Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-эпидемиологический анализ ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-эпидемиологический анализ ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области"

На правах рукописи

Турбина Галина Ивановна

МОЛЕКУЛЯРНО- ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ НА ТЕРРИТОРИИ ЛИПЕЦКОЙ ОБЛАСТИ

03 00.03 -молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003168382

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ Доктор биологических наук,

профессор Гараев Мансур Мухамедович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор медицинских наук, чл.-корр РАМН, профессор Урываев Леонид Викторович Доктор биологических наук, Шевелев Алексей Борисович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Научно-исследовательский институт молекулярной генетики РАН, Москва.

Защита состоится «19» мая 2008 г в 12-00 часов

на заседании диссертационного Совета Д 001.20 01 при ГУ НИИ

вирусологии им Д И Ивановского РАМН (адрес 123098 Москва, ул Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского

Автореферат разослан « »_2008 г

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Н П Косякова

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Распространение ВИЧ-инфекции в мире носит характер пандемии В Российской Федерации и странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются одни из самых высоких в Восточной Европе темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции, что связано с началом крупномасштабной эпидемии в этом регионе только в середине 90-х годов (Российский комитет защиты мира, 2006). Общее число зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции в РФ на 31.08.07 г. составляет 390365 человек, из них 2642 ребенка. За 8 месяцев 2007 год выявлено 28974 новых случаев ВИЧ-инфекции, что на 12% больше, чем за аналогичный период 2006 года Большинство случаев ВИЧ-инфицирования связано с инъекционным употреблением наркотиков (70%), однако, отмечается четкая тенденция ежегодного увеличения числа случаев передачи вируса половым путем. В 2006 году он превысил 50% всех новых случаев заражения (Покровский В.В., Савченко И Г., Ладная H.H., 2006).

Необходимо отметить, что эпидемия ВИЧ-инфекции в России имеет неравномерный характер распространения. ВИЧ-инфицированные граждане зарегистрированы на всех 89 административных территориях страны, однако, согласно данным Российского Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИД, около 60% от абсолютного числа всех зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции сконцентрированы в 10 субъектах РФ, где уровень инфицированности превышает 300 человек на 100 тыс жителей: Свердловская область, Московская область, г. Санкт-Петербург, Самарская область, г. Москва, Иркутская область, Челябинская область, Оренбургская область, Ханты-Мансийский АО, Ленинградская область Помимо территорий с высоким уровнем ВИЧ-инфекции в РФ отмечены регионы, где количество инфицированных менее 50 человек на 100 тыс населения, и таких регионов 38, в них проживает четвертая часть всего населения РФ (Липецкая, Курская, Воронежская, Астраханская обл. и др.) (данные приведены на 01 09 07 г.). Основная масса публикаций, касающаяся

изучения эпидпроцесса ВИЧ-инфекции и анализа распространенности субтипов ВИЧ-1 в регионах РФ, посвящена территориям с высоким и/или очень высоким уровнем превалентности этого заболевания (Покровский В.В. 1987, Козлов А.П. 1990, Garaev М.М. 1993, Бобков А Ф. 1998, Набатов А.А 1999, Зверев С.Я, Машарский Э.В 2004), но, практически отсутствуют данные о районах с низким уровнем распространенности этого вируса.

В качестве такой модели был изучен регион, который в настоящее время по количеству ВИЧ-инфицированных находится на 84 месте из 89 субъектов Российской Федерации - Липецкая область, где уровень превалентности ВИЧ/СПИД составил 45 инфицированных на 100 тыс. жителей («СПИДометр» ЛОЦПБС и ИЗ от 01.09.07 г.).

Для характеристики вариантов вируса обычно используют подходы, основанные на методах молекулярно-биологического мониторинга вирусных популяций (Garaev, 1993) Изучение первичной структуры генома ВИЧ-1 позволяет установить направленность генетической изменчивости его гипервариабельных и консервативных областей и определить основные факторы, обуславливающие полиморфизм вирусных популяций. В качестве информационных областей при анализе нуклеотидной последовательности генома ВИЧ-1 особое внимание привлекает область env, основного белка оболочки gpl20, как представителя генетического разнообразия вариантов вируса, и область gag, кодирующая внутренние белки вируса, как один из консервативных участков вириона, который может быть использован для определения схожести и общности происхождения вирусов

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение особенностей течения эпидемического процесса на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-1, а также, исследование молекулярно-генетических и молекулярно-эпидемиологических характеристик вариантов ВИЧ-1, получивших

распространение в Липецкой области Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gag (782-1318 но), гена env (6582-7782 но) и 5'-нетранслируемой области (662-788 но) генома вариантов ВИЧ-1, получивших распространение на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-инфекции (координаты указаны по иуклеотидной последовательности НХВ2 GeneBank Ас.№К03455)

2. Провести субтипирование полученных первичных последовательностей вариантов ВИЧ-1 от пациентов Липецкой области

3 На основании филогенетического анализа определить степень гомологии вариантов вируса в изучаемой популяции от пациентов с различным эпиданамнезом, а также сравнить уровень их генетической близости с известными штаммами ВИЧ-1 международной базы данных GeneBank

4 Изучить характер мутаций гипервариабельных участков исследуемых областей генома вариантов gagA/envA ВИЧ-1, получивших распространение на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-1 (Липецкой области)

Научная новизна работы.

1. Впервые показано, что эпидемия ВИЧ-инфекции на территориях с низким уровнем превалентности ВИЧ-1 это - вялотекущий эпидпроцесс среди местного населения в основном, связанный с половыми контактами, без широкого распространения среди наркоманов. Основной вклад в увеличение численности ВИЧ-инфицированных на таких территориях вносит, так называемый, «миграционный компонент», который формируется за счет временной миграции жителей данного региона на территории с взрывным характером распространения вируса, либо за счет иммиграции населения с территорий с высоким уровнем ВИЧ-инфекции (иммигранты, сезонные рабочие и т д.).

2. Получены молекулярно-эпидемиологаческие данные о вариантах вируса иммунодефицита человека 1-го типа, получивших распространение на территории Липецкой области в период с 1994 по 2006 годы. На территории области обнаружены 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA (82%), gagB/envB (11%), gagC/envC (3,5%) и рекомбинант gagA/envB (3,5%). Установлена генетическая близость вариантов gagA/envA, циркулирующих на территории Липецкого региона, с изолятами, выделенными на территории Ближнего зарубежья (Украины, Молдовы) Данные филогенетического анализа образцов свидетельствуют о заносе вируса gagA/envA на территорию региона из очага ВИЧ-инфекции в Украине, который был осуществлен за счет «миграционного компонента» (сезонные рабочие, переселенцы) из этой страны.

3 При анализе генетического полиморфизма области env генома ВИЧ-1, было установлено, что кроме мутаций в виде трансзиций и трансверсий присутствуют дупликации 15-30 нуклеотидов в Р1-Р2 и Р4 областях В 28 исследованных образцах число дупликаций и количество повторяющихся нуклеотидов было различным.

4 При изучении 5'-нетранслируемой области геномной РНК ВИЧ-1 в вариантах вируса субтипа А, выделенных от пациентов Липецкой области, было установлено, что область, охватывающая шпильки DIS, SD и отличается высоким уровнем консервативности и встречающиеся в них замены не приводят к значительным изменениям их вторичной структуры

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Изучен эпидпроцесс ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области с низким уровнем превалентности этой инфекции. Полученные данные показывают, что динамика выявляемое™ ВИЧ-инфицированных в Липецкой области отражает общероссийскую ситуацию развития ВИЧ-инфекции, но эпидемический процесс имеет ряд особенностей Установлено, что основной вклад в число выявленных ВИЧ-инфицированных вносят лица, так называемый

«миграционный компонент» (сезонные работы, переселенцы из стран ближнего зарубежья, заключенные УИН) для которых основной путь инфицирования -потребление внутривенных наркотиков Среди местных жителей распространение ВИЧ инфекции идет преимущественно за счет полового пути передачи. Таким образом, эпидемия ВИЧ-инфекции на территории РФ носит неоднородный характер, на территориях с высоким уровнем превалентности ВИЧ - в виде вспышек при попадании вируса в популяцию наркоманов, а в регионах с низким уровнем распространенности - вялотекущий эпидпроцесс среди местного населения в основном, связанный с половыми контактами, без широкого распространения среди наркоманов

2. На основании молекулярно-эпидемиологических данных, установлено, что на территории области обнаружены 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA, gagB/envB, gagC/envC и рекомбинант gagA/envB., Преобладающим является субтип gagA/envA , который был выявлен в 82% случаев от числа обследованных лиц.

3. Изучение первичной структуры нуклеотидной последовательности области гена env, кодирующего gpl20, вариантов ВИЧ-1 субтипа А у пациентов Липецкого региона, показало, что ранние этапы ВИЧ-инфекции характеризуются низким уровнем полиморфизма этого участка генома вируса

4 Шпилечные структуры 5'-концевой области геномной РНК ВИЧ-1 в вариантах субтипа А вируса, выделенных от пациентов Липецкой области, отличаются высоким уровнем консервативности их нуклеотидного состава и вторичных форм

5. Полиморфизм участка гена gag, кодирующего матриксный белок р17, вариантов субтипа А ВИЧ-1 у пациентов Липецкого региона в группе ПИН достоверно превышает этот показатель среди пациентов с половой трансмиссией вируса, и составляет соответственно 1,9% и 1,2% при (р<0,05) Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы опубликованы в 2 статьях, 2 тезисах

Объем я структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержит 9 таблиц и 25 рисунка В международной базе данных GeneBank зарегистрированы 47 нуклеотидных последовательностей области гена gag, кодирующей матриксный белок р17 и N-концевую часть бежа р24 (Ас№ EF 119574-199588, EF 121245-121272, EF 139232-129236), и 32 последовательности области генома env, кодирующей поверхностный гликопротеин gpl20 (Ас №.EF 121273-121304), вариантов ВИЧ-1 выделенных от пациентов Липецкого региона.

