Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение природных изолятов клубеньковых бактерий R. leguminosarum Bv. Viceae и получение штаммов, вступающих в эффективный симбиоз с викой мохнатой

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение природных изолятов клубеньковых бактерий R. leguminosarum Bv. Viceae и получение штаммов, вступающих в эффективный симбиоз с викой мохнатой"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

гкльскохозяпствг.::поп микробиологии

ГГ5 он

I/ \/Г>11 * I'

. . * * ¿ . • V

Оксана Никол^еииа

ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДНЫХ ИЗОЛЯТОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ я. ЬЕСиМНМОЗАКиМ ВУ. У1СЕАЕ И ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ, ВСТУПАЮЩИХ В ЭФФЕКТИВНЫЙ СИМБИОЗ С ВИКОЙ МОХНАТОЙ

Специальное 1ь: (Ki.00.07 — микробиология

Л В I О Р Е Ф I: Р Л Г

лпесерIацни па соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

На правах рукописи УДК: 633.352:П7П.851.13"

Работа выполнена в лаборатории генетики и сслскщш микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург).

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Б. В. Симаров.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор К. В. Квитко, кандидат биологических наук Л. Н. Пароменская.

Ведущее учреждение — Российский государственный педагогический университет имени Герцена.

Защита диссертации состоится « 4У» 1995 года в час.

на заседании Специализированного Совета (К-020.26.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, г. Санкт-Петербург, Пушкин-8, шоссе Подбельского, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В земледелии биологическая фиксагдел азота, осуществляемая бобовыми растениями в симбиозе с клубеньковыми бактериями, остается незаменимым экологически чистым и экономически выгодным ИСТОЧНИКОМ ПОЛуЧйНИЛ ЭТОГО ЭЛбМЕНТЗ.

Для повышения урожайности бобовых культур используют предпосевную обработку семян ризоторфином - препаратом, приготовлен-

1Ш Ш) и/iwm НИЯЖП»»»»™» Tw~SíIбакТйрИЙ. ¡ЮН

sie« алл поучения высокоэффективного симбиозз необходимо учитывать не только активность клубеньковых бактерий, но и их специфичность взаимодействия с растением-хозяином, и вести координированную селекцию обоих партнеров.

Среда большого разнообразия бобовых культур значительное место занимают растения, принадлежащие роду Vicia. Только на территории бывшего СССР произрастает около 90 видов этого рода (Комаров, 1948). На первом маете по площадям воздолшззпия находится вика посевная (Vicia sativa). Поэтому, до настоящего времени производственные штаммы были получены только для этого вида вики (Доросинский, 1970; Allen, Allen, 1981; Aclkgoz, 1988). Не меньший интерес представляет другой вид вики - вика мохнатая (V.villoea). Это - высокобелковая кормовая культура, содержащая до 26% белка в сухой масса растений. Она дает зеленую массу ранней весной и поздней осенью, когда другие бобовые культуры не могут быть использованы для этой цели.

Работ, посвященных исследованию симбиоза у вики мохнатой и ее микросимбионтов, подбору штаммов для аа нитрзгипхзяпжт, практически нет. Не исследована и генетическая детерминация симбиоти-ческой активности бакгернЯ. Поэтому изучение симбиоза вики мохнатой с клубеньковыми бактериями представляет как теоретический, так и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Цель исследований состояла в выделении высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий для пики мохнатой, в изучении состава плазмид ризобий и их роли в определении активности симбиоза, а также - в оценке симбиотического потенциала вша! мохнатой.

Конкретные задачи настоящей работы состояли в следующем: - выделить из клубеньков вики и почв географических отдаленных

районов (Украина и Средняя Азия) коллекцию штаммов И. Хе^итШо-вагиш bv.vi.ceae, изучить их изменчивость по симбиотическим свойствам и плазмидному составу и проанализировать связь иежду этими показателями и происхождением штаммов;

- отобрать штаммы, вступающие в высокоэффективный симбиоз с викой мохнатой;'

- изучить специфичность взаимодействия высокоактивных штаммов R.legumlnosaгum с различными видами и сортами вики, проанали- 1 зировать вклады генотипов макро- и микросимбионтов и их взаимодействия в определение эффективности симбиоза;

- с помощью транспозона Тп5 маркировать плазмиды у активных штаммов, выявить среди них симбиотические путем мобилизации в бесплазмидный штамм Сш1-9023 АДш>е1ас1епа и Ной~-штамм СХМ1-46 И.теШои;

- осуществить коньюгативный перенос маркированных плазмид высокоактивных штаммов в штаммы И.1.Ьу.у1сеае с низкой эффективностью и изучить влияние симбиотической плазмиды на проявление эффективности симбиоза у клубеньковых бактерий вики.

