Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического разнообразия и анализ генома ВИЧ-1 в странах бывшего СССР

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического разнообразия и анализ генома ВИЧ-1 в странах бывшего СССР"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

МАШАРСКИИ Алексей Эльвинович

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ И АНАЛИЗ ГЕНОМА ВИЧ-1 В СТРАНАХ БЫВШЕГО СССР

03.00.15- Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии АНО "Биомедицинский центр" и лаборатории молекулярной вирусологии ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов".

Научный руководитель:

доктор биологических наук Козлов Андрей Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Поспелов Валерий Анатольевич

доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович

Ведущее учреждение:

ГУ "Научно-исследовательский институт гриппа РАМН"

Защита состоится "2Я" 2005 г. в ^часов на заседании

Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "/V" 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Высокий уровень генетического разнообразия вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) является одним из основных препятствий в борьбе с эпидемией ВИЧ/СПИД. Данное свойство ВИЧ-1, типичное для всех ретровирусов, является результатом эволюции вирусного генома, обусловленной высокими частотами мутаций и рекомбинаций, высокой скоростью размножения и большим размером вирусной популяции в инфицированном организме [1-3]. Благодаря накоплению большого числа спонтанных мутаций в геноме ВИЧ-1, в организме зараженного человека присутствуют штаммы, потенциально устойчивые к действию иммунной системы и лекарственных препаратов [4,5]. При передаче вируса от одного человека к другому за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции [б].

Основным методом изучения генетического разнообразия ВИЧ-1 является определение нуклеотидной последовательности вирусного генома или его отдельных участков. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей штаммов ВИЧ-1 из различных географических регионов было установлено, что они образуют три группы: М, N и О, которые соответствуют трем независимым случаям переноса вируса иммунодефицита обезьян от шимпанзе к человеку [7]. Вирусы группы М, в которую входит подавляющее большинство обнаруженных штаммов ВИЧ-1, в свою очередь могут быть разделены на подгруппы, названные "субтипами", которых на сегодняшний день обнаружено 9 [8]. Субтипы группы М ВИЧ-1 соответствуют равноудаленным друг от друга кластерам филогенетического дерева Генетическое расстояние между нуклеотидными последовательностями наиболее вариабельного вирусного гена ет разных субтипов ВИЧ-1 составляет от 15 до 25%. Геном некоторых штаммов ВИЧ-1 является результатом рекомбинации геномов разных субтипов. Такие "межсубтипические рекомбинанты" возникают при репликации генома ВИЧ-1 в организме человека, одновременно зараженного вирусами разных субтипов. Рекомбинанты, которые получили широкое распространение, называют "циркулирующими рекомбинантными формами" (ЦРФ) ВИЧ-1, которых в настоящее время идентифицировано 16 [9]. Существование отличающихся вариантов ВИЧ-1 (субтипов и ЦРФ) позволяет отслеживать их происхождение и последующее распространение в различных географических регионах и группах риска. Кроме того, создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены [10].

В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции, поскольку в этом регионе крупномасштабная эпидемия началась только в середине 90-х годов. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В августе 2004 года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 291512 - по сравнению с 10993 на конец 1998 года [11]. В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Первым шагом в этом направлении должна быть молекулярно-генетическая характеристика циркулирующих в регионе вирусных штаммов, подразумевающая изучение их генетического разнообразия и определение доминирующих вариантов ВИЧ-1. Вторым этапом является клонирование и секвенирование полноразмерных геномов доминирующих в регионе вариантов ВИЧ-1.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования была молекулярно-генетическая характеристика шаммов ВИЧ-1, вызвавших эпидемию в странах бывшего СССР, и анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов доминирующих вариантов ВИЧ-1 для разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД. Задачи исследования:

1. Определить нуклеотидные последовательности участков генов env и gag штаммов ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ.

2. Проклонировать полноразмерные геномы вирусных штаммов, представляющих доминирующие в регионе варианты ВИЧ-1.

3. Определить полные нуклеотидные последовательности проклонированных геномов ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ.

4. Проанализировать аминокислотные последовательности белков полученных штаммов ВИЧ-1 с целью предсказания их биологических и иммунологических свойств.

Научная новизна работы. Впервые секвенированием участков генов eriv и gag ВИЧ-1 установлено, что в различных регионах Украины среди ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков доминируют штаммы ВИЧ-1 различных субтипов: штаммы субтипа В в Николаеве и штаммы субтипа А на остальной территории Украины Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей рекомбинантной форме CRF03-AB, в Республике Беларусь. Впервые проклонированы и просеквенированы полноразмерные геномы штамма ВИЧ-1, относящегося к циркулирующей рекомбинантной форме CRF03-AB, изолированного в Республике Беларусь, и штамма ВИЧ-1 субтипа А, изолированного на Украине. Впервые показано особое положение штаммов субтипа А из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1, позволяющее выделить их в новый подсубтип внутри субтипа А.

Научно-практическая значимость работы. В рамках данной работы получены клонированные полноразмерные геномы двух вирусных изолятов, представляющих доминирующие в странах бывшего СССР варианты ВИЧ-1. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности. Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в России и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания российской вакцины против ВИЧ/СПИД.

Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнялась в рамках финансирования AHO "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов" по проектам Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего" и Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", а также по грантам Международного центра Фогарти (FIC, AITRP, 5-D43-TW01028-04) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, BRHE, ST-012-0).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 7-й-11-й Международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 1999-2003; 3-ей Европейской конференции по экспериментальным исследованиям СПИДа, Мюнхен, Германия, 1998; 12-й и 14-й Всемирных конференциях по СПИДу, Женева, Швейцария, 1998 и Барселона, Испания, 2002; конференциях "Вакцина против СПИДа" (AIDS Vaccine 2001 и 2003), Филадельфия, США, 2001 и Нью-Йорк, США, 2003; 10-й конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Бостон, США, 2003; 2-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Париж, Франция, 2003. По теме диссертации опубликовано 10 статей и 14 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, 31 таблицей и 4 приложениями. Список литературы содержит 411 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использовали образцы крови от 17 ВИЧ-инфицированных пациентов из Николаева, Одессы, Киева и Могилева, собранные в 1997-2000 годах сотрудниками украинского национального комитета по профилактике наркомании и СПИДа и сотрудником НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь Ереминым В.Ф. По их данным, все пациенты заразились в результате употребления инъекционных наркотиков в 1996-98 годах. Для всех образцов серотип ВИЧ-1 определяли методом ИФА на основании

взаимодействия сыворотки крови с синтетическими пептидами, имитирующими иммунодоминантный B-клеточный эпитоп \/3-петли белка др120 различных субтипов ВИЧ-1 [12,13].

Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности. Высокомолекулярную ДНК из МКПК ВИЧ-инфицированных пациентов выделяли с помощью коммерческого набора "DNAttraction-IV™" (Клоноген, Санкт-Петербург). Амплифицирование фрагментов генома ВИЧ-1 из ДНК МКПК ВИЧ-инфицированных пациентов проводили методом двухраундовой полимеразной цепной реакции (ПЦР). В первую очередь для всех образцов ДНК амплифицировали короткие участки генома ВИЧ-1, соответствующие р17/р24 области гена gag длиной 435 п.н. и V3-V5 области гена env длиной 667 п.н. (см.рис.1.А). Для двух штаммов, представляющих доминирующие в странах бывшего СССР варианты ВИЧ-1, амплифицировали фрагменты ДНК длиной от 725 до 1899 п.н., перекрывающие в совокупности полный вирусный геном (см.рис.2).

Амплифицированные короткие участки генов gag и env содержали на своих концах искусственно внедренные олигонуклеотиды, позволяющие осуществлять прямое секвенирование с помощью универсальных праймеров. Амплифицированные фрагменты, перекрывающие полный вирусный геном, клонировали с помощью плазмидного вектора, а затем секвенировали с помощью вектор-специфических и ВИЧ-специфических праймеров. Разделение и детекцию продуктов реакции секвенирования проводили с помощью автоматического секвенатора "ALFexpress" (Pharmacia Biotech, Швеция). Полученные нуклеотидные последовательности были депонированы в базу данных "GenBank" под номерами AF098952, AF098953, AF100934-9, AY077629, AY766061-9, AF413958-4006.

Первичный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ DNASIS v.2.5 и BioEdit v.5.0.9. Филогенетический анализ проводили с помощью пакета компьютерных программ PHYLIP v.3.57c. Расстояния между нуклеотидными последовательностями вычисляли методом Кимуры в программе DNADIST (PHYLIP). На основании полученных матриц генетических расстояний методом "neighbor joining" с помощью программы NEIGHBOR (PHYLIP) строили филогенетические деревья. Для определения достоверности топологий построенных филогенетических деревьев использовали метод "бутстрэп" ("bootstrap") с помощью программ SEQBOOT и CONSENSE (PHYLIP). Филогенетические деревья представляли с помощью программы TreeView v.1.6.0. Для обнаружения возможных точек рекомбинации между различными субтипами в нуклеотидных последовательностях геномов штаммов ВИЧ-1 применяли методы сканирующего анализа генетического расстояния ("distance scanning") и сканирующего бутстрэп-анализа ("bootscanning") с помощью программы SimPlot v.2.5. Для статистического анализа полученных результатов данные обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel и пакета программ STATISTICA v.5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение генетического разнообразия ВИЧ-1 в странах бывшего СССР

Для изучения генетического разнообразия ВИЧ-1 на основании результатов серотипирования были выбраны 16 ВИЧ-инфицированных пациентов из различных городов Украины и один из Республики Беларусь (см.табл.1). Восемь пациентов были инфицированы серотипом В ВИЧ-1, 9 -серотипом А/С. Серотип А/С является общепризнанным, так как из-за сильного сходства аминокислотных последовательностей \/3-петли белка др120 субтипы А и С ВИЧ-1 серологически не различимы.

Таблица 1

Штаммы ВИЧ-1, для которых были амплифицированы участки генов дад и env

№ п/п Код штамма ВИЧ-1 Город Серотип ВИЧ-1 Субтип ВИЧ-1 на основании гена Предполагаемый субтип на основании всего генома ВИЧ-1

дад env

1 97UA0077 Николаев В В В В

2 97UA0078 Николаев В В не анализ. В

3 97UA0081 Николаев В не анализ. В В или CRF03-AB

4 97UA0082 Николаев В В не анализ. В

5 97UA0083 Николаев В В В В

6 97UA0084 Николаев А/С А не анализ. А

7 97UA0085 Николаев В В В В

8 97UA0086 Николаев В В В В

9 97UA0096 Одесса А/С не анализ. А А

10 97UA0097 Одесса А/С не анализ. А А

11 98UA0123 Киев А/С не анализ. А А

12 98UA0127 Киев А/С А А А

13 98UA0130 Киев А/С не анализ. А А

14 98 U А0132 Киев А/С не анализ. А А

15 98UA0133 Киев А/С А А А

16 00UA0116 Киев А/С А А А

17 00BY10443 Могилев В А В CRF03-AB

При амплифицировании коротких участков генома ВИЧ-1 для 11 пациентов были получены фрагменты длиной около 500 п.н., соответствующие р17/р24 области гена дад, а для 14 пациентов - фрагменты длиной около 700 п.н., соответствующие \/3-\/5 области гена ет (см.табл.1 и рис.1.А). Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей соответствующих участков генома ВИЧ-1 представлены на рис.1.Б, В.

Горизонтальные участки ветвей филогенетического дерева изображают генетическое расстояние между нуклеотидными последовательностями, при этом длина отрезка в нижней части рисунка соответствует генетическому расстоянию 0.1 нуклеотидной замены на один нуклеотид или 10%. Обозначения приведены только для штаммов ВИЧ-1, перечисленных в табл.1 Скобками показаны кластеры, соответствующие субтипам и подсубтипам ВИЧ-1, а также кластеры штаммов субтипов А и В из стран бывшего СССР.

д р17/р24 дад

УЗ-У5 епу

с

9виА0133

г 9811А0123 - 98иА0127 98иА0130 98иА0132

100 V 97иА0096 - 971М0097 -00иА011в _

Ё

871 100

&

100

9711А0081

>- 97ЦА0085

1г 97иА0077 1 97ЦА0086 - 9711А0083

— (ЮВУ10443.

ш

96|-~СЕ

В

"1N J и..

В

0.1

чн

0 ?

К С

в

л

н

о

Рис 1 Локализация амплифицированных участков генома ВИЧ-1 (А) и результаты филогенетического анализа соответствующих нуклеотидных последовательностей (Б,В)

Достоверность этих кластеров выражена бутстрэп-значениями, приведенными около соответствующих узлов филогенетического дерева. Для всех отмеченных кластеров бутстрэп-значения превышают 70%, что свидетельствует о их достоверности.

Как видно из рис.1.Б, нуклеотидные последовательности участка гена gag всех штаммов из Николаева, кроме 97UA0084, принадлежат к субтипу В, а последовательности штаммов 97UA0084, 00BY10443 и всех штаммов из Киева

- к субтипу А. Рис.1.В демонстрирует, что нуклеотидные последовательности участка гена env штамма 00BY10443 и всех штаммов из Николаева принадлежат к субтипу В, а последовательности всех штаммов из Киева и Одессы - к субтипу А. Для всех проанализированных штаммов ВИЧ-1 показано соответствие серотипа ВИЧ-1 и генетического субтипа (см.табл.1). Все штаммы ВИЧ-1, относящиеся к серотипу А/С, принадлежат к субтипу А. Хотя для пяти из них не удалось просеквенировать участок гена gag, вероятнее всего, они относятся к нерекомбинантному варианту субтипа А, поскольку в странах бывшего СССР не было обнаружено ни одного примера межсубтипических рекомбинантов, содержащих ген env субтипа А [14]. Таким образом, все проанализированные штаммы ВИЧ-1 из Одессы и Киева и один штамм из Николаева относятся к субтипу А, что согласуется с полученными нами ранее данными о превалировании на Украине серотипа А/С [12].

Нуклеотидные последовательности семи штаммов ВИЧ-1 серотипа В из Николаева принадлежат к субтипу В. При этом четыре штамма генотипированы как по гену env, так и по гену gag, два (97UA0078 и 97UA0082)

- только по гену gag и один (97UA0081) - только по гену env. Поскольку для пяти штаммов серотип В соответствует елу-субтипу В, можно предположить, что штаммы 97UA0078 и 97UA0082, для которых не удалось просеквенировать участок гена env, также относятся к субтипу В по обоим генам. Не исключено, что штамм 97UA0081, для которого не был просеквенирован участок гена gag, может принадлежать к ЦРФ CRF03-AB. Принадлежность к данной рекомбинантной форме нам удалось достоверно показать для белорусского штамма 00BY10443, у которого ген env принадлежит к субтипу В, а ген gag - к субтипу А. Скорее всего, пациент заразился в Калининграде, где CRF03-AB доминирует с 1996 года [15]. Это первый и пока единственный случай обнаружения данной ЦРФ в Республике Беларусь.