По результатам работы опубликовано 4 печатные работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе были использованы образцы крови от 60 ВИЧ-инфицированных пациентов, собранных на территории Липецкой области за период с 19942006 г.г. У пациентов выясняли вероятные факторы риска заражения, предполагаемый путь инфицирования, место и время инфицирования

Специфические фрагменты ДНК, соответствующие области env, основного белка оболочки gpl20, области gag, кодирующая р17, и 5'-нетранслируемой области геномной РНК ВИЧ-1, амплифицировали с помощью двух пар праймеров в варианте "nested" ПЦР (таб.1).

Определение уровня изменчивости аминокислотной последовательности gpl20 рассчитывали с помощью программы ACCORD За величину вариабельности принимали коэффициент К, который вычисляли по формуле:

К= л/ (X1(A-XV(Ar+(XiiC -Xv,c)i+(Xi,G-XV)Gr+(X1)T-X'v,T)i

где Х1га, Х,_с, Х,,о, Х,д - нормированные координаты по осям А, С, G или Т в 1-той позиции алаймента, соответственно^,a, Xv_c, XViq, Xv>t - нормированная координата максимальной вариабельности по осям А, С, G или Т в i-той

позиции алаймента, соответственно. Коэффициент К выражается в условных единицах

Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 3100, USA). Для компьютерной обработки нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ DNAstar V 3.12 (Lasergene, USA).

Таблица 1.

Праймеры, использованные для амплификации мишенсвых

фрагментов ДНК.

Праймер Нуклеотидная последовательность Координаты праймера в нукпеотидах Использование праймера

GAG1 5'-CCGAACAGGGACCTGAAAGCG-3' 642-662 1-ый раунд

GAG2 5'-GTACTAGTAGTTCCTGCTATGTCAC-3' 1490-1514

ED3 5'-TAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG-3' 5957-5986

ED14 5'-TCTTGCCTGGAGCTGTTTGATGCCCCAGAC-3' 7932-7961

LTR1M 5'-AGACCCTTTTAGTCAGTGTGG-3' 601-621

GAG 13 5'-GACTAGCGGAGGCTAGAAG-3' 764-782 2-ой раунд

GAG4 5'-AATCTTGTGGGGTGGCTCCTTC-3' 1318-1339

GAG19R 5'-TGGGATACTAAATTTCAAGATCCACT-3' 1254-1271

ED5 5'-ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTG-3' 6557-6582

ED12 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCCAAGAACCCAAG3' 7782-7811

ED31 5'CCTCAGTCATTACACAGGCCTGTCCAAAG-3' 6817-6845

ED33 5'- GAGGGGAATTTTTCTACTGTAA-3' 7360-7381

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Анализ эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области.

Общая динамика роста количества ВИЧ-инфицированных на территории Липецкого региона за период 1996-2006 г.г. показала наличие трех этапов развития эпидпроцесса в области (рис. 1)

На первом этапе (1993-1998 г.г.) на территории области эпидпроцесс, связанный с распространением ВИЧ-инфекции, отсутствовал, это период единичных случаев инфицирования вирусом среди местных жителей, эпидемически связанных с ВИЧ-инфицированными с других территорий Ближнего зарубежья (Украина, Молдова)

Второй этап (1999-2001г.г.), характеризующийся резким подъемом заболеваемости ВИЧ-1 и преобладанием парентерального «наркотического» пути передачи ВИЧ-1, Однако, на данном этапе в Липецкой области среди местных жителей не было отмечено вспышки ВИЧ-инфекции в популяции ПИН, и продолжается занос ВИЧ с других территорий сезонными рабочими, переселенцами и подопечными УИНа

■ новые случен ВИЧ-мнфвюци 9 новые случян ВИЧ-ифхдои среди месмю поталей

Рисунок 1. Число новых случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных на территории Липецкой области По оси ох - годы, по оси оу - абсолютное количество ВИЧ-инфицированных в соответствующий год

С 2002 года наблюдается активное развитие эпидпроцесса ВИЧ-инфекции на территории области Основная прибавка новых случаев ВИЧ-инфекции в области происходит за счет инфицирования местных жителей, более половины случаев заражения происходит на территории области. ВИЧ-инфекция регистрируется во всех возрастных группах населения, преобладает половой путь передачи вируса, третью часть новых случаев ВИЧ-инфекции составляют женщины репродуктивного возраста, зарегистрирован первый случай вертикального пути передачи вируса от матери ребенку (рис.2) ВИЧ-инфекция зарегистрирована во всех районах области.

А)

I этап II этап III этап

■ половой путь □ в/в введение наркотиков ■ вертикальный путь

Б)

■ женщины □ мужчины

В)

100% 50%-0%

67%

60%

13%

20%

,0% 0%

10%

20%

10%

0%

7%

58% ~ 24%.

3%

I этап II этап III этап

115-19 лет □20-29 лет 1330-39 лет □ 40-49 лет ■50-59 лет

Рисунок 2 Распределение популяции ВИЧ-инфицированных пациентов на разных этапах развития эпидемии в Липецком регионе (А - по пути инфицирования, Б - по полу, В - по возрасту)

2. Молекулярно-эпидемнологическая характеристика вариантов ВИЧ-1, получивших распространение на территории Липецкой области.

В соответствии с периодизацией, выделенной в предыдущем разделе, мы изучили распространенность субтипов ВИЧ-1 на 3-х этапах эпидпроцесса ВИЧ-инфекции в Липецком регионе.

На территории Липецкой области в период 1994-1998гг. циркулировали варианты вируса, имеющие субтипы §а§А/епуА и §а§В/епуВ. Как показали результаты исследования, среди местных жителей были выявлены 2 варианта

ВИЧ-1 - gagA/envA и gagB/envB, а среди приезжих только один - gagA/envA Анализ гетеродуплексов области env пациентов с субтипом А показал высокий уровень гомологии этих участков генома, что может свидетельствовать об общности происхождения вируса, которым были инфицированы эти лица, как местные жители, так и приезжие.

В период с 1999 по 2001 на территории Липецкой области продолжали циркулировать варианты ВИЧ-1: gagA/envA и gagB/envB. При сравнении изучаемых последовательностей областей генома gag и env с имеющимися вариантами А-субтип в базе данных Los Alamos, было обнаружено, что исследуемые образцы имеют высокий процент гомологии со штаммами gagA/envA (Ac№AY829212) из Узбекистана и (Ac№AF413987) из Украины, а также, с рекомбинантным штаммом gagA/envB (Ac.№AF 193276) из Калининграда. Нуклеотидные последовательности областей env и gag генома вируса пациента, у которого был выявлен субтип В, оказались наиболее близки к канадскому штамму (Ас.№ AY779552) субтипа В. При этом вариант gagA/envA был выявлен у пациентов как с парентеральным, так и половым путем трансмиссии вируса. Эти данные показывают, что широко распространенные варианты А-субтипа ВИЧ-1, которые прежде обнаруживались в основном среди лиц, употребляющих внутривенно наркотики, теперь появляются, с высокой частотой в гетеросексуальной популяции и становятся способными к половой трансмиссии вируса

Анализ первичной последовательности вариантов ВИЧ-1, полученных от ВИЧ-инфицированных Липецкой области в период с 2002 по 2006г.г. показал, что выделенные штаммы принадлежат к трем env- и gag-субтипам А, В, С. При проведении сравнительного анализа с генетической базой данных Los Alamos наиболее близким вариантом к образцу с С-субтипом оказался штамм из Эфиопии (Ac.№AY829206), для образцов с В-субтипом это был штамм (Ac №DQ410069) из США, а образцы с А-субтипом имели наибольший процент гомологии с штаммами из Украины (Ac №AF082486, U93665) Таким образом, с 2002 по 2006 г г на территории Липецкого региона продолжают

циркулировать штаммы gagA/envA, gagB/envB, а также выявлен новый для Липецкого региона субтип gagC/envC и рекомбинантный штамм gagA/envB. Рекомбинатный вариант gagA/envB был обнаружен у женщины, которая инфицировалась при гетеросексуальном контакте на территории области, но источник инфекции был житель Калининграда, употреблявший внутривенные наркотические вещества

Анализируя полученные данные, можно отметить, что эпидпроцесс в Липецкой области отражает общероссийскую ситуацию развития ВИЧ-инфекции- доминирует вирус субтипа А. Но хотелось бы отметить, что занос инфекции на территорию региона произошел с начала развития эпидемии ВИЧ/СПИД в Украине (1994-1995гг) за счет миграции сезонных рабочих из этой страны, что существенно раньше, чем возникли вспышки заболевания на других территориях РФ, но подъема заболеваемости ВИЧ-инфекцией в области не произошло, так как ВИЧ не попал в среду ПИН.

3. Анализ генетического изменчивости области гена env ВИЧ-1, кодирующей поверхностный гликопротеин gpl20.