Научная новизна. Создана коллекция штаммов клубеньковых бактерий вики, которая может быть использована для изучения их природного разнообразия по широкому кругу симбиотических, морфологических и физиолого-биохимических признаков.

-Сравнительный анализ двух выборок штаммов ризобий вики, выделенных на Украине и в Средней Азии,показал, что географическое происхоядение штаммов оказывает влияние на генетическую структуру популяции, но не на симбиотическую активность штаммов.

Обнаружено преобладание симбиотрофного типа питания азотом у вики мохнатой по сравнению с автотрофным типом азотного питания у вики посевной.

Впервые проведен анализ вклада генотипов вики и клубеньковых бактерий в определение активности их симбиоза.

У трех высокоактивных штаммов ризобий вики идентифицированы симбиотические плазмиды и оценена их роль в проявлении эффективности симбиоза.

Практическая ценность. Впервые проведена специальная селекция высокоактивных штаммов для вики мохнатой. Отобраны три штамма &.Геяит1повагш Ьу. у1сеае с повышенной симбиотической эффективностью. Два из них решением Межведомственной комиссии Географи-

ческой сети опытов с гштрэппюм включены в число штаммов, испытываемых в производственных условиях.

Проведен анализ схмСиотической эффективности вики мохнатой с.Ставчакка и его 4-х форм в полевых условиях. Показано, что фориы V.villosa, отобранные по хозяйственно-ценным признакам ' (семенная продуктивность, урожай зеленой массы и др.), характеризовались пониженной отзывчивостью на инокуляцию ризобиями. Следовательно, параллельно с селекцией вики по этим признакам необходима селекция ее и по сиибиотииаоит.

Показано, чао шгшшы н. iAgnminomru!!!, г-ятупагщю в ъиооиоак-тивный симбиоз с викой мохнатой, способны формировать высокоэф^ фективные клубеньки и на корнях вики посевной.

Показана возможность использования генетических методов, в частности - коньюгативного переноса плазмид, для улучшения сим-биотической активности штаммов клубеньковых бактерий вики. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IX Международном конгрессе по азотфиксации (Мексика, Канкун, 1992); на VIII Восточно-Европейском симпозиуме по биологической азотфиксации (Саратов, 1592); на I Всероссийском съезде ВОГИС (Саратов, 1994); на I Европейской конференции по азотфиксации (Венгрия, 1994); на IX Ваховском коллоквиуме по биологической фиксации молекулярного азота (Москва, 1995). Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела "Материалы и методы", глав, содержащих результаты экспериментальной работы и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 167 страницах миппшописного текста, содержит 36 таблиц, II рисунков, 13 фотографий. Список литератур:.' состоит из IS5 источников, включая 130 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Объекты исследований. В работе использованы штаммы A.tumeiaci-ens Gm1-9023 (Rosenberg et al., 1984), R.meliloti CXM1-46 (Федоров и др.. ТЭ87), R.meliloti MV-II (Hynes et al., 1986),

R. leguininosarum VF-39 (Hynes et al., 1988) и штаммн E.coli, несущи плазмида pRP4-4, pSUP5011 (Simon et al,', 1983). Эталонный

штамм 0610 клубеньковых бактерий вики получен из коллекции БНШСХМ.

Семена растений вига мохнатой с.Ставчанка, его 4-х форм и

вики посевной с. Белоцерковская получены из НИИЗиХ западных районов Украины, семена вики посевной с.Немчиновская получены из коллекции ВИРа.

Методы. Природные изоляты R.legumino6arum bv.viceae выделяли из клубеньков 7 дикорастущих и 2 культурных видов вики, а также почвенных образцов различных районов Украины и Горно-Заравшан-ского района Средней Азии по методике Теплера и др, (1979) и Raflqual (1984).