При филогенетическом анализе обоих участков генома ВИЧ-1 было установлено, что все штаммы из стран бывшего СССР, обнаруженные и нами, и другими исследователями, образуют отдельные кластеры внутри субтипов А и В, обозначенные на рис.1 A-FSU и B-FSU, соответственно. Эти кластеры имеют бутстрэп-значение 100% и не содержат штаммов ВИЧ-1 из других регионов мира. Характерные значения генетического расстояния Кимуры между нуклеотидными последовательностями участков генов gag и env проанализированных штаммов ВИЧ-1 субтипов А и В представлены в табл.2.

Штаммы ВИЧ-1, нуклеотидные последовательности которых были получены в данной работе, обозначены в таблице "А-1/А" и "В-ЦА" в зависимости от субтипа, к которому они принадлежат на основании анализируемого участка генома. Как видно из табл.2, в пределах обоих проанализированных участков генома медиана генетического расстояния внутри кластеров А-РБи и В-РБи не превышает 3.2%, тогда как для кластеров, соответствующих субтипам А и В, эта величина достигает 19% и 8.7% в случае генов епу и дад, соответственно.

Таблица 2

Внутригрупповое генетическое расстояние между штаммами ВИЧ-1 из кластеров, обнаруженных в результате филогенетического анализа

Ген ВИЧ-1 Группа штаммов ВИЧ-1 Число штаммов ВИЧ-1 Число пар штаммов ВИЧ-1 Ген< меж/i этическое расстояние у штаммами ВИЧ-1, %

медиана нижний -верхний квартили минимальное -максимальное значение

дад A-UA 5 10 2.4 1.8-3.0 1.2-3.6

A-FSU 19 171 1.2 0.6-1.8 0.0-3.6

субтип А 29 406 8.7 1.5-11.7 0.0-18.9

B-UA 6 15 2.3 2.0-2.9 1.1-3.8

B-FSU 8 28 2.9 2.2-3.2 1.1-4.6

субтип В 12 66 7.4 2.9-9.3 1.1-11.8

env A-UA 8 28 2.1 1.8-3.2 1.1 -4.7

A-FSU 16 120 1.9 1.6-2.4 0.7-4.7

субтип А 27 351 19.0 2.3-21.5 0.7-26.1

B-UA 6 15 3.2 2.2-3.5 1.2-4.4

B-FSU 13 78 3.2 2.4-3.9 1.2-5.9

субтип В 17 136 4.2 3.0-10.0 1.2-17.3

Клонирование полноразмерного генома доминирующих в странах бывшего СССР вариантов ВИЧ-1

На основании результатов анализа нуклеотидных последовательностей участков генов дад и елудва штамма, 00UA0116 и 00BY10443, представляющие доминирующие в странах бывшего СССР варианты ВИЧ-1 A-FSU и CRF03-AB, были выбраны для анализа полного генома. Для получения полноразмерного вирусного генома использовали подход, основанный на амплифицировании нескольких перекрывающихся фрагментов генома длиной до 2 т.п.н. (см.рис.2). Это было связано с неудачными попытками амплифицировать фрагменты генома ВИЧ-1 длиной более 3 т.п.н. из провирусной ДНК с помощью имевшихся в нашем распоряжении реактивов для ПЦР. Кроме того, данный подход облегчает процедуру клонирования амплифицированных фрагментов генома ВИЧ-1, так как короткие фрагменты более стабильны в составе бактериальных плазмидных векторов. В результате клонирования амплифицированных фрагментов генома штаммов ВИЧ-1 и последующего выбора подходящих клонов была создана коллекция плазмид, содержащих фрагменты, перекрывающие весь геном штаммов 00UA0116 и 00BY10443 (см.табл.З).

II IV VI Vllb

Vila

Рис.2. Схема расположения амплифицированных фрагментов, в совокупности перекрывающих весь геном ВИЧ-1

В результате клонирования амплифицированных фрагментов генома штаммов ВИЧ-1 и последующего выбора подходящих клонов была создана коллекция плазмид, содержащих фрагменты, перекрывающие весь геном штаммов OOUAOH6 и 00BY10443 (см.табл.З). Чтобы учесть наличие генетического разнообразия, присущего популяции ВИЧ-1 в организме, для каждого амплифицированного фрагмента генома мы постарались отобрать и просеквенировать хотя бы по три клона. Однако это удалось сделать не для всех амплифицированных фрагментов. Например, для фрагмента VII генома штамма 00UA0116 так и не удалось обнаружить клон, содержащий полноразмерную вставку, что может быть связано с негативным воздействием соответствующей плазмиды на жизнеспособность несущих ее бактериальных клеток. В случае штамма 00BY10443 также возникли сложности при клонировании фрагмента VII: удалось обнаружить всего один рекомбинантный клон. Решить эту проблему для фрагмента VII генома штамма 00UA0116 удалось, заменив его двумя фрагментами меньшей длины Vila и Vllb, полностью перекрывающими соответствующий участок генома ВИЧ-1 (см.рис.2). Для этих фрагментов сложностей при клонировании не наблюдалось.

Таблица 3

Результаты отбора бактериальных клонов, содержащих амплифицированные фрагменты, перекрывающие полноразмерный геном штаммов ВИЧ-1

Фрагменты генома ВИЧ-1 I II III IV V VI VII Vila Vllb

Число клонов для штамма 0011А0116 всего 4 4 3 4 4 3 _ 3 4

недефектных 4 1 2 4 4 2 — 3 4

Число клонов для штамма 00ВУ10443 всего 3 3 3 3 2 3 1 — —

недефектных 3 2 0 1 1 3 0 — —

В результате секвенирования для всех фрагментов были обнаружены различия между нуклеотидными последовательностями клонов, отражающие генетическое разнообразие ВИЧ-1 в организме инфицированного пациента. Некоторые из них приводили к нарушению кодирующей последовательности генов ВИЧ-1. Поскольку клонированные фрагменты генома штаммов ВИЧ-1 планировалось использовать для сборки полноразмерных вирусных генов, пригодных для создания ДНК-вакцин и продуцентов вирусных белков in vitro, нашей задачей было отобрать "недефектные" клоны, не содержащие мутаций, приводящих к нарушению рамок считывания.

В случае штамма 00UA0116 для всех амплифицированных фрагментов нами был обнаружен хотя бы один клон, не содержащий дефектных генов; для штамма 00BY10443 для фрагментов III и VII таких клонов найти не удалось (см.табл.З). Единственный полученный нами для фрагмента VII клон содержит нонсенс-мутацию во втором экзоне гена tat, приводящую к образованию белка из 86 аминокислот, укороченного на 15 аминокислот по сравнению с большинством штаммов ВИЧ-1. Тем не менее, такой вариант белка Tat обнаружен для многих штаммов ВИЧ-1, и эта делеция не приводит к нарушению функций, важных для репликации вируса. Из трех клонов, полученных для фрагмента III, два содержат нонсенс-мутации, а третий -вставку одного нуклеотида, нарушающие рамку считывания гена pol. Поскольку два из трех проанализированных клонов не содержат этой вставки, а один - не имеет нонсенс-мутаций, то обнаруженные дефекты гена pol не являются характерной чертой штамма 00BY10443 и могут быть скомпенсированы комбинированием участков имеющихся клонов. Таким образом, проклонированные в виде перекрывающихся фрагментов полные геномы двух штаммов ВИЧ-1 содержат все вирусные открытые рамки считывания и могут быть использованы для экспрессии белков.

Филогенетический анализ полноразмерного генома доминирующих в странах бывшего СССР вариантов ВИЧ-1

Для нуклеотидных последовательностей генома штаммов 00UA0116 и 00BY10443 был проведен филогенетический анализ с референсными штаммами различных субтипов и ЦРФ ВГ' * '-------ох

AB из Калининграда. j_l q

Рис.3. Результаты филогенетического анализа полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ-1

кластером, включающим африканские штаммы ВИЧ-1 подсубтипа А1. Штамм 00ВУ10443 образует отдельный кластер вместе с двумя штаммами СРРОЗ-

Как видно из рис.3, штамм 0011А0116 образует отдельный кластер А-Яви вместе с единственным изолятом субтипа А из

стран бывшего СССР, для с которого просеквенирован

полный геном. Кластер А-FSU с бутстрэп-значением

98% группируется вместе с

Для установления точек рекомбинации между субтипами А и В в геноме штамма 00BY10443 были применены методы сканирующего анализа генетического расстояния и сканирующего бутстрэп-анализа. Нуклеотидная последовательность штамма 00BY10443 была выровнена с последовательностями трех референсных штаммов, представляющих субтипы А, В и С. Для перекрывающихся участков выровненных последовательностей длиной 500 п.н., сдвинутых относительно друг друга на 20 п.н., были вычислены генетические расстояния между одним из трех референсных изолятов ВИЧ-1 и штаммом 0OBY1O443, а также проведен филогенетический анализ с определением бутстрэп-значения, соответствующего кластеру, в который попадает штамм OOBY10443.

На графике, представленном на рис.4.А, каждому референсному изоляту ВИЧ-1 соответствует определенная кривая, изображающая степень его родства с анализируемым штаммом в различных участках генома. На протяжении генов gag и nef, в начале pol и конце env наблюдается сильное сходство нуклеотидных последовательностей штамма 00BY10443 и штамма субтипа А. В остальной части генома наиболее близким является штамм субтипа В. На рис.4.Б каждая кривая показывает филогенетическую достоверность того, что штамм 00BY10443 принадлежит к субтипу А, В или С, в зависимости от участка генома. Из этого рисунка видно, что в геноме анализируемого штамма ВИЧ-1 имеется четыре точки рекомбинации между субтипами А и В, разбивающие его на пять участков, показанных на рис.4.В.

с 96bw0502 в нхв2 a 97bl006

0 05 1015 2.0 25 30 35 4.0 4.5 50 50 60 65 70 75'80 85ТПН

—т

0 05 1015 2,0 25 30 35 40 4.5 50 50 60 65 70 75 80 85тпн

Рис.4. А и Б. Результаты сканирующего анализа генетического расстояния и сканирующего бутстрэп-анализа для рекомбинантного штамма 00ВУ10443. В. Схема рекомбинантной структуры генома штамма 00ВУ10443

На основании этих результатов можно заключить, что штамм 00BY10443 является типичным представителем CRF03-AB. Его LTR, гены gag, nef, протеаза, первые 62 аминокислоты обратной транскриптазы, последние 106 аминокислот интегразы, первые 27 аминокислот белка Vif и последние 48 аминокислот др41 относятся к субтипу А, а остальная часть генома - к субтипу В. Это полностью согласуются с результатами Лиитсола с соавт., которые впервые описали рекомбинантную структуру генома CRF03-AB на примере двух штаммов из Калининграда [15].

Следует отметить важную особенность варианта A-FSU. Соответствующий кластер филогенетического дерева обособлен от кластера, который образуют штаммы подсубтипа А1 африканского происхождения, и общий узел этих кластеров далеко отстоит от предкового узла подсубтипа А1. Такая же особенность характерна для кластеров, соответствующих подсубтипу А2 и ЦРФ CRF01-AE и CRF02-AG (см.рис.3). Эту особенность можно трактовать следующим образом: прародитель варианта A-FSU произошел не от одного из современных (изолированных в 1992-95 гг.) представителей подсубтипа А1 ВИЧ-1, а от их общего предка. На основании современной филогенетической классификации штаммов ВИЧ-1 обнаруженная особенность кластера A-FSU позволяет нам предположить, что это новый подсубтип субтипа А.

24,0 г? 22.°

е- 20,0

I 18,0 ° 16,0

§ 14,0

ш 12,0

I Ю,0 0)

| 8,0 | 6,0 £ 4,0 2,0 0,0

п = 64 24 578 16 40 64 24 578 24 16 64 24 578 24 24

Рис.5 Результаты сравнительного анализа распределения значений

генетического расстояния между штаммами ВИЧ-1 Приведены диаграммы диапазонов для значений генетического расстояния внутри субтипа (1), между разными подсубтипами (2), между разными субтипами (3), между подсубтипами А1 и А2 (4), между А-РЭи и подсубтипом А1 (5); п - число проанализированных пар штаммов ВИЧ-1

gag 1 pol !........ епу

с: -■мф ФсЬ 1 X 1 1 1 1 1 1 1 | 1 •в -в— -в -Б- с: ф ф + максимум 1 верхний квартиль Щ медиана нижний квартиль минимум

1 23451 23451 2345

А-Рви

Общепринятым методом для проверки гипотезы о принадлежности группы штаммов ВИЧ-1 к новому подсубтипу является сравнительный анализ распределения значений генетического расстояния. Результаты этого анализа, представленные на рис.5, говорят о том, что значения генетического расстояния между штаммами кластера А-РБи и штаммами подсубтипа А1 для всех трех проанализированных участков генома соответствуют значениям генетического расстояния между штаммами, относящимися к парам признанных подсубтипов (В, О), (Р1, ?2), и (А1, А2), и достоверно отличаются от значений генетического расстояния как между штаммами одного субтипа, так и между штаммами разных субтипов (р < 0.001 согласно ¿Лкритерию Манна-Уитни). Таким образом, вариант А-Яви можно считать подсубтипом субтипа А.

Для ответа на вопрос о происхождении подсубтипа А-Рви мы провели поиск родственных ему штаммов ВИЧ-1, обнаруженных в Африке. Таких штаммов было найдено всего два, хотя в базе данных "вепВапк" содержится более 4 тысяч нуклеотидных последовательностей штаммов ВИЧ-1 субтипа А из стран Африки. При филогенетическом анализе только эти два штамма, КРЕ326 и 01С0106, обнаруженные в результате независимых исследований в Демократической Республике Конго (ДРК, бывший Заир) [16,17], образовывали общий кластер с А-РБи, выделенный серым прямоугольником на рис.6.

Мы включили в филогенетический анализ также нуклеотидные последовательности 8 штаммов ВИЧ-1 93иА12-19, изолированных в 1993 году от пациентов из Одессы, заразившихся гетеросексуальным путем [18]. Эти штаммы попадают в кластер, объединяющий А-РЭи со штаммами из ДРК. Все они происходят от одного штамма, попавшего в Одессу в середине 1980-х годов. Один из этих штаммов (9311А13) наиболее близок к штаммам подсубтипа А-РБи, и потому он может рассматриваться как прародитель этого подсубтипа.