Сведений о направленности и характере изменчивости вариабельных и консервативных областей генома ВИЧ-1 субтипа А в литературе не много и они касаются коротких участков гена env, в частности области V3 (Лукашин, Бобков АФ, 1989). Мы провели сравнительный анализ распределения полиморфных областей у различных субтипов ВИЧ-1 и рассмотрели межсубтиповую изменчивость gpl20 Для этого из международной базы данных Лос Аламос были взяты по 45 нуклеотидных последовательностей субтипов A-D, 8 образцов субтипа F, 20 последовательностей субтипа G и 3 секвенса субтипа Н ВИЧ-1 После трансляции нуклеотидных последовательностей в аминокислотные, определили уровень изменчивости областей C1-V5 gpl20 (Willey et al, 1986, Goudsmit et al., 1989) с помощью программы ACCORD. Результаты исследования представлены в виде диаграмм (рис. 3)

и Л А Д А

Л А В

л А| А, с

¡И А А*,: О

ч А \ "и Р

А Л /и «

и - 1, V н

К1 1Р и 1 Р2 кг А РЗ Р4 члл вя КЗ 1

15РЬ

" Я

а

VI

К1мИ

Я й? и

Рисунок 3 Изменчивость аминокислотной последовательности цр120 субтипов А, В, С, Б, Б, в и Н и межсубтиповая вариабельность ВИЧ-1. Примечание. Буквами справа указаны субтипы ВИЧ-1, по оси ох - позиции ао и области §р120, начиная с 1 сигнального пептида, по оси оу - условные единицы вариабельности Ниже графика приведены координаты областей цр120 (\Villey ег а1,1986; Ооибэш« е1 а!., 1989)

Как видно из представленного рисунка, характер распределения вариабельных областей у всех вариантов вируса носит схожий характер При анализе межсубтипового профиля изменчивости §р120 мы выделили 4 вариабельные и 3 консервативные участка, которые не чередуются между собой, как было описано в литературе ранее, а следуют попарно разделенные консервативной областью. Как видно из представленных диаграмм, области межсубтиповой изменчивости в большинстве случаев совпадают с областями вариабельности отдельных субтипов. Исключение составляет область КЗ. При ее рассмотрении для отдельно взятого субтипа вируса во всех кластерах был отмечен высокий полиморфизм данного участка, но уровень изменчивости области КЗ был практически одинаков для всех рассмотренных субтипов, в результате межсубтиповая вариабельность была минимальной. КЗ участок включает в себя около 60 ао, и проецируется на области С4, У4 и У5. В позиции N-454 расположен сайт гликозилирования, который является консервативным и обеспечивает образование С04-связывающего сайта Однако в непосредственной близости от этого находится гипервариабельный участок (451-453 ао) при этом замены аминокислот в этих позициях носят ограниченный характер, что и объясняет низкий межсубтиповой уровень изменчивость данной области.

Координаты вариабельных (Р1-Р4) и консервативных (К1-КЗ) областей §р120, определенные на основании межсубтипового профиля изменчивости др120 субтипов А-О, Б, й и Н ВИЧ-1 представлены в таблице 2.

Для исследования внутрипопуляционной изменчивости были взяты нуклеотидные последовательности вариантов вируса субтипа А, получившие распространение на территории Липецкого региона Образцы лимфоцитов были собраны в период с 1996-2006гг. Материалы от пациентов получали сразу же после постановки диагноза ВИЧ-инфекция По данным эпиданамнеза, промежуток времени от момента инфицирования до забора образца составлял в большинстве случаев не более 2 лет, у пациентов регистрировали первые стадии ВИЧ-инфекции (2А-2В), Для анализа мы использовали фрагмент 120,

включающий области У1-С5 (МИеу, Ооиёзпи!, 1989) соответствующие 130-511 ао Как видно из рисунка 4, профиль изменчивости полиморфизма gpl20 в изучаемой популяции носит иной характер распределения вариабельных областей, чем для субтипа А и ВИЧ-1 рассмотренные выше Пики вариабельности соответствовали следующим областям 150-165ао (Р1), 210-225ао (Р2) и 390-420 ао (Р4).

Таблица 2

Координаты вариабельных и консервативных областей gpl20

Область цр120 Координаты ао

К1 30-120

Р1 120-165

Р2 165-225

К2 255-330

РЗ 330-390

Р4 390-450

КЗ 450-511

Примечание В таблице координаты аминокислотной остатков приведены, начиная с первого сигнального пептида §р120

Отсутствие вариабельной зоны РЗ и низкий уровень полиморфизма §р120 в изучаемой популяции, возможно, является отражением того, что исследованные образцы были получены от пациентов на ранних стадиях ВИЧ-инфекции, когда в организме больного преобладают М-тропные варианты вируса

Для сравнения был проведен ретроспективный анализ изменчивости §р120 вариантов вируса субтипом в ВИЧ-1 для популяции пациентов Ростово-Элистинской вспышки 1989 года. К моменту забора исследованных образцов период инфицирования составлял более 8 лет, пациенты находились в стадиях

ЗБ-4 ВИЧ-инфекции Взятые для анализа фрагменты др 120, включали области VI-С5 гена ёр 120, соответствовали 130-511 ао

04 03 02 0.1 0

-»-субтип А

-«-варианты вируса субтипа А нацистов Липецкой области

Рисунок 4. Изменчивость аминокислотной последовательности §р120 субтипа А и вариантов вируса пациентов Липецкой области По оси ох - позиции ао и области §р120, начиная с 1 сигнального пептида; по оси оу - условные единицы вариабельности

□ 4

0,3 02 0,1

о

-«-субтип С

-♦варианты вируса субтипа в падоетов Росгово-Элистинской всгъшжи

Рисунок 5 Изменчивость аминокислотной последовательности §р120 субтипа в и популяционная изменчивость вариантов вируса Ростово-Элистинской вспышки (образцы 2000года). По оси ох - позиции ао и области §р120, начиная с 1 сигнального пептида, по оси оу - условные единицы вариабельности

Характер распределения вариабельных областей (рис 5) в данной популяции полностью соответствует уровню полиморфизма Бр120 для всего

субтипа в ВИЧ-1 рассмотренного вьппе. Пики изменчивости аминокислотной последовательности §р120 в этой группе включают области 150-225 ао, 330-390 ао, 405-450 ао , 495-511 ао.

Кроме того, из международной базы данных Лос Аламос, нами были отобраны секвенсы вариантов субтипа в ВИЧ-1 Ростово-Элистинской вспышки, полученные от пациентов в 1992 году на ранних стадиях ВИЧ-инфекции, как и в случаи с пациентами с субтипом А. Фрагменты 120 включали области УЗ-С5 гена §р120, соответствующий 300-511 ао

Рисунок 6 Изменчивость аминокислотной последовательности др120 субтипа в и популяционная изменчивость вариантов вируса Ростово-Элистинской вспышки (образцы 1992 года). По оси ох - позиции ао и области ^>120, начиная с 1 сигнального пептида; по оси оу - условные единицы вариабельности

Анализ профиля изменчивости фрагмента дрПО в данной группе пациентов (рис.6) характеризовался низким уровнем вариабельности и наличием только одной области изменчивости Р4 (390-450ао), как и в популяции пациентов из Липецкой области с субтипов А. Таким образом, появление вариабельных областей в структуре 120 субтипа в популяции 2000 года, является отражением того, что данная популяция находится на поздних стадиях ВИЧ-инфекции, и преобладанием Т-тропного варианта вируса

0,4

1 30 120 165 225 330 390 450 511 -♦- субтип б

-ф-щияты труса субтала С пйииенго» Ростово-Элистинской вспышки

Таким образом, на основании проведенного анализа можно сделать вывод что, межсубтиповая изменчивость gpl20 ВИЧ-1 как показатель эволюции вируса является отражением полиморфизма внутри субтипа, который определяется функциональной нагрузкой той или иной области в жизненном цикле вируса, тем самым, определяя его фенотип - тропизм, цитопатичность, синцитийобразующую способность, скорость репликации.

Проведенное исследование показало, что области вариабельных и консервативных участка гена епу яр120 ВИЧ-1, описанные в литературе ранее в настоящий момент имеют несколько другие границы и требуют дополнительного изучения

4. Дупликации вариабельных областей гена едо, кодирующего gpl20.

Как было описано выше, наиболее вариабельными областями фрагмента гена, кодирующего §р120 в популяции пациентов, инфицированных субтипом А ВИЧ-1 из Липецкого региона, являются участки с координатами 6608-6878нп (135-225ао) (Р1-Р2) и 7263-7398нп (420-450ао) (Р4) (координаты последовательности штамма НХВ2 ВИЧ-1) Изучение первичной последовательности указанных областей показало, что его полиморфизм связан с различными мутационными процессами в данных участках гена епу Нами были проанализированы 28 нуклеотидных последовательностей вариантов вируса субтипа А Процент выявленных трансверсий, транзиций указан в таблице 3

Таблица 3

Процент трансверсий и транзицийв вариабельных областях

(Р1, Р2, Р4).

Область гена епу {>р120 транзиций трансверсий

Р1 1,8% 1,0%

Р2 2,6% 0,14%

Р4 1,6% 1,0%

Наибольший процент транзиций выявлен в области Р2 (2,6%), в областях Р1 и Р4 был одинаковый процент трансверсий (1,0%). Кроме различных замен нуклеотидов в изучаемых последовательностях были обнаружены вставки, по своему составу представляющие собой дуплицированный участок нуклеотидной последовательности

Дупликация представляет собой тип перестройки, заключающийся в удвоении какого-либо участка гена, который могут образовываться как в результате мутационных, так и рекомбинационных процессов и является важнейшим фактором эволюции генов

На рис. 7 представлены типичные дупликации в нуклеотидной последовательности.

А) attgtactgaaccccgccacaacagta---------------------------gcattagat

Б) attgtaCTGAACCCCGCCACAACAGTA---СТОЯАССССвСЗЛСААТАСеСЛ-----ttagat

aatgtactgaaccCATTAGCGTTAACAGCAA—САТСАВСвТТАТСАОСАА---gcattagat

Рисунок 7. Нуклеотвдные дупликации (А - последовательность без повтора, Б~ последовательности с разными дупликациями)

Примечание Дуплицированные участки подчеркнуты и выделены жирным шрифтом

С помощью программы СшбЫ КЫАйэЫ, были построены вторичные структуры РНК участков, образующихся повторам. В результате были получены шпилечные структуры, которые включали в себя стебель, состоящий из 6-12 нуклеотидов и петлю из 5-10 нуклеотидов (рис.8)

Рисунок 8 Варианты шпилечных структур области %р!20

Среди 28 рассмотренных нуклеотидных последовательностей дупликации были обнаружены во всех образцах, но количество повторов и их состав был различным. Нуклеотидные повторы вариабельных областей гена епу §р120 имели свои структурные особенности. Дупликации в области Р1 были обнаружены во всех образцах, длина их составляла 15-30 нп, в 9 случаях структура повторов была одинаковой В области Р2 дупликации были обнаружены в 11 образцах, они различались по своему составу, а их длина не превышала 21нп В области Р4 дуплицированные участки имели длину 21-30нп Идентичный нуклеотидный повтор был в 11 случаях.

