian, P. Sommer, S. Wain-Hobson // Trends Mol. Med. 2003. - V.9. - P.409-13.
231. Vartanian J.P. HIV genetic variation is directed and restricted by DNA precursor availability / J.P. Vartanian, U. Plikat, M. Henry et al. // J. Mol. Biol. 1997. -V.270. — P.139-51.
232. Vartanian J.P. Selection, recombination, and G~>A hypermutation of humanimmunodeficiency virus type 1 genomes / J.P. Vartanian, A. Meyerhans, B. Asjo et al. // J. Virol. 1991. -V.65. -P. 1779-88.
233. Vartanian J.P. Sustained G~>A hypermutation during reverse transcription of an entire human immunodeficiency virus type 1 strain Vau group O genome / J.P. Vartanian, M. Henry, S. Wain-Hobson // J. Gen. Virol. 2002. - V.83. - P.801-5.
234. Vodicka M.A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses / M.A. Vodicka, W.C. Goh, L.I. Wu et al. // Virology. 1997. - V.233. - P. 193-8.
235. Wabl M. Hypermutation at the immunoglobulin heavy chain locus in a pre-B-cell line / M. Wabl, P.D. Burrows, A. von Gabain et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A.- 1985. V.82. - P.479-82.
236. Wain-Hobson S. Nucleotide Sequence of the AIDS Virus, LAV/ Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., Alizon MM Cell. 1985. -V.40. - P. 9-17. .
237. Westendorp M.O. Human immunodeficiency virus type 1 Tat upregulates interleukin-2 secretion in activated T cells / M.O. Westendorp, M. Li-Weber, R.W. Frank et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.4177-85.
238. Wilson D. HIV Epidemiology: A Review of Recent Trends and Lessons — 2007.http://data.unaids.org/pub/ExternalDocument/2007/20060913wilsonen.pdf
239. Wolfs T.F. HIV-1 genomic RNA diversification following sexual and parenteral virus transmission / T.F. Wolfs, G. Zwart, M. Bakker, J. Goudsmith // Virology. 1992. - V. 189. - P. 103-10.
240. Wolinsky S. M. Selective transmission of human immunodeficiency virus type-1 variants from mother to infants / S. M. Wolinsky, C.M. Wike, B.T. Korber et al. // Science. 1992. - V.255. -P.l 134-7.
241. Wong-Staal F. Genomic diversity of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III) / F. Wong-Staal, G.M. Shaw, B.H. Hahn et al. // Science. 1985. -V.229. - P.759-62.
242. Wooley D.P. Direct demonstration of retroviral recombination in a rhesus monkey / D.P. Wooley, R.A. Smith, S. Czajak et al. // J. Virol. 1997. - V.71.1. P.9650-3.
243. Wu L. CD4-induced interaction of primary HTV-1 gpl20 glycoproteins with the chemokine receptor CCR-5 / L. Wu, N.P. Gerard, R. Wyatt et al. // Nature. -1996. V.384. - P.179-83.
244. Wyatt R. The HIV-l envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens / R. Wyatt, J. Sodroski // Science. 1998. - V.280. - P.1884-8.
245. Yamaguchi J. Identification of a new HIV-2 subtype based on phylogenetic analysis of full-length genomic sequence / J. Yamaguchi, S.G. Devare, C.A. Brennan // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. - V.16. - P.925-30.
246. Yamaguchi J. Near full-length genomes of 15 HIV type 1 group O isolates / J. Yamaguchi, P. Bodelle, L. Kaptue et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003.- V.19. P.979-88.
247. Yirrell D.L. HIV-l subtype in Scotland: the establishment of a national surveillance system / D.L. Yirrell, L. Shaw, S.M. Burns et al. // Epidemiol. Infect.- 2004. -V. 132. -P.693-8.
248. Yu X. Induction of APOBEC3G ubiquitination and degradation by an HIV-l Vif-Cul5-SCF complex / X. Yu, Y. Yu, B. Liu et al. // Science. 2003. - V.302. -P.1056-60.
249. Zarandia M. HIV-l genetic diversity and genotypic drug susceptibility in the Republic of Georgia / M. Zarandia, T. Tsertsvadze, J.K. Carr et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2006. - V.22. - P.470-6.
250. Zhang H. The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-l DNA / H. Zhang, B. Yang, R.J. Pomerantz et al. // Nature. -2003.-V.424.-P.94-8.
251. Zhang J. Most retroviral recombinations occur during minus-strand DNA synthesis / J. Zhang, L.Y. Tang, T. Li et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P.2313-22.
252. Zhu T. Genotypic and phenotypic characterization of HIV-1 patients with primary infection / T. Zhu, H. Mo, N. Wang et al. // Science. 1993. - V.261. -P.1179-81.
253. Zhu T. Genotypic and phenotypic characterization of HIV-1 patients with primary infection / T. Zhu, H. Mo, N. Wang et al. // Science. 1993. - V.261. -P.1179-81.
254. Zhuang J. Human immunodeficiency virus type 1 recombination: rate, fidelity, and putative hot spots / J. Zhuang, A.E. Jetzt, G. Sun et al. // J. Virol. 2002. -V.76.-P.11273-82.
-
Духовлинова, Елена Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2010
-
ВАК 03.01.04
- Исследование изменчивости нуклеотидной последовательности функционально значимых районов генома вируса иммунодефицита человека первого типа
- Молекулярно-биологическая характеристика изолятов ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге
- Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев
- Молекулярно-эпидемиологический анализ ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области
- Изучение генетического разнообразия и анализ генома ВИЧ-1 в странах бывшего СССР