Рис.6. Филогенетическое дерево, построенное на основании участка гена env, демонстрирующее родство штаммов ВИЧ-1 подсубтипа А-Рви со штаммами, изолированными в 1993 году в Одессе, и штаммами из ДРК; приведена только часть филогенетического дерева, соответствующая субтипу А

96ЦА21 I 9611А27 _ 9611А26 иА1165 ГОЛ 175 А.иКК970063 9611А22 11А1127 9611А28 9виА25

- А 97В1.006

- 9виА24

- 0011А0116 961М20 930А13

V— 9виА23 гАЗиА18

93иА16 93иА10

9311А17 93иА12

СРР02-Ав

С другой стороны, его собственным прародителем, попавшим в Одессу в середине 1980-х годов, был редкий африканский штамм ВИЧ-1 субтипа А, достаточно сильно отличающийся от всех известных на сегодня подкластеров субтипа А: подсубтипов А1 и А2, а также родительских штаммов субтипа А для рекомбинантов СИР01-АЕ и СРР02-АС (см.рис.6). Этот же штамм мог быть и прародителем двух современных (изолированных в 1997 и 2000 годах) штаммов из ДРК, родственных штаммам подсубтипа А-РЭИ Тот факт, что таких штаммов нашлось только два, и оба они обнаружены в ДРК, указывает на то, что именно эта страна является родиной прародителя подсубтипа А-РЭи, который благодаря "эффекту основателя" в результате проникновения в благоприятную для широкого распространения среду инъекционных наркоманов в странах бывшего СССР дал начало новому подсубтипу субтипа А.

ВЫВОДЫ

^Проанализированные штаммы принадлежат к трем вариантам ВИЧ-1, соответствующим субтипу А, субтипу В и циркулирующей рекомбинантной форме между этими субтипами. Для всех обнаруженных вариантов ВИЧ-1 характерен низкий уровень генетического разнообразия.

2. Штаммы ВИЧ-1, для которых получены полноразмерные геномы, представляют доминирующие в странах бывшего СССР варианты ВИЧ-1, соответствующие субтипу А и ЦРФ СЯРОЗ-АВ.

3. Проклонированные полноразмерные геномы двух штаммов ВИЧ-1 содержат все открытые рамки считывания и могут быть использованы для экспрессии вирусных белков.

4. Штаммы ВИЧ-1 из стран бывшего СССР, относящиеся к доминирующему варианту субтипа А, образуют подсубтип А-Рви, возникший благодаря "эффекту основателя" в результате единичного проникновения редкого центральноафриканского штамма ВИЧ-1 в благоприятную для широкого распространения среду инъекционных наркоманов.

5. Штаммы подсубтипа А-РБи существенно отличаются по нуклеотидной последовательности генома от штаммов ВИЧ-1, распространенных за пределами стран бывшего СССР. Поэтому создание отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД на основе проклонированного в результате данной работы генома штамма ВИЧ-1 субтипа А представляется наиболее целесообразным.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи :

1. Набатов A.A., Машарский А.Э., Веревочкин C.B., Максименок E.H., Ченцова Н.П., Студзинский В.Р., Попова Л.Н., Глушкова Е.И., Козлов А.П. Изучение антигенного разнообразия ВИЧ-1 в различных регионах Украины: разные субтипы в разных городах // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. - 1998. - Т.2. -№1. -С.11-8.

2. Щелканов М.Ю., Ярославцева Н.Г., Набатов A.A., Машарский А.Э., Юдин А.Н., Мирсков Ю.А., Ченцова Н.П., Кобыща Ю.В., Козлов А.П., Карамов Э.В. Серотипическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов на юге/юго-востоке Украины // Вопросы вирусологии. -1998,- №4,-С.176-82.

3. Набатов A.A., Машарский А.Э., Веревочкин C.B., Емельянов A.B., Козлов А.П. Индивидуальность и консервативность гуморального иммунного ответа на основной нейтрализуемый домен ВИЧ-1 // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. -1998. - Т.2. - №3. - С.82-6.

4. Веревочкин C.B., Гагарина С.Ю., Набатов A.A., Машарский А.Э., Козлов А.П. Банк сывороток ВИЧ-инфицированных России и ближнего зарубежья: серологическое изучение развитие эпидемии // Аллергия, астма и клиническая имунология. - 1999. - №9. - С. 106-9.

5. Мурашев Б.В., Мурашева И.В., Романович А.Э., Машарский А.Э., Климов H.A., Козлов А.П. Создание и изучение иммунологических свойств ДНК-вакцины на основе гена env ВИЧ-1 // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. -2000. - Т.4. - N22. - С.29-36.

6. Туманова О.Ю, Кувшинов В.Н., Азаев М.Ш., Машарский А.Э., Климов H.A., Козлов А.П., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Получение пептидов-имитаторов эпитопа белка др41 вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2F5 // Молекулярная билогия. - 2001. - Т.35. - №1. - С.146-51.

7. Машарский А.Э., Еремин В.Ф., Климов H.A., Козлов А.П. Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности полноразмерного генома вариантов ВИЧ-1, доминирующих среди инъекционных наркоманов стран бывшего СССР // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. - 2002. -Т.6. - №1 - С.12-21.

8. Мурашев Б.В., Мурашева И.В., Духовлинов И.В., Духовлинова E.H., Машарский А.Э., Галачьянц Ю.П., Дорофеева Е.С., Климов H А., Козлов А.П. Разработка ДНК-вакцин против ВИЧ/СПИД на основе генов, кодирующих иммуногенные эпитопы вариантов ВИЧ // Аллергия, астма и клиническая иммунология - 2003. -Т.7. - №9. - С.126-33.

9. Masharsky А.Е., Klimov N.A., Kozlov А.Р. Molecular cloning and analysis of full-length genome of HIV type 1 strains prevalent in countries of the former Soviet Union // AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 2003. - V.19. - P.933-9.

10 Nabatov A.A., Masharsky A.E., Verevochkin S.V., Emelyanov A V., Kozlov A.P. Host-dependent serum specificity to the V3 domain of HIV-1 // Scand J Immunol. - 2004. -V.60. - P.471-6.

Тезисы докладов:

1 Nabatov А , Masharsky A., Verevochkin S , Maksimenok E , Tchentsova N , Kobyscha Yu , Kozlov A HIV-1 serotyping of Ukraine seropositive IVDUs using multiple antigen peptides: different HIV-1 subtypes in different cities // Abstracts 3rd European Conference on Expenmental AIDS Research, Munich, Germany, 1998.-#59.

2 Nabatov A A , Masharsky A.E., Verevochkin S V , Maksimenok E V , Tchentsova N.P , Kobyscha Yu.V , Kozlov A.P. HIV-1 sero- and genotyping of HIV/AIDS outbreak in Ukraine IVDUs population: different subtypes in different cities // Abstracts 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998. - P.127.

3. Машарский А.Э., Набатов A.A, Максименок E В., Кислых E H., Ченцова H П., Козлов А.П Генетические субтипы вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди ВИЧ-инфицированных наркоманов на Украине // Тезисы 7-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 1999. - C.76.

4 Машарский А.Э., Набатов А А, Веревочкин С В, Мурашев Б.В , Козлов А.П Клонирование фрагментов генома вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в странах бывшего СССР, для создания вакцины против ВИЧ // Тезисы 8-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 2000. - С 25.

5 Веревочкин С.В., Гагарина С.Ю., Машарский А.Э., Козлов А.П. Банк сывороток ВИЧ-инфицированных России и ближнего зарубежья' серологическое изучение развития эпидемии Н Тезисы 9-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 2001 -С 8

6 Машарский А.Э., Еремин В Ф , Климов Н А , Козлов А П. Клонирование и анализ полноразмерных геномов вариантов ВИЧ-1, вызвавших эпидемию ВИЧ-инфекции среди внутривенных наркоманов стран бывшего СССР // Тезисы 9-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 2001. - С 13

7 Masharsky А.Е., Eremin V F, Klimov N A., Kozlov A P Cloning and Analysis of Full-Length Genomes of HIV-1 Strains Prevalent among IDU in Countries of the FSU. Abstracts AIDS Vaccine 2001 Conference, Philadelphia, USA, 2001. - P. 111. - #260.

8 Веревочкин С В., Гагарина С Ю , Машарский А.Э., Козлов А П Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в России и других стран СНГ // Тезисы 10-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 2002 - С.58.

9. Машарский А.Э., Еремин В Ф , Климов Н А, Козлов А.П. Клонирование и анализ полноразмерных геномов штаммов ВИЧ-1 субтипа А и рекомбинантной формы CRF03-AB, превалирующих среди внутривенных наркоманов стран бывшего СССР // Тезисы 10-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 2002 -С 60-1.

10. Masharsky А.Е., Eremin V F , Kozlov A P Cloning and analysis of full-length genomes of HIV-1 strains of subtype A and CRF03-AB prevalent among intravenous drug users in countries of the former Soviet Union // Abstracts 14th international AIDS Conference, Barcelona, Spain, 2002. - P.365. - #TuPeA4409

11 Murashev В V , Masharsky A.E., Murasheva I V., Romanovich A. E., Dukhovlinov I V , Pavlova M.S , Dukhovlinova Y N , Dorofeyeva Y S , Galatchiants Y P , Klimov N. A , Kozlov A.P. Design, purification, and immunological testing of DNA vaccines against HIV-1 // Abstracts 10th Conferentce on Retroviruses and Opportunistic Infections, Boston, USA, 2003. - P.216. - #451.

12 Masharsky A.E., Klimov N A., Kozlov A P Full-length genome analysis reveals that HIV-1 subtype A strains from countries of the former Soviet Union represent a novel sub-subtype within subtype A // Abstracts 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, Paris, France, 2003. - P.S244. - #247.

13 Машарский А.Э., Еремин В.Ф., Климов НА., Козлов А.П. Генетические субтипы ВИЧ-1, циркулирующие в странах бывшего СССР, и их филогенетические отношения со штаммами ВИЧ-1 из других регионов мира // Тезисы 11-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 2003 - С.66-7.

14. Dukhovlinov I V , Murashev B.V , Murasheva I.V., Vorojtsova E V , Masharsky A.E., Klimov N.A., Kozlov A P. Design and Development of Candidate DNA Vaccines Based on HIV-1 Subtype A gag and nef Gene // Abstracts AIDS Vaccine 2003 Conference, New York, USA, 2003. - P 140. - #300

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Roberts J D The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1 / J D Roberts, К Bebenek, T A Kunkel II Science. - 1988. - V.242. - P. 1171-3.

2 Hu W.S. Retroviral recombination and reverse transcription /WS.Hu.HM Temin // Science. - 1990 -V.250.-P. 1227-33.

3 Ho D.D. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection / D D Ho, A U Neumann, A.S. Perelson et al. // Nature. -1995. - V.373. - P.123-6.

4 Najera I Natural occurrence of drug resistance mutations in the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 isolates /1 Najera, D D Richman, I. Olivares et al // AIDS Res. Hum Retroviruses. - 1994. - V.10. - P.1479-88.

5. Karlsson AC. Dual pressure from antiretroviral therapy and cell-mediated immune response on the human immunodeficiency virus type 1 protease gene IА С Karlsson, S G. Deeks, J D Barbour et al II J Virol. - 2003. - V.77. - P.6743-52.

6 Lawson V A Adaptive changes after human immunodeficiency virus type 1 transmission / V A Lawson, R. Oelrichs, С Gulllon et al. // AIDS Res Hum. Retroviruses. - 2002. - V.18. - P.545-56.

7. Gao F. Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes / F. Gao, E. Bailes, D.L. Robertson et al.//Nature -1999 -V397 -P.436-41.

8. Robertson D.L. HIV-1 nomenclature proposal / D L Robertson, J P Anderson, J A. Bradac et al // Science. - 2000. - V.288. - P.55-6.

9. HIV-1 Circulating Recombinant Forms. HIV Sequence Database / Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. httpY/www hiv lanl gov/content/hiv-db/CRFs/CRFs.html

10 Approaches to the development of broadly protective HIV vaccines: challenges posed by the genetic, biological and antigenic variability of HIV-1 / Report from a meeting of the WHO-UNAIDS Vaccine Advisory Committee Geneva, 21-23 February 2000 // AIDS. - 2001 - V 15 - P.W1-W25

11. Федеральный научно-методический центр no профилактике и борьбе со СПИДом http://www.hivrussla.org.

12 Набатов А А Изучение антигенного разнообразия ВИЧ-1 в различных регионах Украины разные субтипы в разных городах I А А Набатов, А Э Машарский, С В Веревочкин и др II Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы -1998.-Т 2. - №1 -С.11-8.

13. Веревочкин С В Банк сывороток ВИЧ-инфицированных России и ближнего зарубежья серологическое изучение развития эпидемии / С В Веревочкин, С Ю Гагарина, А А Набатов, А Э Машарский и др И Аллергия, астма и клиническая иммунология - 1999 - №9 - С 106-9

14. Bobkov A F Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A / A.F. Bobkov, E V. Kazennova, L M Selimovaetal IIJ Med Virol -2004 -V74 -P 191-6.

15. Llitsola K. An AB recombinant and Its parental HIV type 1 strains in the area of the former Soviet Union: low requirements for sequence identity in recombination. UNAIDS Virus Isolation Network / K. Liitsola, К Holm, A. Bobkov et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 2000. - V.16. - P.1047-53

16 Vidal N. Unprecedented degree of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) group M genetic diversity in the Democratic Republic of Congo suggests that the HIV-1 pandemic originated in Central Africa/N Vidal, M Peeters, С Mulanga-Kabeya et al //J Virol -2000 -V74 -P 10498-507

17 Kita K. Genetic diversity of HIV type 1 in Likasi, southeast of the Democratic Republic of Congo / К Kita, N. Ndembi, M. Ekwalanga et al. II AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 2004. - V.20. - P 1352-7.

18 Novitsky V.A. Molecular epidemiology of an HIV-1 subtype A subcluster among Injection drug users in the Southern Ukraine / V.A Novitsky, M A. Montano, M Essex // AIDS Res. Hum Retroviruses -1998 - V.14. - P.1079-85.

* П 2 4 2

РЫБ Русский фонд

2006-4 6348

Отпечатано в РИЦ ГОУ «СПбГДТЮ» Санкт-Петербург, Невский пр., 39. Подписано в печать (А Формат бумаги 60x84/16

Объем 1 у п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 166.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Машарский, Алексей Эльвинович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика эпидемии ВИЧ/СПИД в мире.

1.2. Структура генома ВИЧ-1 и вирусные белки.

1.3. Генетическое разнообразие ВИЧ-1.

1.3.1. Мутационная изменчивость генома ВИЧ-1.

1.3.2. Рекомбинационная изменчивость генома ВИЧ-1.

Ч 1.4. Филогенетическая классификация штаммов ВИЧ-1.

1.4.1. История развития филогенетической классификации ВИЧ-1.

1.4.2. Современная филогенетическая классификация ВИЧ-1.

1.5. Методы определения генетического разнообразия и субтипов ВИЧ-1.

1.5.1. Секвенирование амплифицированных фрагментов генома ВИЧ-1, полученных методом полимеразной цепной реакции.

1.5.2. Секвенирование полноразмерных геномов ВИЧ-1.

1.6. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1.

1.6.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в мире.

1.6.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в странах бывшего СССР.

1.7. Фенотипические свойства штаммов ВИЧ-1.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ty 2.1. Образцы крови.

2.2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови.