Состав плазхшд штаммов клубеньковых бактерий вики анализировали методом Экхардта (Eckhardt, 1978) с модификациями, применяемыми для данного вида ризобий (Rosenbprg et al., 1982).

Для маркирования плазмид клубеньковых бактерий вики использовали транспозоновый мутагенез. Для этого штамм-донор S17-1 E.coli, несущий плазмидный вектор pSUP5011 с Тп5, скрещивали со штаммами реципиентами на поверхности плотной среды 20Е (Werner, 1975). Идентификацию плазмид проводили при мобилизации их в бесплаз-мидный штамм Gm1-9023 A.tumeiaciens и №э(1~-мутант СХМ1-46 R.me-Hloti. Частоты возникновения рекомбинантов рассчитывали на клетку реципиента.

Симбиотические свойства штаммов R.leguminoBarum оценивали в условиях стерильных микровегетационных и вегетационных опытов (Симаров, 1984). Эффективность штаммов определяли по способности увеличивать надземную массу инокулированных растений вики и накоплению в пей азота. Удельное содержание азота в сухой массе растений определяли по методу Къельдаля на автоматическом анализаторе "Къельтек-Авто" (Текатор, Швеция). Высокоактивные штаммы проверяли в вегетационных и полевых опытах по общепринятой методике (Доспехов, 1968).

Для статистической обработки данных использовали стандартные методы дисперсионного и корреляционного анализов, хи-квадрат, t-критерий Стьюдента (Лакин,_ 1980; Плохинский, 1967).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Создание коллекции штаммов клубеньковых бактерий, вступающих • в симбиоз с викой мохнатой, анализ их плазмидного состава и . .симбиотических свойств.

С целью получения активных штаммов R.l.bv.viceae, которые могут быть использованы как для генетического изучения, так и для

применения в сельскохозяйственном производстве, из клубеньков вики и почв Украины (рав(шнные районы Львовской и Киевской областей, горы Карпаты) и Горно-Заравшанского района Средней Азии, ,мы выделили 165 штаммов.

Из 60 образцов почв этих районов был выделен 71 штамм. Кроме почвенных образцов на Украине и в Средней Азии были собраны растения, принадлежащие к 7 дикорастущим (V.angustiíolia L., V.nar-bonensie, V.hyrcanica Fich et Mey.,, V.kokanica Regel et Sctoialh, V.michauxii Spreng., V.tenuiíolia Roth., V.peregrina L.) и 2

титтпг.»".—• L., 7,rxiiuHM «ntrii таи««. " ¡i..;

клу«ен?-я«?? выдолону 34 ¡¡¡таммя клуоенькосых бактерий.

Симбиотическую активность штаммов клубеньковых бактерий вики изучали в стерильных микровегетационных опытах.

Две выборки штаммов, различающиеся по географическому происхождению (Украина и Средняя Азия), содержат приблизительно одинаковое количество эффективных изолятов (53% и 62%, соответственно) (табл.1).

Таблица I. Активность клубеньковых бактерий вики, выделенных в различных географических районах

Происхождение штамма К-во проанализированных штаммов % штаммов, достоверно превышающих по эффективности

контроль б/ин. t штамм 0610 t

А: Р-ны выделения:

Украина Средняя Азия 136 29 53 II 0,33 62 20 И II 1,25

Б: Истсткх тзтадзлания:

клубеньки Азия Украина 16 7а 56 II 0,44 62 25 II 21 0,34

Украина ~ 19 71 80 ** V 4,26 35 16 II 15 0,11

Сравнивая эффективность шгашоа, выделенных из клубеньков и из почв, ш обнаружили, что среди изолятов из клубеньков процент активных штаммов практически одинаков в обеих выборках. В то ие время выявлено преобладание активных штаммов среди изолятов, выделенных из неокультуренных почв горных районов Украины и Средней

- б -

Азии, по сравнению с изолятами, выделенными из почв равнинных районов Украины.

Анализ плазмидного состава 71 штамма показал, что генетическая структура популяций КДе^^лпИгозагит bv.vl.ceae может зависеть от их географического происхождения. Все изученные штаммы из обеих выборок содержали от 2 до б плазмид, но среднее количество плаз-мид у штаммов украинской выборки было равно 3, в то время как у средне-азиатских штаммов - 4 (табл.2). Отмечен больший размах варьирования плазмид по молекулярной массе у штаммов из среднеазиатской выборки (52-900 кЬ), чем у штаммов из украинской выборки (200-800 кЬ).