Трансляция, выявленных дупликаций нуклеотидных последовательностей в аминокислотную показала, что в результате дупликации происходит удвоение сайта гликозилирования или дупликация находится в непосредственной близости от него. В области Р1 дупликации выявлялись в позициях сайтов гликозилирования N-141 или N-146, а в области Р4 в непосредственной близости от сайта N-420, в то же время, в участке Р2 дуплицированные повторы не были связаны с №гликанами. Таким образом, появление дупликаций, а именно, увеличение количества сайтов гликозилирования в др 120, может указывать на переход вируса от использования первичного ССЯ5 рецептора (М-тропного типа вируса) к целому спектру различных рецепторов, главным из которых является СХС114, в результате чего меняется клеточный тропизм вируса, он становится Т-тропный, что способствует увеличению скорости репликации ВИЧ-1 и прогрессированию развития инфекции в организме больного.

Механизм возникновения дуплицированных участков гена до конца не изучен. Как один из возможных механизмов образования дупликаций можно рассмотреть процесс, протекающий одновременно с обратной транскрипцией, когда в результате считывания геномной РНК происходит подтягивание и фолдирования 3' -концевого участка, в результате чего возможно образование шпилечной структуры и повторное чтение одного и того же фрагмента гена. Схема формирования шпилечной структуры представлена на рисунке 9

'З^ »

jT*

* к I

—ÎL^.

® ' A В

Рисунок 9 Схема формирования шпилечной структуры в процессе обратной транскрипции.

5. Анализ консервативного региона генома ВИЧ-1.

В качестве контрольной области была взята последовательность, кодирующая матриксный белок р17 Данная область гена gag ВИЧ-1 является высоко консервативной, и имеет большое значение на разных этапах жизненного цикла ВИЧ-1.

В работе было использовано 38 образцов ДНК, выделенных из лимфоцитов ВИЧ инфицированных пациентов Липецкой области в период 1996-2006г.г. В результате амплификации был получен фрагмент гена gag размером 528 нуклеотидов, кодирующий матриксный белок р17 и N-концевую область р24.

Нами был проведено определение уровня изменчивости нуклеотидной последовательности матриксного белка р17 для вариантов ВИЧ-1 gagA-субтипа у пациентов с половым и парентеральным путем трансмиссии вируса При сравнении консенсусных последовательностей вариантов вируса процент гомологии был очень высок и составлял 99,7% Однако изменчивость гена gag в группе ПИН была выше, чем среди пациентов инфицированных половым путем, и составляла 1,9% и 1,2% соответственно при (р<0,5) Эти данные показывают, что широко распространенные варианты ВИЧ-1 gagA-субтипа, которые прежде обнаруживались в основном среди лиц, употребляющих

внутривенно наркотики, теперь появляются, с высокой частотой в гетеросексуальной популяции и становятся способными передаваться половым путем

6. Изучение вторичной структуры 5'-нетранслируемой области геномной РНК ВИЧ-1.

Были амплифицированы специфические фрагменты нуклеотидных последовательностей для 25 образцов субтипа А ВИЧ-1 длиной 546 нп, включающие в себя 5'-концевую область геномной РНК, соответствующую трем шпилечным структурам. Мы рассмотрели какие структуры шпилек DIS, SD и встречаются среди вариантов субтипа А ВИЧ-1 Липецкой области. Алаймированные образцы, полученных фрагментов, отличались высоким уровнем консервативности, процент их гомологии составил 93,4% С помощью программы Crustal RNAfold, были построены вторичные структуры 5'-концевой области геномной РНК.

шпилька формировалась из 12-14 нуклеотидов. Ее вторичная структура практически во всех случаях имела стебель, образованный 10 нуклеотидами и петлю из 4 нуклеотидов (рис 10 А), только в одном образце шпилька имела укороченный стебель из 8 нуклеотидов (рис 10 Б)

гтф

А Б

Рисунок 10. Варианты шпильки.

В 20 изученных образцах шпилька БО имела удвоенную форму, состоящую из 19 нуклеотидов (рис 11 А). В остальных пробах вторичная структура данной шпильки отличалась незначительно. В двух случаях она имела укороченный второй стебель на одну нуклеотидную пару (рис 11 Б), в

трех образцах этот стебель исчезал с формированием петли из 9-11 нуклеотидов (рис.11 В,Г)

"Ъ

А

Б

В

Г

Рисунок 11. Варианты БР- шпильки.

ОК-шпилька сворачивалась в сложную вторичную структуру из 35 нуклеотидов в 24 последовательностях (рис.12 А). В одном секвенсе шпилька в результате замены нуклеотида теряла свои внутренние петли и формировала простую структуру из длинного стебля и петли (рис. 12 Б).

Рисунок 12. Варианты DIS- шпильки

Таким образом, можно отметать, что в области генома ВИЧ-1 субтипа А, охватывающей шпильки DIS, SD и встречаются только те мутации, которые не приводят к значительным изменениям их вторичной структуры

А

Б

Выводы.

1. Характер распространения ВИЧ-инфекции на территориях с низким уровнем превалентности этого заболевания, рассмотренный на модели Липецкой области, отличается от территорий с высоким уровнем распространенности ВИЧ-1 и имеет ряд особенностей: доминирует половой путь передачи инфекции; низкая скорость распространения ВИЧ-1 среди местных жителей; резкие изменения динамики нарастания новых случаев обусловлены, так называемым «миграционным компонентом» (сезонными рабочими, переселенцами и подопечными УИНа).

2. Установлено, что на территории области циркулируют 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA, gagB/envB, gagC/envC и рекомбинант gagA/envB Преобладающим является субтип gagA/envA , который был выявлен в 82% случаев от числа обследованных лиц

3 В структуре gpl20 выявлены 4 полиморфные (Р) и 3 консервативные (К) области, которые имеют координаты К1-30-120ао, Р1-120-165ао, Р2-165-225ао, К2-225-330ао, Р3-330-390ао, Р4-390-450ао и К3-450-511ао Аналогичные данные были получены при анализе полиморфизма нуклеотидных последовательностей этих областей

4 Ранние этапы ВИЧ-инфекции характеризуются низким уровнем полиморфизма gpl20 и отсутствием вариабельности в области РЗ (330-390ао).

5. Консенсусные последовательности области гена gag, кодирующего матриксный белок р17, вариантов ВИЧ-1 от пациентов с половым и парентеральным путем трансмиссии имеют высокий процент гомологии (99,7%) Полиморфизм этого фрагмента в группе ПИН достоверно превышает этот показатель среди пациентов с половой трансмиссией вируса, и составляет соответственно 1,9% и 1,2% при (р<0,05)

Список опубликованных работ.

1 Пазилин A.C., Леликова Г.И., Кириллова Л.Д, Гараев М.М. Субтипирование области gag вариантов вируса иммунодефицита человека типа 1, распространенных на территории Российской Федерации. // Мат. 10 международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», Санкт-Петербург, 21-22 мая 2002, с.65.

2. Гараев ММ., Пазилин A.C., Леликова Г.И., Никитина ЛД, Кириллова Л.Д. Генотипирование области gag вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа с гетеросексуальным путем трансмиссии. // В сб. Профилактическая медицина - практическому здравоохранению ММА им И.М.Сеченова Москва.-2003 -стр.292-297.

3. Турбина Г.И., Соломенцева М.Л, Кириллова Л.Д., Никитина Л.Д., Гараев М М Эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области в период 1993-2005г.г//Вопросы вирусологии-2006.-№6 -С19-22.

4. Турбина Г.И., Кириллова Л.Д, Гараев М.М.. Молеклярно-эпидемиологическая характеристика вариантов ВИЧ-1, получивших распространение на территории Липецкой области // Ж Микробиол. Эпидемиол. Иммунол. в печати.

Vf

Заказ № 288. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www postator ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Турбина, Галина Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура вириона ВИЧ-1.

1.2. Организация генома ВИЧ-1.

1.3. Особенности репликации вируса.

1.3.1. Связывание вириона с поверхностью клетки.

1.3.2. Слияние клеточной и вирусной мембран.

1.3.3.Высвобождение нуклеоида и геномной РНК вируса.

1.3.4. Обратная транскрипция.

1.3.5. Интеграция.

1.3.6. Транскрипция провирусной ДНК.

1.3.7. Трансляция вирусных белков.

1.3.8. Вирусные белки.

1.3.9. Образование новых вирионов.

1.4. Механизмы генетической изменчивости ВИЧ-1.

1.4.1.Скорость репликации ВИЧ-1, квазивиды, жизнеспособность.

1.4.2. Естественный отбор.

1.4.3. Вариабельность гена env ВИЧ-1.

1.5. Классификация ВИЧ-1.

1.6. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в мире.

1.7. Эпидемия ВИЧ-1 в России. Распространение субтипов ВИЧ-1.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.90.

2.1. Пациенты.

2.2. Забор крови и выделение лимфоцитов.

2.3. Выделение тотальной ДНК.

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.5. Электрофорез ДНК.

2.6. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.

2.7. Построение алайментов и филогенетический анализ.

2.8. Анализ вариабельности областей gag и env.

2.9. Анализ электрофоретической подвижности гетеродуплексов.

2.10. Разработка метода типирования штаммов ВИЧ-1 для области gag с использованием ПГД.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области.