2.3. Методы очистки ДНК.

2.3.1. Выделение ДНК из мононуклеарных клеток периферической крови.

2.3.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

2.3.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.4. Стратегия аплифицирования фрагментов генома ВИЧ-1 из ДНК ВИЧ-инфицированных пациентов.

2.5. Реакции ферментативной модификации ДНК.

2.5.1. Полимеразная цепная реакция.

2.5.2. Реакция лигирования фрагментов ДНК.

2.5.3. Реакция рестрикции плазмидной ДНК.

2.5.4. Реакция ферментативного секвенирования ДНК.

2.6. Методы электрофореза ДНК.

2.6.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.6.2. Препаративный электрофорез ДНК в легкоплавкой агарозе.

2.6.3. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле.

2.7. Микробиологические методы.

2.7.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli для трансформации.

2.7.2. Трансформация клеток Е. coli.

2.8. Компьютерные методы анализа данных.

2.8.1. Первичный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.!

2.8.2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1.

2.8.3. Анализ функциональных элементов в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях ВИЧ-1.

2.8.4. Статистический анализ полученных результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Изучение генетического разнообразия ВИЧ-1.

3.1.1. Результаты амплифицирования участков генов env и gag ВИЧ-1.

3.1.2. Результаты секвенирования участков генов env и gag ВИЧ-1.

3.1.3. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участков генов env и gag ВИЧ-1.

3.1.4. Результаты анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых участками генов env и gag ВИЧ-1.

3.1.5. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участков генов env и gag ВИЧ-1.

3.2. Клонирование и секвенирование полноразмерного генома штаммов ВИЧ-1.

3.2.1. Результаты амплифицирования, клонирования и секвенирования фрагментов ДНК, содержащих в совокупности полный геном ВИЧ-1.

3.2.2. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей молекулярных клонов фрагментов генома ВИЧ-1.

3.2.3. Реконструкция полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома штаммов ВИЧ-1.

3.3. Анализ полноразмерного генома ВИЧ-1.

3.3.1. Результаты анализа функциональных элементов генома ВИЧ-1.

3.3.2. Результаты филогенетического анализа полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ-1.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Генетическое разнообразие ВИЧ-1 в странах бывшего СССР.

4.2. Клонирование и секвенирование полноразмерного генома вариантов

ВИЧ-1, доминирующих в странах бывшего СССР.

4.3. Филогенетический анализ доминирующих в странах бывшего СССР вариантов ВИЧ-1.

4.4. Характерные особенности вариантов ВИЧ-1, доминирующих в странах бывшего СССР.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетического разнообразия и анализ генома ВИЧ-1 в странах бывшего СССР"

Высокий уровень генетического разнообразия вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) является одним из основных препятствий в борьбе с эпидемией ВИЧ/СПИД. Данное свойство ВИЧ-1, типичное для всех ретровирусов, является результатом эволюции вирусного генома, обусловленной высокими частотами мутаций и рекомбинаций, высокой скоростью размножения и большим размером вирусной популяции в инфицированном организме [163,169,312]. Благодаря накоплению большого числа спонтанных мутаций в геноме ВИЧ-1, в организме зараженного человека присутствуют штаммы, потенциально устойчивые к действию иммунной системы и лекарственных препаратов [192,273]. При передаче вируса от одного человека к другому за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции [219].

Основным методом изучения генетического разнообразия ВИЧ-1 является определение нуклеотидной последовательности вирусного генома или его отдельных участков. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей штаммов ВИЧ-1 из различных географических регионов было установлено, что они образуют три группы: М, N и О, которые соответствуют трем независимым случаям переноса вируса иммунодефицита обезьян от шимпанзе к человеку [129]. Вирусы группы М, в которую входит подавляющее большинство обнаруженных штаммов ВИЧ-1, в свою очередь могут быть разделены на подгруппы, названные "субтипами", которых на сегодняшний день обнаружено 9 [315]. Субтипы группы М ВИЧ-1 соответствуют равноудаленным друг от друга кластерам филогенетического дерева. Генетическое расстояние между нуклеотидными последовательностями наиболее вариабельного вирусного гена env разных субтипов ВИЧ-1 составляет от 15 до 25%. Геном некоторых штаммов ВИЧ-1 является результатом рекомбинации геномов разных субтипов. Такие "межсубтипические рекомбинанты" возникают при репликации генома ВИЧ-1 в организме человека, одновременно зараженного вирусами разных субтипов. Рекомбинанты, которые получили широкое распространение, называют "циркулирующими рекомбинантными формами" (ЦРФ) ВИЧ-1, которых в настоящее время идентифицировано 16 [161]. Существование отличающихся вариантов ВИЧ-1 (субтипов и ЦРФ) позволяет отслеживать их происхождение и последующее распространение в различных географических регионах и группах риска. Кроме того, создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены [36].

В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции, поскольку в этом регионе крупномасштабная эпидемия началась только в середине 90-х годов. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В августе 2004 года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 291512 - по сравнению с 10993 на конец 1998 года [21]. В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Первым шагом в этом направлении должна быть молекулярно-генетическая характеристика циркулирующих в регионе вирусных штаммов, подразумевающая изучение их генетического разнообразия и определение доминирующих вариантов ВИЧ-1. Вторым этапом является клонирование и секвенирование полноразмерных геномов доминирующих в регионе вариантов ВИЧ-1.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования была молекулярно-генетическая характеристика штаммов ВИЧ-1, вызвавших эпидемию в странах бывшего СССР, и анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов доминирующих вариантов ВИЧ-1 для разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.

Задачи исследования:

1. Определить нуклеотидные последовательности участков генов env и gag штаммов ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ.

2. Проклонировать полноразмерные геномы вирусных штаммов, представляющих доминирующие в регионе варианты ВИЧ-1.

3. Определить полные нуклеотидные последовательности проклонированных геномов ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ.

4. Проанализировать аминокислотные последовательности белков полученных штаммов ВИЧ-1 с целью предсказания их биологических и иммунологических свойств.

Научная новизна работы

Впервые секвенированием участков генов env и gag ВИЧ-1 установлено, что в различных регионах Украины среди ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков доминируют штаммы ВИЧ-1 различных субтипов: штаммы субтипа В в Николаеве и штаммы субтипа А на остальной территории Украины. Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей рекомбинантной форме CRF03-AB, в Республике Беларусь. Впервые проклонированы и просеквенированы полноразмерные геномы штамма ВИЧ-1, относящегося к циркулирующей рекомбинантной форме CRF03-AB, изолированного в Республике Беларусь, и штамма ВИЧ-1 субтипа А, изолированного на Украине. Впервые показано особое положение штаммов субтипа А из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1, позволяющее выделить их в новый подсубтип внутри субтипа А.

Научно-практическая значимость работы

В рамках данной работы получены клонированные полноразмерные геномы двух вирусных изолятов, представляющих доминирующие в странах бывшего СССР варианты ВИЧ-1. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности. Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.

Форма выполнения диссертационной работы

Работа выполнялась в рамках финансирования АНО "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов" по проектам Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего" и Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", а также по грантам Международного центра Фогарти (FIC, AITRP, 5-D43-TW01028-04) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, BRHE, ST-012-0).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 7-й-П-й Международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, Россия, 1999-2003; 3-ей Европейской конференции по экспериментальным исследованиям СПИДа, Мюнхен, Германия, 1998; 12-й и 14-й Всемирных конференциях по СПИДу, Женева, Швейцария, 1998 и Барселона, Испания, 2002; конференциях "Вакцина против СПИДа", Филадельфия, США, 2001 и Нью-Йорк, США, 2003; 10-й конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Бостон, США, 2003; 2-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Париж, Франция, 2003. По теме диссертации опубликовано 10 статей и 14 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, 31 таблицей и 4 приложениями. Список литературы содержит 411 литературных источников.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Машарский, Алексей Эльвинович

выводы

1. Проанализированные штаммы принадлежат к трем вариантам ВИЧ-1, соответствующим субтипу А, субтипу В и циркулирующей рекомбинантной форме между этими субтипами. Для всех обнаруженных вариантов ВИЧ-1 характерен низкий уровень генетического разнообразия.

2. Штаммы ВИЧ-1, для которых получены полноразмерные геномы, представляют доминирующие в странах бывшего СССР варианты ВИЧ-1, соответствующие субтипу А и циркулирующей рекомбинантной форме CRF03-AB.

3. Проклонированные полноразмерные геномы двух штаммов ВИЧ-1 содержат все открытые рамки считывания и могут быть использованы для экспрессии вирусных белков.

4. Штаммы ВИЧ-1 из стран бывшего СССР, относящиеся к доминирующему варианту субтипа А, образуют подсубтип A-FSU, возникший благодаря "эффекту основателя" в результате единичного проникновения редкого центральноафриканского штамма ВИЧ-1 в благоприятную для широкого распространения среду инъекционных наркоманов.

5. Штаммы подсубтипа A-FSU существенно отличаются по нуклеотидной последовательности генрма от штаммов ВИЧ-1, распространенных за пределами стран бывшего СССР. Поэтому создание отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД на основе проклонированного в результате данной работы генома штамма ВИЧ-1 субтипа А представляется наиболее целесообразным.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Машарский, Алексей Эльвинович, Санкт-Петербург

1. Бобков А.Ф. Генетическая характеристика вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа, вызвавших эпидемию среди наркоманов в странах СНГ / А.Ф. Бобков, В.В. Покровский, JI.M. Селимова и др. // Вопросы вирусологии. 1998. -Т.43. - С.253-6.

2. Бобков А.Ф. Субтипы ВИЧ-1 в России в 1987-1998 гг. / А.Ф. Бобков, Е.В. Казеннова, JI.M. Селимова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1999. -№1. С.43-5.

3. Бобков А.Ф. Эпидемиологическая и генетическая характеристика первых 40 случаев ВИЧ-инфекции на территории Пермской области / А.Ф. Бобков, С.Я. Зверев, М.Р. Бобкова и др. // Вопросы вирусологии. 2000. - Т.45. - С.18-21.

4. Бобкова М.Р. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика основных очагов эпидемии ВИЧ-инфекции среди наркоманов в России / М.Р. Бобкова, А.Ф. Бобков, Е.В. Буравцова и др. // Вопросы вирусологии. 1999. - Т.44. - С.220-4.

5. Гашникова Н.М. Молекулярно-эпидемиологический анализ распространения ВИЧ-инфекции в Новосибирской области / Н.М. Гашникова, Е.Ф. Бочаров, П.А. Гладкий и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2004. - №3. - С.30-4.

6. Казеннова Е.В. Анализ субтипов гена gag вариантов ВИЧ-1, выделенных в России, методом сравнительной оценки электрофоретической подвижности гетеродуплексов / Е.В. Казеннова, А.Ф. Бобков, JI.M. Селимова и др. // Вопросы вирусологии. 2001. -Т.46. -С.12-6.

7. Козлов А.П. Выявление первых случаев инфицирования вирусом иммунодефицита человека в Ленинграде / А.В. Емельянов, А.Г. Малых, В.В. Касаткин и др. // Иммунология. 1990. - №5. - С.9-11.

8. Козлов А.П. Закономерности ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД / А.П. Козлов, А.В. Емельянов, С.В. Веревочкин, Э.В. Карамов // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 1997. - Т.1. - №1. - С.5-28.

9. Машарский А.Э. Генетические субтипы вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди

10. Набатов А.А. Изучение антигенного разнообразия ВИЧ-1 в различных регионах Украины: разные субтипы в разных городах. / А.А. Набатов, А.Э. Машарский, С.В. Веревочкин и др. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 1998. -Т.2.-№1.-С.11-8.

11. Онищенко Г.Г. ВИЧ-инфекция, развитие эпидемии в Российской Федерации / Г.Г. Онищенко, М.И. Наркевич, А.Т. Голиусов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1997. - №6. - С.47-50.

12. Покровский В.В. Эпидемиологическое исследование первого случая СПИДа, обнаруженного у гражданина СССР / В.В. Покровский, З.К. Янкина, В.И. Покровский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1987. - №12. - С.8-11.

13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. М.: МедиаСфера, 2002.

14. Федеральный научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом. http://www.hivrussia.org.

15. Чемерис А.В. Секвенирование ДНК / А.В. Чемерис, Э.Д. Ахунов, В.А. Вахитов. М.: Наука, 1999.

16. Щелканов М.Ю. Анализ серологических свойств ВИЧ-1 из очага эпидемии в Гомельской области Белоруссии (1996 г.) / М.Ю. Щелканов, Н.Г. Ярославцева, А.Н. Юдин и др. // Вопросы вирусологии. 1998. - Т.43. - С.220-9.

17. Щелканов М.Ю. Серотипическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов на юге/юге-востоке Украины / М.Ю. Щелканов, Н.Г. Ярославцева, А.А. Набатов, А.Э. Машарский и др. // Вопросы вирусологии. 1998. - Т.43. - С. 176-82.

18. Abebe A. HIV-l subtype С syncytium- and non-syncytium-inducing phenotypes and coreceptor usage among Ethiopian patients with AIDS / A. Abebe, D. Demissie, J. Goudsmit et al. // AIDS. 1999. - V.13. - P.1305-11.

19. Abebe A. Identification of a genetic subcluster of HIV type 1 subtype С (С') widespread in Ethiopia / A. Abebe, G. Pollakis, A.L. Fontanet et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses.2000.-V. 16.-P. 1909-14.

20. Adachi A. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone / A. Adachi, H.E. Gendelman, S. Koenig et al. // J. Virol. 1986. - V.59. - P.284-91.

21. Agwale S.M. Development of an env gp41-based heteroduplex mobility assay for rapid human immunodeficiency virus type 1 subtyping / S.M. Agwale, K.E. Robbins, L. Odama et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - V.39. - P.2110-4.

22. Alaeus A. Most HIV-l genetic subtypes have entered Sweden / A. Alaeus, T. Leitner, K. Lidman et al. //AIDS. 1997. - V.ll. - P. 199-202.

23. Alaeus A. Similar rate of disease progression among individuals infected with HIV-l genetic subtypes A-D / A. Alaeus, K. Lidman, A. Bjorkman et al. // AIDS. 1999. - V.13. -P.901-7.

24. Albert J. Simple, sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers / J. Albert, E.M. Fenyo // J. Clin. Microbiol. 1990. - V.28. - P.1560-4.

25. Alizon M. Genetic variability of the AIDS virus: nucleotide sequence analysis of two isolates from African patients / M. Alizon, S. Wain-Hobson, L. Montagnier et al. // Cell. -1986. V.46. - P.63-74.

26. Anderson J.A. Correlated template-switching events during minus-strand DNA synthesis: a mechanism for high negative interference during retroviral recombination / J.A. Anderson, R.J. Teufel, P.D. Yin et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.l 186-94.

27. Ayouba A. HIV-l group N among HIV-l-seropositive individuals in Cameroon / A. Ayouba, S. Souquieres, B. Njinku et al. // AIDS. 2000. - V.14. - P.2623-5.