Таблица 2. Распределение по плазмидному составу штаммов клубеньковых бактерий вики, выделенных на Украине и в Средней Азии

Район выделения К-во штаммов Среднее число плазмид на клетку Число штаммов, содержащих данное количество плазмид X2

2 3 4 5 6

Украина Средняя Азия 46 25 3 4 8 32 4 1 I I 5 13 6 0 28,2 Р<0,001

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что, хотя проанализированные выборки штаммов двух географически отдалешшх популяций-различаются по генетической структуре, а ' именно по плазмидному составу, по симбиотической активности они представляют одинаковый интерес для отбора высокоактивных штаммов R.leguminoвaгuш. Корреляционных связей между количеством плазмид в бактериальной клетке и симбиотической активностью штаммов нами не обнаружено (г = -0,41 - +0,22).

На основании проведенной работы, в условиях микровегетационного опыта было отобрано 11 'изолятов, достоверно превышающих по эффективности симбиоза эталонный штамм 0610 (прибавки от инокуляции составляли 10-2755 по массе растений и 9-30% по общему накоплению азота).

Анализ симбиотических свойств клубенЬковых' бактерий вики в вегетационных и полевых опытах.

Эффективность 11 наиболее активных в микровегетационных опытах штаммов К.1еёШ11по8агит была оценена в условиях, приближенных к производственным: в нестерильных вегетационных опытах и в полевых мелкоделяночных опытах.

В результате проделанной работы было выделено 3 штамма, вы- • зывающих достоверное увеличение урожая зеленой массы вшей и накопления в ней азота (табл.3). Эти штаммы могут быть рекомендованы для приготовления препаратов клубеньковых бактерий для вики ~ ^«»¡пчшжит т.г. -."г

ЧЙОКОЙ ОЧТТ^ТТОСГТТ,

Сопоставление эффективности изученных штаммов R.legшIlinoвarum в микровегетационных, вегетационных и полевых опытах показало, что между результатами этих экспериментов имеет место достаточно высокая положительная корреляция. По массе растений коэффициент корреляции равен 0,43-0,74, а по накоплению азота - 0,420,78 . Это подтверждает целесообразность использования микровегетационных опытов для первичной массовой оценки эффективности штаммов клубеньковых бактерий вики.

Таблица 3. Симбиотическая эффективность лучших штаммов-клубеньковых бактерий вики

Штамм Средняя прибавка {%) к эталонному штамму 0610

вегетационные опыты полевые опыты

монокультура в смеси с овсом вико-пшеничная смесь

п1 М N п1 М ¡1 п1 М N

1-32 1-42 30 2(1) +46* +33* 1(1) +19* 140* 2(1) +10* +Ш 2(1) +25* +21* 1 (1 ) + 9 +32* 2(1) +12* +13* 2(1) +8 +13* .1 +7 +13 1 +8 +14

"прибавка достоверна при Р<0,05.

п1 - количество опытов, в скобках указаны те из них, в которых штамм обеспечивал достоверное повышение массы растений и (или) накопления в них азота;

М - масса инокулировэнных растений; М - общее накопление азота.

3. Отзывчивость различных сортов и видов вики на инокуляцию активными штаммами К.1е£цт1по5агш и на внесение карбамида.

Поскольку вика в основном возделывается в смесях со злаковыми

культурами, мы испытывали влияние инокуляции высокоактирными штаммами на вико-овсяную смесь в условиях вегетационного опыта (табл.4). Оказалось, что инокуляция ризобиями влияет только на урожайность вики, а урожай ■ овса по сравнению с контролем без инокуляции не повышался. Следовательно, внесение активных штаммов клубеньковых бактерий повышает роль бобового компонента травосмеси, в результате чего вика занимает ведущее место в определении урожая зеленой массы и накопления в ней азота. Вклад вики в общую биомассу смеси почти в 2 раза выше, чем при внесении "связанного" азота, который, в свою очередь, влияет только на урожай овса. Использование в качестве контроля- варианта с внесением "связанного" азота в форме карбамида обусловлено тем, что часто в сельскохозяйственном производстве с целью повышения урожайности многих культур применяют азотные удобрения. Результаты проведенных нами опытов показали, что (табл.'4): а) штаммы, отсе-