3.2.Молекулярно-эпидемическая характеристикавариантов ВИЧ-1, получивших распространение на территории Липецкой области.

3.2.1. Анализ генетической изменчивости области гена env ВИЧ-1, кодирующей поверхностный гликопротеин gpl20.

3.2.2. Дупликации вариабельных областей гена env, кодирующего gpl20.

3.2.3. Анализ консервативного региона ВИЧ-1.

3.2.4. Изучение вторичной структуры 5'-нетранслируемой области геномной РНК ВИЧ-1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-эпидемиологический анализ ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области"

Распространение ВИЧ-инфекции в мире носит характер пандемии. В Российской Федерации и странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются одни из самых высоких в Восточной Европе темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции, что связано с началом крупномасштабной^ эпидемии в.этом регионе только в середине 90-х годов (Российский комитет защиты мира, 2006). Общее число зарегистрированных случаев* ВИЧ-инфекции в РФ на 31.08.07г. составляет 390365 человек, из них 2642 ребенка. За 8 месяцев 2007 год выявлено 28974 новых случаев ВИЧ-инфекции, что на 12% больше, чем за аналогичный период 2006 года. Большинство случаев ВИЧ-инфицирования связано с инъекционным употреблением наркотиков (70%), однако, отмечается четкая тенденция ежегодного увеличения числа случаев передачи вируса половым путем. В 2006 году он превысил 50% всех новых случаев заражения (Покровский В.В., Савченко И.Г., Ладная Н.Н., 2006).

Необходимо отметить, что эпидемия ВИЧ-инфекции в России имеет неравномерный характер распространения. ВИЧ-инфицированные граждане зарегистрированы на всех 89 административных территориях страны, однако, согласно данным Российского Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИД, около 60% от абсолютного числа всех зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции сконцентрированы в 10 субъектах: Свердловская область (32064 чел.), Московская область (30369 чел.), г. Санкт-Петербург (33688 чел.), Самарская область (28319 чел.), г.Москва (28807 чел.), Иркутская область (22260 чел.), Челябинская область (16967 чел.), Оренбургская область (16161 чел.), ХантььМансийский АО (10832 чел.), Ленинградская область (11553 чел.). Помимо территорий с высоким уровнем ВИЧ-инфекции в РФ отмечены регионы, где количество инфицированных не превышает 50 человек на 100 тыс. населения, и таких регионов 38, в них проживает четвертая часть всего населения РФ

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение особенностей течения эпидемического процесса на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-1, а также, исследование молекулярно-генетических и молекулярно-эпидемиологических характеристик вариантов ВИЧ-1, получивших распространение в Липецкой области. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gag (782-1318 но), гена env (6582-7782 но) и 5-нетранслируемой области (662-788 но) генома вариантов ВИЧ-1, получивших распространение на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-инфекции (координаты указаны по нуклеотидной последовательности НХВ2 GeneBank).

2. Провести субтипирование полученных первичных последовательностей вариантов ВИЧ-1 от пациентов Липецкой области.

3. На основании филогенетического анализа определить степень гомологии вариантов вируса в. изучаемой популяции от пациентов с различным эпиданамнезом, а также сравнить уровень их генетической близости с известными штаммами ВИЧ-1 международной базы данных GeneBank.

4. Изучить характер мутаций гипервариабельных участков исследуемых областей генома вариантов gagA/envA ВИЧ-1, получивших распространение на территории с низким уровнем превалентности ВИЧ-1 (Липецкой области).

Научная новизна работы.

1. Впервые показано, что эпидемия ВИЧ-инфекции на территориях с низким уровнем превалентности ВИЧ-1 это вялотекущий эпидпроцесс среди местного населения в основном, связанный с половыми контактами, без широкого распространения среди наркоманов. Основной вклад в увеличение численности ВИЧ-инфицированных на таких территориях вносит, так называемый, «миграционный компонент», который формируется за счет временной миграции жителей данного региона на территории с взрывным характером распространения вируса, либо за счет иммиграции населения с территорий с высоким уровнем ВИЧ-инфекции (иммигранты, сезонные рабочие и т.д.).

2. Получены молекулярно-эпидемиологические данные о вариантах вируса иммунодефицита человека 1-го типа, получивших распространение на территории Липецкой области в период с 1994 по 2006 годы. На территории области обнаружены 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA (82%), gagB/envB (11%), gagC/envC (3,5%) и рекомбинант gagA/envB (3,5%). Установлена генетическая близость вариантов gagA/envA, циркулирующих на территории Липецкого региона, с изолятами, выделенными на территории Ближнего зарубежья (Украины, Молдовы). Данные филогенетического анализа образцов свидетельствуют о заносе вируса gagA/envA на территорию региона из очага ВИЧ-инфекции в Украине, который был осуществлен за счет «миграционного компонента» (сезонные рабочие, переселенцы) из этой страны.

3. При анализе генетического полиморфизма области env генома ВИЧ-1, было установлено, что кроме мутаций в виде трансзиций и трансверсий присутствуют дупликации 15-30 нуклеотидов в Р1-Р2 и Р4 областях. В 28 исследованных образцах число дупликаций и количество повторяющихся нуклеотидов было различным.

4. При изучении 5'-нетранслируемой области геномной РНК ВИЧ-1 в вариантах вируса субтипа А, выделенных от пациентов Липецкой области, было установлено, что область, охватывающая шпильки DIS, SD и отличается высоким уровнем консервативности и встречающиеся в них замены не приводят к значительным изменениям их вторичной структуры.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Изучен эпидпроцесс ВИЧ- инфекции на территории Липецкой области с низким уровнем превалентности этого заболевания. Полученные данные показывают, что динамика выявляемости ВИЧ-инфицированных в Липецкой области отражает общероссийскую ситуацию развития ВИЧ-инфекции, но эпидемический процесс имеет ряд особенностей. Установлено, что основной вклад в число выявленных ВИЧ-инфицированных вносят лица, так называемый «миграционный компонент» (сезонные работы, переселенцы из стран ближнего зарубежья, заключенные УИН) для которых основной путь инфицирования - потребление внутривенных наркотиков. Среди местных жителей распространение ВИЧ инфекции идет преимущественно за счет полового пути передачи. Таким образом, эпидемия ВИЧ-инфекции на территории РФ носит неоднородный характер, на территориях с высоким уровнем превалентности ВИЧ - в виде вспышек при попадании вируса в популяцию наркоманов, а в регионах с низким уровнем распространенности -вялотекущий эпидпроцесс среди местного населения в основном, связанный с половыми контактами, без широкого распространения среди наркоманов.

2. На основании молекулярно-эпидемиологических данных, установлено, что на территории^ области обнаружены 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA, gagB/envB, gagC/envC и рекомбинант gagA/envB, Преобладающим является субтип gagA/envA , который был выявлен в 82% случаев от числа обследованных лиц.

3. Изучение первичной структуры нуклеотидной последовательности области гена env, кодирующего gpl20, вариантов ВИЧ-1 субтипа А у пациентов Липецкого региона, показало, что ранние этапы ВИЧ-инфекции характеризуются низким уровнем полиморфизма этого участка генома вируса.

4. Шпилечные структуры 5'-концевой области геномной РНК ВИЧ-1 в вариантах субтипа А вируса, выделенных от пациентов Липецкой области отличаются высоким уровнем консервативности их нуклеотидного состава и вторичных форм.

5. Полиморфизм участка гена gag, кодирующего матриксный белок р17, вариантов субтипа А ВИЧ-1 у пациентов Липецкого региона в группе ПИН достоверно превышает этот показатель среди пациентов с половой трансмиссией вируса, и составляет соответственно 1,9% и 1,2% при (р<0,05).

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы опубликованы в 2 статьях, 2 тезисах.

Личный вклад диссертанта заключается в проведении основной части экспериментов - сбор материала и создание банка реципрокных сывороток и лимфоцитов от ВИЧ-инфицированных пациентов, определение нуклеотидной последовательности gag и env- фрагментов и субтипирование ВИЧ-1. В международной базе данных GeneBank зарегистрированы 47 нуклеотидных последовательностей области гена gag, кодирующей матриксный белок р17 и N-концевую часть белка р24 (Ас.№ EF 119574199588, EF 121245-121272, EF 139232-129236), и 32 последовательности области генома env, кодирующей поверхностный гликопротеин gpl20 (Ac.№.EF 121273-121304), вариантов ВИЧ-1 выделенных от пациентов Липецкого региона.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Турбина, Галина Ивановна

выводы

1. Характер распространения ВИЧ-инфекции на территориях с низким уровнем превалентности этого заболевания, рассмотренный на модели Липецкой области, отличается от территорий с высоким уровнем распространенности ВИЧ-1 и имеет ряд особенностей: доминирует половой путь передачи инфекции; низкая скорость распространения ВИЧ-1 среди местных жителей; резкие изменения динамики нарастания новых случаев обусловлены, так называемым «миграционным компонентом» (сезонными рабочими, переселенцами и подопечными УИНа).

2. Установлено, что на территории области циркулируют 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA 1, gagB/envB, gagC/envC и рекомбинапт gagAl/envB. Преобладающим является субтип gagA/envA , который был выявлен в 82% случаев от числа обследованных лиц.

3. В структуре gpl20 выявлены 4 полиморфные (Р) и 3 консервативные (К) области, которые имеют координаты К1-30-120ао, Р1-120-165ао, Р2-165-225ао, К2-225-330ао, Р3-330-390ао, Р4-390-450ао и КЗ-450-5llao. Аналогичные данные были получены при анализе полиморфизма нуклеотидных последовательностей этих областей.

4. Ранние этапы ВИЧ-инфекции характеризуются низким уровнем полиморфизма gpl20 и отсутствием вариабельности в области РЗ (330-390ао).