28. Ayouba A. HIV-l group О infection in Cameroon, 1986 to 1998 / A. Ayouba, P. Mauclere, P.M. Martin et al. // Emerg. Infect. Dis. 2001. - V.7. - P.466-7.

29. Balode D. Rapid epidemic spread of HIV type 1 subtype Al among intravenous drug users in Latvia and slower spread of subtype В among other risk groups / D. Balode, A. Ferdats, I. Dievberna et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. - V.20. - P.245-9.

30. Bandres J.C. Human immunodeficiency virus (HTV) envelope binds to CXCR4 independently of CD4, and binding can be enhanced by interaction with soluble CD4 or by

31. V" HIV envelope deglycosylation / J.C. Bandres, Q.F. Wang, J. O'Leary et al. // J. Virol.1998. — V.72. P.2500-4.

32. Barabitskaya O. Molecular epidemiology of HIV-l in St. Petersburg, Russia / O. Barabitskaya, A. Malykh, A. Emeljanov et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1995. -V.ll Suppl 1. -P.S145.

33. Barnes W.M. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates / W.M. Barnes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. -V.91.-P.2216-20.

34. Sharp, V.M. Hirsch // Human Retroviruses and AIDS 1999. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1999. - P.460-74.

35. Bell B. Ras-responsiveness of the HIV-l LTR requires RBF-1 and RBF-2 binding sites / B. Bell, I. Sadowski // Oncogene. 1996. - V.13. - P.2687-97.

36. Berger E.A. A new classification for HIV-l / E.A. Berger, R.W. Doms, E.M. Fenyo et al. // Nature. 1998. - V.391. - P.240.

37. Bobkov A. Identification of an env G subtype and heterogeneity of HIV-l strains in the Russian Federation and Belarus / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, M. Garaev et al. // AIDS. 1994. - V.8. - P. 1649-55.

38. Bobkov A. Genetic heterogeneity of HIV type 1 in Russia: identification of H variants and relationship with epidemiological data / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, L. Selimova et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - V.12. - P. 1687-90.

39. Bobkov A. HIV type 1 subtype E in Russia / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, L.

40. Selimova et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1997. - V. 13. - P.725-7.

41. Bobkov A. An HIV type 1 epidemic among injecting drug users in the former Soviet Union caused by a homogeneous subtype A strain / A. Bobkov, R. Cheingsong-Popov, L. Selimova et al. //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1997. - V.13. -P.l 195-201.

42. J. Goudsmit et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. - V.16. - P.291-4.

43. A.F. Bobkov, E.V. Kazennova, L.M. Selimova et al. // J. Med. Virol. 2004. - V.74. - P. 191-6.

44. Bodelle P. Identification and genomic sequence of an HIV type 1 group N isolate from Cameroon / P. Bodelle, A. Vallari, R. Coffey et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. - V.20. - P.902-8.

45. Bouhamdan M. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr protein binds to the uracil DNA glycosylase DNA repair enzyme / M. Bouhamdan, S. Benichou, F. Rey et al. // J. Virol. -1996. V.70. - P.697-704.

46. Boyd M.T. A single amino acid substitution in the VI loop of human immunodeficiency -4 virus type 1 gpl20 alters cellular tropism / M.T. Boyd, G.R. Simpson, A.J. Cann et al. // J.

47. Virol. 1993. - V.67. - P.3649-52.

48. Boyer J.C. Unequal human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase error rates with RNA and DNA templates / J.C. Boyer, K. Bebenek, T.A. Kunkel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992. - V.89. - P.6919-23.

49. Boyum A. Separation of white blood cells / A. Boyum // Nature. 1964. - V.204. - P.793-4.

50. Bracho M.A. Contribution of Taq polymerase-induced errors to the estimation of RNA virus diversity / M.A. Bracho, A. Moya, E. Barrio // J. Gen. Virol. 1998. - V.79. - P.2921-8.

51. Briggs D.R. Envelope V3 amino acid sequence predicts HIV-l phenotype (co-receptor usage and tropism for macrophages) / D.R. Briggs, D.L. Tuttle, J.W. Sleasman et al. // AIDS. 2000. - V. 14. - P.2937-9.

52. Bures R. Regional clustering of shared neutralization determinants on primary isolates of clade С human immunodeficiency virus type 1 from South Africa / R. Bures, L. Morris, C. Williamson et al. // J. Virol. 2002. - V.76. - P.2233-44.

53. Cao H. Cytotoxic T-lymphocyte cross-reactivity among different human immunodeficiency virus type 1 clades: implications for vaccine development / H. Cao, P. Kanki, J.L. Sankale et al. // J. Virol. 1997. - V.71. - P.8615-23.

54. Cao H. Cellular immunity to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-l) clades: relevance to HIV-l vaccine trials in Uganda / H. Cao, I. Mani, R. Vincent et al. // J. Infect. Dis. 2000. - V.182. - P. 1350-6.

55. J 70. Carr J.K. Full-length sequence and mosaic structure of a human immunodeficiency virus1 type 1 isolate from Thailand / J.K. Carr, M.O. Salminen, C. Koch et al. // J. Virol. 1996. 1. V.70. P.5935-43.

56. Carr J.K. Diverse BF recombinants have spread widely since the introduction of HIV-l into South America / J.K. Carr, M. Avila, C.M. Gomez et al. // AIDS. 2001. - V.15. - P.F41-F47.

57. Carrillo A. Human immunodeficiency virus type 1 tropism for T-lymphoid cell lines: role of -4. the V3 loop and C4 envelope determinants / A. Carrillo, L. Ratner // J. Virol. 1996.1. V.70. -Р.1301-9.

58. Cassan М. Translational frameshifting at the gag-pol junction of human immunodeficiency virus type 1 is not increased in infected T-lymphoid cells / M. Cassan, N. Delaunay, C. Vaquero et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.1501-8.

59. Casseb J. Serotyping HIV-l with V3 peptides: detection of high avidity antibodies presenting clade-specific reactivity / J. Casseb, D. Katzenstein, M. Winters et al. // Braz. J. Med. Biol. Res. 2002. - V.35. - P.369-75.

60. Center R.J. Oligomeric structure of the human immunodeficiency virus type 1 envelope protein on the virion surface / RJ. Center, R.D. Leapman, J. Lebowitz et al. // J. Virol. -2002. V.76. - P.7863-7.

61. Chaix M.L. Stable prevalence of genotypic drug resistance mutations but increase in non-B virus among patients with primary HIV-l infection in France / M.L. Chaix, D. Descamps, M. Harzic et al. // AIDS. 2003. - V.17. - P.2635-43.

62. Charneau P. Isolation and envelope sequence of a highly divergent HIV-l isolate: definition of a new HIV-l group / P. Charneau, A.M. Borman, C. Quillent et al. // Virology. 1994. -V.205. -P.247-53.

63. Chen R. Roles of uracil-DNA glycosylase and dUTPase in virus replication / R. Chen, H. Wang, L.M. Mansky // J. Gen. Virol. 2002. - V.83. - P.2339-45.

64. Choi D.J. HIV type 1 isolate Z321, the strain used to make a therapeutic HTV type 1 immunogen, is intersubtype recombinant / D.J. Choi, S. Dube, T.P. Spicer et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1997. - V.13. - P.357-61.

65. Cichutek K. Development of a quasispecies of human immunodeficiency virus type 1 in vivo / K. Cichutek, H. Merget, S. Norley et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1992. V.89. - P.7365-9.

66. Cline J. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases / J. Cline, J.C. Braman, H.H. Hogrefe // Nucleic Acids Res. 1996. - V.24. - P.3546-51.

67. Coffin J.M. Structure, replication, and recombination of retrovirus genomes: some unifying hypotheses / J.M. Coffin // J. Gen. Virol. 1979. - V.42. - P. 1-26.

68. Coffin J.M. Genetic variation in AIDS viruses / J.M. Coffin // Cell. 1986. - V.46. - P. 1-4.

69. Coffin J.M. HTV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy / J.M. Coffin // Science. 1995. - V.267. - P.483-9.

70. Collman R. An infectious molecular clone of an unusual macrophage-tropic and highly cytopathic strain of human immunodeficiency virus type 1 / R. Collman, J.W. Balliet, S.A. Gregory et al. // J. Virol. 1992. - V.66. - P.7517-21.

71. Connor R.I. Change in coreceptor use coreceptor use correlates with disease progression in

72. HIV-1— infected individuals / R.I. Connor, K.E. Sheridan, D. Ceradini et al. // J. Exp. Med.- 1997. V.185. -P.621-8.

73. Delwart E.L. Human immunodeficiency virus type 1 evolution in vivo tracked by DNA heteroduplex mobility assays / E.L. Delwart, H.W. Sheppard, B.D. Walker et al. // J. Virol.1994. V.68. -P.6672-83.

74. Demirov D.G. The late domain of human immunodeficiency virus type 1 p6 promotes virus release in a cell type-dependent manner / D.G. Demirov, J.M. Orenstein, E.O. Freed // J. Virol. 2002. - V.76. - P.105-17.

75. Deng H. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-l / H. Deng, R. Liu, W. Ellmeier et al. // Nature. 1996. - V.381. - P.661-6.

76. Descamps D. HIV-l group О sensitivity to antiretroviral drugs / D. Descamps, G. Collin, I. Loussert-Ajaka et al. // AIDS. 1995. - V.9. - P.977-8.

77. Dittmar M.T. Langerhans cell tropism of human immunodeficiency virus type 1 subtype A through F isolates derived from different transmission groups / M.T. Dittmar, G. Simmons, S. Hibbitts et al. // J. Virol. 1997. - V.71. - P.8008-13.

78. D'Souza M.P. Chemokines and HIV-l second receptors. Confluence of two fields generates optimism in AIDS research / M.P. D'Souza, V.A. Harden // Nat. Med. 1996. - V.2. -P. 1293-300.

79. Dumitrescu O. Characterization of human immunodeficiency virus type 1 isolates from children in Romania: identification of a new envelope subtype / O. Dumitrescu, M.L. Kalish, S.C. Kliks et al. // J. Infect. Dis. 1994. - V.169. - P.281-8.

80. Durali D. Cross-reactions between the cytotoxic T-lymphocyte responses of human immunodeficiency virus-infected African and European patients / D. Durali, J. Morvan, F. Letourneur et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P.3547-53.

81. Eckert D.M. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition / D.M. Eckert, P.S. Kim // Annu. Rev. Biochem. 2001. - V.70. - P.777-810.

82. Eckert K.A. High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase / K.A. Eckert, T.A. Kunkel // Nucleic Acids Res. 1990. - V.18. - P.3739-44.

83. Eigen M. On the nature of virus quasispecies / M. Eigen // Trends Microbiol. 1996. - V.4. -P.216-8.

84. Engelke D.R. Direct sequencing of enzymatically amplified human genomic DNA / D.R.

85. Engelke, P.A. Hoener, F.S. Collins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. - V.85. - P.544-8.

86. Erickson J.W. Protease inhibitors: resistance, cross-resistance, fitness and the choice of initial and salvage therapies / J.W. Erickson, S.V. Gulnik, M. Markowitz // AIDS. 1999. -V.13 Suppl A. -P.S189-S204.

87. Estable M.C. Purification of RBF-2, a transcription factor with specificity for the most conserved cis-element of naturally occurring HIV-1 LTRs / M.C. Estable, M. Hirst, B. Bell et al. // J. Biomed. Sci. 1999. - V.6. - P.320-32.

88. Esteves A. Spreading of HIV-l subtype G and envB/gagG recombinant strains among injecting drug users in Lisbon, Portugal / A. Esteves, R. Parreira, J. Piedade et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. - P.511-7.

89. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap / J. Felsenstein // Evolution. 1985. - V.39. - P.783-91.

90. Felsenstein J. Phylogenies from molecular sequences: inference and reliability / J. Felsenstein // Annu. Rev. Genet. 1988. - V.22. - P.521-65.

91. Felsenstein J. PHYLIP Phylogeny Inference Package (Version 3.2) / J. Felsenstein // Cladistics. - 1989. - V.5. - P.164-6.

92. Feng Y. HIV-l entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor / Y. Feng, C.C. Broder, P.E. Kennedy et al. // Science. 1996. -V.272. - P.872-7.

93. Fenyo E.M. Distinct replicative and cytopathic characteristics of human immunodeficiency virus isolates / E.M. Fenyo, L. Morfeldt-Manson, F. Chiodi et al. // J. Virol. -1988. V.62. - P.4414-9.

94. Ferdats A. An HTV type 1 subtype A outbreak among injecting drug users in Latvia / A. Ferdats, V. Konicheva, I. Dievbema et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. - V.15. - P.1487-90.

95. Ferrari G. Clade B-based HIV-l vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers / G. Ferrari, W. Humphrey, M.J. McElrath et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. - V.94. - P. 1396-401.

96. Fitzgibbon J.E. A new type of G~>A hypermutation affecting human immunodeficiency virus / J.E. Fitzgibbon, S. Mazar, D.T. Dubin // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1993. -V.9. - P.833-8.

97. Fouchier R.A. Phenotype-associated sequence variation in the third variable domain of the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 molecule / R.A. Fouchier, M. Groenink, N.A. Kootstra et al. // J. Virol. 1992. - V.66. - P.3183-7.

98. Frankel A.D. HIV-l: fifteen proteins and an RNA / A.D. Frankel, J.A. Young // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V.67. - P. 1-25.

99. Fujita K. Rapid degradation of CD4 in cells expressing human immunodeficiency virus type

100. Env and Vpu is blocked by proteasome inhibitors / K. Fujita, S. Omura, J. Silver // J. Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.619-25.

101. Gallay P. HIV-l infection of nondividing cells through the recognition of integrase by the importin/karyopherin pathway / P. Gallay, T. Hope, D. Chin et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. - V.94. - P.9825-30.

102. Gao F. The heterosexual human immunodeficiency virus type 1 epidemic in Thailand is caused by an intersubtype (A/E) recombinant of African origin / F. Gao, D.L. Robertson, S.G. Morrison et al. // J. Virol. 1996. - V.70. - P.7013-29.

103. Gao F. A comprehensive panel of near-full-length clones and reference sequences for non-subtype В isolates of human immunodeficiency virus type 1 / F. Gao, D.L. Robertson, C.D. Carruthers et al. //J. Virol. 1998. - V.72. - P.5680-98.

104. Gao F. Origin of HIV-l in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes / F. Gao, E. Bailes, D.L. Robertson et al. // Nature. 1999. - V.397. - P.436-41.

105. Gao F. Evidence of two distinct subsubtypes within the HIV-l subtype A radiation / F. Gao, N. Vidal, Y. Li et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001. - V.17. - P.675-88.

106. Gao F. Unselected mutations in the human immunodeficiency virus type 1 genome are mostly nonsynonymous and often deleterious / F. Gao, Y. Chen, D.N. Levy et al. // J. Virol.- 2004. V.78. - P.2426-33.