Таблица 4. Влияние инокуляции штаммами клубеньковых бактерий и внесения карбамида на массу и общее накопление азота в растениях вики

Прибавка к контролю без инокуляции (%) по

Вид сухой массе растений общему накоплению азота

вики от инокуляции (среднее по штаммам) от внесе-сения азота от инокуляции (среднее по штаммам) от внесения азота

Вика мохнатая

(монокультура) +76* +51 +77* +44

Вика мохнатая (вико-овся-ная смесь):

вика +45* + 8 . +50* -3

овес -18 +76* - 2 +225*

общее +52 +41* +64*

Вика посевная !

с. Немчиновская(I) +52* +82* +169* +170*

(2) + 6 +39* +23* +94*

с.Белоцерков окая - 2 +60* -£27* +138*

* прибавка достоверна при Р<0,05..

лектирсватше по способности формировать высокоэффективный симбиоз с викой мохнатой, можно использовать, для повышения урожайности вики посевной; б) вика мохнатая более отзывчива на инокуляцию ризобиями, чем на внесение карбамида; вика посевная, наоборот, более отзывчива на внесение "связанного" азота; в) и при внесении карбамида, и при инокуляции ризобиями у обоих сортов вики посевной наблюдается тенденция к большему увеличению общего накопления азота, чем массы растений; у вики мохнатой масса растений и лЛшоо ----- - ü¿>v/i.á ч»«.11ииипашэт «

ЬОИ OVHIIHHU- Ф/ч ССЛЗ 7 LiU.il МОХНАТОЙ фиксируемый ризобиями

азот полностью реализуется в форме растительной биомассы, то у вики посевной - расходуется на повышение урожая вики в меньшей степени, "чем на общее накопление в ней азота.

Бика мохнатая характеризуется более высокой индивидуальной изменчивостью растений по массе (коэффициент вариации равен 46,7%), чем вика посевная (36,1%). Это может быть связано как с различием способов размножения изученных видов вики (V.yillosa - перекрестник, 7.sativa - самоопылитель), так и оо значительно более высокой степенью окультуренности V.sativa. Вика мохнатая ¡Превосходит также вику посевную по удельному содержанию азота в растениях, инокулированных ризобиями (3,85% и 1,96%, соответственно).

Таким образом, на основании получении результатов можно предположить, что вика мохнатая является бобовой культурой с более выраженной способностью к симбиотрофному питанию азотом и может оказаться ценным модельным объектом для изучения генетической природы этого явления. Благодаря высокой изменчивости вики мохнатой по симбиозу можно вести направленный отбор ии.ятвидучл^пя:

растений, облацякчиих высокой симбиотической активностью. 1 О

Повнпение .ч^фективностн бобово-ризобиального симбиоза невозможно без селекции растения-хозяина на увеличение симбиотической активности. Необходимым'этапом в этой работе является оценка отзывчивости сортов и линий бобовых культур на нитрагтшза-цчю. Мы изучили отзывчивость на инокуляцию активными штаммами, отобранными для V.villosa с.Ставчанка, у полученных из этого сорта форм. Ранее, Гзлан (1939) после проведения химического мутагенеза получил формы Широколистая, Усатая, Фасциировакная и Тетраплоидная, отличающиеся от исходного сорта по морфологическим и хозяйственно-ценным признакам (семенная продуктивность, урожай

зеленой массы и др.). Мы изучили эти формы и показали, что от, как правило, уступали с.Ставчанка по отзывчивости на.инокуляцию активными штаммами 1-42 и 1-32 К.1.Ьу.у1сеае (прибавки по массе составляли +10% и +12%, соответственно, по сравнению с прибавками у с.Ставчанка - +18%). Следовательно, кроме селекции форы по показателям продуктивности, необходимо параллельно вести селекцию и по симбиотическим признакам.

При проведении селекции растений и бактерий на повышение эффективности бобово-ризобиального симбиоза большое значение имеет изучение относительного вклада их генотипов в определение этого признака (рис.1). Анализ взаимодействия двух видов вики,

60 ко го О

Í*

М 1

ы

i

-56

i

N

ш

w.

i

М)

ш

М N

т

\Л

Si

dA

а

к-

N N17.)