5. Консенсусные последовательности области гена gag, кодирующие матриксный белок р17, вариантов ВИЧ-1 от пациентов с половым и парентеральным путем трансмиссии имеют высокий процент гомологии (99,7%). Полиморфизм этого фрагмента в группе ПИН достоверно превышает этот показатель среди пациентов с половой трансмиссией вируса, и составляет соответственно 1,9% и 1,2% при (р<0,05).

Благодарности. Автор выражает особую благодарность научному руководителю доктору биологических наук, профессору Гараеву Мансуру Мухамедовичу за постоянную помощь, внимание к работе и ценную помощь при написании и оформлении диссертации.

Автор благодарит сотрудников организационно-методического отдела и отдела диспансеризации ГУЗ «Липецкий областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» Кириллову Л.Д., Соломенцеву М.Л., Коннову Т.Н., Щепинову О.Н., Тонких О.С., Клевцову И.В. за помощь в сборе клинических образцов и предоставленные эпидемиологические данные.

Автор благодарит всех сотрудников лаборатории биотехнологии Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского за помощь при проведении экспериментальных работ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди огромного разнообразия РНК-содержащих вирусов, вирус иммунодефицита человека обладает наибольшим уровнем генетической изменчивости. К настоящему моменту варианты ВИЧ-1 разделяют на три группы «О», «N» и «М» (Robertson, 2000). Наибольшее распространение получила группа «М», которая обеспечивает в настоящее время пандемию вируса в мире (Stanecki КА., 2004, Кожокин Е.М., Мазус А.И. и соав.2006).

Несмотря на огромное количество информации по распространению генетических вариантов вируса в мире и в России в частности, основная масса работ посвящена анализу распространения субтипов ВИЧ-1 на территориях с высоким уровнем превалентности ВИЧ-инфекции. Но практически нет данных о вариантах,ВИЧ-1, получивших распространение на территориях с низким уровнем распространенности данной инфекции. В связи с этим была предпринята попытка изучить особенности течения эпидемического процесса, а также дать оценку с точки зрения молекулярной эпидемиологии вариантов ВИЧ-1, получивших распространение в Липецкой области, регионе, где уровень распространенности ВИЧ-1 не превышает 50 человек на 100 тысяч жителей.

На первом этапе нашего исследования было установлено, что эпидемия ВИЧ-инфекции на территориях с низким уровнем превалентности ВИЧ-инфекции это вялотекущий эпидпроцесс среди местного населения в основном, связанный с половыми контактами, без широкого распространения среди наркоманов. Основной вклад в увеличение численности ВИЧ-инфицированных на таких территориях вносит, так называемый «миграционный компонент».

Данные молекулярно-эпидемиологического анализа показали, что на территории Липецкой области в период с 1994 по 2006 годы циркулировали 4 варианта ВИЧ-1 с генотипами gagA/envA (82%), gagB/envB (11%), gagC/envC (3,5%) и рекомбинант gagAl/envB (3,5%). Была установлена генетическая близость вариантов gagA/envA, циркулирующих на территории Липецкого региона, с изолятами, выделенными на территории Ближнего зарубежья (Украины, Молдовы). Данные филогенетического анализа образцов свидетельствуют о заносе вируса gagA/envA на территорию региона из очага ВИЧ-инфекции в Украине, который был осуществлен за счет «миграционного компонента».

Для получения молекулярно-генетических характеристик вариантов ВИЧ-1, получивших распространение в Липецкой области, проводили изучение полиморфизма гипервариабельных и консервативных областей генома вируса. В качестве гипервариабельной области генома ВИЧ-1 исследовали фрагмент гена env, кодирующий поверхностный гликопротеин gpl20, в качестве консервативной области - ген gag, кодирующей матриксный белок р 17 и N-концевую часть белка р24.

Анализ генетической изменчивости фрагмента гена env, кодирующего gpl20 ВИЧ-1, показал, что полиморфизм Р1-Р2 и Р4 областей, обусловлен не только мутациями в виде трансзиций и трансверсий, а также наличием дуплицированных участков нуклеотидной цепи. Повторы были обнаружены во всех 28 изученных последовательностях и отличались по числу дупликаций и их нуклеотидному составу.

При рассмотрении межсубтиповой вариабельности и полиморфизма внутри отдельно взятого субтипа gpl20 ВИЧ-1, мы обнаружили, что области вариабельных и консервативных участков гена env gpl20 ВИЧ-1, отличаются от описанных в литературе ранее.

При изучении полиморфизма gag-области р17 вируса генотипа gagA в популяциях ВИЧ-позитивных с половым и парентеральным путем инфицирования, нам не удалось обнаружить различий между консенсусными последовательностями вариантов ВИЧ-1 в этих группах. Однако, уровень изменчивости гена gag, кодирующего р17, у внутривенных наркоманов был достоверно выше, чем у лиц, инфицированных при сексуальном контакте (1,9 и 1,2%, соответственно, при р<0,05). Эти данные показывают, что широко распространенные варианты ВИЧ-1 gagA-субтипа, которые прежде обнаруживались в основном среди ПИН, теперь появляются, с высокой частотой в гетеросексуальной популяции и становятся способными передаваться половым путем.

Изучение5-нетранслируемой области геномной РНК ВИЧ-1 вариантов вируса субтипа А, выделенных от пациентов Липецкой области, показало, что шпилечные структуры DIS, SD и формирующиеся в данном участке генома отличается очень высоким уровнем консервативности, а встречающиеся в ней замены не приводят к значительным изменениям их вторичной структуры.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что в результате проведенной работы с использованием молекулярно-биологических и молекулярно-генетических методов исследования были установлены особенности течения эпидемического процесса на территориях с низким уровнем превалентности ВИЧ-1, изучена распространенность субтипов вируса на территории Липецкого региона, а также определены молекулярно-генетические характеристики вариантов вируса циркулирующих на данной территории.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Турбина, Галина Ивановна, Москва

1. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Селимова JI.M. Молекулярная и вирусологическая специфика эпидемии ВИЧ-инфекции в России и странах СНГ. // Вестн. Рос. Акад. Мед. Наук 2003. - С.83-85.

2. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Бобкова М.Р., и др. Молекулярно-генетическая характеристика ВИЧ-1 на территории России. // Вестн. Рос. Акад. Мед. Наук 2002. -№8 - С.40-42.

3. Бобков. А.Ф., Казеннова Е.В., Селимова JI.M. и др. Субтипы ВИЧ-1 в России. // Ж. Микробиол.- 1999. -№4 С.43-45.

4. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Бобкова М.Р., и др. Генетический анализ вариантов вируса иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-1), циркулирующих среди наркоманов в Москве и Московской области // Ж. Микробиол. Эпидемиол. Иммунол. 2000. -№4 - С. 19-21.

5. Бобков А.Ф., Покровский В.В., Селимова JI.M. и др. Генетическое разнообразие вирусов иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-1) на территории России.// ДАН.- 1997.- Т.353.-С.822-824.

6. Зарудная М.И., Коломеец И.Н. Первичная и вторичная структуры области геномной РНК ВИЧ-1.// Биохимия клетки 2004. -№1 - С.46-49.

7. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф. Подтипы вируса иммунодефицита человека 1-го типа: классификация, происхождение и распространение в Европе// Ж. Микробиол. Эпидемиол. Иммунол. 2003. -№1 - С.90-96.

8. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф.,Селимова Л.М. и др. Анализ субтипов гена gag вариантов ВИЧ-1, выделенных в России методом сравнительной оценки электрофоретической подвижности гетеродуплексов.// Вопросы вирусологии,- 2001.-Т.46.-С. 12-16.

9. Ладная Н.Н., Покровский В.В., Бобков А.Ф. и др. Распределение субтипов ВИЧ-1 в России.// Эпидемиология и инфекционные болезни.-1998.- №3.-С.19-23.

10. Покровский В.В., Савченко И.Г., Ладная Н.Н. и др. ВИЧ- инфекция.

11. Информационный бюллетень №36. Российский научно- методический центр по профилактике и борьбе со СПИД. М.,2006

12. Покровский В.В., Ерамова И.Ю. и др. Внутрибольничная вспышка ВИЧ инфекции в Элисте. // Ж. Микробиол.Эпидемиол. Иммунол. 1990. -Т.4. - с.17-23.

13. Ржанинова А.А. Антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита человека. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

14. Суханова А.Л., Казеннова Е.Б., Бобкова М.Р. и др. Варианты вируса иммунодефицита человека 1 типа, обнаруженные в России среди инфицированных половым путем. // Вопросы вирусологии.- 2004.-№4.-С.4-7.

15. Турбина Г.И., Соломенцева М.Л.,. Кириллова Л.Д., Никитина Л.Д., Гараев М.М. Эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области в период 1993-2005г.г. //Вопросы вирусологии.-2006.-№6.-С 19-22.

16. Шмальгаузен И.И. Пути и закономерности эволюционного процесса. Избранные труды.-М.: Наука, 1983.-360 с.

17. Ahlguist Р, Noueiry АО, Lee W-M, Kusher D.B. Host factors in positive-strand RNA-virus genome replication. //J. of Virol.- 2003.- 77(15):8181-86

18. Albert J. and Fenyo E.M. Simple, sensitive and specific detection of HIV-1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers. // J.Clin. Microbiol. 1990. - V.28 - P. 1560-1564.

19. Allen P, Collins B, Brown D, Hostomsky Z, Gold L. A specific RNA structural motif mediates high affinity binding by the HIV-1 nucleocapsid protein (NCp7). //J. of Virol.- 1996.-V.225-P.306-315

20. Amara A., Litfman DR. After Hrs with HIV: master of the host cell. Genome Biology, 2001, 2 (11): http://genomebiology.eom/2001/2/l 1 /reviews/1030.1.

21. Bedinger P, Moriarty A, von Borstel RC et al. Internalization of the human immunodeficiency virus does not require the cytoplasmic domain of CD4. // Nature 1988. - V.334. - P. 162-165.