107. Garcia-Albert L. HIV type 1 non-B subtype prevalence in Spain, 1997-1998 / L. Garcia-Albert, M. Ortiz, A. Garcia-Saiz // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001. - V.17. - P. 1317-20.

108. Glickman B.W. International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. Working paper no. 2. Spontaneous mutations in mammalian cells / B.W. Glickman, V.A. Saddi, J. Curry // Mutat. Res. 1994. - V.304. - P. 19-32.

109. Goodenow M. HIV-l isolates are rapidly evolving quasispecies: evidence for viral mixtures and preferred nucleotide substitutions / M. Goodenow, T. Huet, W. Saurin et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1989. - V.2. - P.344-52.

110. Gottlieb G.S. Molecular epidemiology of dual HIV-l/HIV-2 seropositive adults from Senegal, West Africa / G.S. Gottlieb, P.S. Sow, S.E. Hawes et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. - P.575-84.

111. Gottlinger H.G. HIV-l Gag: a Molecular Machine Driving Viral Particle Assembly and Release / H.G. Gottlinger // HIV Sequence Compendium 2001. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2001. - P.2-28.

112. Gratton S. Highly restricted spread of HIV-l and multiply infected cells within splenic germinal centers / S. Gratton, R. Cheynier, M.J. Dumaurier et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. - V.97. - P. 14566-71.

113. Greenway A. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein inhibits activation pathways in peripheral blood mononuclear cells and T-cell lines / A. Greenway, A. Azad, D. McPhee // J. Virol. 1995. - V.69. - P.1842-50.

114. Guo X. Suppression of an intrinsic strand transfer activity of HTV-1 Tat protein by its second-exon sequences / X. Guo, M. Kameoka, X. Wei et al. // Virology. 2003. - V.307. - P.154-63.

115. Gurtler L.G. A new subtype of human immunodeficiency virus type 1 (MVP-5180) from Cameroon / L.G. Gurtler, P.H. Hauser, J. Eberle et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P. 1581-5.

116. Hahn B.H. Molecular cloning and characterization of the HTLV-Ш virus associated with AIDS / B.H. Hahn, G.M. Shaw, S.K. Arya et al. // Nature. 1984. - V.312. - P. 166-9.

117. Hahn B.H. Genetic variation in HTLV-ID/LAV over time in patients with AIDS or at risk for AIDS / B.H. Hahn, G.M. Shaw, M.E. Taylor et al. // Science. 1986. - V.232. - P.1548-53.

118. Hahn B.H. AIDS as a zoonosis: scientific and public health implications / B.H. Hahn, G.M. Shaw, K.M. De Cock et al. // Science. 2000. - V.287. - P.607-14.

119. Hajjar A.M. Modification of retroviral RNA by double-stranded RNA adenosine deaminase / A.M. Hajjar, M.L. Linial // J. Virol. 1995. - V.69. - P.5878-82.

120. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT / T.A. Hall // Nucl. Acids. Symp. Ser. 1999. - V.41. - P.95-8.

121. Hamano T. Determination of HIV type 1 CRF01AE gag pl7 and env-V3 consensus sequences for HIV/AIDS vaccine design / T. Hamano, P. Sawanpanyalert, H. Yanai et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. - V.20. - P.337-40.

122. Hanke T. Design and construction of an experimental HTV-1 vaccine for a year-2000 clinical trial in Kenya / T. Hanke, A.J. McMichael // Nat. Med. 2000. - V.6. - P.951-5.

123. Harris R.S. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection / R.S. Harris, K.N. Bishop, A.M. Sheehy et al. // Cell. 2003. - V.113. - P.803-9.

124. He J. Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R (Vpr) arrests cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2 activity / J. He, S. Choe, R. Walker et al. // J. Virol. 1995. - V.69. -P.6705-11.

125. Heinemeyer T. Expanding the TRANSFAC database towards an expert system of regulatory molecular mechanisms / T. Heinemeyer, X. Chen, H. Karas et al. // Nucleic Acids Res. -1999.-V.27.-P.318-22.

126. Herring B.L. Segregation of human immunodeficiency virus type 1 subtypes by risk factor in Australia / B.L. Hening, Y.C. Ge, B. Wang et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - V.41. - P.4600^.

127. Hillis D.M. Analysis of DNA sequence data: phylogenetic inference / D.M. Hillis, M.W. Allard, M.M. Miyamoto // Methods Enzymol. 1993. - V.224. - P.456-87.

128. HTV Molecular Immunology Database / Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. http://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/index.html.

129. HIV Sequence Database / Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html.

130. HIV-l Circulating Recombinant Forms. HIV Sequence Database / Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. http://www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/CRFs/CRFs.html

131. HIV-l subtypes: implications for epidemiology, pathogenicity, vaccines and diagnostics / Workshop Report from the European Commission (DG XII, INCO-DC) and the Joint United Nations Programme on HIV/AIDS // AIDS. 1997. - V.l 1. - P.17-36.

132. Ho D.D. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HTV-1 infection / D.D. Ho, A.U. Neumann, A.S. Perelson et al. // Nature. 1995. - V.373. - P. 123-6.

133. Hoelscher M. Detection of HIV-l subtypes, recombinants, and dual infections in east Africa by a multi-region hybridization assay / M. Hoelscher, W.E. Dowling, E. Sanders-Buell et al. // AIDS. 2002. - V. 16. - P.2055-64.

134. Hoffman N.G. Variability in the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 Env protein linked to phenotype-associated changes in the V3 loop / N.G. Hoffman, F. Seillier-Moiseiwitsch, J. Ahn et al. // J. Virol. 2002. - V.76. - P.3852-64.

135. Holguin A. HIV-positive immigrants in the Canary Islands, Spain: implications for public health in Europe / A. Holguin, A. Alvarez, M.J. Pena et al. // HIV. Clin. Trials. 2003. -V.4.-P. 184-92.

136. Howard T.M. Genomic structure and nucleotide sequence analysis of a new HIV type 1 subtype A strain from Nigeria / T.M. Howard, S. Rasheed // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - V.12. -P.1413-25.

137. Hu W.S. Genetic consequences of packaging two RNA genomes in one retroviral particle: pseudodiploidy and high rate of genetic recombination / W.S. Hu, H.M. Temin // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. - V.87. - P. 1556-60.

138. Hu W.S. Retroviral recombination and reverse transcription / W.S. Hu, H.M. Temin // Science. 1990. - V.250. - P. 1227-33.

139. Hua J. Human immunodeficiency virus types 1 and 2 and simian immunodeficiency virus Nef use distinct but overlapping target sites for downregulation of cell surface CD4 / J. Hua, B.R. Cullen // J. Virol. 1997. - V.71. - P.6742-8.

140. Huang H. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-l reverse transcriptase: implications for drug resistance / H. Huang, R. Chopra, G.L. Verdine et al. // Science. 1998. - V.282. - P. 1669-75.

141. Huvent I. Interaction and co-encapsidation of human immunodeficiency virus type 1 Gag and Vif recombinant proteins / I. Huvent, S.S. Hong, C. Fournier et al. // J. Gen. Virol. -1998. V.79. -P.1069-81.

142. Hwang S.S. Identification of the envelope V3 loop as the primary determinant of cell tropism in HIV-l / S.S. Hwang, T.J. Boyle, H.K. Lyerly et al. // Science. 1991. - V.253. - P.71-4.

143. Jain C. Structural model for the cooperative assembly of HIV-l Rev multimers on the RRE as deduced from analysis of assembly-defective mutants / C. Jain, J.G. Belasco // Mol. Cell. 2001. - V.7. - P.603-14.

144. Janssens W. Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa / W. Janssens, L. Heyndrickx, K. Fransen et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. -V.10. -P.877-9.

145. Jarmuz A. An anthropoid-specific locus of orphan С to U RNA-editing enzymes on chromosome 22 / A. Jarmuz, A. Chester, J. Bayliss et al. // Genomics. 2002. - V.79. - P.285-96.

146. Javaherian K. Broadly neutralizing antibodies elicited by the hypervariable neutralizing determinant of HIV-l / K. Javaherian, A.J. Langlois, G.J. LaRosa et al. // Science. 1990. -V.250.-P. 1590-3.

147. Jeeninga R.E. Functional differences between the long terminal repeat transcriptional promoters of human immunodeficiency virus type 1 subtypes A through G / R.E. Jeeninga, M. Hoogenkamp, M. Armand-Ugon et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P.3740-51.

148. Jetzt A.E. High rate of recombination throughout the human immunodeficiency virus type 1 genome / A.E. Jetzt, H. Yu, G.J. Klarmann et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P. 1234-40.

149. Ji J.P. Fidelity of HIV-l reverse transcriptase copying RNA in vitro / J.P. Ji, L.A. Loeb // Biochemistry. 1992. - V.31. - P.954-8.

150. Ji J. Fidelity of HIV-l reverse transcriptase copying a hypervariable region of the HIV-l env gene / J. Ji, L.A. Loeb // Virology. 1994. - V.199. - P.323-30.

151. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS. AIDS Epidemic Update: December 2004 / UNAIDS. 2004. http://www.unaids.org/wad2004/report.html.

152. Jorgensen L.B. Prevalence of drug resistance mutations and non-B subtypes in newly diagnosed HIV-l patients in Denmark / L.B. Jorgensen, M.B. Christensen, J. Gerstoft et al. // Scand. J. Infect. Dis. 2003. - V.35. - P.800-7.

153. Jung A. Multiply infected spleen cells in HIV patients / A. Jung, R. Maier, J.P. Vartanian et al. // Nature. 2002. - V.418. - P. 144.

154. Junghans R.P. Retroviral DNA H structures: displacement-assimilation model of recombination / R.P. Junghans, L.R. Boone, A.M. Skalka // Cell. 1982. - V.30. - P.53-62.

155. Kaleebu P. An improved algorithm for determining HIV type 1 subtypes in a primary laboratory in Uganda / P. Kaleebu, D. Yirrell, N. French et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. - V.16. - P.621-5.

156. Kalish M.L. Early HIV type 1 strains in Thailand were not responsible for the current epidemic / M.L. Kalish, C.C. Luo, B.G. Weniger et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1994. V.10. - P.1573-5.

157. Kanki PJ. Human immunodeficiency virus type 1 subtypes differ in disease progression / P.J. Kanki, D.J. Hamel, J.L. Sankale et al. // J. Infect. Dis. 1999. - V.179. - P.68-73.

158. Karlsson A.C. Dual pressure from antiretroviral therapy and cell-mediated immune response on the human immunodeficiency virus type 1 protease gene / A.C. Karlsson, S.G. Deeks, J.D. Barbour et al. // J. Virol. 2003. - V.77. - P.6743-52.

159. Karn J. Tat, a novel regulator of HIV transcription and latency / J. Karn // HIV Sequence Compendium 2000. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2000. - P.2-18.

160. Khan M.A. Human immunodeficiency virus type 1 Vif protein is packaged into the nucleoprotein complex through an interaction with viral genomic RNA / M.A. Khan, C. Aberham, S. Kao et al. // J. Virol. 2001. - V.75. - P.7252-65.

161. Kim T.A. HIV-l Tat-mediated apoptosis in human brain microvascular endothelial cells / T.A. Kim, H.K. Avraham, Y.H. Koh et al. // J. Immunol. 2003. - V.170. - P.2629-37.

162. Kimura M. A simple model for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences / M. Kimura // J. Mol. Evol. 1980. - V.16. -P. 111-20.

163. Kita K. Genetic diversity of HIV type 1 in Likasi, southeast of the Democratic Republic of Congo / K. Kita, N. Ndembi, M. Ekwalanga et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. -V.20.-P. 1352-7.

164. Klatzmann D. Selective tropism of lymphadenopathy associated virus (LAV) for helper-inducer T lymphocytes / D. Klatzmann, F. Barre-Sinoussi, M.T. Nugeyre et al. // Science. -1984. V.225. - P.59-63.

165. Koch W.H. Evaluation of United States-licensed human immunodeficiency virus immunoassays for detection of group M viral variants / W.H. Koch, P.S. Sullivan, C. Roberts et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - V.39. - P.1017-20.

166. Kondo E. A conserved LXXLF sequence is the major determinant in p6gag required for the incorporation of human immunodeficiency virus type 1 Vpr / E. Kondo, H.G. Gottlinger // J. Virol. 1996. - V.70. - P. 159-64.

167. Koot M. Prognostic value of HIV-l syncytium-inducing phenotype for rate of CD4+ cell depletion and progression to AIDS / M. Koot, LP. Keet, A.H. Vos et al. // Ann. Intern. Med. -1993. V.118.-P.681-8.

168. Korber B. Nucleotide Alignments of HIV-l Complete Genomes / B. Korber, C.L. Kuiken,

169. В. Foley et al. // Human Retroviruses and AIDS 1998. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1998. - P.I-A-17-96.

170. Kostrikis L.G. Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1 strains from patients in Cyprus: identification of a new subtype designated subtype I / L.G. Kostrikis, E. Bagdades, Y. Cao et al. // J. Virol. 1995. - V.69. - P.6122-30.

171. Kotler M. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-l) protein Vif inhibits the activity of HIV-l protease in bacteria and in vitro / M. Kotler, M. Simm, Y.S. Zhao et al. // J. Virol. 1997. - V.71. - P.5774-81.

172. Kozlov A.P. Epidemiology of HIV infection in St. Petersburg, Russia / A.P. Kozlov, G.V. Volkova, A.G. Malykh et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1993. - V.6. - P.208-12.

173. Krokan H.E. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA / H.E. Krokan, R. Standal, G. Slupphaug // Biochem. J. 1997. - V.325. - P.l-16.

174. Kuiken C. Maps of HTV and SIV Genomes / C. Kuiken, B. Foley, B. Hahn et al. // HIV Sequence Compendium 2000. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2000. - P.iv.

175. Kurbanov F. Human immunodeficiency virus in Uzbekistan: epidemiological and genetic analyses / F. Kurbanov, M. Kondo, Y. Tanaka et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2003.-V.19.-P.731-8.

176. Kwok S. Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection / S. Kwok, D.H. Mack, K.B. Mullis et al. // J. Virol. 1987. - V.61. - P.1690-4.

177. Lamb R.A. Do Vpu and Vpr of human immunodeficiency virus type 1 and NB of influenza В virus have ion channel activities in the viral life cycles? / R.A. Lamb, L.H. Pinto // Virology. 1997. - V.229. - P.l-11.

178. Laukkanen T. Virtually full-length sequences of HIV type 1 subtype J reference strains / T. Laukkanen, J. Albert, K. Liitsola et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. - V.15. -P.293-7.

179. Laure F. Genomic diversity of Zairian HIV isolates: biological characteristics and clinical manifestation of HIV infection / F. Laure, R. Leonard, K. Mbayo et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1987. - V.3. - P.343-53.