>J¿

¡

зЛ

I

II

III

Рис.2. Вклад генотипов симбионтов в обцее варьирование показателей эффективности симбиоза "вика - R.leguminosarum" в вегетационных и полевых опытах:

I - вег. опыт 1991г. (2 вида вики),

II - полевой опыт 1990-91гг.(4 формы V.villosa с.Ставчанка),

III - вег. опыт 1992г. (2 сорта V.sativa).

М - масса растений; N(2) - удельное содержание азота; N - общее накопление азота.

еа - вклад генотипов штаммов шзобий,

ЕЭ - вклад генотипов сортов (форм) растений,

□ - вклад взаимодействия генотипов партнеров,

ES3 - "неконтролируемые" факторы.

в также различных сортов и форм внутри одного вида, с различными штаммами ризобий показал, что влияние генотипов растения-хозяина на эффективность симбиоза максимально при сопоставлении 2 видов вики - V.villoBa и V.sativa (23,6% и 69,6% от общего варьирования массы растений и накопления в них азота, соответственно). При испытании же сортов (форм), относящихся к одному виду, это влияние либо проявлялось в меньшей степени (для V.villosa 3,220,2% от общего варьирования симбиотических признаков), либо не проявлялось вообтп Г пи О V.fTítlTüJ. оЗи-гя г'пмп »mí

p«M(TrT«na,/Tf c!r?:5;!o~noc;~i¿ партнеров, чем масса инокулировашшх растений вики. В условиях полевого опыта влияние взаимодействия генотипов растений и бактерий контролирует 52,6% от общего- варьирования количества накопленного азота, однако этот фактор не проявляется при анализе массы растений вико-пше-ничной смеси.

4. Генетический контроль симбиотической эффективности клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с викой мохнатой.

На последнем этапе работы мы провели изучение генетического контроля симбиотической эффективности у клубеньковых бактерий вики и, в частности, вклада симбиотических плазмид в ее проявление.

Ранее, с помощью гель-электрофореза по Экхардту, было обнаружено, что штаммы 1-32, 1-42 и 30 R.leguminoBarura содержат по три плазмиды каждый. Используя транспозон Тп5 и плазмиду-помощшк pRP4-4 для осуществления коньюгативного переноса плазмид, мы провели маркировку и мобилизацию в,бесплазмидный штамм A.tume-íaciens плазмид исследуемых активных штаммов. Анализ л-пядмйдккх профил&Л производных Agrobacterim и родительских штаммов показал, что агробактериалыше рекомбинанты всех трах гтаммов, формирующие клубеньки на корнях вики, содержат плазмида, соответствующие по. подвижности наименьшим плазмидам донорных штаммов (рис.2).

Рекомбинанты, содержащие среднюю плазмиду, не образовывали клубеньков на корнях вики. Размеры идентифицированных симбио-тических-дяазмид составляли приблизительно 270 kb для штаммов 1-32 и 1 --Í2, и 350 kb для штамма 30 клубеньковых бактерий вики мохнатой.

: Рис.2. Плазмидный профиль агробактериалышх рекомбинан-тов, полученных у штамма 1-32 НЛе^^иМповагит Ь7.у1сеае

4 I 3 М £~ е 9 40 Н 13 44 44Г

' 1 г 3 4 5" б ? У 9 Ъ и У/ /3 /Г ' •

"в А М МРМП'М.М'

| л ■ ■') < ■■ . Ь ч I) I

дорожки: 1,4,10,12 - АЛитеГас1еп8 Ст1 -5023 (реципиент), 5,8,9,14,15 - К.1е£Цш1поеагиш (донор), 2,3,6,7,11,13 - рекомбинанты. .

Для дальнейшего изучения вклада плазмид в проявление симбио-тической активности были отобраны транспозанты штамма 1 -32 с неизмененной эффективностью. Затем был осуществлен койьюгатив-ный перенос маркированных транспозоном плазмид в нефиксирующий азот штамм У57 и штамм У14 с пониженной эффективностью (табл.5)

Таблица 5. Симбиотические свойства трансконьюгантов, полученных от скрещивания штаммов 1-32 и У14.