22. Bennetts, В. H., Teutsch, S. M., Buhler, M. M. et al. The CCR5 deletion mutation fails to protect againstmultiple sclerosis. // Human Immunology -1997.-V.58.-P. 52-59.

23. Berger EA, Murphy PM, Farber JM. Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: Roles in viral entry, tropism, and disease. // Annu. Rev. Immunol. -1999.-V.17.-P. 657-700.

24. Bobkov A.F., Cheingsong-Popov R., Selimova L. et al. An HIV type 1 among injecting drug users in the former Soviet Union caused by a homogeneous subtype A strain. // AIDS Res. Hum. Retrovirus 1997. - V. 13. - P. 19951201.

25. Bobkov A.F., Kazennova E., Selimova L. et al. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A. // J. Med. Virol.- 2004.-V.74(2).-P.191-196.

26. Bordier B, Tarrago-Litvak L, Sallafranque-Andreola ML. et al. Inhibition of the p66/p51 form of human immunodeficiency virus reverse transcriptase by tRNA(Lys). //Nucleic Acids Res. 1990. - V.ll. -P. 429-436.

27. Bour S, Streber K. The HIV-1 Vpu pronein: a multifunctional enhancer of viral particle release. Microbes and infection, 2003, 5: 1029-1039

28. Brautigam C. A., Steitz T. A. Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. - V.8. - P. 54-63.

29. Bukrinsky MA. A hard way to the nucleus. // Molecular, Medicine. 2004.-№10,- C.l-6.

30. Butsch off Boris-Lowrie K. Destiny of unspliced retroviral RNA: ribosome and/or virion? // J. of Virol.- 2002.-V. 76.- P.3089-3094.

31. Catasti P, Bradbury M. E. Gupta G. Structure and Polymorphism of HIV-1 Third Variable Loops. // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - №.14. - P. 82368242.

32. Cen S, Niu M, Heiman L. The connection domain in reverse transcriptase facilitates the in vivo annealing of tRNALys3 to HIV-1 genomic RNA. // Retrovirology 2004. - V.19. - P.33.

33. Check E. Gene regulation: RNA to the rescue? // Nature -2004.-V.425(6953).-P.10-12

34. Cheng-Mayer C., Seto D., Tateno M. et al. Biologic features of HIV-1 that correlate with virulence in the host. // Science 1988. - V.240. - P. 80-82.

35. Clever J.L., Miranda D. et al. RNA structure and packaging signals in the 5' leader region of the human immunodeficiency virus type 1 genome. //J. Virol. -2002-V.76.-P. 12381-12387.

36. Clever J, Sassetti C, Parslow T. G. RNA secondary structure and binding sites for gag gene products in the 5' packaging signal of human immunodeficiency virus type 1. //J Virol. -1995-V.69.-P.2101-2109.

37. Coff SP. Death by Deamination: A novel host restriction system for HIV-1// Cell 2003,- V.l 14.-|P.281-283.

38. Coffin JM. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. // Science 1995. - V.267. - P. 483-489

39. Connor R. I., Sheridan К. E., Ceradini D., et al. Change in coreceptor use coreceptor use correlates with disease progression in HIV-1-infected individuals. // J. of Exp. Med. 1997. - V.185. - P. 621-628.

40. Cowley S. The biology of HIV infection. // Leprosy Review -2001- V. 7.- P.-212-220

41. Cullen S. Nuclear mRNA export: insinghts from virology. // Trends in Biochemical Sciences.- 2003 .-V.28(8).-P.419-424.

42. De Jong J., De Ronde A., Keulen W. et al. Minimal requirements for the human immunodeficiency virus type 1 V3 domain to support the syncytium-inducing phenotype: analysis by aingle amino acid aubstitution. // J. Virol. -1992. V.66. - P. 6777-6780.

43. De Martino GN, Slaughter CA. The proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms. // The J. of Biological Chemistry.-1999.-V.274(32).-P.22123-22126.

44. De Ronde A., van Dooren M., van Der Hoek L. et al. Establishment of new transmissible and drug-sensitive human immunodeficiency virus type 1, wild types due to transmission of nucleoside analogue-resistant virus. // J. Virol. -2001.-V.75.-P. 595-602.

45. Dean M., Carrington M., Winkler C. et al. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene.//Science 1996.-V.273.-P. 1856-1862.

46. Delward E.L., Sphaer E.G., McCutchan F.E. et al. Genetic relationships determined by a heteroduplecx mobility assay: analysis of HIV env genes. // Science 1993. - V.262. -P. 1257-1261.

47. Deng H, Liu R, Ellmeier W. et al., Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. // Nature 1996. - V.20. - P. 661-666.

48. Ding J., Hughes S. H., Arnold E. Proteinnucleic acid interactions and DNA conformation in a complex of human immunode®ciency virus type 1 reverse transcriptase with a double-stranded DNA template-primer. // Biopolymers -1997.-V.44.-P. 125-138.

49. Domingo E., Holland J.J. RNA vims mutation and fitness for survival. // Annu. Rev. Microbiol.- 1997.-V.51.- P.151-178.

50. Domingo E. Quasispises theory in virology. // J. Virol. 2002. - V.76. - P. 463-465.

51. Doms R., Moore J. HIV-1 Coreceptor Use: A Molecular Window into Viral Tropism. // In: Kuiken CL, Foley B, Hahn BH et al. Human retroviruses and

52. AIDS: a compilation and analysis of nucleic and amino acid sequences. Los Alamos, NM: Los Alamos National Laboratory. 1997. - P. 492-505.

53. Doms RW. Trono D. The plasma membrane as a combat zone in the HIV battlefield. //Genes & Development. 2000. - V.14.- P.2677-2688.

54. Dragic T. An overview of the determinants of CCR5 and CXCR4 co-receptor function. // J. of Gen. Virol. 2001. - V.82. - P. 1807-1814.

55. Dragic Т., Trkola A., Lin S. W. et al. Amino-terminal substitutions in the CCR5 coreceptor impair gpl20 binding and human immunodeficiency virus type 1 entry. // J. Virol. 1998. - V.72. - P. 279-285.

56. Druilleimec S., Caneparo A., de Rocquigny H., Roques B.P. Evidence of interactions between the nucleocapsid protein NCp7 and the reverse transcriptase of HIV-1. //J. Biol. Chem. 1999. - V.16. -P. 11283-11288.

57. Eigen M. On the nature of virus quasispecies. // Trends Microbiol. 1996.-V.4(6).- P.216-218.

58. Elgavish Т., VanLoock M.S., Harvey S.C. Exploring three-dimensional structures of the HIV-1 RNA/tRNALys3 initiation complex. // J. Mol. Biol. -1999. V.285. - P. 449-453.

59. Fantini J., Tamalet C., Yahi N. Secondary structure predictions of HIV-1 reverse transcriptase provides new insights into the development of drug-resistance genotypes. // AIDS 2001. - V. 15. - P. 1191 -1192.

60. Felsenstein J. Evolutionary trees, from gene frequencies and quantitative characters: finding maximum likelihood estimates. // Evolution 1981. -V.35.-P. 1229-1242.

61. Felsenstein J. Parsimony in systematics: biological and statistical issues. // Ann. Rev. of Ecol. and System. 1983. - V.14. - P. 313-333.

62. Feng Y., Broder С. C., Kennedy P. E, Berger E. A. HIV-l entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. // Science 1996. - Y.272. - P. 872-877.

63. Fouchier R.A., Groenink M., Kootstra N.A. et al. Phenotype-associated sequence variation in the third variable domain, of the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 molecule. // J. Virol. -1992. V.66. — P; 3183-3187.

64. Freed EQ. HIV-l and the host cell: an intimate association. //Trends in Microbiology.- 2004.-V.12(4).-P.172-177.

65. Gelderblom H.R. Assembly and morphology of HIV: potential effect of structure on viral function. // AIDS 1991. - V.5. - P. 617-637.

66. Gomes P., Diogo L, Goncalves M.F., et al. Different pathways to nelfmavir genotypic resistance in HIV-l subtypes В and G. // 9th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. 2002. - Seattle, WA. - Abst. 46

67. Goudsmit J., Boucher C.A., Meloen R.H. et al. Human antibody response to a strain-specific HIV-l gpl20 epitope associated with cell fusion inhibition. // AIDS. — 1988. V.2. - P. 157-164.(a)

68. Goudsmit J., Kuiken C.L., Nara P.L. Linear versus conformational variation of V3 neutralization domains of HIV-1 during experimental and natural infection. // AIDS 1989. - V.3. - P. 119-123.

69. Greenway AL, Hollo way G, Mc Phee DA, Ellis P, Cornall A, Lidman M.HIV-1 Nef control of cell signaling molecules: multiple strategies to promote virus replication. // J. of Biosciences.- 2003.-V. 28.-P.323-335.

70. Hansen J.I., Long A.M., Schultz. Structure RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus. // Structure.- 1997.- V.5(8).-P. 1109-1122.

71. He J., Chen Y., Farzan M., et al. CCR3 and CCR5 are co-receptors for HIV-1 infection of microglia. // Nature 1997. - V.385. - P. 645-649.

72. Holmes E.C., Zhang L.Q., Simmonds P. et al. Convergent and divergent sequence evalution in the surface evelope human immunodeficiency virus type 1 within a single infeced patient. // Proc. Natl.Acad.Sci USA.-1992.-V.89 (1 l).-P.4835-4839.

73. Jacks Т., Power M.D., Masiarz F.R. et al., Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. // Nature 1988. - V.21. - P. 280-2873.

74. Jacks Т., Varmus H.E. Expression of the Rous sarcoma virus pol gene by ribosomal frameshifting. // Science 1985. - V.230. - P. 1237-1242.