180. Lawson V.A. Adaptive changes after human immunodeficiency virus type 1 transmission / V.A. Lawson, R. Oelrichs, C. Guillon et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002. -V.18. -P.545-56.

181. Lecossier D. Hypermutation of HIV-l DNA in the absence of the Vif protein / D. Lecossier, F. Bouchonnet, F. Clavel et al. // Science. -2003. -V.300. -P. 1112.

182. Leitner T. Analysis of heterogeneous viral populations by direct DNA sequencing / T. Leitner, E. Halapi, G. Scarlatti et al. // Biotechniques. 1993. - V.15. - P.120-7.

183. Leitner T. Yet another subtype of HIV type 1? / T. Leitner, A. Alaeus, S. Marquina et al. //

184. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1995. - V.ll. - P.995-7.

185. Leitner T. Biological and molecular characterization of subtype D, G, and A/D recombinant HIV-l transmissions in Sweden / T. Leitner, D. Escanilla, S. Marquina et al. // Virology. -1995. -V.209.- P. 136-46.

186. Leitner T. Molecular epidemiology and MT-2 cell tropism of Russian HIV type 1 variant / T. Leitner, G. Korovina, S. Marquina et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - V.12. -P.1595-603.

187. Leitner T. Genetic Subtypes of HIV-l / T. Leitner // Human Retroviruses and AIDS 1996. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1996. - Р.Ш-28-40.

188. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-l vaccine / N.L. Letvin // Science. -1998. V.280. -P.1875-80.

189. Li W.H. Rates and dates of divergence between AIDS virus nucleotide sequences / W.H. Li, M. Tanimura, P.M. Sharp // Mol. Biol. Evol. 1988. - V.5. - P.313-30.

190. Liitsola K. Genetic characterization of HIV-l strains in the Baltic countries and Russia / K. Liitsola, T. Laukkanen, A. Denisova et al. // Scand. J. Infect. Dis. 1996. - V.28. - P.537-41.

191. Liitsola K. HIV-l genetic subtype A/B recombinant strain causing an explosive epidemic in injecting drug users in Kaliningrad / K. Liitsola, I. Tashkinova, T. Laukkanen et al. // AIDS.- 1998.-V.12.-P. 1907-19.

192. Linton M.F. Reading-frame restoration by transcriptional slippage at long stretches of adenine residues in mammalian cells / M.F. Linton, M. Raabe, V. Pierotti et al. // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - P.14127-32.

193. Lole K.S. Full-length human immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C-infected seroconverters in India, with evidence of intersubtype recombination / K.S. Lole, R.C. Bollinger, R.S. Paranjape et al. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.152-60.

194. Loussert-Ajaka I. Variability of human immunodeficiency virus type 1 group О strains isolated from Cameroonian patients living in France / I. Loussert-Ajaka, M.L. Chaix, B. Korber et al. // J. Virol. 1995. - V.69. - P.5640-9.

195. Louwagie J. Phylogenetic analysis of gag genes from 70 international HIV-l isolates provides evidence for multiple genotypes / J. Louwagie, F.E. McCutchan, M. Peeters et al. // AIDS. 1993. - V.7. - P.769-80.

196. Louwagie J. Genetic analysis of HIV-l isolates from Brazil reveals presence of two distinct genetic subtypes / J. Louwagie, E.L. Delwart, J.I. Mullins et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - V.10. - P.561-7.

197. Louwagie J. Genetic diversity of the envelope glycoprotein from human immunodeficiencyvirus type 1 isolates of African origin / J. Louwagie, W. Janssens, J. Mascola et al. // J. Virol. 1995. - V.69. - P.263-71.

198. Lukashov V.V. Simultaneous introduction of distinct HIV-l subtypes into different risk groups in Russia, Byelorussia and Lithuania / V.V. Lukashov, M.T. Cornelissen, J. Goudsmit et al. // AIDS. 1995. - V.9. - P.435-9.

199. Lukashov V.V. Intrahost human immunodeficiency virus type 1 evolution is related to length of the immunocompetent period / V.V. Lukashov, C.L. Kuiken, J. Goudsmit // J. Virol. 1995. - V.69. - P.6911-6.

200. Lukashov V.V. Extreme founder effect in an HIV type 1 subtype A epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus / V.V. Lukashov, E.V. Karamov, V.F. Eremin et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. - V.14. - P. 1299-303.

201. Luo C.C. The development and evaluation of a probe hybridization method for subtyping HIV type 1 infection in Uganda / C.C. Luo, R.G. Downing, T.N. Dela et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. - V.14. - P.691-4.

202. Mangeat B. Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts / B. Mangeat, P. Turelli, G. Caron et al. // Nature. 2003. - V.424. - P.99-103.

203. Mansky L.M. Lower in vivo mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 than that predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase / L.M. Mansky, H.M. Temin // J. Virol. 1995. - V.69. - P.5087-94.

204. Mansky L.M. The mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 is influenced by the vpr gene / L.M. Mansky // Virology. 1996. - V.222. - P.391-400.

205. Mansky L.M. The interaction of vpr with uracil DNA glycosylase modulates the human immunodeficiency virus type 1 In vivo mutation rate / L.M. Mansky, S. Preveral, L. Selig et al. // J. Virol. 2000. - V.14. - P.7039-47.

206. Marquina S. Coexistence of subtypes B, F, and as B/F env recombinant of HIV type 1 in Buenos Aires Argentina / S. Marquina, T. Leitner, R.D. Rabinovich et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - V.12. - P.1651-4.

207. Martinez M.A. Hypermutagenesis of RNA using human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and biased dNTP concentrations / M.A. Martinez, J.P. Vartanian, S. Wain-Hobson // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. - V.91. - РЛ1787-91.

208. Mascola J.R. Two antigenically distinct subtypes of human immunodeficiency virus type 1: viral genotype predicts neutralization serotype / J.R. Mascola, J. Louwagie, F.E. McCutchan et al. // J. Infect. Dis. 1994. - V. 169. - P.48-54.

209. Masharsky A.E. Molecular cloning and analysis of full-length genome of HIV type 1 strainsprevalent in countries of the former Soviet Union / A.E. Masharsky, N.A. Klimov, A.P. Kozlov // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. - P.933-9.

210. Mathews C.K. DNA precursor asymmetries, replication fidelity, and variable genome evolution / C.K. Mathews, J. Ji // Bioessays. 1992. - V.14. - P.295-301.

211. Matzura O. RNAdraw: an integrated program for RNA secondary structure calculation and analysis under 32-bit Microsoft Windows / O. Matzura, A. Wennborg // Comput. Appl. Biosci. 1996. - V.12. - P.247-9.

212. McCune J.M. Endoproteolytic cleavage of gpl60 is required for the activation of human immunodeficiency virus / J.M. McCune, L.B. Rabin, M.B. Feinberg et al. // Cell. 1988. -V.53. -P.55-67.

213. McCutchan FE. Genetic analysis of HIV-l isolates from Zambia and an expanded phylogenetic tree for HIV-l / F.E. McCutchan, B.L. Ungar, P. Hegerich et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1992. - V.5. - P.441-9.

214. Mehle A. Vif overcomes the innate antiviral activity of APOBEC3G by promoting its degradation in the ubiquitin-proteasome pathway / A. Mehle, B. Strack, P. Ancuta et al. // J. Biol. Chem. 2004. - V.279. - P.7792-8.

215. Milich L. V3 loop of the human immunodeficiency virus type 1 Env protein: interpreting sequence variability / L. Milich, B. Margolin, R. Swanstrom // J. Virol. 1993. - V.67. -P.5623-34.

216. Miller M.D. The human immunodeficiency virus-1 nef gene product: a positive factor for viral infection and replication in primary lymphocytes and macrophages / M.D. Miller, M.T. Warmerdam, I. Gaston et al. // J. Exp. Med. 1994. - V.179. - P.101-13.

217. Miller V. International perspectives on antiretroviral resistance. Resistance to protease inhibitors / V. Miller// J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. -2001. V.26 Suppl 1. -P.S34-S50.

218. Mokili J.L. Identification of a novel clade of human immunodeficiency virus type 1 in Democratic Republic of Congo / J.L. Mokili, M. Rogers, J.K. Carr et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002. - V.18. - P.817-23.

219. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1987 / G. Myers // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1987.

220. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1988 / G. Myers, S.F. Josephs, A.B. Rabson et al. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. -1988.

221. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1992 / G. Myers, B. Korber, S. Wain-Hobson etal. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1992.

222. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1993 / G. Myers, B. Korber, S. Wain-Hobson et al. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1993.

223. Myers G. Human Retroviruses and AIDS 1994 / G. Myers, B. Korber, S. Wain-Hobson et al. // Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1994.

224. Naganawa S. First report of CRF03AB recombinant HIV type 1 in injecting drug users in Ukraine / S. Naganawa, S. Sato, D. Nossik et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002. -V.18.-P.1145-9.

225. Najera I. Natural occurrence of drug resistance mutations in the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 isolates /1. Najera, D.D. Richman, I. Olivares et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. - V.10. - P. 1479-88.

226. Najera R. Genetic recombination and its role in the development of the HIV-l pandemic / R. Najera, E. Delgado, L. Perez-Alvarez et al. // AIDS. 2002. - V.16 Suppl 4. - P.S3-16.

227. Nasioulas G. Molecular analysis of the full-length genome of HIV type 1 subtype I: evidence of AJGfl recombination / G. Nasioulas, D. Paraskevis, E. Magiorkinis et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. - V.15. - P.745-58.

228. Neville M. The importin-beta family member Crmlp bridges the interaction between Rev and the nuclear pore complex during nuclear export / M. Neville, F. Stutz, L. Lee et al. // Curr. Biol. 1997. - V.7. - P.767-75.

229. Niederman T.M. Myristoylation-enhanced binding of the HTV-1 Nef protein to T cell skeletal matrix / T.M. Niederman, W.R. Hastings, L. Ratner // Virology. 1993. - V. 197. - P.420-5.

230. Nkengasong J.N. Genotypic subtypes of HIV-l in Cameroon / J.N. Nkengasong, W. Janssens, L. Heyndrickx et al. // AIDS. 1994. - V.8. - P.1405-12.

231. Nkengasong J.N. Lack of correlation between V3-loop peptide enzyme immunoassay serologic subtyping and genetic sequencing / J.N. Nkengasong, B. Willems, W. Janssens et al. // AIDS. 1998. - V.12. - P.1405-12.

232. Nkengasoftg J.N. Distribution of HIV-l subtypes among HTV-seropositive patients in the interior of Cote d'lvoire / J.N. Nkengasong, C.C. Luo, L. Abouya et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2000. - V.23. - P.430-6.

233. Novitsky V.A. Molecular epidemiology of an HIV-l subtype A subcluster among injection drug users in the Southern Ukraine / V.A. Novitsky, M.A. Montano, M. Essex // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. - V.14. - P. 1079-85.

234. Op de Coul E.L. Using phylogenetic analysis to trace HIV-l migration among western European injecting drug users seroconverting from 1984 to 1997 / E.L. Op de Coul, M. Prins, M. Cornelissen et al. // AIDS. 2001. - V.15. - P.257-66.

235. Ou S.H. Role of flanking E box motifs in human immunodeficiency virus type 1 TATA element function / S.H. Ou, L.F. Garcia-Martinez, E.J. Paulssen et al. // J. Virol. 1994. -V.68. -P.7188-99.

236. Pandrea I. HIV type 1 genetic diversity and genotypic drug susceptibility in the Republic of Moldova / I. Pandrea, D. Descamps, G. Collin et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2001. V.17. - P.1297-304.

237. Papuashvili M.N. Characteristics of HIV-l env V3 loop sequences for subtype Al variant spread in Eastern Europe / M.N. Papuashvili, A.S. Novokhatsky, T.I. Shcherbakova // Infect. Genet. Evol. 2005. - V.5. - P.45-53.

238. Parekh B. Impact of HIV type 1 subtype variation on viral RNA quantitation / B. Parekh, S. Phillips, T.C. Granade et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. - V.15. - P.133-42.

239. Pau C.P. Highly specific V3 peptide enzyme immunoassay for serotyping HIV-l specimens from Thailand / C.P. Pau, S. Lee-Thomas, W. Auwanit et al. // AIDS. 1993. - V.7. - P.337-40.

240. Peden K.W. Instability of HIV sequences in high copy number plasmids / K.W. Peden // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1992. - V.5. -P.313-5.

241. Peeters M. Characterization of a highly replicative intergroup M/O human immunodeficiency virus type 1 recombinant isolated from a Cameroonian patient / M. Peeters, F. Liegeois, N. Torimiro et al. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.7368-75.

242. Peeters M. Recombinant HIV sequences: Their role in the global epidemic / M. Peeters // HIV Sequence Compendium 2000. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 2000. - P.I-39-54.

243. Peeters M. Genetic diversity of HIV in Africa: impact on diagnosis, treatment, vaccinedevelopment and trials / M. Peeters, C. Toure-Kane, J.N. Nkengasong // AIDS. 2003. -V.17. - P.2547-60.

244. Pereira L.A. A compilation of cellular transcription factor interactions with the HIV-l LTR promoter / L.A. Pereira, K. Bentley, A. Peeters et al. // Nucleic Acids Res. 2000. - V.28. -P.663-8.

245. Pillai S. A new perspective on V3 phenotype prediction / S. Pillai, B. Good, D. Richman et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. - P. 145-9.

246. Pollakis G. N-linked glycosylation of the HIV type-1 gpl20 envelope glycoprotein as a major determinant of CCR5 and CXCR4 coreceptor utilization / G. Pollakis, S. Kang, A. Kliphuis et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. - P.13433-41.

247. Pope M. Different subtypes of HIV-l and cutaneous dendritic cells / M. Pope, D.D. Ho, J.P. Moore et al. // Science. 1997. - V.278. - P.786-8.

248. Rambaut A. Human immunodeficiency virus. Phylogeny and the origin of HIV-l / A. Rambaut, D.L. Robertson, O.G. Pybus et al. // Nature. 2001. - V.410. - P.1047-8.

249. Reinis M. Genetic subtypes of HIV type 1 viruses circulating in the Czech Republic / M. Reinis, M. Bruckova, R.R. Graham et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001. - V.17. - P.1305-10.

250. Renjifo B. Differences in perinatal transmission among human immunodeficiency virus type 1 genotypes / B. Renjifo, W. Fawzi, D. Mwakagile et al. // J. Hum. Virol. 2001. - V.4. -P.16-25.

251. Resch W. Improved success of phenotype prediction of the human immunodeficiency virus type 1 from envelope variable loop 3 sequence using neural networks / W. Resch, N. Hoffman, R. Swanstrom // Virology. 2001. - V.288. - P.51-62.

252. Ricchetti M. Reverse transcriptases and genomic variability: the accuracy of DNA replication is enzyme specific and sequence dependent / M. Ricchetti, H. Buc // EMBO J. -1990. V.9. - P.1583-93.