Штамм Сухая масса растений, мг/сосуд С^Нр-редуктаз-ная активность, мкм СрН4 на сосуд/раст. Общее накопление азота, мг/сосуд

Донор 1-32 103,2* . 1,2* 3,42*

Редшиент_Л4 60,7 0,35 1,40

Рекомбинанты: 92,1* . К2 74,4, И5 89,7* 6,74* 0,04 0,48 2,11* 1,35, 2,23*

Реципиент У57 52,7 0,02 0,96

Рекомбинанты: Щ 101,2 ЙЗ 72,5 0,74* 0,09 3,68* 0,99

"прибавки по отношению к штамму-реципиенту достовер1ш;

Перенос рБутп в штамп У57 И.1.Ьу.у1сеае сопровождался суще-ственнш улучшениеи ацетилен-редуктазной активности и симбиоти-ческой эффективности рекоибинантов по сравнению со штаммом-реципиентом. При введении несиыбиотической плазмиды такого эффекта отмечег"

В с. э,

введет 1-

вать м!

ствешо| т

повышав _ _________

нению с исходный шташои-реципиентои. Анализ плазнидиого профиля агробактериальных рекомбинантов подтвердил наличие у них донорной плазмиди штамма 1-32 К.1.Ьу.у1сеае.

Таким образом, при коньюгативном переносе рБуш из высокоактивного штамма в менее' активный можно «як повысить активность последнего (табл.4 Ш н ИБ), так и понизить, что может являться итогом различных рексмбинационных событий, происходящих в клетке реципиента.

Рис.3. Плазмидный профиль ризобиальннх и агробактериальных рекоибинантов, полученных при коньюгативном переносе плазмид у И. 1е(*игп1гювагил) Ь7.71сеае.

}- 8 в -¡£> -И ¿2.

Справа-наново; I- маркерный штамм И.теШо-Ц МУ-И, 2- К.1е-тшпопагш №-39, 3,11- И. 1е£итпо5агит 1-32 (донор), 4,8- КЛе§ш1поБагш У14 (рецшшент1), 5- рексмбинант К5, 6- агробактвриальшй реком-бинант В5, 7- АЛип^ас1епв (реципиент 2), 9-рекомбинант Я2, Ю- агробактериальный рекомби-кант Иг, 12- рекомбинант Й1.

Эти результаты подтверждают предположение об участии Sym-плазмид в детерминации симбиотической эффективности у R.leguminosarum bv.vlceae H что метод коньюгативного переноса плазмид может быть использован для улучшения симбиотической активности штаммов клубеньковых бактерий вики. Однако, следует учитывать, что активность симбиоза сложный полигенный признак, который у рекомби-нантных штаммов зависит от свойств донорной плазмиды, природы реципиентного штамма и рекомбинационных событий, происходящих в бактериальных клетках.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция природных изолятов клубеньковых бактерий R.leguminosarum bv.viceae, вступащих в симбиоз с викой мохнатой (Vicia villoGa}.. Коллекция насчитывает 165 штаммов, выделенных в двух географически отдаленных районах - на Украине и в Средней Азии. Показано, что проанализированные выборки штаммов двух географически отдаленных популяций различаются по генетической структуре, а именно по плазмидному составу, по симбиотической активности они однородны.

2. Отобраны три штамма клубеньковых бактерий (1-32, 1-42 и 30), достоверно повышающих в вегетационных и полевых опытах урожай зеленой массы вики мохнатой. Прибавки урожая вико-пшеничной смеси в полевых опытах составляли в среднем по штаммам 20,4%, а по общему накоплению азота - 31,3% по отношению к контролю без инокуляции. Показана возможность использования штаммов, отобранных для вики мохнатой, и для повышения урожайности вики посевной. Инокуляция тагами штаммами увеличивала в условиях полевого опыта массу растений V.sativa в среднем по штаммам на 13,8%, а накопление в ней азота на 18,6% по сравнению с контролем без инокуляции.

3. Анализ взаимодействия 2 видов, 4 форм и 2 сортов вики с 3 штаммами R.leguminosarum показал, что при сопоставлении различных видов вики (V.villosa и V.sativa) максимальное влияние на эффективность симбиоза оказывают генотипы растения-хозяина, а при испытании сортов (форм), относящихся к одному виду, это влияние либо проявлялось в меньшей степени (для V.villosa), либо не проявлялось вообще (для V.sativa). Накопление азота более жестко ■ контролируется генотипами симбиотических партнеров, чем масса инокутгрованных растений вики. Выявлена более высокая вну-трисортовая изменчивость растений по м^ссе у V.villosa по срзвне-

нию с V.sativa (коэффициента вариации составляют 46,7% и 36,1%, соответственно).