75. Kantor R., Katzenstein D., Camacho R. et al. Genotypic analyses of RT and protease sequences from persons infected with non-subtype В HIV-1. // 10th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. 2003. - Boston, MA. - abst. 623 (a)

76. Kuiken C.L., Foley В., Hahn B.H. et al. Human retroviruses and AIDS: a compilation and analysis of nucleic and amino acid sequences. // Los Alamos, NM: Los Alamos National Laboratory. 2003.

77. Kwong P.D., Wyatt R., Robinson J. et al. Structure of an HIV gpl20 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. // Nature 1998. - V.393. - P. 648-659.

78. Lake JA, Carr J. et all The role of Vif during HIV-1 infection: interaction with novel host cellular factors. //J. of Clinical virology.- 2003.-V. 26.-P.143-152.

79. Lame J. The phisiological relevance of CD4 receptor down-modulation during HIV infection. // Current HIV Research. 2003. - V. 1.-P. 167-184.

80. Leigh Braun A.J. Sequence variability in the human immunodeficiency viruses: pattern and process in viral evolution. // AIDS. 1992. - V.6. — P.1178-1184.

81. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. // Microbiol. Rev. 1993. - V.57. P. 183-289.

82. Liang C, Wainderg MA. The role of Tat in HIV-1 replication: an activator and/of a suppressor? // AIDS Reviews. 2002.-V. 4.-P.41-49.

83. Lukashov V.V., de Ronde A., de Jong J. et al. 2000 Epidemiology of HIV-1 and emerging problems. // Internat. Journal of antimicob. Agents. 2000.-V. 16.-P.463-466. .

84. Lukashov V.V., Karamov E.V., Eremin V.F. et al. Extreme founder effect in an HIV type 1 subtype A epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus. // AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998. - V.20. - P. 1299-1303.

85. Lukashov V.V., Kuiken C.L., Goudsmit J. et al. Intrahost human immunodeficiency virus type 1 evalution is related to length of the immunocompetent type 1 period. // J. Virol.-1995.-V.69(l 1).-P.6911-6916.

86. Lusio JP, Rous DA ed-all. Lysosome endosome fusion and lysosome biogenesis. // J. of Cell Science - 2000. - V.l 13.-P.1515-1524.

87. Mabara IG. Transport into and out of the Nucleus. //Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2001.- V.65(4). - P.570-594.

88. Maddon P.J., McDougal J.S., Clapham P.R. et al. HIV infection does not require endocytosis of its receptor, CD4. // Cell 1988. - V.54. - P. 865-874.

89. Mansky L.M. Retrovirus mutation rates and their role in genetic variation. // J. Gen. Virol. 1998.-V.79.-P. 1337-1345.

90. Martin-Serrano J, Zang T. Bieniasz PD. Role of ESCRT-I in retroviral budding. //J. of Virology 2003.- V.77(8).-P. 4794-4804.

91. Юб.Мс. Michael AJ., Row land-Jones S.L. Cellular immune responses to HIV. //Nature 2001.- V. 410.-P.980-987.

92. McNearney Т., Hornickova Z., Markham R. et al. Relationship of human immunodeficiency virus type 1 sequence heterogeneity to stage of disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. - V.89. -P. 10247-10251.

93. Meltzer M.S. Skillman D.R., Hoover D.L. et al. Macrophages and the human immunodeficiency virus. // Immunol Today. 1990. - V. 11. - P. 217-223.

94. Mendoza C.D., Rodriguez С., Corral A. et al. Evidence for a different transmission efficiency of viruses with distinct drug-resistant genotypes // Antiviral Therapy 2003. -V.8. - P. 144.

95. Montal M. Structure function correlates of Vpu, a membrane protein of HIV-1. // FEBS Letters - 2003. - V.552.-P.47-53.

96. Moore J.P., Nara P.L. The role of the V3 loop of gpl20 in HIV infection. // AIDS. 1991.-V.5.-P. 21-33.

97. Muesing M.A., Smith D.H., Cabradilla C.D. et al. Nucleic acid structure and expression of the human AIDS/lymphadenopathy retrovirus. // Nature 1985. -V.7.-P. 450-458.

98. Muthumani K., Choo AY. et. all. Mechanism of HIV-1 viral protein R-induced apoptosis.// Biochemical and Biophisical Research Communications.-2003.-V. 304.-P.583-592.

99. Nowak M., Schuster P. Erroe threshold of replication in finite populations mutations frequencies and the onset of Muller' raschet. // J. Theor. Biol.-1989.-V. 137(4).- P.379-395.

100. O'Brien W., Koyanagi Y., Namazie A. et. al. HIV-1 tropism for mononuclear phagocytes can be dermined by region of gp 120 outside the CD4-biding domain. // Nature 1998. - V.348. - P. 69-73.

101. Palker T.J., Clark M.E., Langlois AJ. et al. Type-specific neutralization of the human immunodeficiency virus with antibodies to env-encoded synthetic peptides. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. - V.85. - P. 1932-1936.

102. Piper RC, Luzio JP. Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. //Traffic 2001. - V.2.-P.612-621.

103. Pollakis G., Abebe A., Kliphuis A. et al. Phenotypic and genotypic comparisons of CCR5- and CXCR4-tropic human immunodeficiency virus type 1 biological clones isolated from subtype C-infected individuals. // J. Virol. 2004. - V.78. - P. 2841-2852.

104. Pollakis G., Kang S., Kliphuis A. N-Linked Glycosylation of the HIV Type-1 gpl20 Envelope Glycoprotein as a Major Determinant of CCR5 and

105. CXCR4 Coreceptor Utilization. // J. Biol. Chem. 2001. - V.276. - P. 1343313441.

106. Ptak RC. HIV-1 regulatory proteins: targets for novel drug development. // Expert Opinion on Investigational Drugs.- 2002.- V.l 1(8).-P.l099-1115.

107. Restle Т., Pawlita M., Sczakiel G. et al., Structure-function relationships of HIV-1 reverse transcriptase determined using monoclonal antibodies. // J. Biol. Chem. 1992.-V.267.-P. 14654-14661.

108. Rhee S.Y., Gonzales M.J., Kantor R. et al. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase and protease sequence database. // Nucleic Acids Res. -2003.-V.31.-P. 298-303.

109. Rini J.M., Schulze-Gahmen U., Wilson I. A. Structural evidence for induced fit as a mechanism for antibody-antigen recognition. // Science 1992. -V.255.-P. 959-965.

110. Rini J.M., Stanfield R.L., Stura E.A. et al., Crystal structure of a human immunodeficiency virus type 1 neutralizing antibody, 50.1, in complex with its V3 loop peptide antigen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - V.90. - P. 6325-6329.

111. Robert-Guroff M., Goedert J.J., Naugle C.J. et al. Spectrum of HIV-1 neutralizing antibodies in a cohort of homosexual men: results of a 6 year prospective study. // AIDS Res. Hum. Retroviruses 1988. - V.4. - P. 343350.

112. Rodgers D.W., Gamblin S.J., Harris B.A. et al. The structure of unliganded reverse transcriptase from the human immunodeficiency virus type 1. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. - V.92. - P. 1222-1226.

113. Ross T.M., Cullen B.R. The ability of HIV type 1 to use CCR-3 as a coreceptor is controlled by envelope V1/V2 sequences acting in conjunction with a CCR-5 tropic V3 loop. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. - V.95. -P. 7682-7686.

114. Ruiz-Jarabo C.M., Arias A., Baranowski E. et al. Memory in viral quasispacies// J. Virol. 2000. - V.74 (8). - P. 3543-3547.

115. Sawaya M., Prasad R, Wilson S.H. et al. Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with gapped and nicked DNA: evidence for an induced fit mechanism. // Biochemistry 1997. - V.16. - P. 11205-11215.

116. Sherman MP, Greene WC. Slipping through the door: HIV entry into the nucleus. //Microbes and infection.- 2002.-V.4.-P.67-73.

117. Sonigo P., Alizon M., Staskus K. S. et al. Nucleotide sequence of the visna lentivirus: relationship to the AIDS virus. // Cell 1985. - V.42. - P. 369-382.

118. Stremlau M, Owens C.M. et all. The cytoplasmis body component TRIM 5 alpha restricts HIV- infection in old wold monkeys. // Nature.-2004.-V.427.-P.848-883.

119. Strannicova N., Ray C.S., Livingston R.A. Convergent evolution within the V3 loop domain of human immunodeficiency virus type 1 in association with disease progression// J. Virol. 1995. - V.69 (12). - P. 7548-7558.

120. Tolstrup M, Ostergaard L. et all. HIV/SIV escapes from immune surveillance focus on Nef Current HIV. // Rescach 2004-V.2.-P.141-151.

121. Wang Z. X., Berson J. F., Zhang T. Y. et al. CXCR4 sequences involved in coreceptor determination of human immunodeficiency virus type-1 tropism. Unmasking of activity with M-tropic Env glycoproteins. // J. Biol. Chem. -1998.-273.-P. 15007-15015.

122. White-Scharf M.E., Potts B.J., Smith L.M. et al. Broadly neutralizing monoclonal antibodies to the V3 region of HIV-1 can be elicited by peptide immunization. // J.Virol. 1993. - V.192. - P. 197-206.

123. Willey R.L., Rutledge R.A., Dias S. et al. Identification of conserved and divergent domains within the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. -V.83.-P. 5038-5042.

124. Wyatt R., Sodroski J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens and immunogens. // Science 1998. - V.280. - P. 1884-1888.

125. Yeni P.G., Hammer S.M., Hirsch M.S. et al. Treatment for adult HIV infection: 2004 recommendations of an internatinal AIDS Society-USA Panel. // JAMA.-2004.-V.292.-P.251-265.

126. Zhang S, Grosse F. Multiple Functions of Nuclear DNA Helicase II (RNA Helicase A) in Nucleic Acid Metabolism. // Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004.-V.3 6(3).-P. 177-183.