253. Rittner K. The human immunodeficiency virus long terminal repeat includes a specialised initiator element which is required for Tat-responsive transcription / K. Rittner, M.J. Churcher, M.J. Gait et al. // J. Mol. Biol. 1995. - V.248. - P.562-80.

254. Roberts J.D. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-l / J.D. Roberts, K. Bebenek, T.A. Kunkel // Science. 1988. - V.242. - P.l 171-3.

255. Robertson D.L. Recombination in HIV-l / D.L. Robertson, P.M. Sharp, F.E. McCutchan et al. // Nature. 1995. - V.374. - P. 124-6.

256. Robertson D.L. HTV-1 Nomenclature Proposal / D.L. Robertson, J.P. Anderson, J.A. Bradac et al. // Human Retroviruses and AIDS 1999. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. 1999. - P.492-505.

257. Robertson D.L. HIV-l nomenclature proposal / D.L. Robertson, J.P. Anderson, J.A. Bradac et al. // Science. 2000. - V.288. - P.55-6.

258. Roos M.T. Viral phenotype and immune response in primary human immunodeficiency virus type 1 infection / M.T. Roos, J.M. Lange, R.E. de Goede et al. // J. Infect. Dis. 1992. - V.165. - P.427-32.

259. Roques P. Phylogenetic analysis of 49 newly derived HTV-1 group О strains: high viral diversity but no group M-like subtype structure / P. Roques, D.L. Robertson, S. Souquiere etal. // Virology. 2002. - V.302. - P.259-73.

260. Roques P. Phylogenetic characteristics of three new HIV-l N strains and implications for the origin of group N / P. Roques, D.L. Robertson, S. Souquiere et al. // AIDS. 2004. -V.18. — P.1371-81.

261. Rosen C.A. The location of cis-acting regulatory sequences in the human T cell lymphotropic virus type HI (HTLV-II1/LAV) long terminal repeat / C.A. Rosen, J.G. Sodroski, W.A. Haseltine // Cell. 1985. - V.41. - P.813-23.

262. Saag M.S. Extensive variation of human immunodeficiency virus type-1 in vivo / M.S. Saag, B.H. Hahn, J. Gibbons et al. // Nature. 1988. - V.334. - P.440-4.

263. Sabatier J.M. Evidence for neurotoxic activity of tat from human immunodeficiency virus type 1 / J.M. Sabatier, E. Vives, K. Mabrouk et al. // J. Virol. 1991. - V.65. - P.961-7.

264. Sabino E.C. Distribution of HIV-l subtypes seen in an AIDS clinic in Sao Paulo City, Brazil / E.C. Sabino, R.S. Diaz, L.F. Brigido et al. // AIDS. 1996. - V.10. - P.1579-84.

265. Saiki R.K. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / R.K. Saiki, S. Scharf, F. Faloona et al. // Science. 1985. - V.230. - P. 1350-4.

266. Salminen M. Rapid and simple characterization of in vivo HIV-l sequences using solid-phase direct sequencing / M. Salminen // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. - V.8. - P. 1733-42.

267. Salminen M.O. Recovery of virtually full-length HTV-1 provirus of diverse subtypes from primary virus cultures using the polymerase chain reaction / M.O. Salminen, C. Koch, E. Sanders-Buell et al. // Virology. 1995. - V.213. - P.80-6.

268. Samson M. Resistance to HIV-l infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene / M. Samson, F. Libert, B.J. Doranz et al. // Nature. -1996. V.382. - P.722-5.

269. Sanchez J.L. Expanding epidemics of HIV-l in states of the Former Soviet Union / J.L. Sanchez, J.K. Carr, R. Graham et al. // Abstracts 11th Conference on Retroviruses and Opportunictic Infections, San Francisco, USA, 2004. #867.

270. Sanchez-Palomino S. Primary genetic characterization of HIV-l isolates from WHO-sponsored vaccine evaluation sites by the RNase-A mismatch method / S. Sanchez-Palomino, J. Dopazo, I. Olivares et al. // Virus Res. 1995. - V.39. - P.251-9.

271. Sanger F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977. - V.74. - P.5463-7.

272. Sarr A.D. HIV-l and HIV-2 dual infection: lack of HTV-2 provirus correlates with low CD4+ lymphocyte counts / A.D. Sarr, D.J. Hamel, I. Thior et al. // AIDS. 1998. - V.12. - P. 131-7.

273. Sato A. Evidence for direct association of Vpr and matrix protein pl7 within the HTV-1 virion / A. Sato, J. Yoshimoto, Y. Isaka et al. // Virology. 1996. - V.220. - P.208-12.

274. Scala G. The expression of the interleukin 6 gene is induced by the human immunodeficiency virus 1 TAT protein / G. Scala, M.R. Ruocco, C. Ambrosino et al. // J. Exp. Med. 1994. - V.179. - P.961-71.

275. Scharf S.J. Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences / S J. Scharf, G.T. Horn, H.A. Erlich // Science. 1986. - V.233. - P.1076-8.

276. Schwartz O. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-l Nef protein / O. Schwartz, V. Marechal, S. Le Gall et al. // Nat. Med. 1996.- V.2. P.338-42.

277. Selig L. Interaction with the p6 domain of the gag precursor mediates incorporation into virions of Vpr and Vpx proteins from primate lentiviruses / L. Selig, J.C. Pages, V. Tanchou et al. // J. Virol. 1999. - V.73. - P.592-600.

278. Servais J. HTV type 1 pol gene diversity and archived nevirapine resistance mutation in pregnant women in Rwanda / J. Servais, C. Lambert, E. Karita et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. - V.20. - P.279-83.

279. Shafer R.W. Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and protease mutation search engine for queries / R.W. Shafer, D.R. Jung, B.J. Betts // Nat. Med. 2000. -V.6.-P. 1290-2.

280. Sheehy A.M. Isolation of a human gene that inhibits HTV-1 infection and is suppressed by the viral Vif protein / A.M. Sheehy, N.C. Gaddis, J.D. Choi et al. // Nature. 2002. - V.418.- P.646-50.

281. Sheehy A.M. The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV-l Vif / A.M. Sheehy, N.C. Gaddis, M.H. Malim // Nat. Med. 2003. -V.9.-P. 1404-7.

282. ShiodaT. Macrophage and T cell-line tropisms of HTV-1 are determined by specific regions of the envelope gpl20 gene / T. Shioda, J.A. Levy, C. Cheng-Mayer // Nature. 1991. -V.349.-P.167-9.

283. Simmonds P. Analysis of sequence diversity in hypervariable regions of the external glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 / P. Simmonds, P. Balfe, C.A. Ludlam et al. // J. Virol. 1990. - V.64. - P.5840-50.

284. Simon F. Identification of a new human immunodeficiency virus type 1 distinct from group M and group О / F. Simon, P. Mauclere, P. Roques et al. // Nat. Med. 1998. - V.4. - P. 1032-7.

285. Smith D.B. Virus 'quasispecies': making a mountain out of a molehill? / D.B. Smith, J. McAllister, C. Casino et al. // J. Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.1511-9.

286. Snoeck J. Rising prevalence of HIV-l non-B subtypes in Belgium: 1983-2001 / J. Snoeck, K. Van Laethem, P. Hermans et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2004. - V.35. - P.279-85.

287. Soto-Ramirez L.E. HIV-l Langerhans' cell tropism associated with heterosexual transmission of HIV / L.E. Soto-Ramirez, B. Renjifo, M.F. McLane et al. // Science. 1996. - V.271. - P.1291-3.

288. Strebel K. The HIV 'A' (sor) gene product is essential for virus infectivity / K. Strebel, D. Daugherty, K. Clouse et al. // Nature. 1987. - V.328. - P.728-30.

289. Strunnikova N. Evolution of human immunodeficiency virus type 1 in relation to disease progression in children / N. Strunnikova, S.C. Ray, C. Lancioni et al. // J. Hum. Virol. -1998. V.l. - P.224-39.

290. Su L. Characterization of a virtually full-length human immunodeficiency virus type 1 genome of a prevalent intersubtype (C/B') recombinant strain in China / L. Su, M. Graf, Y. Zhang et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P. 11367-76.

291. Takahashi H. Induction of broadly cross-reactive cytotoxic T cells recognizing an HIV-l envelope determinant / H. Takahashi, Y. Nakagawa, C.D. Pendleton et al. // Science. -1992. V.255. - P.333-6.

292. Takehisa J. Human immunodeficiency virus type 1 intergroup (M/O) recombination in Cameroon / J. Takehisa, L. Zekeng, E. Ido et al. //J. Virol. 1999. - V.73. - P.6810-20.

293. Tang H. Lentivirus replication and regulation / H. Tang, K.L. Kuhen, F. Wong-Staal // Annu. Rev. Genet. 1999. - V.33. - P. 133-70.

294. Thomas M.J. Transcriptional fidelity and proofreading by RNA polymerase II / M.J.

295. Thomas, A.A. Platas, D.K. Hawley // Cell. 1998. - V.93. - P.627-37.

296. Tovanabutra S. A new circulating recombinant form, CRF1501B, reinforces the linkage between IDU and heterosexual epidemics in Thailand / S. Tovanabutra, V. Watanaveeradej, K. Viputtikul et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. - P.561-7.

297. Tramuto F. Detection of HIV type 1 non-B subtypes in Sicily, Italy / F. Tramuto, F. Vitale, F. Bonura et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004. - V.20. - P.251-4.

298. Triques K. High diversity of HIV-l subtype F strains in Central Africa / K. Triques, A. Bourgeois, S. Saragosti et al. // Virology. 1999. - V.259. - P.99-109.

299. Vanden Haesevelde M. Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immunodeficiency virus isolate / M. Vanden Haesevelde, J.L. Decourt, R.J. De Leys et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.1586-96.

300. Vartanian J.P. Selection, recombination, and G—>A hypermutation of human immunodeficiency virus type 1 genomes / J.P. Vartanian, A. Meyerhans, B. Asjo et al. // J. Virol. 1991. - V.65. - P. 1779-88.

301. Vartanian J.P. HIV genetic variation is directed and restricted by DNA precursor availability / J.P. Vartanian, U. Plikat, M. Henry et al. // J. Mol. Biol. 1997. - V.270. - P.139-51.

302. Vartanian J.P. Sustained G~>A hypermutation during reverse transcription of an entire human immunodeficiency virus type 1 strain Vau group О genome / J.P. Vartanian, M. Henry, S. Wain-Hobson // J. Gen. Virol. 2002. - V.83. - P.801-5.

303. Vartanian J.P. Death and the retrovirus / J.P. Vartanian, P. Sommer, S. Wain-Hobson // Trends Mol. Med. 2003. - V.9. - P.409-13.

304. Vodicka M.A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses / M.A. Vodicka, W.C. Goh, L.I. Wu et al. // Virology. 1997. -V.233. -P.193-8.

305. Wabl M. Hypermutation at the immunoglobulin heavy chain locus in a pre-B-cell line / M. Wabl, P.D. Burrows, A. von Gabain et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985. - V.82. - P.479-82.

306. Wang R.F. Construction of versatile low-copy-number vectors for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli / R.F. Wang, S.R. Kushner// Gene. 1991. - V.100. - P.195-9.

307. Wei M. Simple subtyping assay for human immunodeficiency virus type 1 subtypes В, C, CRF01-AE, CRF07-BC, and CRF08-BC / M. Wei, Q. Guan, H. Liang et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V.42. - P.4261-7.

308. Westendorp M.O. Human immunodeficiency virus type 1 Tat upregulates interleukin-2 secretion in activated T cells / M.O. Westendorp, M. Li-Weber, R.W. Frank et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.4177-85.

309. Wong-Staal F. Genomic diversity of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III) / F. Wong-Staal, G.M. Shaw, B.H. Hahn et al. // Science. 1985. - V.229. - P.759-62.

310. Wood R. Quantification and comparison of HIV-l proviral load in peripheral blood mononuclear cells and isolated CD4+ T cells / R. Wood, H. Dong, D.A. Katzenstein et al. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1993. - V.6. - P.237-40.

311. Wooley D.P. Direct demonstration of retroviral recombination in a rhesus monkey / D.P. Wooley, R.A. Smith, S. Czajak et al. // J. Virol. 1997. - V.71. - P.9650-3.

312. World Bank. A World Bank Policy Research Report. Confronting AIDS: Public Priorities in a Global Epidemic / World Bank. New York: Oxford University Press, 1997.

313. Wu L. CD4-induced interaction of primary HIV-l gpl20 glycoproteins with the chemokine receptor CCR-5 / L. Wu, N.P. Gerard, R. Wyatt et al. // Nature. 1996. - V.384. - P.179-83.

314. Wyatt R. The HIV-l envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens / R. Wyatt, J. Sodroski // Science. 1998. - V.280. - P.1884-8.

315. Yamaguchi J. Identification of a new HIV-2 subtype based on phylogenetic analysis of full-length genomic sequence / J. Yamaguchi, S.G. Devare, C.A. Brennan // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. - V.16. - P.925-30.

316. Yamaguchi J. Near full-length genomes of 15 HIV type 1 group О isolates / J. Yamaguchi, P. Bodelle, L. Kaptue et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2003. - V.19. - P.979-88.

317. Yirrell D.L. HIV-l subtype in Scotland: the establishment of a national surveillance system / D.L. Yirrell, L. Shaw, S.M. Burns et al. // Epidemiol. Infect. 2004. - V.132. - P.693-8.

318. Yu H. Comparison of HIV-l and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates / H. Yu, M.F. Goodman // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. - P. 10888-96.

319. Yu X.F. Maintaining low HIV type 1 env genetic diversity among injection drug users infected with a B/C recombinant and CRF01AE HIV type 1 in southern China / X.F. Yu, W. Liu, J. Chen et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002. - V.18. - P. 167-70.

320. Yu X. Induction of APOBEC3G ubiquitination and degradation by an HIV-l Vif-Cul5-SCF complex / X. Yu, Y. Yu, B. Liu et al. // Science. 2003. - V.302. - P. 1056-60.

321. Zhang H. The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-l DNA / H. Zhang, B. Yang, R.J. Pomerantz et al. // Nature. 2003. - V.424. - P.94-8.

322. Zhang J. Most retroviral recombinations occur during minus-strand DNA synthesis / J. Zhang, L.Y. Tang, T. Li et al. // J. Virol. 2000. - V.74. - P.2313-22.

323. Zhu T. Genotypic and phenotypic characterization of HIV-l patients with primary infection / T. Zhu, H. Mo, N. Wang et al.//Science. 1993. - V.261. - P.1179-81.

324. Zhu T. Was HIV present in 1959? / T. Zhu, D.D. Ho // Nature. 1995. - V.374. - P.503-4.

325. Zhuang J. Human immunodeficiency virus type 1 recombination: rate, fidelity, and putative hot spots / J. Zhuang, A.E. Jetzt, G. Sun et al. // J. Virol. 2002. - V.76. - P.l 1273-82.