4. Изучена отзывчивость на инокуляцию ризобиями и на внесение азота в форме карбамида у двух видов вики (мохнатой и посевной). Показано, что инокуляция ризобиями повышает массу растений вики мохнатой и накопление в ней азота в большей степени, чем внесение "связанного" азота. При выращивании, вики мохнатой в смеси с

овсом инокуляция активными штаммами влияет тош,кг> ua ----

ииио- ия»« ÍC-Лвй Cil¿UU4¡ibU ль ВНЙОИНМР wnivSain»»» t rf!

на инокуляции ризобиями.

5. С помощью транспозона Tn5 у штаммов 1-32, 1-42 и 30 маркированы плазмиды и идентифицированы среди них симбиотиче.ские. Используя высокоактивный штамм 1-32 с меченной симбиотической плаз-мидой, проведен кокыогативный перенос этой плазмиды в штаммы клубеньковых бактерий вики с пониженной эффективностью.. Среди полученных трансконыогантов выявлены штаммы с повышенной симбиотической эффективностью по сравнении со штаммом-реципиентом, что говорит о роли симбиотической плазмиды в детерминации симбиотической эффективности клубеньковых бактерий вики, и позволяет реко-медовать коньюгативный перенос плазмид для направленного конструирования высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий вики.

Работы, опубликованные по материалам диссертации:

1. Курчак О.Н., Проворов H.A., Лисова Н.Е., Омаров Б.В. Сим-биотические свойства штаммов R.leguminosarm, выделенных из клубеньков тачгц •««ï'isTOft (Vicía vlllosa). Билл. ВИИИСХМ, 1950, N53, с.18-210

2. O.Kurchak, H.Provorov, B.Simarov. Identification oí Syro-plasmid in strain 1-42 oí Ríiisobium leguminosarum bv. vlceae. ß-th "Fflfitem Burope Symposium on Bioligical Hitrogen Fixation. Hitrogen Fix-92, Saratov, 1992, p.47.

3. O.Kurchak, N.Provorov, B.Simarov. Identification oí Sym-plasmids in Rhizobim leguminocaram bv. viceae able to eííect symbiosis with Vicia villosa. Proc. 9th International Congress on nitrogen fixation, Cancm, Mexico, 1992, p.624.

4. N.Provorov, U.Saimnazarov, T.Tanriverdiev, A.Fesenko, O.Kur-chak B.Slmarov. Ihteraction oi plant and bacterial genotypes during formation of effective legume-rhizobial symbiosis. Proc. 9th International Congress on nitrogen fixation, Qancun, Mexico, 1992, p.738.

5. Курчак O.H., Проворов Н.А., Симаров В.В. Отзывчивость различных видов вики на инокуляцию высокоактивными штаммами R.le-guminosarum bv.viceae. Сб. науч. трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции, 1993, т.151, с.59-62.

6. Kurchak O.N.,'Sharypova L.A., Slmarov B.V. Biodiversity of the vetch Rhizobium strains from Ukraine and Middle Asia. Proc.

nt

1° European nitrogen fixation conference, Szeged, Hungary, 1994, p.359.

7. Sharypova L.A., Rumyantseva M.L., Kurchak O.N., Slmarov B.V. Study of Rhizobium populations and release of unmodified strains in the former Soviet Union. Proc. 1st European nitrogen fixation conference, Szeged, Hungary, 1994, p.280-283.

8. Курчак O.H. Изучение полиморфизма штаммов R.leguminosarum bv.viceae, выделенных в различных районах Украины и Средней Азии. Генетика, приложение, 1994, т.30, с.84.

9. Курчак О.Н., Проворов Н.А. Соотношение симбиотрофного и ¿втотрофного питания азотом у вики мохнатой (V.vlllosa) и посевной (V.sativa). Тезисы докладов, 9-й Каховский коллоквиум по азотфиксации, 1995, Москва. Пущино. с,51.

РТП. Тип,ВИР.Зак,104, ТирЛОО. 31.03.95«